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DE102006053540B3 - Vorrichtung und Verfahren zur Analyse biologischer Proben - Google Patents

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DE102006053540B3
DE102006053540B3 DE102006053540A DE102006053540A DE102006053540B3 DE 102006053540 B3 DE102006053540 B3 DE 102006053540B3 DE 102006053540 A DE102006053540 A DE 102006053540A DE 102006053540 A DE102006053540 A DE 102006053540A DE 102006053540 B3 DE102006053540 B3 DE 102006053540B3
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Gerd Dipl.-Ing. Sulz
Hagen Dr.-Ing. Thielecke
Carsten Dr. Bolwien
Steffen Koch
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Universitaet Stuttgart
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Abstract

Die Erfindung liegt im technischen Gebiet der Zellbiologie und Transplantatemedizin. Sie betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur schnellen und nicht-invasiven Analyse oder Kontrolle biologischer Proben, besonders zur Sterilitätskontrolle, zur Charakterisierung von in der biologischen Probe enthaltenen infektiösen Partikeln und Mikroorganismen sowie zur Charakterisierung von Gewebezellen und Transplantaten. Hauptanwendungsgebiete der Erfindung sind die biotechnologische Produktion pharmakologischer Wirkstoffe und Therapeutika sowie die Transplantationsmedizin.

Description

  • Die vorliegende Erfindung liegt im technischen Gebiet der Zellbiologie und Transplantatemedizin. Sie betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur schnellen und nicht-invasiven Analyse oder Kontrolle biologischer Proben, besonders zur Sterilitätskontrolle, zur Charakterisierung von in der biologischen Probe enthaltenen infektiösen Partikeln und Mikroorganismen sowie zur Charakterisierung von Gewebezellen und Transplantaten. Hauptanwendungsgebiete der Erfindung sind die biotechnologische Produktion pharmakologischer Wirkstoffe und Therapeutika sowie die Transplantationsmedizin.
  • Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft die Kontaminations- und Qualitätskontrolle vor allem in der Transplantationsmedizin. Bei der individuellen Therapie von Organdefekten mittels organähnlicher Gewebekulturen, beispielsweise Haut- oder Knorpeltransplantate, ist die Keimfreiheit der biologischen Implantate eine gesetzlich vorgeschriebene Voraussetzung für die Freigabe zur Implantation. Der Nachweis kontaminierender Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze ist mit den bekannten Nachweisverfahren nur zeitverzögert möglich. Steril- beziehungsweise Kontaminationskontrollen biologischer Implantate erfolgen bislang über bekannte Abklatsch- und Ausstreichproben der zu untersuchenden Flüssigkeiten und anschließender Bebrütung. Nachteilig ist dabei, dass die Ergebnisse der Analyse mit Charakterisierung des kontaminierenden Mikroorganismus, der zum Teil nur langsam wachsenden Erreger, erst etwa zwei Wochen nach Freigabe des biologischen Implantats zur Implantation in den Patienten vorliegen. Erst dann können entsprechende therapeutische Schritte gegen die nachgewiesene Kontamination, beispielsweise eine spezifische Antibiotikatherapie eingeleitet werden. Es sind deshalb Mittel und Verfahren wünschenswert, wodurch eine Kontamination biologischer Implantate innerhalb kurzer Zeit sensitiv und selektiv detektiert und der vorhandene kontaminierende Mikroorganismus charakterisiert und gegebenenfalls identifiziert werden kann.
  • Zur Qualitätskontrolle von biologischen Implantaten, Gewebepräparaten oder Transplantaten ist es wünschenswert, die kultivierten Gewebezellen des Implantats, beispielsweise humane Knorpelzellen, vor der Anwendung aber auch während der Kultivierung des Implantats charakterisieren zu können. Dabei soll vorrangig der Differenzierungsgrad und/oder die Vitalität der Zellen ermittelt werden. Dies ist insbesondere bei Implantaten aus (autologen) humanen Zellen von großer Bedeutung, da diese Zellen während der Kultivierung dedifferenzieren können, wobei sie ihre gewebespezifischen und für die Therapie gewünschten Eigenschaften verlieren. Die Qualität des Implantats sinkt dadurch. Dedifferenzierte Zellen neigen außerdem oft zu einer erhöhten Proliferationsrate, weshalb sie als potentielle Krebszellen angesehen werden. Wünschenswert sind daher Mittel und Verfahren zur Charakterisierung und Typisierung der Gewebezellen und der extrazellulären Matrix des Gewebes und damit zur Qualitätskontrolle der biologischen Implantate.
  • Die Qualitätskontrolle von biologischen Implantaten ist zurzeit gesetzlich nicht einheitlich geregelt, da es keine bekannte Methode gibt, die als „Goldstandard" auf die unterschiedlichsten Gewebezelltypen gleichermaßen anwendbar wäre. Bekanntermaßen werden immunzytologische Verfahren eingesetzt, deren Qualität vor allem von der Spezifität der eingesetzten Antikörper abhängig ist und welche nicht normierbar beziehungsweise standardisierbar sind. Bekannte Verfahren zur Charakterisierung von biologischem Material sind „invasive" Methoden, die die Weiterverwendung der untersuchten Zellen unmöglich machen. Zum Beispiel werden bei der bekannten Durchflusszytometrie die Zellen anhand der Expression bestimmter Oberflächenmoleküle charakterisiert (CD-Antigentest). Aufgrund dieses methodischen Mangels können zurzeit nur Teile des kultivierten Gewebes als biologisches Implantat für die Implantation vorgesehen werden. Der andere Teil muss für die invasive Charakterisierung der Zellen „geopfert" werden. Wünschenswert sind deshalb Mittel und Verfahren, worin eine nicht-invasive, zerstörungsfreie biologische Charakterisierung der zu untersuchenden Zellen, möglichst im flüssigen Kulturmedium, erfolgen kann. Weiter ist es wünschenswert, die Belastung des Gewebes bei der Messung zu minimieren.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Sterilitätskontrolle bei der Herstellung von Medikamenten oder Wirkstoffen nach im Wesentlichen biotechnologischen Verfahren. In solchen Verfahren werden Wirkstoffe durch biologische Zellen oder Zellsysteme wie Mikroorganismen und/oder Gewebezellen in so genannten Bioreaktoren produziert. Im industriellen Maßstab werden Bioreaktoren mit Volumina von 50 Litern oder mehr eingesetzt. Oft erfordert die Gewinnung der Wirkstoffe eine Kultivierungsdauer in den Reaktoren von mehreren Wochen. In der Produktionskette schließt sich an den Bioreaktor meist eine mehrstufige Aufreinigung an, woraus schließlich die gewünschte Wirkstoffzusammensetzung erhalten werden kann.
  • Es ist dabei essenziell, dass keine Fremdkontamination in der Reaktorcharge auftreten und die Sterilität der aus dem Bioreaktor gewonnenen Wirkstoffzusammensetzung gewährleistet ist. In bekannten Verfahren wird routinemäßig zu Beginn und am Ende der Reaktorkultivierung beziehungsweise am Ende der Produktionskette die Charge out Fremdkontamination und Sterilität geprüft. Im Falle einer festgestellten Kontamination muss dann das gesamte Produktvolumen verworfen werden.
  • In bekannten Sterilitätstests werden aus dem laufenden Produktionsprozess biologische Proben in Form kleiner Flüssigkeitsmengen entnommen, nach klassischen mikrobiologischen Verfahren auf Nährmedium bebrütet und zur Bestimmung der Art der Kontamination anschließend differenziert. Ergebnisse sind erst mit einer Verzögerung von mehreren Tagen zu erwarten. Nachteilig ist, dass dann die Möglichkeiten zum regulierenden Eingriff in den Prozess begrenzt sind. In den meisten Fällen sind zumindest die eingesetzten Ressourcen für die Fortführung des Produktionsprozesses zwischen dem Zeitpunkt der Flüssigkeitenentnahme und dem Zeitpunkt des positiven Nachweises einer Kontamination verschwendet.
  • Zur Verbesserung des Produktionsablaufs und zur Vermeidung von Kosten besteht der Bedarf an einer laufenden Überprüfung auf Sterilität beziehungsweise Kontamination über die gesamte Kultivierungsdauer, während des gesamten Produktionsprozesses und/oder entlang der gesamten Produktionskette. Wünschenswert ist ein schnelles Nachweisverfahren, das eine kurze Nachweiszeit bietet, und Mittel zur Durchführung eines solchen Verfahrens. Gleichzeitig soll eine hohe Spezifität und Sensitivität gegeben sein. Vorzugsweise soll ein solches Nachweisverfahren auch geeignet sein, die Art der Kontamination eindeutig festzustellen, das heißt besonders, den kontaminierenden Mikroorganismus zu bestimmen. Neben der Ersparnis der Kosten für die ansonsten verschwendeten Ressourcen, wäre damit auch eine Zeitersparnis verbunden, da der kontaminierte Prozess schnell beendet und frühzeitig ein neuer Prozess gestartet werden könnte.
  • Die Raman-Spektroskopie ist eine bekannte Methode, die bislang vorwiegend in der chemischen Analyse und der Oberflächencharakterisierung eingesetzt wird. Zunehmend wird die Methode auch zur Charakterisierung von biologischen Proben und bei der Untersuchung von biologischen Flüssigkeiten eingesetzt. Bei Bestrahlung der biologischen Probe mit Anregungsstrahlung bestimmter Wellenlänge oder Wellenlängenbereich treten sowohl elastische als auch unelastische Streuprozesse an bestrahlten Molekülen in der Probe auf. Der Hauptanteil des eingestrahlten Anregungslichts wird in der Probe elastisch gestreut (im Wesentlichen die so genannte Rayleigh-Streuung). Daneben tritt zu einem geringen Anteil unelastische Streuung an Molekülen, die so genannte Raman-Streustrahlung, auf. Die Raman-Streustrahlung unterscheidet sich im Energiegehalt und damit in der Wellenlänge von der eingestrahlten Anregungsstrahlung. Die Raman-Streustrahlung weist sowohl einen zu kürzeren Wellenlängen hin verschobenen Anteil auf (Antistokes-Linien) als auch einen Anteil längerer Wellenlängen (Stokes-Linien). Als Raman-Spektrum wird regelmäßig die spektrale Verteilung des zu längeren Wellenlängen hin verschobenen Anteil der Raman-Streustrahlung verstanden (Stokes-Linien). Das Raman-Spektrum ist meist charakteristisch für das bestrahlte Molekül beziehungsweise die Molekülzusammensetzung der bestrahlten Probe. Mit vor allem auf statistischen Algorithmen basierenden Verfahren können solche Spektren gegebenenfalls eindeutig bestimmten Molekülen einer bestrahlten Probe zugeordnet werden, sodass Molekülzusammensetzungen, biologische Zellen, Zellkompartimente und subzelluläre Strukturen charakterisierbar und gegebenenfalls spezifizierbar werden.
  • In einem aus der WO 2004/099763 A1 bekannten Verfahren wird die Raman-Spektroskopie zur Untersuchung und Analyse biologischer Zellen eingesetzt, wobei die zu untersuchenden Mikroorganismen kultiviert, isoliert, mit Anregungsstrahlung bestrahlt und die von den Zellen emittierte Raman-Streustrahlung spektroskopisch analysiert wird. Aus den aufgenommenen spektralen Verteilungen der emittierten Raman-Streustrahlung werden mittels statistischer Analysen die für die jeweiligen Mikroorganismen charakteristischen Kennwerte, beispielsweise bestimmte Banden im Spektrum, erfasst und mit entsprechenden, in Datenbanken hinterlegten Kennwerten von bekannten Mikroorganismen verglichen. Die Analysemethode ist invasiv, da die zu untersuchenden Mikroorganismen aus dem Zellverband herausgelöst und präpariert werden. Eine Rekultivierung der analysierten Zellen ist nicht vorgesehen.
  • Aus der WO2006/091223 A2 ist ein Verfahren zur Ramanspektroskopischen. Analyse von Proben wie biologische Kontaminationen aus Luft und Flüssigkeiten bekannt. Die Probe wird nach Fixierung zunächst optisch untersucht. Dabei identifizierte Partikel werden anschließend Raman-spektroskopisch untersucht. Es wird auch eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens beschrieben, worin eine Mikroskopieeinheit, eine Spektroskopieeinheit und eine Fixiereinheit für Proben kombiniert sind.
  • Nachteilig bei diesen Verfahren ist der invasive Ansatz, der zur Zerstörung der analysierten Zellen führt. Nachteilig ist weiter die mit bekannten Raman-spektroskopischen Verfahren verbundenen langen Messzeiten.
  • Ausgehend vom Stand der Technik besteht das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem vor allem darin, Mittel und Verfahren zur einfach handhabbaren, schnellen, nicht-invasiven, zerstörungsfreien Detektion und Charakterisierung biologischer Zellen in biologischen Proben, vorzugsweise in Zellverbänden, Geweben, Zellsuspensionen oder biologischen Flüssigkeiten, bereitzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem im Wesentlichen durch die Bereitstellung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 zur Analyse einer biologischen Probe, das auf einem optisch-spektroskopischen Prinzip beruht. Die biologische Probe, die bevorzugt als flüssige oder überwiegend flüssige Probe (biologische Flüssigkeit) vorliegt oder bereitgestellt wird, wird in einer Probenhalteeinheit, bevorzugt reversibel, das heißt wieder entfernbar und nicht-invasiv, fixiert, das heißt festgehalten; die in der biologischen Probe gegebenenfalls enthaltenen Partikel werden kategorisiert durch: mikrophotographisches Aufnehmen der biologischen Probe und/oder der in der Probe enthaltenen Partikel und Analysieren der Bilddaten mittels automatischem Mustererkennungsprozess; und die biologische Probe wird Raman-spektroskopisch analysiert, und zwar innerhalb einer im Bereich der biologischen Probe positionierbaren Messzone, indem in der Messzone Raman-Streustrahlung angeregt oder erzeugt wird durch Fokussieren einer Anregungsstrahlung und die von der biologischen Probe in der Messzone emittierte Raman-Streustrahlung detektiert wird und die spektrale Verteilung der Ra man-Streustrahlung analysiert wird, wobei mindestens ein Raman-Spektrum von der biologischen Probe erhalten wird.
  • Das Fixieren der biologischen Probe erfolgt erfindungsgemäß durch Durchströmenlassen der biologischen Probe durch die Probenhalteeinheit, wobei die Probenhalteeinheit als Fluidzelle ausgebildet ist, wobei in der biologischen Probe gegebenenfalls enthaltende Partikel in der Fluidzelle zurückgehalten und dort reversibel, zumindest für die Dauer der Analyse, fixiert werden, indem die Partikel in der Fluidzelle durch mindestens eine in der Fluidzelle angeordnete Lochplatte mit mehreren Durchbrechungen zurückgehalten werden und die Durchbrechungen in der Lochplatte strukturiert in Form eines regelmäßigen und adressierbaren Musters zeilen- und spaltenweise angeordnet sind.
  • Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Messzone auf bestimmte Abschnitte oder Partikel der biologischen Probe anhand der Ergebnisse der mikrophotographischen Kategorisierung nach festgelegten Kriterien automatisch positioniert und die Raman-spektroskopische Analyse auf den Bereich der mindestens einen automatisch positionierten Messzone beschränkt wird.
  • Die Erfindung sieht vor, die Raman-spektroskopische Analyse der biologischen Probe räumlich auf dort gegebenenfalls vorhandene Partikel, die einer vorbestimmten Kategorie angehören, zu beschränken. Dies geschieht, indem die Messzone automatisch jeweils auf bestimmte Partikel der biologischen Probe positioniert wird und dort die Raman-spektroskopische Analyse durchgeführt wird. Die Kategorisierungs-gesteuerte Positionierung der Messzone wird in einer bevorzugten Variante mehrfach für andere Bereiche der Probe und/oder andere Kategoriekriterien wiederholt.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer „biologischen Probe" eine oder mehrere biologische Zellen, einzeln oder in Zellverbünden, Gewebe, Transplantate, Implantate, Organ- und Gewebeersatzpräparate und Teile davon verstanden. Als biologische Zellen gelten hier vor allem tierische und menschliche Zellen, wie Gewebe-, Embryonalzellen oder Stammzellen, Bakterienzellen und Bakteriensporen, Mykoplasmen, Pilzzellen, -hyphen und -sporen. Dabei muss die biologische Probe nicht notwendigerweise solche Zellen enthalten; der Nachweis in einer biologischen Probe potentiell enthaltener Zellen ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die biologische Probe ist eine potentiell mindestens eine biologische Zelle enthaltende Zusammensetzung; darunter sind auch klinische Proben, Biopsien, sowie flüssige und überwiegend nicht flüssige biologische Proben von Geweben, Transplantaten, Organ- und Gewebeersatzpräparaten und Teilen davon und Rückstände der Sterilfiltration zu verstehen.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird vorliegend unter „Partikel" eine biologische Zelle oder ein Teil einer biologischen Zelle verstanden, die in einer biologischen Probe, beispielsweise in Form einer Flüssigkeit vorliegen kann. Unter „Partikel" werden auch alle individualisierbaren oder kategorisierbaren Zellen oder Zellfragmente, die in biologischen Proben, besonders in Zellverbünden, Geweben, Transplantaten, Implantaten, Organ- und Gewebeersatzpräparaten oder Teilen davon vorhanden sind, verstanden.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer „biologischen Flüssigkeit" eine Sonderform einer biologischen Probe verstanden, eine potentiell unsterile beziehungsweise mit biologischen Zellen kontaminierte Flüssigkeit oder Suspension, die vor allem im Kontext der Kultivierung biologischer Zellen auftritt. Die in einer solchen biologischen Flüssigkeit vorhandenen biologischen Zellen sind nicht nur Kontaminanten; darunter werden auch die kultivierten biologischen Zellen, beispielsweise Gewebezellen verstanden. Die Zellen werden dabei als Zellverband oder Gewebe oder als Zellsuspension kultiviert. Die biologische Flüssigkeit ist vorzugsweise ausgewählt aus: vor allem biologisch hergestellten, pharmazeutischen Wirkstoffen oder Wirkstoffzusammensetzungen, Kulturmedien von Biofermentern, klinischen Proben, wie Blut, Urin, Liquor, Cerebrospinalflüssigkeit, Blutplasma, Blutserum, Lymphe, Glaskörperflüssigkeit, Schleimhautabstrich, Bronchiallavage und ähnlichem, sowie flüssigen Kulturmedien und Überstände von Gewebekulturen, von Kulturen biologischer Implantate, Organ- und Gewebeersatzpräparate; darunter zählen vor allem Transportmedien, Auftaumedien, Spülmedien und Lagermedien.
  • Die Erfindung ermöglicht also durch die Kombination einer mikrophotographischen Bildanalyse mit einem spektroskopischen Analyseverfahren, die ziel- und zweckgerichtete Reduktion der spektroskopisch zu analysierenden Bereiche der Probe einen enormen Zeitgewinn. Durch die Kategorisierung mittels mikrophotographischer Bildanalyse der biologischen Probe kann die zeitintensive Raman-spektroskopische Analyse der biologischen Probe vorteilhafterweise räumlich auf bestimmte Messzonen der Probe beschränkt werden. Dadurch wird die Gesamtanalysenzeit gegenüber bekannten Verfahren vorteilhafterweise deutlich verkürzt. Je nach Anwendungsgebiet wird die Messzeit (Zeit von Eingabe der biologischen Probe bis zum Ende der Erhebung der Messdaten, beziehungsweise bis zum Erhalt des Analyseergebnisses) auf 48, 24 und bis zu 12 Stunden verkürzt.
  • Dabei ist vor allem vorgesehen, die Auswahl der Messzonen, vorzugsweise anhand vorher festgelegter Kriterien, automatisch durchzuführen, wobei die Auswahl zielgerichtet nach den in der jeweiligen Analyse wesentlich interessierenden Aspekten erfolgt: Ist die Fragestellung der Analyse primär auf die Kontrolle der Kontamination einer Probe mit Keimen gerichtet, so erlaubt die Vorauswahl anhand der Kategorisierung der im mikroskopischen Bild detektierten Keimen wie Bakterien und Pilzzellen oder -sporen die gezielte spektroskopische Analyse solcher Keime.
  • Ist die Fragestellung der Analyse primär auf die Charakterisierung von Vitalität oder Differenzierungsstadium von Gewebezellen gerichtet, so erlaubt die Vorauswahl anhand der Kategorisierung der im mikroskopischen Bild detektierten Gewebezellen, beispielsweise Chondrozyten, die gezielte spektroskopische Analyse dieser Zellen auf „Vitalitätsmarker" beziehungsweise „Gewebetypmarker" die an hand von spezifischen Kennwerten der Raman-Spektrogramme erkennbar sind.
  • Die mikrophotographische Kategorisierung der Partikel erfolgt bevorzugt in die Kategorien „biologische Zelle" und „nicht-biologische Zelle, Artefakt". Innerhalb der Kategorie „biologische Zelle" erfolgt die Kategorisierung bevorzugt in die Kategorien „Bakterienzelle", „Pilzzelle", „Bakterienspore", „Pilzspore" und „(humane) Gewebezelle". In der Kategorie „(humane) Gewebezelle" erfolgt die Kategorisierung bevorzugt in die Kategorien „vitale Zelle" und „nicht-vitale Zelle" und/oder bevorzugt in die Kategorien „differenzierte Zelle" und „dedifferenzierte Zelle".
  • Bevorzugt wird zur Erzeugung der Raman-Streustrahlung eine Anregungsstrahlung mit einer Wellenlänge im nahen Infrarot, vorzugsweise von 785 ± 60 nm beziehungsweise im UV-Bereich von 200 ± 50 nm, eingesetzt.
  • Bevorzugt ist vorgesehen, dass die in Form der bevorzugt linienförmigen Anregungszone fokussierte Anregungsstrahlung bei der Analyse, vorzugsweise schrittweise über die ortsfesten Partikel bewegt wird. Nach jedem Schritt wird vorzugsweise ein neuer Messzyklus durchgeführt. Die in den einzelnen aufeinander folgenden Messzyklen erhaltenen Analysedaten der aus der Anregungszone aufgenommenen Raman-Spektren werden anschließend zu einem ortsaufgelösten Bild lokaler Raman-Spektren zusammengesetzt. Dazu wird erfindungsgemäß bevorzugt eine ortsaufgelöste spektrale Analyse der Raman-Streustrahlung durchgeführt, indem die Raman-Streustrahlung der Anregungszone spektral aufgetrennt wird und mittels eines zweidimensionalen CCD-Array-Detektors detektiert wird.
  • Die Erfindung sieht also bevorzugt vor, die spektrale Analyse der Raman-Streustrahlung durch sequentielles Fokussieren der Anregungsstrahlung in Form mehrerer linienförmiger Anregungszonen [i ... i + n] innerhalb der Messzone auf die biologischen Probe durchzuführen. Durch die Linienfokussierung wird die Messzeit der spektralen Analyse noch weiter verkürzt, weil entlang der linienförmigen Ausdehnung der Anregungszone eine parallele Detektion und Registrierung mehrerer lokaler Raman-Spektren gleichzeitig möglich ist.
  • Demgemäß wird die Spektralanalyse der Raman-Streustrahlung bevorzugt durchgeführt durch ein ortsaufgelöstes spektrales Analysieren mittels zweidimensionalem CCD-Array-Detektor, wobei in der ersten Dimension des CCD-Arrays eine (erste) linienförmige Anregungszone i ortstreu entlang ihrer Längsausdehnung abgebildet wird und in der zweiten Dimension des CCD-Arrays die spektrale Verteilung der Raman-Streustrahlung von jedem Punkt entlang der Längsausdehnung dieser (ersten) Anregungszone abgebildet wird und die lokalen Raman-Spektren ortsaufgelöst getrennt registriert werden.
  • Die örtsaufgelöste spektrale Analyse der gesamten Messzone erfolgt bevorzugt in einem interativen Prozess, wobei in einem ersten Messzyklus die erste Schar lokaler Raman-Spektren in der ersten Anregungszone i registriert werden und in einem zweiten nachfolgenden Messzyklus eine zweite Schar lokaler Raman-Spektren einer an die erste Anregungszone i örtlich angrenzenden zweiten Anregungszone i + 1 registriert werden. Dazu wird zwischen den Messzyklen der linienförmige Fokus der Anregungsstrahlung von einer ersten Position relativ zu der in der Messzone fixierten biologischen Probe zu einer zweiten Position hin bewegt. Weitere Messzyklen werden für weitere örtlich angrenzende Anregungszonen i + n wiederholt, wobei zwischen den Messzyklen der linienförmige Fokus der Anregungsstrahlung immer zu einer nächsten Position geführt wird. Dabei werden die Scharen der lokalen Raman-Spektren aller Anregungszonen [i ... i + n] zu einem Gesamtbild ortsaufgelöster spektraler Verteilungsmuster der in der Messzone fixierten biologischen Probe zusammengesetzt (line-scan).
  • Die Erfindung sieht vor, mittels der mikroskopischen Bilddaten der Partikel individuelle Partikel zu lokalisieren, zu charakterisieren und gegebenenfalls mittels Mustervergleich zu identifizieren. Die aufgenommenen Bilddaten werden bevorzugt geometrisch analysiert, wobei Bild-Kennwerte erhalten werden. Die Bildanalyse erfolgt in an sich bekannter Weise, vorzugsweise mittels softwareimplementierter Feature-Detektoren und Mustererkennung. Aus den Bildkennwerten kann vor allem eine erste Kategorisierung oder Typisierung der Partikel erfolgen.
  • Weiter ist vorgesehen, dass die Bilddaten mit den von den so lokalisierten Partikeln parallel aufgenommenen lokalen Raman-Spektren korreliert werden. Vorzugsweise werden die Raman-Spektren eines optisch lokalisierten Partikels zur Charakterisierung des Partikels herangezogen. So wird vorteilhafterweise eine individualisierte Charakterisierung und gegebenenfalls Identifizierung der Partikel aufgrund charakteristischer Raman-Spektren, aufgrund charakteristischer Morphologie sowie bevorzugt aus der Kombination der aus der Bildanalyse und der Spektralanalyse gewonnenen Erkenntnisse charakterisiert, spezifiziert und identifiziert.
  • Aus den erhaltenden mikroskopischen Bilddaten und mindestens einem Raman-Spektren werden bevorzugt in mindestens einem weiteren Schritt die in der Messzone analysierte biologische Probe oder Partikel charakterisiert. Dies erfolgt in einer bevorzugten Variante durch Ermitteln von typischen Kennwerten aus dem mindestens einen Raman-Spektrum und Vergleichen der ermittelten typischen Spektrum-Kennwerte mit hinterlegten bekannten Spektrum-Kennwerten. In einer anderen bevorzugten Variante erfolgt die Charakterisierung durch Ermitteln von typischen Kennwerten aus den mikrophotographischen Bilddaten und Vergleichen der ermittelten Bild-Kennwerte mit hinterlegten bekannten Bild-Kennwerten. In einer anderen bevorzugten Variante erfolgt die Charakterisierung durch die Kombination der Ergebnisse der Kennwertvergleiche von Spektrum-Kennwerten und Bild-Kennwerten.
  • Bevorzugt erfolgt, bevorzugt nach zuvor festgelegten Kriterien, aus dem Vergleich der ermittelten Kennwerte die Charakterisierung der biologischen Probe oder darin enthaltenen Partikel. Bevorzugte Parameter der Charakterisierung sind: Gattung, Spezies, Differenzierungsgrad, Vitalität und chemische Zusammensetzung.
  • Die Erfindung stellt ein optisch-spektroskopische Verfahren zur Analyse biologischer Flüssigkeiten bereit, das zumindest folgende Schritte umfasst: bevorzugt reversibles Fixieren der biologischen Probe in einer Probenhalteeinheit; Kategorisieren der in der biologischen Probe gegebenenfalls enthaltenen Partikel durch: mikrophotographisches Aufnehmen der biologischen Probe und/oder der enthaltenen Partikel und Analysieren der Bilddaten mittels automatischem Mustererkennungsprozess; und Raman-spektroskopische Analyse der biologischen Probe innerhalb einer im Bereich der biologischen Probe positionierbaren Messzone durch: Anregung von Raman-Streustrahlung durch Fokussieren einer Anregungsstrahlung in der Messzone und Detektieren der von der biologischen Probe in der Messzone emittierten Raman-Streustrahlung und Analysieren der spektralen Verteilung der Raman-Streustrahlung, wobei mindestens ein Raman-Spektrum von der biologischen Probe erhalten wird, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass das reversible Fixieren der biologischen Probe erfolgt, indem die biologische Probe die Probenhalteeinheit durchströmt oder dort eingespritzt wird, wobei in der biologischen Probe gegebenenfalls enthaltende Partikel in der Messzone zurückgehalten und dort reversibel, zumindest für die Dauer der Analyse, fixiert werden. Dabei ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass die biologische Probe eine biologische Flüssigkeit ist und die Probenhalteeinheit als so genannte Fluidzelle ausgebildet ist.
  • Die Partikel werden mit der biologischen Flüssigkeit in die Fluidzelle gespült und dort mittels geeigneter Mittel in der Fluidzelle zurück- oder festgehalten. Die Erfindung sieht vor, den oder die in der Fluidzelle zurück- oder festgehaltenen Partikel mittels Raman-Spektroskopie, und bevorzugt zusätzlich mittels optischer Mikroskopie, vorzugsweise als differentieller Interphasenkontrast (DIC), zu detektieren und vorzugsweise zusätzlich zu charakterisieren.
  • Das Verfahren sieht weiter vor, dass die Partikel in der Fluidzelle vorkategorisiert werden. Dies erfolgt bevorzugt durch: Auftrennen der Partikel nach ihrer Größe an mehreren der Fluidzelle in Durchströmungsrichtung hintereinander geschalteten Lochplatten mit unterschiedlichen Durchbrechungsdurchmessern. Das Verfahren sieht so eine quasi zwei- oder mehrstufige Vorauswahl oder Vorselektion der jenigen Probenbereiche oder Partikel vor, bevor, nachfolgend oder zeitgleich, die spektroskopische Analyse der Vorauswahl stattfindet. In dieser bevorzugten Variante der Erfindung erfolgt also in einer ersten Stufe eine Vorselektion nach der Größe und in einer letzten Stufe eine Selektion nach der Kategorie.
  • In einem bevorzugten weiteren Schritt erfolgt der Nachweis einer gegebenenfalls vorhandenen Kontamination der biologischen Flüssigkeit anhand erfindungsgemäß ermittelter Spektrum- und/oder Bild-Kennwerte, wobei ausreichende Übereinstimmung von Kennwerten das Vorhandensein infektiöser Partikel in der biologischen Flüssigkeit nachgewiesen ist und bei fehlender Übereinstimmung der Kennwerte die Abwesenheit einer Kontamination der biologischen Flüssigkeit nachgewiesen ist.
  • Die Erfindung sieht also vor: Eine Fluidzelle wird mit der zu analysierenden biologischen Flüssigkeit durchströmt und dabei werden in der biologischen Flüssigkeit enthaltene Partikel, das heißt besonders biologische Zellen, in der Fluidzelle zurückgehalten, vorzugsweise festgehalten. Dies geschieht vorzugsweise zeitweilig, bevorzugt zumindest für die Dauer der Analyse; für die Analyse werden die in der Fluidzelle zurück- beziehungsweise festgehaltenen Partikel mit einer Anregungsstrahlung bestrahlt, die eine unelastische Streustrahlung, das heißt Raman-Streustrahlung, in den bestrahlten Partikeln anregt. Zur Analyse wird weiter die von den bestrahlten Partikeln emittierte Raman-Streustrahlung detektiert und die spektrale Verteilung der Raman-Streustrahlung analysiert, wobei zumindest ein Raman-Spektrum erhalten wird. Von dem mindestens einen Raman-Spektrum wird einer und bevorzugt werden mehrere, vorzugsweise charakteristische, Kennwerte ermittelt, und die ermittelten Kennwerte werden mit bekannten und hinterlegten Kennwerten, vorzugsweise nach an sich bekannten Analyseverfahren, verglichen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt, dass bei ausreichender Übereinstimmung der ermittelten Kennwerte mit den hinterlegten Kennwerten das Vorhandensein von Partikeln, vorzugsweise infektiösen Partikeln, wie Bakterien, Zellen, Bakteriensporen, Pilzzellen oder Pilzsporen, in der biologischen Flüssigkeit nachgewiesen ist; bei fehlender Übereinstimmung der Kennwerte ist die Abwesenheit einer Kontamination der biologischen Flüssigkeit mit infektiösen Partikeln, das heißt die Sterilität, nachgewiesen.
  • In einer anderen bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch den erfindungsgemäßen Kennwertvergleich, bei ausreichender Übereinstimmung bestimmter Kennwerte, der zurückgehaltene Partikel charakterisiert, das heißt vor allem der Zelltyp, Zellspezies und/oder der Differenzierungsgrad der Zelle bestimmt, sodass das Vorhandensein einer bestimmten Zellspezies beziehungsweise einer Zelle mit einem bestimmten Differenzierungsgrad in der biologischen Flüssigkeit nachgewiesen ist. Das erfindungsgemäße Verfahren dient damit vorteilhafterweise der laufenden Sterilitätskontrolle in biologischen Flüssigkeiten und/oder der Bestimmung und Charakterisierung, besonders der Bestimmung des Differenzierungsgrads, der in einer biologischen Flüssigkeit gegebenenfalls enthaltenen biologischen Zellen.
  • Die Erfindung ermöglicht vorteilhafterweise, dass sowohl bei der Medikamentenentwicklung, als auch bei der Bereitstellung individueller Therapeutika, das heißt beispielsweise biologischer Implantate und Gewebepräparate, primär biologische Flüssigkeiten untersucht werden können, ohne dass die Zusammensetzung der untersuchten biologischen Flüssigkeit verändert oder verschlechtert wird. Besonders werden die in der biologischen Flüssigkeit gegebenenfalls enthaltenen Partikel, das heißt besonders biologische Zellen, besonders Gewebezellen, in ihren Vitalfunktionen nicht beeinflusst und in ihrer Integrität nicht gestört. Dies wird vor allem dadurch ermöglicht, dass biologische Zellen in ihrer „natürlichen" Umgebung, das heißt in der biologischen Flüssigkeit, die in den meisten Fällen das Kultivierungsmedium der Zellen ist, gemessen werden können, wobei die Zellen, bevorzugt ausschließlich, für die Dauer der Messung beziehungsweise Analyse in der erfindungsgemäßen vorgesehenen Fluidzelle zurück- beziehungsweise festgehalten werden.
  • Die Erfindung erlaubt weiter, dass eine Raman-spektroskopische Analyse zur Detektion und gegebenenfalls Charakterisierung der in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenen biologischen Zellen in einem laufenden Produktions- oder Kultivierungsprozess, bevorzugt kontinuierlich oder quasi-kontinuierlich, durchgeführt werden kann, ohne dass Teile beziehungsweise Proben aus dem Prozess entnommen und getrennt analysiert und anschließend verworfen werden müssen. In einer bevorzugten Variante ist deshalb die erfindungsgemäße Vorrichtung in eine Produktionskette, vorzugsweise im Nebenstrom, so integriert, dass, beispielsweise während der Produktion oder Aufreinigung biologisch produzierter Wirkstoffe, im Fermentationsprozess oder bei der Kultivierung von Gewebetransplantaten, die Sterilität, die Gegenwart einer Fremdkontamination beziehungsweise der Zelldifferenzierungsgrad laufend untersucht werden kann.
  • Weiter besteht der Vorteil, dass man bei der Sterilitätskontrolle von Gewebetransplantaten bereits zum Zeitpunkt der Implantation in den Patienten Aussagen treffen kann, ob das Implantat kontaminiert ist oder nicht. Bei Detektion einer Kontamination inzwischen bereits implantierter Präparate kann in vergleichsweise kurzer Zeit eine differenzierte Diagnose gestellt werden, und es kann gegebenenfalls der, im Rückschluss, höchstwahrscheinlich erkrankte Patient gezielt gegen den bestimmten Erreger behandelt werden. Ein weiterer Vorteil ist auch die Integrierbarkeit von erfindungsgemäßem Sterilitätstest, differenzierter Diagnose und Bestimmung der Vitalität beziehungsweise Viabilität der Zellen und des Implantates in einer Anordnung beziehungsweise mit einem kombinierten Verfahren, wodurch in dem Falle von autologen Transplantaten die gesamte notwendige Bandbreite der Analysemethoden abgedeckt ist.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren sieht vor, dass die gegebenenfalls in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen und zu analysierenden Partikel in der Fluidzelle durch mindestens eine in der Fluidzelle angeordnete Lochplatte mit einer oder mehreren Durchbrechungen durchgehalten werden. Diese Durchbrechungen sind in der Lochplatte strukturiert angeordnet. Es wird hier auf die untenstehenden Ausführungen verwiesen. Das Verfahren sieht dabei besonders bevorzugt vor, dass die Partikel aus der biologischen Flüssigkeit auf der Oberseite der Lochplatte zurückgehalten werden. Dies wird bevorzugt dadurch gewährleistet, dass durch Anlegen eines Unterdrucks an der gegenüberliegenden Seite der Lochplatte die in der biologischen Flüssigkeit vorhandenen Partikel an die Durchbrechungen an der Oberseite der Lochplatte quasi „angesogen" werden und im Bereich oder auf den Durchbrechungen festgehalten werden. Erfindungsgemäß werden die Partikel an der Lochplatte zumindest zeitweilig fest gehalten; bevorzugt zumindest für die Dauer der Analyse. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass der Unterdruck etwa für die Zeitdauer des Festhaltens angelegt wird.
  • Das Verfahren sieht dabei im einzelnen weiter vor, dass die Partikel in der Fluidzelle durch mindestens eine in der Fluidzelle angeordnete Lochplatte mit mehreren Durchbrechungen zurückgehalten werden. Bevorzugt werden die Partikel aus der biologischen Flüssigkeit und auf der „Oberseite" der Lochplatte festgehalten durch, gegebenenfalls zeitweiliges, Anlegen eines dynamischen und/oder statischen Druckgefälles in Richtung der gegenüberliegenden „Unterseite" der Lochplatte. Darunter wir vor allem verstanden, dass eine Druckdifferenz zwischen der Oberseite der Lochplatte und der gegenüberliegenden Unterseite der Lochplatte, die über die mindestens eine in der Lochplatte vorgesehene Durchbrechung kommunizieren, hergestellt wird. Dies wird einer bevorzugten Variante erreicht, indem zumindest ein Teil der an der Oberseite der Lochplatte sich befindlichen oder vorbei fließenden Partikel enthaltenden biologischen Flüssigkeit über die mindestens eine Durchbrechung über die Lochplatte hinweg nach unten abgesaugt wird. In einer alternativen Variante die druckbeaufschlagte biologische Flüssigkeit auf der Oberseite der Lochplatte zumindest teilweise über die mindestens eine Durchbrechung über die Lochplatte hinweg nach unten hin drainiert. Das Anlegen des Unterdrucks geschieht vorzugsweise in einem Betriebszustand, in dem die biologische Flüssigkeit die Fluidzelle durchströmt und damit an der Oberseite der Lochplatte entlangströmt. In einer alternativen Variante wird der Unterdruck angelegt in einem Betriebszustand, in dem kein Nettofluss der biologi schen Flüssigkeit durch die Fluidzelle und entlang der Oberfläche der Lochplatter erfolgt.
  • In einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Variante durchströmt die biologische Flüssigkeit die Lochplatte im Hauptstrom, wodurch die gegebenenfalls in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen Partikel entsprechend der geometrischen Verhältnisse von Durchbrechungsdurchmesser und Partikelgröße an der stromaufwärts gerichteten Seite der Lochplatte festgehalten werden, indem sie quasi aus der biologischen Flüssigkeit „filtriert" werden. Der Fachmann wählt je nach Anwendungsgebiet und konkretem geometrischen Aufbau der Fluidzelle das geeignete Verfahren oder kombiniert mehrere bevorzugte Verfahrensvarianten, ohne dass die Lehre der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
  • Bevorzugt wird die Anregungsstrahlung auf mindestens einem der in der Fluidzelle zurückgehaltenen Partikel in einer lokalen Anregungszone fokussiert. Besonders bevorzugt ist diese Anregungszone linienförmig (Linienfokus), sodass gleichzeitig eine Reihe von nebeneinander in der Messzone, das heißt in der Fluidzelle beziehungsweise Kulturschale zurück- beziehungsweise festgehaltenen Partikeln zur Emission der Raman-Streustrahlung angeregt werden.
  • Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird auch gelöst durch die Bereitstellung einer Vorrichtung, die vor allem zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens geeignet ist. Die im Zusammenhang mit den nachfolgenden Vorrichtungen beschriebenen Vorgehensweisen, Parameter und Verfahrensschritte sind ebenfalls bevorzugte Merkmale der vorstehend beschriebenen Verfahren.
  • Eine Vorrichtung zur optisch-spektroskopischen Analyse biologischer Proben gemäß dieser Erfindung enthält zumindest folgende Elemente:
    • – Probenhalteeinheit zur ortsfesten Fixierung der biologischen Probe in einer Messzone;
    • – Anregungsstrahlungseinheit, geeignet zur Anregung von Raman-Streustrahlung mittels Anregungsstrahlung in einer Anregungszone auf innerhalb der Messzone; und
    • – Analyseeinheit, geeignet zur spektralen Analyse der in der Anregungszone von der biologischen Probe emittierten Raman-Streustrahlung.
  • Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass
    • – die Probenhalteeinheit eine von der biologischen Probe durchfließbare Fluidzelle ist, wobei die Fluidzelle Mittel aufweist, die geeignet sind zum Zurückhalten und reversiblen zeitweiligen Fixieren von in der biologischen Probe gegebenenfalls enthaltenen Partikeln, wobei die Fluidzelle als Mittel zum Zurückhalten der Partikel mindestens eine erste Lochplatte mit mehreren Durchbrechungen mit erstem Durchmesser aufweist und wobei die Durchbrechungen in der Lochplatte strukturiert in Form eines regelmäßigen und adressierbaren Musters zeilen- und spaltenweise angeordnet sind.
  • Die Vorrichtung enthält also zumindest folgende Elemente: zumindest eine Fluidzelle, die von der biologischen Probe in Form einer biologischen Flüssigkeit durchflossen werden kann, wobei die Fluidzelle als Mittel zum zeitweiligen Zurückhalten, besonders zum Festhalten der Partikel, zumindest eine Lochplatte mit mehreren regelmäßig ange ordneten Durchbrechungen aufweist; die Partikel sind an dem Mittel zumindest für die Dauer der spektroskopischen und gegebenenfalls mikroskopischen Analyse immobilisiert; zumindest eine Anregungsstrahlungseinheit, die in der Lage ist, eine Anregungsstrahlung zu erzeugen, wodurch bei in der Fluidzelle zurück- oder festgehaltenen Partikeln Raman-Streustrahlung angeregt werden kann; zumindest eine Analyseeinheit, die geeignet ist, die von den Partikeln emittierte Raman-Streustrahlung spektral aufzutrennen und das Raman-Spektrum zu erfassen (spektrale Analyse).
  • Gemäß der Erfindung ist die Fluidzelle vorzugsweise so ausgestaltet, dass mit der biologischen Probe in die Fluidzelle eintretende Partikel, also mögliche biologische Zellen als Kontaminanten oder Gewebezellen, aber auch mögliche Artefakte, in der Fluidzelle zurückgehalten und vor allem dort an bestimmter Position festgehalten werden können. Dies wird erfindungsgemäß ermöglicht durch mindestens eine in der Fluidzelle vorgesehene Lochplatte oder Locharray mit mehreren Durchbrechungen oder Poren, vorzugsweise so genannte Mikroporen. Bevorzugt sind die Durchbrechungen oder Poren von kreisrundem oder nahezu kreisrundem Querschnitt. In einer bevorzugten Variante sind die Durchbrechungen linien- oder spaltförmig ausgebildet. Dabei ist die Lochplatte, gleich einem Filternetz, befähigt, Partikel aus der durch die Fluidzelle strömenden flüssigen biologischen Probe zurückzuhalten. Vorzugsweise ist der Durchmesser beziehungsweise die Abmessungen der Durchbrechungen in der Lochplatte so gewählt, dass Partikel, beziehungsweise biologische Zellen aufgrund ihrer Größe im Wesentlichen nicht durch die Durchbrechungen treten können und in der Fluidzelle zurückhaltbar sind. Bevorzugt kann in einer einzelnen Durchbrechung mindestens ein, vorzugsweise genau ein, solcher Partikel zurück- oder festhaltbar.
  • Die erfindungsgemäße Fluidzelle zeichnet sich dadurch aus, dass zumindest die eine Lochplatte oder Locharray strukturiert angeordnete Durchbrechungen aufweist. Die Durchbrechungen sind erfindungsgemäß in einem regelmäßigen Muster (Array) angeordnet, wobei vorzugsweise das Verhältnis von mittlerem Abstand der Durchbrechungen zueinander (Lochabstand, Rastermaß) zum Durchmesser der Durchbrechung so gewählt ist, dass an einer, vorzugsweise an jeder einzelnen Durchbrechung, jeweils mindestens ein, vorzugsweise genau ein, Partikel festgehalten werden kann. Vorzugsweise beträgt dieses Rastermaß/Durchmesser-Verhältnis 1,1 bis 20, besonders bevorzugt 5 bis 15, weiter bevorzugt etwa 10. Erfindungsgemäß ist die Lochplatte so ausgebildet, dass die Durchbrechungen oder Poren dort in Form eines regelmäßigen adressierbaren Musters oder Arrays, zeilenweise und spaltenweise, angeordnet sind. Bei einer Größe des Locharrays von etwa 1,6 cm2 (etwa 0,5 × 0,5 inch) sind vorzugsweise etwa 106 Durchbrechungen in Form von Mikrolöchern angeordnet; bei einem Porendurchmesser von 1 μm beträgt das Rastermaß etwa 12 μm. Damit wird gewährleistet, dass die an einer Pore festgehaltene biologische Zelle oder Partikel nicht mit der an einer benachbarten Pore festgehaltenen Zelle oder Partikel überlappt, so dass beide Zellen oder Partikel getrennt optisch analysiert werden können. Es versteht sich, dass bei Lochplatten, die zum Festhalten kleiner biologischer Zellen wie Bakterien das Lochraster kleinere Werte annimmt, als bei Lochplatten zum Festhalten großer (humaner) Sängerzellen. In einer Variante haben die Löcher einen Durchmesser von 1 μm und die Fläche des Locharrays beträgt 10 mm2 (10 × 10 mm). Bei einem Lochraster von 10 μm befinden sich etwa 1.002.000 Löcher im Locharray. Dieses Locharray dient vor allem dem Zurück- oder Festhalten von Bakterienzellen, Pilzsporen und ähnlichem. Solche Lochplatten besitzen vorzugsweise Durchmesser der Durchbrechungen im Bereich von 1 μm oder kleiner, die bevorzugte untere Grenze beträgt 0,2 μm. Das bevorzugte Lochraster beträgt von 2 bis 15 μm, bevorzugt etwa 10 bis 12 μm.
  • In einer anderen bevorzugten Variante einer Lochplatte haben die Löcher einen Durchmesser von 2 μm und ein Lochraster von 20 μm. Dieses Locharray dient vor allem dem Zurück- oder Festhalten von Gewebezellen tierischen oder humanen Ursprungs. Solche Lochplatten besitzen vorzugsweise Durchmesser der Durchbrechungen von 2 μm oder größer, bevorzugt von etwa 2 bis 6 μm. Das bevorzugte Lochraster beträgt 15 μm oder mehr, bevorzugt etwa 15 bis 50 μm.
  • Die für das jeweilige Anwendungsgebiet geeignete Dimensionierung der Lochplatte bestimmt der Fachmann innerhalb der erfindungsgemäß vorgegebenen Grenzen letztlich nach den fluidischen Eigenschaften der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit und anhand der zu analysierenden Partikel.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Fluidzelle mindestens eine zweite oder weitere Lochplatte auf. Diese ist oder sind relativ zur Durchströmungsrichtung der biologischen Probe stromaufwärts zur ersten Lochplatte in der Fluidzelle angeordnet. Die zweite oder weitere Lochplatte weist ebenfalls eine und bevorzugt mehrere Durchbrechungen auf. Für die Anordnung der Durchbrechungen in der zweiten oder weiteren Lochplatte gilt bevorzugt das im Zusammenhang mit der ersten Lochplatte vorstehend beschriebene. Der Durchmesser der Durchbrechungen der zweiten oder weiteren Lochplatte ist bevorzugt größer als der Durchmesser der Durchbrechungen der ersten Lochplatte. Bevorzugt ist das Verhältnis von erstem Durchmesser der Durchbrechungen der ersten Lochplatte und zweitem Durchmesser der Durchbrechungen der zweiten und gegebenenfalls weiteren Lochplatten so gewählt, dass in der biologischen Flüssigkeit enthaltene große Partikel, beispielsweise humane Zellen, von der zweiten und gegebenenfalls weiteren Lochplatte zurückgehalten werden können, während kleinere Partikel, wie Bakterienzellen, Bakteriensporen, Mykoplasmen, Pilzzellen oder Pilzsporen, die zweite und gegebenenfalls weitere Lochplatte im Wesentlichen passieren können und (stromabwärts) in der ersten Lochplatte zurückgehalten werden können.
  • Bevorzugt sind die erste, zweite und gegebenenfalls weitere Lochplatte oder Locharray im Wesentlichen parallel übereinander angeordnet. Durch diese regelrechte Filter- oder Siebanordnung innerhalb der Fluidzelle wird es möglich, die in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen Partikel nach ihrer Größe aufzutrennen und in verschiedenen getrennten, bevorzugt übereinander liegenden ersten, zweiten und gegebenenfalls weiteren Ebenen, die durch die Lochplatten in der Fluidzelle gebildet werden, anzuordnen. Dies erlaubt die nach der Größe aufgetrennten zurückgehaltenen Partikel jeweils getrennt zu untersuchen und bevorzugt Raman-spektroskopisch und bevorzugt zusätzlich lichtmikroskopisch zu untersuchen.
  • Bevorzugt ist zumindest die erste (stromabwärts liegende) Lochplatte oder Locharray im Wesentlichen parallel zur Nettodurchflussrichtung der biologischen Flüssigkeit angeordnet (der Winkel der Flächennormale der Lochplatte zum Vektor des Nettoflusses beträgt etwa 90°), sodass sich in der Probenflüssigkeit vorhandene Partikel in einem ersten Betriebszustand der Fluidzelle auf der Oberseite der Lochplatte entlang bewegen können und in einem zweiten Betriebs zustand die Partikel, vorzugsweise durch einen an der gegenüberliegenden Seite der Lochplatte anlegbaren Unterdruck aus der überströmenden Flüssigkeit, zurückgehalten und an den Durchbrechungen auf der Oberseite der Lochplatte festgehalten werden können. Es ist bevorzugt, dass die in der Fluidzelle zurückhaltbaren Partikel nebeneinander, besonders in einer Ebene, anordenbar sind.
  • Vorzugsweise ist die Fluidzelle mit einer ersten und mindestens einer zweiten Lochplatte oder Locharray so ausgestaltet, dass in der von der zweiten Lochplatte gebildeten Ebene Partikel in der Größe von mindestens 2 μm festgehalten werden und in einer Linie angeordnet werden können, sodass im Fokus der Anregungsstrahlung die Messung der Zellen erfolgen kann. In der stromabwärts liegenden ersten Lochplatte können Partikel einer Größe von kleiner als 2 μm und größer als 1 μm festgehalten werden, die bereits die zweite Lochplatte passiert haben. Darunter befinden sich vor allem Bakterien, Pilze, Mykoplasmen sowie Bakteriensporen und Pilzsporen, die sämtlich als „infektiöse Partikel" die Kontamination einer untersuchten biologischen Flüssigkeit anzeigen können. In dieser Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist vorgesehen, dass die Anregungsstrahlung auf die in der stromabwärts gelegenen („unteren") ersten Lochplatte festhaltbaren Partikel fokussierbar ist. So wird es vorteilhafterweise möglich, in einer einzigen Messanordnung sowohl größere Partikel, beispielsweise Gewebezellen humanen Ursprungs, und, davon getrennt, kleinere Partikel, vor allem Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze, Sporen, in einer flüssigen biologischen Probe zu analysieren.
  • In einer bevorzugten weiteren Ausführungsform ist in der Fluidzelle ein mikrofluidischer Flusskanal vorgesehen. Dieser Flusskanal ist so ausgestaltet, dass in der biologischen Probenflüssigkeit vorhandene Partikel sequenziell oder überwiegend sequenziell durch den Fluss kanal wandern können, wenn und soweit die Fluidzelle von der biologischen Probe durchströmt wird und die Partikel seriell einer Optik zur Klassifizierung und Charakterisierung zugeführt werden können. Ein bevorzugtes zeitweiliges Festhalten der Partikel in der Fluidzelle für die Analyse wird vor allem ermöglicht durch Stoppen des Nettoflusses der biologischen Flüssigkeit durch die Fluidzelle. Vorzugsweise ordnen sich die in der biologischen Flüssigkeit vorhandenen Partikel hintereinander, bevorzugt unmittelbar hintereinander oder im Wesentlichen regelmäßig beabstandet voneinander, in dem mikrofluidischen Flusskanal an. Die Kanalbreite ist der Größe des Fokus der Optiken angepasst. Im Kanal sind bevorzugt zusätzlich Vorrichtungen zur Erzeugung von Kraftfeldern, bevorzugt ausgewählt aus Schallfeldern und elektromagnetischen Feldern, vorgesehen, um die Partikel während der Durchführung des Messverfahrens in Position zu halten. Der Fachmann kennt die Gesetzmäßigkeiten der Mikrofluidik und wird einen solchen Flusskanal ohne Weiteres so dimensionieren, dass er die erfindungsgemäß vorgesehene Funktionsweise erfüllt.
  • In einer bevorzugten Variante sind mehrere, bevorzugt parallel nebeneinander angeordnete, vorzugsweise regelmäßig beabstandete, mikrofluidische Flusskanäle in der Fluidzelle vorgesehen. Dabei ist bevorzugt, dass sich mindestens zwei der mehreren Flusskanäle in Dimension und/oder Ausgestaltung voneinander unterscheiden, sodass jeweils unterschiedliche mikrofluidische Bedingungen in diesen Kanälen vorherrschen können. Diese Bauweise ist bevorzugt geeignet, verschiedene in der biologischen Flüssigkeit vorkommende Partikel gemäß ihrer mikroskopischen oder physikalischen Eigenschaften zu trennen beziehungsweise zu kategorisieren und gegebenenfalls getrennt zu analysieren. Bevorzugt ist in einer Fluidzelle einer erfindungsgemäßen Lochplatte oder Locharray mindestens ein Flusskanal nachgeschaltet, der im Wesentlichen allein, bevorzugt ausschließlich die Partikel, die kleiner als die Löcher der Lochplatte sind, seriell einer Optik zur Klassifizierung und Charakterisierung zuführt.
  • Die Probenhalteeinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann als Kulturschale mit dünnem, optisch durchlässigem Material ausgeführt sein, damit die Fokussierung der Anregungsstrahlung in der biologischen Probe erfolgen kann. In einer bevorzugten Variante ist zur Analyse einer kleinen Gewebeprobe (von 1 bis 2 mm2) als Probenhalteeinheit eine übliche oben offene Zellkulturplatte oder Zellkulturplatte für die Mikroskopie oder eine Petrischale mit dünnem optisch nicht brechenden Kunststoff- oder Glasboden vorgesehen.
  • Es ist also vorgesehen, dass zumindest die im Strahlengang der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegenden Teile der, also vor allem Fluidzelle beziehungsweise Kulturschale, aus strahlungsdurchlässigem, beziehungsweise lichtdurchlässigem Material gefertigt sind. Bevorzugte Materialien sind ausgewählt aus: Silikatglas, Quartzglas, Siliziumglas, Siliziumoxidglas, Siliziumnitridglas, Kalziumfluoridglas, Bariumfluoridglas, Zinkselenidglas, Zinksulfidglas und Germaniumglas. Bevorzugt ist hier vor allem Siliziumnitrid. Die Erfindung ist nicht auf diese Materialien beschränkt; der Fachmann wird ähnliche, für den Zweck geeignete Materialien, vor allem alle optisch klaren, möglichst wenig brechenden, möglichst wenig chromatisch dispergierenden und sowohl im Bereich der Wellenlänge der Anregungsstrahlung als auch im Bereich der emittierten und zu detektierenden Raman-Streustrahlung möglichst durchlässigen Materialien in Betracht ziehen. Diese sind von der erfindungsgemäßen Lehre mitumfasst. Solche weiteren Materialien sind insbesondere synthetische Polymere wie Polyacryle, Polyethylene, Ethylen/Propylen-Copolymere, Polystyrene, Polyamide und Polycarbonate.
  • Weiter ist vorgesehen, die Probenhalteeinheit an der Oberfläche mit Metall oder Metallkolloiden zu beschichten oder anzureichern, und zwar zumindest im Kontaktbereich mit der biologischen Probe, beziehungsweise die Lochplatte der Fluidzelle, zumindest im Bereich der Durchbrechungen oder Poren, wo die Partikel festgehalten werden können, mit Metall oder Metallkolloiden zu beschichten oder anzureichern. Die Bindung des Metalls geschieht in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch lokale Derivatisierung der Oberfläche. Besonders bevorzugt ist die Anreicherung der Kulturschalenoberfläche beziehungsweise der Lochplattenoberfläche mit Goldkolloiden. Um die Raman-spektroskopische Analyse von im Bereich der Durchbrechungen festgehaltenen Partikel gegenüber sich sonstwo auf oder im Bereich der Lochplatte befindlichen Partikeln zu verbessern, ist vorgesehen, das Metall oder Metallkolloide allein im Bereich der Durchbrechungen auf die Lochplatte aufzubringen.
  • Die elektronischen Eigenschaften der Metalle sind geeignet, die Raman-Emissionen der bestrahlten biologischen Probe, biologischen Zelle beziehungsweise der zurück- und festgehaltenen Partikel zu erhöhen (SERS, Surface-Enhanced-Raman-Spectroscopy). Durch die Intensitätssteigerung nach den an sich bekannten Prinzipien lässt sich die Integrationszeit der Detektion verkürzen. Dies stellt einen weiteren Aspekt der erfindungsgemäßen Lösung zur Verkürzung der Mess- oder Analysezeit dar. Außerdem ermöglicht die Kombination mit SERS eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Detektion weiterer möglicher charakteristischer Banden im Raman-Spektrum.
  • Bevorzugt weist die Anregungsstrahlungseinheit mindestens eine Lichtquelle zur Erzeugung der Anregungsstrahlung auf. Bevorzugt ist diese Lichtquelle mindestens ein Laser mit quasi monochromatischem Emissionsspektrum. Alternativ ist die Lichtquelle eine Gasentladungslampe und/oder eine Glühemissionslampe, beispielsweise Wolframlampe oder Nernst-Stift, wobei bevorzugt zur Einengung des Emissionsspektrums dieser Lampen ein geeigneter Monochromator, beispielsweise ein optisches Gitter oder eine Kombination mehrerer optischer Gitter vorgeschaltet ist. Bevorzugt weist die Anregungsstrahlungseinheit so genannte Plasmalinefilter oder entsprechende Mittel zum Filtern der Hauptwellenlänge auf. Weiter bevorzugt weist die Anregungsstrahlungseinheit mindestens einen so genannten Bandpassfilter oder entsprechende Mittel zur Parallelisierung von Laserlicht auf.
  • In einer bevorzugten Variante weist die Anregungsstrahlung eine spektrale Verteilung im nahen Infrarot-Bereich auf. Bevorzugt sind Wellenlängen von 700 bis 1200 nm. Besonders bevorzugt weist die Anregungsstrahlung eine Wellenlänge von etwa 785 ± 60 nm, bevorzugter 785 ± 30 nm, 785 ± 10 nm und am meisten bevorzugt von etwa 785 nm auf. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, weist dieser Wellenlängenbereich für die Raman-Spektroskopie lebender biologischer Zellen in flüssigen Medien oder in Zellverbänden oder Geweben eine Reihe von Vorteilen auf: Die Absorption der Anregungsstrahlung im flüssigen Medium ist tolerierbar gering, die unerwünsch te Emission von Fluoreszenzstrahlung ist tolerierbar gering, der schädigende Einfluss auf Struktur und Lebensfunktion der bestrahlten lebenden Zellen ist minimal. Gleichzeitig erleichtert die in diesem Wellenlängenbereich angeregte Raman-Streustrahlung die Aufnahme zellspezifischer Raman-Spektren (so genannter „fingerprint"-Bereich).
  • In einer weiteren Variante der Erfindung ist eine Anregungsstrahlung im UV-Bereich vorgesehen. Bevorzugte Wellenlängen sind 200 ± 50 nm. Die nachfolgenden Ausführungen gelten somit auch für die UV-Raman-Spektroskopie, wobei Strahlungsintensitäten, Materialauswahl der optischen Medien und Detektorenempfindlichkeiten gegenüber einer IR-Spektroskopie entsprechend angepasst werden.
  • Um die Messzeit zur Detektion und Erfassung des Raman-Spektrums weiter zu verringern (zeitliche Integration), soll möglichst eine Anregungsstrahlung hoher Intensität verwendet werden. Dies wird vorzugsweise durch die Verwendung eines Hochenergielasers mit einer Anregungsenergie von mehr als 50 mW, besonders bevorzugt im Bereich von 50 bis 500 mW, erreicht. In einer bevorzugten Variante wird ein Laser mit etwa 100 mW verwendet. Bevorzugt sind Diodenlaser. Der Fachmann erkennt, dass die auf die bestrahlten Partikel wirkende Strahlungsenergie vom konkret verwendeten optischen System und der optischen Anordnung abhängt. Je nach optischem Aufbau sind gegebenenfalls Lichtquellen mit höherer oder entsprechend niederer Strahlungsenergie erforderlich. Die auf die biologische Zelle während der Messung eingestrahlte Strahlungsenergie ist nach unten hin begrenzt durch die Messzeit und das Signal/Rausch-Verhältnis des verwendeten Detektors für die Raman-Streustrahlung: Sie ist nach oben hin begrenzt durch die bei höherer Energie einsetzenden nachteiligen Auswirkungen auf Integrität und Lebensfunktion der bestrahlten Zelle. Bevorzugt sind Strahlungsenergien (berechnet für den Ort der bestrahlten Zelle und integriert über die Bestrahlungsdauer) von mindestens etwa 10 Joule bis maximal etwa 300 Joule, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 200 Joule.
  • Bevorzugt weist die Vorrichtung weiter mindestens eine Linienfokussierungseinheit auf. Diese ist geeignet zur Fokussierung der in der Anregungsstrahlungseinheit erzeugten Anregungsstrahlung auf der biologischen Probe, vor allem auf die in der Probe zu analysierenden biologischen Zellen oder Partikel, in Form einer im Wesentlichen linienförmigen Anregungszone.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung weißt so den Vorteil auf, die Messzeiten zu reduzieren, da mehrere Punkte entlang der linienförmigen Anregungszone gleichzeitig gemessen werden können. Im Gegenzug ist deshalb vorgesehen, die Laserleistung entsprechend zu reduzieren, wodurch die untersuchten lebenden biologischen Zellen noch besser geschont werden. Die Linienfokussierung erlaubt gleichzeitig die ortsaufgelöste Messung mittels so genanntem „line scan", sodass letztlich vorteilhafterweise einzelne Partikel oder biologische Zellen in der Messzone individualisiert analysiert werden können.
  • Bevorzugt wird der Linienfokus mittels mindestens einer zylinderförmigen Linse im Strahlengang der Anregungsstrahlung realisiert. Der Fachmann wird erkennen, dass auch weitere Maßnahmen zur Erzeugung eines Linienfokus geeignet sind, die erfindungsgemäß vorgesehene Linienfokussierungsanordnung zu realisieren.
  • Bevorzugt weist die Linienfokussierungsanordnung zumindest einen so genannten Beamexpander für die verbesserte Fokussierung der Anregungsstrahlung auf. Bevorzugt ist die Fokussierungsanordnung so ausgebildet, dass der fokussierte Strahl der Anregungsstrahlung in einem Winkel von 30° oder weniger auf die Flächennormale der Messzone trifft.
  • Vorzugsweise ist die Linienfokussierungsanordnung geeignet, die linienförmige Anregungszone über die in der Messzone ortsfest angeordneten Partikel oder biologischen Zellen zu bewegen. Dies wird ermöglicht durch mindestens eine an der Linienfokussierungsanordnung vorgesehene Scannereinheit, die in an sich bekannter Weise aufgebaut ist. Der Fachmann kennt geeignete Maßnahmen und Mittel, eine solche Scannereinheit zu realisieren. Bevorzugt ist die Linienfokussierungsanordnung so mit der Scannereinheit verbunden, dass ein Bewegen der linienförmigen Anregungszone im Wesentlichen senkrecht zu ihrer Längsausdehnung bewegbar ist. Als Scannereinheit ist bevorzugt ein akusto-optisch abstimmbares Filter (AOTF) eingesetzt. Dieses weist nach Bauart und Funktionsweise keine beweglichen optischen Teile auf. In einer bevorzugten Variante ist die Messzone mit den Partikeln oder biologischen Zellen relativ zu einem ortsfesten Fokusstrahl bewegbar. Vorzugsweise wird dies realisiert durch einen motorisierbaren Probenhalter oder Objekttisch, womit die Kulturschale ortsfest verbunden ist. Hier eignen sich beispielsweise Piezo-betriebene Systeme.
  • In bevorzugter Ausführung ist die erfindungsgemäße Analyseeinheit ein CCD (charge coupled device)-basierter Raman-Spektrograph, der zumindest folgende Elemente enthält:
    mindestens ein optisches Gitter oder ähnliches Mittel zur spektralen Auftrennung der in der Anregungszone emittierten Raman-Streustrahlung;
    mindestens ein zweidimensionales CCD-Array zur ortsaufgelösten elektrischen Detektion, gegebenenfalls zur bildgebenden Registrierung der spektral aufgetrennten Streustrahlung; und
    mindestens eine optische Anordnung zur Abbildung der spektral aufgetrennten Streustrahlung auf dem zweidimensionalen CCD-Array.
  • Die Analyseeinheit ist vorzugsweise als Raman-Spektrograph nach Czerny-Turner ausgebildet. Alternativ bevorzugt ist der Raman Spektrograph ein linsenbasiertes System. Die Analyseeinheit ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass die optische Anordnung zur ortsaufgelösten Abbildung der spektral aufgetrennten Streustrahlung einer linienförmigen Anregungszone derart auf dem zweidimensionalen CCD-Array abgebildet ist, dass in der ersten Dimension des CCD-Arrays die bevorzugt linienförmige Anregungszone ortstreu entlang ihrer Längsausdehnung abgebildet ist und in der zweiten Dimension des CCD-Arrays die spektrale Verteilung der Streustrahlung von jedem Punkt entlang der Längsausdehnung bevorzugt der linienförmigen Anregungszone abgebildet ist. Dieser Aufbau erlaubt vorteilhafterweise, besonders in Verbindung mit dem Linescanverfahren, eine ortsaufgelöste Reproduktion der Messzone, worin die zu analysierenden Partikel oder biologischen Zellen angeordnet sind. Die ortstreue Repräsentation der Daten der lokalen Raman-Spektren von den Partikeln oder biologischen Probe in der Messzone erfolgt in Form eines drei- und vorzugsweise vierdimensionalen Arrays, wobei die ersten beiden Dimensionen der Breiten- und Längsausdehnung der Messzone entsprechen. In der dritten und gegebenenfalls vierten Dimension sind entsprechend von jedem Ort des analysierten Bereichs die lokalen Raman-Spektren in Form eines charakteristischen Kennwerts oder „Bande" (dritte Dimension) oder bevorzugt die spektrale Verteilung der Intensität (dritte Dimension) nach Wellenlänge beziehungsweise Wellenzahl (vierte Dimension), bevorzugt in Relation zur Anregungswellenlänge, aufgetragen. Dazu werden vorzugsweise im Linescanverfahren in einem ersten Messzyklus die lokalen Raman-Spektren (dritte und vierte Dimension) für die Orte entlang der Längsausdehnung (zweite Dimension) einer ersten Anregungszone gleichzeitig erfasst. In weiteren Messzyklen kann dies für eine zweite und jede weitere Anregungszone entlang der Breitenausdehnung (erste Dimension) der gesamten Messzone weitergeführt werden.
  • Das in der Analyseeinheit zur Registrierung/Detektion und Analyse der emittierten Raman-Streustrahlung vorgesehene CCD-Array (CCD-Chip) ist vorzugsweise so ausgeführt, dass es für den nahinfraroten Bereich beziehungsweise für einen Spektralbereich von Wellenzahl 200 bis 3500 cm–1 besonders empfindlich ist. Der Fachmann sieht hierfür an sich bekannte Maßnahmen vor. Bevorzugt sind Ausführungen von CCD-Arrays mit schneller Messzeit (Integrationszeit) bei gutem Signal/Rausch-Verhältnis, besonders ist dies eine so genannte „open electrode"-CCD, rückgedünnte CCD, Tiefentladungs-CCD („deep depletion”-CCD) oder eine Elektronenvervielfacher-CCD. Um das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern, wird das CCD-Array bevorzugt gekühlt; bevorzugte Kühltemperaturen sind etwa –50°C bis etwa –100°C.
  • Gemäß eines Aspekts der Erfindung weist die Vorrichtung vorzugsweise mindestens eine mikroskop-optische Einheit oder Vorrichtung, das heißt Mikroskopeinheit, zur bildgebenden mikroskopischen oder mikrophotographischen Analyse der in der Messzone erfindungsgemäß zurück- oder festgehaltenen Partikel. Bevorzugt ist diese optische Einheit ein Durchlichtmikroskop mit bevorzugt Wahlweise zuschaltbarer, Phasenkontrastoptik, vorzugsweise für die differentielle Interphasenkontrast-Mikroskopie (DIS), besonders bevorzugt ein Fluoreszenzmikroskop.
  • Bevorzugt weist die Mikroskopeinheit Optiken auf, die eine ausreichende Durchlässigkeit im Wellenlängenbereich der Anregungsstrahlung und im Wellenlängenbereich der emittierten Raman-Streustrahlung besitzen, besonders für diese Wellenlängenbereiche optimiert ist. Vorzugsweise wird die Anregungsstrahlungseinheit über geeignete Maßnahmen in den Strahlengang der Mikroskopeinheit, eingekoppelt. Beispielsweise ist die an einem Fluoreszenzmikroskop herkömmlicher Weise vorgesehene Lichtquelle zur Erzeugung von Fluoreszenz durch die erfindungsgemäße Anregungsstrahlungseinheit ersetzt oder ergänzt.
  • Durch geeignete optische Maßnahmen, insbesondere Sperrfilter wird bevorzugt gewährleistet, dass in der Mikroskopeinheit die Anregungsstrahlung vom Beobachtungsstrahlengang und vom Beleuchtungsstrahlengang des bildgebenden Teils der Mikroskopeinheit und vom Strahlengang der emittierten und vorzugsweise mittels der Mikroskopeinheit aufgenommenen Raman-Streustrahlung getrennt wird. So wird es möglich, die erfindungsgemäße Vorrichtung in üblichen, konfektionierten Mikroskopsystemen zu integrieren. Bevorzugt wird dazu auch die zur Analyse der spektralen Verteilung der Raman- Streustrahlung geeignete Analyseeinheit in die Mikroskopeinheit integriert. Dies wird vorzugsweise dadurch realisiert, dass die Analyseeinheit in den Beobachtungsstrahlengang, zum Beispiel Kameraanschluss, in geeigneter Weise eingekoppelt wird.
  • Neben der Anregungsstrahlungseinheit kann an der Mikroskopeinheit vorzugsweise zusätzlich mindestens eine weitere Beleuchtungsquelle zur Herstellung der mikroskopischen Bilder, besonders eine Lichtquelle für die Fluoreszenzmikroskopie. Dies ist typischerweise eine Hochdruckquecksilberdampflampe. Die Mikroskopeinheit ist demgemäß vorzugsweise mit an sich bekannten Filtern zur Durchführung der Fluoreszenzmikroskopie ausgestattet.
  • Weiter ist die Mikroskopeinheit zur Registrierung und späteren Analyse der von den in der Messzone der Vorrichtung angeordneten Partikeln oder biologischen Zellen gewonnenen mikroskopischen Bildern mit mindestens einer Bildregistriereinheit, vorzugsweise einer CCD-Kamera mit geeigneter Optik, ausgestattet. Besonders bevorzugt ist die Bildregistriereinheit mit einer bevorzugt vorgesehenen Recheneinheit verbunden, die geeignet ist, gegebenenfalls mittels geeigneter Bildanalysealgorithmen, die mit der Mikroskopeinheit aufgenommenen mikroskopischen Bilder der Partikel oder biologischen Zellen zu analysieren und die Ergebnisse der Analyse anzuzeigen und/oder zu speichern.
  • In einer bevorzugten Ausführung weist die Vorrichtung mindestens ein Rechengerät auf. Dies ist bevorzugt zumindest mit der Analyseeinheit zur Analyse der emittierten Raman-Streustrahlung verbunden. Das Rechengerät ist auch geeignet zur Bestimmung von Kennwerten der aufgenommenen Raman-Spektren (Spektrum- Kennwerte) und der Kennwerte der aufgenommenen mikroskopischen Bilder der Partikel (Bild-Kennwerte). Das Rechengerät ist weiter geeignet zum Vergleich der ermittelten Spektrum-Kennwerte beziehungsweise Bild-Kennwerte mit hinterlegten, vorzugsweise vorbestimmten Spektrum-Kennwerten beziehungsweise Bild-Kennwerten. Die Vorrichtung weist vorzugsweise weiter mindestens ein Speicherelement auf, das vor allem zur Speicherung der hinterlegten Kennwerte, der im Rechengerät ermittelten Kennwerte und der Ergebnisse des in der Recheneinheit durchgeführten Kennwertvergleichs geeignet ist. Weiter weist die Vorrichtung vorzugsweise mindestens ein Ausgabeelement, bevorzugt ein Anzeigeelement, auf, das geeignet ist, mindestens ein Ergebnis des Kennwertvergleichs, das die Kategorisierung, Typisierung, Charakterisierung und/oder Spezifizierung des oder der analysierten Partikel beinhaltet, auszugeben beziehungsweise anzuzeigen. Bevorzugt wird dabei mindestens ein Ergebnis des unmittelbar durchgeführten Kennwertvergleichs angezeigt. Alternativ werden in dem mindestens einen Speicherelement abgespeicherte Ergebnisse von vorangegangenem Kennwertvergleichen ausgegeben beziehungsweise angezeigt. Bevorzugt ist die Vorrichtung auch geeignet, dass mikroskopische Bild der analysierten Partikel, gegebenenfalls zusammen mit den Ergebnissen des Kennwertvergleichs und/oder der Raman-Spektren, anzuzeigen.
  • Vorzugsweise ist das Rechengerät auch geeignet, die Ergebnisse der Bildanalyse mit den Ergebnissen der Kennwertanalyse der Raman-Spektren derart zu verrechnen, dass im Ergebnis eine eindeutige Charakterisierung der aus der biologischen Flüssigkeit der Fluidzelle zurückgehaltenen Partikel, das heißt besonders der biologischen Zellen, ermöglicht wird. Vorzugsweise ist das mindestens eine Speicherelement auch geeignet, die Ergebnisse der Bildanalyse und die Ergebnisse der Verrechnung der Ergebnisse der Bildanalyse mit den Ergebnissen des Kennwertvergleichs der Raman-Spektren zu speichern. Bevorzugt ist die mindestens eine Ausgabe- beziehungsweise Anzeigeeinheit auch geeignet, die Ergebnisse der optischen Bildanalyse und/oder die Ergebnisse der Verrechnung der Ergebnisse der optischen Bildanalyse mit den Ergebnissen des Kennwertvergleichs der Raman-Spektren auszugeben beziehungsweise anzuzeigen, und zwar sowohl die aktuellen Ergebnisse, als auch die gegebenenfalls in der mindestens einen Speichereinheit hinterlegten Ergebnisse früherer Messungen oder Analysen.
  • Durch die erfindungsgemäß vorgesehene Auswertung der mikroskopischen Bilder wird vorteilhafterweise ermöglicht, die ortsaufgelöst aufgenommenen lokalen Raman-Spektren bestimmten, über die Mikroskopbilddaten lokalisierten Partikeln zuzuordnen. Auf diese Weise kann eine Aussage über die Verteilung, Anordnung und Häufigkeit bestimmter Partikel, vorzugsweise Gewebezellen, in der biologischen Probe, das heißt besonders in dem analysierten Gewebeabschnitt, Zellverband oder Implantat, getroffen werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der vorbeschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung und der Einsatz des vorbeschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens für die folgenden bevorzugten Verwendungszwecke oder Kombinationen davon:
    • – zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Kontrolle biologischer Proben, vorzugsweise Flüssigkeiten auf Sterilität und/oder Kontamination;
    • – zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung oder Typisierung und/oder Selektion von in einer biologischen Probe enthaltenen biologischen Zelle;
    • – zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung des Differenzierungsstatus von in einer biologischen Probe enthaltenen biologischen Zelle;
    • – zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung oder Typisierung von allogenen oder autologen Implantaten.
  • Die Erfindung wird durch die nachfolgenden 1 und 2 und das nachfolgende Anwendungsbeispiel näher charakterisiert.
  • 1 zeigt den schematischen Aufbau einer Fluidzelle (100) mit einer in der Fluidzelle angeordneten Lochplatte (110) mit mehreren regelmäßig angeordneten Durchbrechungen (115) mit mindestens einem Zufluss (101) für die biologische Flüssigkeit und mindestens einem Abfluss (102). Schematisch sind die an der Lochplatte aus der biologischen Flüssigkeit zurückgehaltenen Partikel und der Nettostromfluss (Pfeil) entlang des Druckgefälles illustriert.
  • 2 zeigt den schematischen Aufbau einer anderen Fluidzelle (100) mit zwei in der Fluidzelle parallel und übereinander liegend angeordneten Lochplatten (110, 120) mit mehreren regelmäßig angeordneten Durchbrechungen (115, 125) mit mindestens einem Zufluss (101) für die biologische Flüssigkeit und mindestens einem Abfluss (102) sowie mindestens einem weiteren Anschluss (103) an der Unterseite der stromabwärts liegenden ersten Lochplatte (110) zum Anlegen eines Unterdrucks relativ zur Oberseite der Lochplatte. Schematisch sind die an den Lochplatten (110, 120) aus der biologischen Flüssigkeit zurückgehaltenen Partikel und der Nettostromfluss (Pfeil) illustriert.
  • Ausführungsbeispiel
  • 1. Sterilitäts- und Qualitätskontrolle eines Transplantats aus autologen Knorpelbiopsien
  • Material:
    • Geräte: Sterile Glaspipetten (5 oder 10 ml, Fa. Eppendorf); Sterile Spritze; Sicherheitswerkbank (HERAsave, Klasse II, Fa. Heraeus); Zentrifuge (5810R, Fa. Eppendorf); erfindungsgemäße Vorrichtung mit Licht- und Phasenkontrastmikroskop sowie Raman-Spektroskop mit Fluidzelle; Begasungsbrutschrank (BBD 6220, Fa. Heraeus)
    • Lösungen: Kollagenase (Fa. Worthington Biochemicals); autologes humanes Serum (Extraktion aus patienteneigener Blutprobe)
    • Transplantat: Autologe Knorpelbiopsie aus dem Patienten
  • Der Transport der Biopsie erfolgt in einem Transportmedium, welches auch als Nährmedium für die enthaltenen Zellen im Biopsat fungiert. Diese Lagerung des Knorpelgewebes erfolgt für 24 bis 48 Stunden bei 8°C.
  • Durchführung:
  • 1.1 Analyse einer flüssigen biologischen Probe
    • 1. Abpipettieren und Untersuchung des Überstandes des Transportmediums im Transportbehälter oder eines Aliquots aus dem Überstand (üblich sind 10% des Gesamtüberstandes). Mit Hilfe eines Vorfilters werden optional dabei alle Partikel, die deutlich größer als Bakterien und Pilzsporen sind (z. B. größer 3 μm), vor der Analyse der Probenflüssigkeit in der Fluidzelle mittels Mikrolocharray herausgefiltert.
    • 2. Die Probe wird unter Sterilbedingungen in die Fluidzelle (unter der Sterilbank, durch Benutzung einer sterilen Spritze), optional über ein oder zwei Septen an einer Einspritzstelle der Fluidzelle, eingespritzt. Optional ist die Fluidzelle direkt an den Transportbehälter gekoppelt.
    • 3. In der Fluidzelle werden die Mikrolöcher der Lochplatte (Locharray; Filterchip) von der Probenflüssigkeit durchströmt oder alternativ überströmt. Die Größe der Mikroporen ist so gewählt, dass die analyserelevanten Partikel, Bakterienzellen, Pilzsporen etc., die Löcher nicht passieren können und auf diesen positioniert werden:
    • – In einem ersten Beispiel einer Fluidzelle haben die Löcher einen Durchmesser von 1 μm und die Fläche des Locharrays hat eine Größe von 10 mm × 10 mm. Bei einem Lochraster von 10 μm befinden sich 1.002.001 Löcher im Locharray.
    • – In einem zweiten Beispiel einer Fluidzelle sind Locharrays mit verschiedenen Lochgrößen (2 μm und 1 μm) hintereinander geschaltet, um entweder die Anzahl der Partikel, die maximal spektroskopisch charakterisiert werden können, zu erhöhen, die Partikel vor der optischen und spektroskopischen Charakterisierung oder Klassifizierung nach einem weiteren Merkmal (kleiner 2 μm oder größer/gleich 2 μm) vorzuklassifizieren.
    • – In einem dritten Beispiel einer Fluidzelle ist einem Locharray ein Flusskanal nachgeschaltet, der die Partikel, die kleiner als die Löcher des Locharrays sind, seriell einer Optik zur Klassifizierung und Charakterisierung zuführt. Die Kanalbreite ist der Größe des Fokus der Optik angepasst. Optional werden die Partikel über eine Vorrichtung zur Erzeugung von Kraftfeldern (Schallfelder, elektromagnetische Felder) während der Charakterisierung in Position gehalten. Es erfolgt so eine Positionierung der Partikel auf den arrayförmig angeordneten Löchern.
    • 4. In einem nachfolgenden Schritt findet die Mikroskopie der in der Messzone der Fluidzelle angeordneten Partikel statt und die Unterscheidung/Kategorisierung von humanen Zellen, Bakterien, Pilzen, Sporen und anderen Partikeln wie Artefakten über die Bildanalysesoftware. Die Bildauswertung dient auch der Lokalisierung der Partikel/Zellen in der Messzone. Optional wird eine Aufnahme eines Raman-Spektrums des zellfreien Anteils des Transportmediums als Referenz für die Extraktion des eigentlichen Raman Signals der Probe beziehungsweise der Zellen durchgeführt.
    • 5. Die Raman-spektroskopische Untersuchung der lokalisierten Zellen zur Unterscheidung von Zelltypen (hier: Chondrozyten und Fibroblasten) und der anderen Mikroorganismen (z.B. Clostridium sporogenes (DSM 1664), Escherichia coli (DSM 498), Bacillus subtilis (DSM 347), Staphylococcus aureus (DSM 799, 346), Pseudomonas aeruginosa (DSM 1128), Aspergillus niger (DSM 1957), Candida albicans (DSM 1386)) anhand von Referenzspektren aus einer Da tenbank und dem Abgleich der gewonnenen Spektren mit den entsprechenden Referenzen (Kennwerten, Kennparametern, Indikatorbanden).
  • Optional findet eine erste Kontrolle des Zustandes oder Qualität der Zellen, insbesondere der Chondrozyten im Präparat anhand von vorher gewonnenen Referenzspektren vitaler Zellen statt.
  • Dauer der Messung: ca. 1 bis 48 Stunden, je nach den notwendigen Anforderungen. Zum Beispiel eine Kontrolle der Sterilität erfolgt neben der Raman-Spektroskopie über die mikroskopische Auswertung der in der Probe enthaltenen Partikel, die Dauer beträgt hier 1 bis 12 Stunden. Die Zuordnung von etwaigen Kontaminationen und die Kontrolle der Zellviabilität erfolgt anschließend bei Bedarf in einer Dauer von 2 bis 36 Stunden.
  • 1.2 Sterilitätstest des Blutserums
  • Nach Abzentrifugieren des Hämatokrit (der festen Blutbestandteile) der dem Organ-/Gewebespender entnommenen Blutprobe zur Gewinnung von autologem Blutserum, welches dem Nährmedium für die Zellkultur des Implantats zugesetzt wird, wird ein Sterilitätstest des Blutserums oder eines Aliquots daraus (Standard sind 10% des Serums) wird in der Fluidzelle und gemäß Schritte 1. bis 5. unter Punkt 1.1 durchgeführt. Dauer der Messung: ca. 1–12 Stunden.
  • Die Gewinnung des autologen Blutserums erfolgt durch Abzentrifugieren des Hämatokrit (der festen Blutbestandteile). Dieses Serum wird dem Nährmedium für die Kultur der Zellen des Implantats zugesetzt. Parallel zu den weiteren Schritten wird eine Blutprobe zu weiteren serologischen Tests an eine externe Stelle gegeben um Viren (z. B. HIV) und Kontaminationen mit Bakterientoxinen (z. B. über einen LAL-Test für den allgemeinen Nachweis von Endotoxinen) auszuschließen.
  • 1.3 in-process Kontrolle der Transplantatqualität
  • Ist der Nachweis von Kontaminationen negativ und erweisen sich die enthaltenen Zellen gemäß den Referenzspektren als innerhalb der Spezifikationen für vitale Zellen, erfolgt die Weiterkultivierung der isolierten Zellen und der Aufbau des autologen Transplantates.
  • Nach Isolierung der gewebespezifischen Zellen durch Kollagenasen, Überführung der Zellen in Nährmedium mit 10% Patientenserum werden sie in eine native Kollagenmatrix (Fa. Ars Arthro) eingegossen. Es beginnt die Kultivierung im Brutschrank (z.B. Temperatur 37°C und CO2-Gehalt 5% für optimale und konstante Kultivierungsbedingungen); die Gesamtkultivierungsdauer beträgt in der Regel 10 bis 14 Tage.
  • Nach den ersten 5 bis 7 Tagen erfolgt eine in-process Kontrolle einer Probe aus dem Überstand des Kulturmediums auf Sterilität, gewebespezifische Zellen und auf Viabilität des Transplantates. Das Vorgehen dabei erfolgt gemäß Punkt 1.1.
  • 1.4 Analyse der ECM
  • Zusätzlich erfolgt während der Kultivierung eine erste Analyse der Matrix (ECM), in die die Zellen eingebettet sind. Die Matrix, worin die Zellen eingebettet sind, besteht zum Beispiel hauptsächlich aus isoliertem Kollagen Typ 1. In der Kultur bildet sich um vitale Chondrozyten nach einiger Zeit jedoch eine eigene Matrix, welche vorwiegend aus Kollagen Typ II besteht. Diese beiden Kollagentypen sind im Raman-Spektrum unterscheidbar.
  • Dazu werden die gelösten Anteile im Überstand des Kulturmediums in der erfindungsgemäßen Vorrichtung spektroskopisch analysiert.
  • 1.5 Analyse des Gesamtpräparats
  • Ergänzend zu 1.1. bis 1.4 werden Einzelzellen an der Oberfläche des Transplantats anhand der Referenzspektren als vital oder nicht-vital kategorisiert. Diese Messungen finden direkt an den ganzen Transplantaten, direkt in den Kulturschalen als erfindungsgemäße Probehalteeinheiten statt. Dazu wird die Kulturschale entnommen, auf die erfindungsgemäße Vorrichtung aufgebracht und vermessen.
  • 1.6 Endkontrolle
  • Nach Fertigstellung des Transplantates ist eine Endkontrolle notwendig, die gemäß dem in Punkt 1.4 beschriebenen Vorgehen folgt.
  • Ergebnisse:
  • Die Messzeit wird hier auf 24 Stunden reduziert. Die erfindungsgemäß erreichte Schnelligkeit ein entscheidender Vorteil, da das Transplantat innerhalb von 24 bis 48 Stunden in den Patienten implantiert werden kann und die Funktionsfähigkeit der Zellen erhalten bleibt. In der erfindungsgemäßen Endkontrolle ist zum Zeitpunkt der Implantation in den Patienten bekannt, dass das Implantat nicht kontaminiert ist.

Claims (44)

  1. Verfahren zur optisch-spektroskopischen Analyse einer biologischen Probe in Flüssigkeiten, enthaltend die Schritte: – Fixieren der biologischen Probe in einer Probenhalteeinheit; – Kategorisieren der in der biologischen Probe gegebenenfalls enthaltenen Partikel anhand einer Analyse der Bilddaten von mikrophotographischen Aufnahmen der biologischen Probe und/oder darin enthaltener Partikel; und – Raman-spektroskopische Analyse der biologischen Probe innerhalb einer im Bereich der biologischen Probe positionierbaren Messzone; wobei die Messzone anhand der Ergebnisse der Kategorisierung nach festgelegten Kriterien auf bestimmte Abschnitte oder Partikel der biologischen Probe automatisch positioniert und die Raman-spektroskopische Analyse auf den Bereich dieser Messzone beschränkt wird; wobei das Fixieren der biologischen Probe erfolgt durch – Durchströmenlassen der biologischen Probe durch die Probenhalteeinheit, wobei die Probenhalteeinheit als Fluidzelle ausgebildet ist, wobei in der biologischen Probe gegebenenfalls enthaltende Partikel in der Fluidzelle zurückgehalten und dort reversibel, zumindest für die Dauer der Analyse, fixiert werden, indem die Partikel in der Fluidzelle durch mindestens eine in der Fluidzelle angeordnete Lochplatte mit mehreren Durchbrechungen zurückgehalten werden und die Durchbrechungen in der Lochplatte strukturiert in Form eines regel mäßigen und adressierbaren Musters zeilen- und spaltenweise angeordnet sind.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in der Lochplatte das Verhältnis von mittlerem Abstand der Durchbrechungen zu Durchmesser der Durchbrechungen so gewählt ist, dass an einer Durchbrechung jeweils genau ein Partikel festgehalten wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Messzone auf mindestens einen in der Probe vorhandenen Partikel, der einer vorbestimmten Kategorie angehört, positioniert wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kategorisierung der Partikel in die Kategorien „biologische Zelle" und „nicht-biologische Zelle, Artefakt" erfolgt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Kategorisierung in der Kategorie „biologische Zelle" in die Kategorien „Bakterienzelle, Pilzzelle, Bakterienspore, Pilzspore" und „(humane) Gewebezelle" erfolgt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Kategorisierung in der Kategorie „(humane) Gewebezelle" in die Kategorien „vitale Zelle" und „nicht-vitale Zelle" erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Kategorisierung in der Kategorie „(humane) Gewebezelle" in die Kategorien „differenzierte Zelle" und „de-differenzierte Zelle" erfolgt.
  8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, die spektrale Analyse der Raman-Streustrahlung erfolgt durch: – sequentielles Fokussieren einer Anregungsstrahlung in Form mehrerer linienförmiger Anregungszonen [i ... i + n] innerhalb der Messzone auf die biologischen Probe.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei eine ortsaufgelöste spektrale Analyse der Raman-Streustrahlung erfolgt durch: – ortsaufgelöstes spektrales Analysieren mittels zweidimensionalem CCD-Array-Detektor, wobei in der ersten Dimension des CCD-Arrays eine linienförmige Anregungszone i ortstreu entlang ihrer Längsausdehnung abgebildet wird und in der zweiten Dimension des CCD-Arrays die spektrale Verteilung der Raman-Streustrahlung von jedem Punkt entlang der Längsausdehnung dieser Anregungszone abgebildet wird und lokale Raman-Spektren ortsaufgelöst registriert werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei – in einem ersten Messzyklus die erste Schar lokaler Raman-Spektren in der ersten Anregungszone i registriert werden, – in einem zweiten nachfolgenden Messzyklus eine zweite Schar lokaler Raman-Spektren einer an die erste Anregungszone i örtlich angrenzenden zweiten Anregungszone i + 1 registriert werden, indem zwischen den Messzyklen der linienförmige Fokus der Anregungsstrahlung von einer ersten Position relativ zu der in der Messzone fixierten biologischen Probe zu einer zweiten Position hin bewegt wird, und – weitere Messzyklen für weitere örtlich angrenzende Anregungszonen i + n wiederholt werden, wobei die Scharen lokaler Raman-Spektren aller Anregungszonen [i ... i + n] zu einem Ge samtbild ortsaufgelöster spektraler Verteilungsmuster der in der Messzone fixierten biologischen Probe zusammengesetzt werden (linescan).
  11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend den Schritt: – Charakterisieren der in der Messzone analysierten biologischen Probe oder Partikel durch: Ermitteln von typischen Kennwerten aus dem mindestens einen Raman-Spektrum und Vergleichen der ermittelten typischen Spektrum-Kennwerte mit hinterlegten Spektrum-Kennwerten.
  12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend den Schritt: – Charakterisieren der in der Messzone analysierten biologischen Probe oder Partikel durch: Ermitteln von typischen Kennwerten aus den mikrophotographischen Bilddaten und Vergleichen der ermittelten Bild-Kennwerte mit hinterlegten Bild-Kennwerten.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei aus dem Vergleich der ermittelten Kennwerte nach festgelegten Kriterien die Charakterisierung der biologischen Probe oder darin enthaltenen Partikel auf Parameter, ausgewählt aus: Gattung, Spezies, Differenzierungsgrad, Vitalität und chemischer Zusammensetzung, erfolgt.
  14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Partikel aus der biologischen Flüssigkeit und auf der „Oberseite" der Lochplatte festgehalten werden durch, gegebenenfalls zeitweili ges, Anlegen eines dynamischen und/oder statischen Druckgefälles in Richtung der gegenüberliegenden „Unterseite" der Lochplatte.
  15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in einer individuellen Durchbrechung der Lochplatte genau ein individueller Partikel festgehalten wird.
  16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend den Schritt: – Vorselektieren der zu analysierenden Partikel durch: Auftrennen der Partikel nach ihrer Größe an mehreren in der Fluidzelle in Durchströmungsrichtung hintereinander geschalteten Lochplatten mit unterschiedlichen Durchbrechungsdurchmessern.
  17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend den Schritt: – Nachweis einer gegebenenfalls vorhandenen Kontamination einer biologischen Flüssigkeit anhand ermittelter Spektrum- und/oder Bild-Kennwerte, wobei ausreichende Übereinstimmung von Kennwerten das Vorhandensein infektiöser Partikel in der biologischen Flüssigkeit nachgewiesen ist und bei fehlender Übereinstimmung der Kennwerte die Abwesenheit einer Kontamination der biologischen Flüssigkeit nachgewiesen ist.
  18. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Anregungsstrahlung eine Wellenlänge von 785 ± 60 nm oder von 250 5 ± 50 nm aufweist.
  19. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur nichtinvasiven, zerstörungsfreien Kontrolle biologischer Flüssigkeiten auf Sterilität und Kontamination.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur nichtinvasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung oder Typisierung und/oder Selektion von in einer Flüssigkeit enthaltenen biologischen Zelle.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur nichtinvasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung des Differenzierungsstatus von in einer Flüssigkeit enthaltenen biologischen Zelle.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur nichtinvasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung oder Typisierung von Geweben oder Gewebeteilen.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur nichtinvasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung oder Typisierung von allogenen oder autologen Implantaten.
  24. Vorrichtung zur optisch-spektroskopischen Analyse biologischer Proben, enthaltend: – Probenhalteeinheit zur ortsfesten Fixerung der biologischen Probe in einer Messzone; – Anregungsstrahlungseinheit, geeignet zur Anregung von Raman-Streustrahlung mittels Anregungsstrahlung in einer Anregungszone auf innerhalb der Messzone; und – Analyseeinheit, geeignet zur spektralen Analyse der in der Anregungszone von der biologischen Probe emittierten Raman-Streustrahlung; wobei die Probenhalteeinheit eine von der biologischen Probe durchfließbare Fluidzelle ist, wobei die Fluidzelle Mittel aufweist, die geeignet sind zum Zurückhalten und reversiblen zeitweiligen Fixieren von in der biologischen Probe gegebenenfalls enthaltenen Partikeln, wobei die Fluidzelle als Mittel zum Zurückhalten der Partikel mindestens eine erste Lochplatte mit mehreren Durchbrechungen mit erstem Durchmesser aufweist und wobei die Durchbrechungen in der Lochplatte strukturiert in Form eines regelmäßigen und adressierbaren Musters zeilen- und spaltenweise angeordnet sind.
  25. Vorrichtung nach Anspruch 24, wobei in der Lochplatte das Verhältnis von mittlerem Abstand der Durchbrechungen zu Durchmesser der Durchbrechungen so gewählt ist, dass an einer Durchbrechung jeweils genau ein Partikel festgehalten werden kann.
  26. Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, wobei der erste Durchmesser 1 μm oder weniger beträgt.
  27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Fluidzelle eine zweite Lochplatte mit einer oder mehreren Durchbrechungen mit zweitem Durchmesser aufweist, wobei die zweite Lochplatte in Durchflussrichtung der biologischen Flüssigkeit durch die Fluidzelle stromaufwärts der ersten Lochplatte angeordnet ist und wobei der zweite Durchmesser größer als der erste Durchmesser ist.
  28. Vorrichtung nach Anspruch 27, wobei der zweite Durchmesser von 2 bis 6 μm beträgt.
  29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei die mehreren Durchbrechungen in der Lochplatte in regelmäßiger Struktur angeordnet sind.
  30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei die Fluidzelle als Mittel zum Zurückhalten der Partikel in der Fluidzelle mindestens einen mikrofluidischen Flusskanal aufweist.
  31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei die Fluidzelle zumindest im Bereich der Anregungszone strahlungsdurchlässiges Material aufweist, das ausgewählt ist aus: Silikatglas, Quartzglas, Silizium, Siliziumoxid, Siliziumnitrid, Kalziumfluoridglas, Bariumfluoridglas, Zinkselenidglas, Zinksulfidglas und Germaniumglas.
  32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 31, weiter enthaltend: – Linienfokussierungseinheit zur Fokussierung der Anregungsstrahlung der Anregungsstrahlungseinheit auf in der Fluidzelle zurückgehaltenen Partikel in Form einer linienförmigen Anregungszone.
  33. Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei die Linienfokussierungseinheit weiter eine Scannereinheit aufweist, die geeignet ist die linienförmige Anregungszone quer zu ihrer Längsdehnung über die zurückgehaltenen Partikel zu bewegen.
  34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 33, weiter enthaltend: – Mikroskopeinheit, geeignet zur bildgebenden mikrophotographischen Analyse der zurückgehaltenen Partikel, worin das optische Bild der zurückgehaltenen Partikel auf ein Bildaufnahmesystem abgebildet ist.
  35. Vorrichtung nach Anspruch 34, wobei die Mikroskopeinheit ein Phasenkontrast/Fluoreszenz-Durchlichtmikroskop ist.
  36. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 35, wobei die Analyseeinheit enthält: – zweidimensionales CCD-Array, geeignet zur ortsaufgelösten elektrischen Detektion von Raman-Streustrahlung; – optisches Gitter geeignet zur spektralen Auftrennung der in der Anregungszone von der biologischen Probe emittierten Raman-Streustrahlung; und – optische Anordnung, geeignet zur ortsaufgelösten Abbildung spektral aufgetrennter Raman-Streustrahlung aus der Anregungszone auf dem CCD-Array, derart, dass in der ersten Dimension die Anregungszone ortstreu entlang ihrer Längsausdehnung und in der zweiten Dimension die spektrale Verteilung von jedem Punkt entlang der Längsausdehnung der Anregungszone abgebildet ist.
  37. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 36, wobei die Analyseeinheit als linsenbasierter Raman-Spektrograph ausgebildet ist.
  38. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 37, wobei die Analyseeinheit eine optimierte Detektionsempfindlichkeit für Raman-Streustrahlung im Bereich von 200 bis 3500 cm–1 aufweist.
  39. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 38, weiter enthaltend: – Rechengerät, geeignet zur Ermittlung von Kennwerten von von der Analyseeinheit aufgenommenen Raman-Spektrums, zum Vergleich der ermittelten Kennwerten mit hinterlegten Kennwerten und zur Ermittlung von Ergebnissen des Vergleichs der Kennwerte; – Speicherelement, geeignet zur Speicherung der hinterlegten Kennwerte, der ermittelten Kennwerte und des Ergebnisses des Kennwertvergleichs des Rechengeräts; und – Anzeigeelement, geeignet zur Anzeige des Ergebnisses des Kennwertvergleichs.
  40. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 39, zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Kontrolle biologischer Flüssigkeiten auf Sterilität und Kontamination.
  41. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 39, zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung oder Typisierung und/oder Selektion von in einer Flüssigkeit enthaltenen biologischen Zelle.
  42. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 39, zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung des Differenzierungsstatus von in einer Flüssigkeit enthaltenen biologischen Zelle.
  43. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 39, zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung oder Typisierung von Geweben oder Gewebeteilen.
  44. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 39, zur nicht-invasiven, zerstörungsfreien Charakterisierung oder Typisierung von allogenen oder autologen Implantaten.
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