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Stand der Technik
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In
einem Laser-Scanning-System werden Laser unterschiedlicher Leistungsklassen
verwendet. Weiterhin ist ein Laser-Scanning-System durch eine große
Anzahl von variablen Modulen gekennzeichnet, die als Detektor oder
zur Beleuchtung dienen. Ein konfokales Scanmikroskop enthält
ein Lasermodul, das bevorzugt aus mehreren Laserstrahlquellen besteht,
die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugen.
Eine Scaneinrichtung, in die das Beleuchtungslicht als Beleuchtungsstrahl
eingekoppelt wird, weist einen Hauptfarbteiler, einen x-y-Scanner
und ein Scanobjektiv auf, um den Beleuchtungsstrahl durch Strahlablenkung über
eine Probe zu führen, die sich auf einem Mikroskoptisch
einer Mikroskopeinheit befindet. Ein dadurch erzeugter von der Probe
kommender Messlichtstrahl wird über einen Hauptfarbteiler
und eine Abbildungsoptik auf mindestens eine konfokale Detektionsblende
(Detektionspinhole) eines Detektionskanals gerichtet.
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In 1 ist
schematisch ein derartiger Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskopes
dargestellt.
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Dargestellt
sind hier die Module: Lichtquelle, Scanmodul/Detektionseinheit und
Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher beschrieben.
Es wird zusätzlich auf
DE 19 702 753 A1 verwiesen.
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Zur
spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat
werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen
eingesetzt. Die Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich
nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe.
Der Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen
hierbei verschiedene Laser (u. a. Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser).
Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen
und die Einstellung der Intensität der benötigten
Anregungswellenlänge, z. B. durch den Einsatz eines akusto-optischen
Kristalls. Anschließend gelangt die Laserstrahlung über
eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.
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Die
in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs
beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die
Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert
punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten
beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von
weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen 100 Mikrosekunden.
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Bei
einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes,
gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber-
und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner
auf einen dichroitischen Strahlteiler (MD). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom
Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht
auf eine Blende (konfokale Blende/Pinhole) fokussiert, die sich
genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch
werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch
Variieren der Blendengröße kann die optische Auflösung
des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich
ein weiterer dirchroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung
unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht
mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen.
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Bei
Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der
Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität
besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer
als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der
Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion
kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
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In
einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption
angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion,
jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit
abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
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Von
einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen
in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption
nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der
Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer
optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der
Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales
Bild der Probe generiert werden. Das LSM ist somit zur Untersuchung von
dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen
werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt.
Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische
Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht
vom Punktdetektor gemessen wird.
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In
biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene
Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert
(Multifluoreszenz).
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Die
einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der Technik entweder
aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften
(Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche
Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den
Nebenstrahlteilern (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen
Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT).
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Das
LSM LIVE der Carl Zeiss Micolmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen
Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde
(http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents-Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b).
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Die
Verbindung der Lichtquellenmodule mit dem Scanmodul erfolgt in der
Regel über Lichtleitfasern.
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Das
Einkoppeln mehrerer unabhängiger Laser in eine Faser zur Übertragung
zum Scankopf wurde beispielsweise in Pawley: „Handbook
of Confocal Microskopy„ Plenum Press, 1994, Seite 151,
beschrieben.
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In
der konfokalen Laserscanmikroskopie werden immer häufiger
Experimente mit UV-Laserlicht im Bereich von ca. 350–365
nm durchgeführt.
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Zur
Erzeugung dieser Laserstrahlung wurde bisher meistens ein spezieller
Ar-Laser verwendet, der groß und teuer ist. Da er zudem
einen extrem kleinen Wirkungsgrad aufweist, ist eine aufwändige Luft-
oder manchmal sogar Wasserkühlung erforderlich. Eine zweite,
bekannte Methode besteht darin, einen gepulsten, modengekoppelten
(üblicherweise, aber nicht zwingend diodengepumpten) Nd:YAG-Laser
mit einer Laseremission bei 1064 nm als primäre Laserquelle
zu verwenden. Die Ausgangspulse werden dann in einer geeigneten
Anordnung, beispielsweise in einem nachgeordneten nichtlinearen
optischen Element, in ihrer optischen Frequenz verdreifacht (third
harmonic generation, THG), d. h. die Wellenlänge wird gedrittelt.
Es ergeben sich Ausgangspulse mit einer Wellenlänge von
355 nm. Es ist auch möglich, das THG-Element direkt in
die Laserkavität einzubauen, um letztlich denselben Effekt
zu erzielen.
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Der
Nachteil dieser Methode ist, dass man durch die gepulste UV-Ausgangsstrahlung
sehr hohe Pulsspitzenleistungen benötigt, um eine für
seine Anwendungen genügend hohe Durchschnittsleistung zu erhalten.
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Durch
die hohe Pulsspitzenleistung wird jedoch die Oberfläche
der Glasfaser, in die die Laserstrahlung eingekoppelt und zum Scankopf
hin geleitet wird, sehr schnell zerstört.
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Dies
wird in seiner Wirkung noch dadurch verstärkt, dass man
für ein LSM normalerweise eine polarisationserhaltende
(polarization maintaining, PM), einmodige (single mode, SM) Glasfaser
verwendet.
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In
PM-SM-Glasfasern existieren durch den inneren Aufbau üblicherweise
hohe mechanische Spannungen, die gerade für die PM-Eigenschaften sorgen.
Durch diese inneren Spannungen wird nun die Zerstörschwelle
der Fasern weiter herabgesetzt, so dass ein Degradieren der Faser
bei noch kleineren Leistungen einsetzt. Dadurch sind diese gepulsten UV-Laser
für ein fasergekoppeltes LSM so nicht oder nur bei für
viele Anwendungen zu geringen Leistungen verwendbar.
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Darstellung
der Erfindung und ihrer Wirkungen und Vorteile Erfindungsgemäß wurde
erkannt, dass sich die oben genannten Probleme durch die Verwendung
eines diodengepumpten Festkörperlasers (diode pumped solid
state, DPSS), der zur Erzeugung von UV Strahlung frequenzverdreifacht
wird und im cw-Betrieb läuft, lösen lassen.
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Solche
Laser werden derzeit beispielsweise von der Firma Oxxius, 4 rue
Louis de Broglie, F-22300 Lannion, France beschrieben (http://www.oxxius.com).
Erste Geräte wurden bereits erfolgreich demonstriert, wenn
auch derzeit mit für manche Anwendungen zu geringen Laserleistungen.
Laser mit höherer Leistung befinden sich jedoch bereits
in der Entwicklung.
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Der
mögliche Aufbau des LSM mit dem Laser ist in 2 skizziert.
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Der
Laser L wird über eine Einkoppeloptiok KO in eine Monomodefaser
F eingekoppelt und wie obern beschrieben in den LSM Strahlengang
MI eingekoppelt. Einzelheiten zum cw-DPSS-THG-Laser kann man der
beiliegenden Veröffentlichung von Oxxius entnehmen.
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Durch
den cw-Betrieb entstehen keine hohen Pulsspitzenleistungen, und
die Stirnseite der Glasfaser wird weniger stark als im Pulsbetrieb
beansprucht. Dadurch ist die Verwendung höhere Durchschnittsleistungen
als bei gepulsten Systemen für die Experimente am LSM möglich.
Durchschittsleistungen (aus einem cw-Laser) von deutlich mehr als
50 mW werden heutzutage vom Anwender benötigt und in handelsüblichen
LSms, beispielsweise dem LSM 510 von Carl Zeiss, eingesetzt. Im
Pulsbetrieb arbeitende UV-Laser zerstören die Stirnseite
der Glasfaser jedoch innerhalb weniger Stunden.
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Es
ist von Vorteil, wenn man den Laserstrahl vor der Einkopplung in
die Glasfaser noch durch einen AOM (oder AOTF) leitet, siehe Skizze
in 3.
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In
diesem Fall lässt sich die optische Leistung regulieren
oder beim Scannen eine „region of interest (ROI)" durch
definierte schnelle Ab- und Abschaltung definieren (19829981 C2).
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Weiterhin
kann auch ein Shutter zwischen Laser und AOM bzw. Glasfaser sitzen
könnte, um die Belastung der Faser während der
Zeiten, zu denen keine Bildaufnahme stattfindet, zu verringern.
- • Der Laser muss nicht unbedingt diodengepumpt sein,
andere Pumparten (welche auch immer) sind auch denkbar.
- • Prinzipiell können auch andere Laser als Nd:YAG
als Ausgangslaser verwendet werden, sofern deren Wellenlänge
(bei Verwendung von THG) im Bereich um 1064 nm liegt.
- • Auch frequenzverdoppelte Festkörper cw-Laser (sofern
es welche mit Wellenlänge im Bereich 710 nm gibt) können
verwendet werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents-Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b [0012]
- - „Handbook of Confocal Microskopy„ Plenum Press,
1994, Seite 151 [0014]
- - http://www.oxxius.com [0022]