DE102006059881A1

DE102006059881A1 - A high-throughput assay for the identification of kinase inhibitors and kinase activators based on the measurement of ATP hydrolysis

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Publication number: DE102006059881A1
Application number: DE200610059881
Authority: DE
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2006-12-19
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2008-07-03
Also published as: WO2008074425A1; TW200848515A

Abstract

Die Erfindung betrifft einen neuen High-Throughput-Assay zum Messen der Kinaseaktivität und zum Identifizieren eines Kinaseinhibitors durch Bestimmen der Hydrolyse von ATP.The invention relates to a novel high-throughput assay for measuring kinase activity and identifying a kinase inhibitor by determining the hydrolysis of ATP.

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen High-Throughput-Assay zum Messen der Kinaseaktivität und zum identifizieren eines Kinase-Inhibitors durch Bestimmen der Hydrolyse von ATP.The The invention relates to a new high-throughput assay for measurement kinase activity and to identify a kinase inhibitor by determining the hydrolysis of ATP.

Eine Kinase ist ein enzymatisches Protein, welches die Übertragung einer Phosphorylgruppe von ATP auf ein Substrat katalysiert. Das Substrat kann beispielsweise die Kinase selbst, ein anderes Protein, ein Peptid, ein Zucker oder ein Lipid sein. Phosphorylierung eines Proteinsubstrats kann dessen Funktion modulieren, z. B. seine Aktivität inhibieren. Wenn das Protein src beispielsweise an einem speziellen Tyrosin phosphoryliert wird, schützt es seine eigene Kinase-Domäne davor, mit einem Substrat in Wechselwirkung zu treten. Die Phosphorylierung eines Proteins kann in anderen Fällen zur Bindung des phosphorylierten Proteins durch andere Proteine führen, die eine Erkennungsdomäne für ein spezielles phosphoryliertes Proteinmotiv haben. Die größte Gruppe der Proteinkinasen wirkt auf spezifische Proteine und modifiziert diese, um Signale zu übertragen und komplexe Prozesse in Zellen zu steuern. Derartige phosphorylierte Proteine ändern üblicherweise ihre funktionale Aktivität. Das Genom des Menschen enthält etwa 500 Proteinkinasegene.A Kinase is an enzymatic protein that transmits catalyzed a phosphoryl group of ATP on a substrate. The Substrate may be, for example, the kinase itself, another protein, a peptide, a sugar or a lipid. Phosphorylation of a Protein substrate can modulate its function, e.g. B. its activity inhibit. For example, if the protein src is attached to a special Tyrosine is phosphorylated, it protects its own kinase domain against interacting with a substrate. The phosphorylation In other cases, a protein may be phosphorylated to bind to a protein Protein through other proteins that carry a recognition domain for a specific phosphorylated protein motif. The largest group of protein kinases acts specific proteins and modifies them to transmit signals and to control complex processes in cells. Such phosphorylated Proteins usually change their functional Activity. The genome of man contains about 500 protein kinase genes.

Die Detektierung einer Kinase-Aktivität wird unter Laborbedingungen üblicherweise durchgeführt, indem eine Kinase unter definierten Bedingungen mit einem speziellen Substrat inkubiert wird. Die Phosphorylierung des Substrats wird nach Abschluss der Inkubierung bestimmt, indem z. B. die eingebaute Radioaktivität gemessen wird oder ein Antikörper verwendet wird, der das phosphorylierte Produkt spezifisch erkennt. Es war aus dem Stand der Technik bekannt, dass Proteinkinase A in der Lage sein würde, ATP direkt zu hydrolysieren ( Armstrong et al., PNAS 76, 722, 1976 ). Es war jedoch nicht möglich, diesen Effekt zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase auszunutzen. Es wurde insbesondere nie untersucht, ob die ATP hydrolysierende Aktivität als Maß für die Proteinphosphorylierungsaktivität verwendet werden kann, und ob bekannte Kinase-Inhibitoren die ATP-Hydrolyse in einer ähnlichen Weise inhibieren, wie sie die Phosphorylierung von Protein- oder Peptidsubstraten blockieren. Es konnte zudem nicht gefolgert werden und wurde nicht untersucht, ob die ATP hydrolysierende Aktivität ein gemeinsames Merkmal vieler Kinasen sein könnte.The detection of kinase activity is usually carried out under laboratory conditions by incubating a kinase under defined conditions with a specific substrate. The phosphorylation of the substrate is determined after completion of the incubation by z. B. the incorporated radioactivity is measured or an antibody is used which specifically recognizes the phosphorylated product. It was known in the art that protein kinase A would be able to directly hydrolyse ATP ( Armstrong et al., PNAS 76, 722, 1976 ). However, it was not possible to exploit this effect to determine the activity of a kinase. In particular, it has never been investigated whether the ATP hydrolyzing activity can be used as a measure of protein phosphorylation activity and whether known kinase inhibitors inhibit ATP hydrolysis in a manner similar to blocking the phosphorylation of protein or peptide substrates. In addition, it could not be concluded and it was not investigated whether the ATP hydrolyzing activity could be a common feature of many kinases.

Durch die Erfindung konnte gezeigt werden, dass direkte Hydrolyse von ATP durch unterschiedliche Kinasen eine effiziente Weise zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase liefert, ohne dass eine Phosphorylgruppe auf ein Protein-, Peptid-, Zucker- oder Lipidsustrat übertragen werden muss. Es konnte ferner gezeigt werden, dass eine derartige Aktivität zum Arzneimittelscreening verwendet werden kann, insbesondere unter den Bedingungen des HTS (High-Throughput-Screening) in Bezug auf alle Typen von Kinasen. Der große Vorteil eines derartigen Verfahrens wäre das effektive Screening von Verbindungen auf ihre Kinase modulierende Aktivität, ohne dass ein spezifisches Substrat in ausreichend großen Mengen zur Verfügung stehen muss.By The invention has been shown to provide direct hydrolysis of ATP by different kinases an efficient way to determine provides the activity of a kinase without a phosphoryl group transferred to a protein, peptide, sugar or Lipidsustrat must become. It could also be shown that such Activity can be used for drug screening, especially under the conditions of the HTS (High Throughput Screening) in terms of all types of kinases. the big advantage Such a method would be effective screening compounds modulating their kinase activity, without having a specific substrate in sufficiently large Quantities must be available.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP (Adenosintriphosphat). Die Proteinkinase kann jegliches Kinaseprotein oder ein Fragment davon sein. Die Aktivität bezieht sich auf den biologisch aktiven Zustand der Proteine, die insbesondere andere Proteine, Proteinfragmente oder Peptide, Zucker oder Lipide phosphorylieren, die entweder aus natürlichen Quellen isoliert oder chemisch synthetisiert wurden. Das Verfahren zum Detektieren dieser Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP wird jedoch erfindungsgemäß ohne Zugabe eines Protein-, Peptid-, Zucker- oder Lipidsubstrats der entsprechenden Kinase durchgeführt.The The invention relates to a method for detecting the activity a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP (adenosine triphosphate). The protein kinase may be any kinase protein or a fragment thereof be. The activity refers to the biologically active State of the proteins, in particular other proteins, protein fragments or phosphorylate peptides, sugars or lipids that are either from isolated or chemically synthesized from natural sources were. The method for detecting this activity However, a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP becomes according to the invention without addition of a protein, peptide, Sugar or Lipidsubstrats the corresponding kinase performed.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung und b) das Bestimmen der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Menge an ATP mittels des Materials Luciferase bestimmt.In a preferred embodiment of the invention the method of detecting the activity of a kinase a) incubating a kinase protein together with ATP in one aqueous solution and b) determining the amount ATP that has been hydrolyzed. In a further preferred Embodiment of the invention, the amount of ATP means of the luciferase material.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung und b) das Bestimmen der Menge an ADP (Adenosindiphosphat) und/oder Pi (anorganischem Phosphat), die durch die Hydrolyse von ATP freigesetzt worden ist.In a further preferred embodiment of the invention includes the method for detecting the activity of a Kinase a) incubating a kinase protein together with ATP in an aqueous solution and b) determining the Amount of ADP (adenosine diphosphate) and / or Pi (inorganic phosphate), which has been released by the hydrolysis of ATP.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase:

a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP und einem Detektierungssystem (z. B. Luciferin/Luciferase),
b) das Bestimmen der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, mittels des Detektierungssystems von a).

In a further preferred embodiment of the invention, the method for detecting the activity of a kinase comprises:

a) incubating a kinase protein together with ATP and a detection system (eg luciferin / luciferase),
b) determining the amount of ATP that has been hydrolyzed by the detection system of a).

Ein derartiges Detektierungssystem, das mit dem Kinaseprotein und ATP inkubiert werden soll, wäre Luciferin/Luciferase, wie bereits genannt, oder ein Detektierungssystem, das für die Erkennung von ADP und/oder Pi spezifisch ist (z. B. spezifische Antikörper; kleine organische Moleküle).One Such detection system coupled with the kinase protein and ATP should be incubated, luciferin / luciferase, as before called, or a detection system used for detection of ADP and / or Pi is specific (e.g., specific antibodies; small organic molecules).

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase ausgewählt aus einer Tyrosinkinase oder einer Serin/Threonin-Kinase.In a preferred embodiment of the invention is the Kinase selected from a tyrosine kinase or a serine / threonine kinase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase aus der folgenden Gruppe EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK ausgewählt.In a particularly preferred embodiment of the invention is the kinase from the following group EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK selected.

In einer weiteren speziellen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase aus TAK1, ABL oder PDK4 ausgewählt.In Another specific preferred embodiment of Invention, the kinase is selected from TAK1, ABL or PDK4.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst in irgendeiner der zuvor genannten Ausführungsformen die wässrige Lösung mehr als ein Kinaseprotein.In a further preferred embodiment of the invention comprises in any of the aforementioned embodiments the aqueous solution more than one kinase protein.

Die wässrige Lösung könnte z. B. zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn und mehr Kinaseproteine von unterschiedlichem Typ, unterschiedlicher Spezifizität, der Herkunft aus unterschiedlichen Spezies, unterschiedlicher Reinigungsweise, unterschiedlicher Modifikation des Proteingrundgerüsts, unterschiedlicher Größe, unterschiedlichem Molekulargewicht, unterschiedlichem Zuckergehalt oder anderen Charakterisierungen enthalten.The aqueous solution could z. B. two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten and more kinase proteins of different type, different specificity, the origin of different species, different ways of cleaning, different modification of the protein scaffold, different size, different molecular weight, different sugar content or other characterizations contain.

Das Verfahren zur Bestimmung der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, und/oder an ADP und/oder Pi, die aus der ATP-Hydrolyse freigesetzt worden ist bzw. sind, kann unter Verwendung eines Kalibrierungsverfahrens, das unter Berücksichtigung der entsprechenden relevanten experimentellen Bedingungen durchgeführt worden ist (z. B. Puffer, pH-Wert, Temperatur, Protein, Lösungsmittel, Ionen, Cofaktoren, Konzentrationen von ATP und/oder ADP und/oder Pi) und/oder unter Verwendung eines internen oder externen, fixierten oder flexiblen Referenzsystems erfolgen (z. B. Nullpunkt und/oder Basisniveau des spektroskopischen Systems).The Method for determining the amount of ATP that has been hydrolyzed is, and / or to ADP and / or Pi, released from the ATP hydrolysis can be determined using a calibration method, this taking into account the relevant relevant experimental conditions has been carried out (z. Buffer, pH, temperature, protein, solvent, Ions, cofactors, concentrations of ATP and / or ADP and / or Pi) and / or using an internal or external, fixed or flexible reference system (eg zero point and / or Base level of the spectroscopic system).

Im Kontext des Verfahrens zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren Ausführungsformen wie beschrieben sollten zuvor experimentelle Aufbauten zu Kontroll- oder Vergleichszwecken durchgeführt werden, insbesondere zu Zwecken der verbesserten Genauigkeit und Wiederholbarkeit oder aus anderen Gründen. Ein Kontrollexperiment könnte beispielsweise aus einem weiteren experimentellen Aufbau (zur Kontrolle) bestehen, wobei im Unterschied zu dem vollständigen experimentellen Aufbau, der einen vollständigen Satz der Komponenten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufweist, mindestens eine der Komponenten (insbesondere das Protein und/oder ATP) weggelassen wurde.in the Context of the method for detecting the activity of a Kinase by quantifying the hydrolysis of ATP in one or several embodiments as described should be previously experimental setups for control or comparison purposes especially for purposes of improved accuracy and Repeatability or for other reasons. A control experiment could, for example, from another experimental Structure (to control) exist, whereby in contrast to the complete experimental setup, which is a complete set of Components for carrying out the inventive Has method, at least one of the components (in particular the protein and / or ATP) has been omitted.

Das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren der Ausführungsformen wie bereits erwähnt kann in einer diskreten (einem oder mehreren, zeitlich getrennten Bestimmungspunkten) oder in einer kontinuierlichen Weise (aufeinanderfolgende Bestimmung) durchgeführt werden.The A method of detecting the activity of a kinase Quantify the hydrolysis of ATP in one or more of the Embodiments as already mentioned can be found in a discrete (one or more, time-separated destinations) or in a continuous manner (sequential determination) be performed.

Das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren der zuvor beschriebenen Ausführungsformen kann zur Identifizierung oder Profilierung einer chemischen Verbindung verwendet werden, die in der Lage ist, die Aktivität eines Kinaseproteins zu inhibieren oder zu stimulieren, oder kann zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase in einer biologischen Probe verwendet werden. Eine biologische Probe besteht aus lebenden oder toten Zellen von eukariontischen (einschließlich Wirbeltieren, insbesondere Säugern, speziell Hund, Ratte, Maus, Rind, Schwein sowie Menschen) oder prokariontischen Organismen (einschließlich Bakterien, Hefe) Organismen.The A method of detecting the activity of a kinase Quantify the hydrolysis of ATP in one or more of the Previously described embodiments may be used for identification or profiling of a chemical compound can be used which is capable of activity of a kinase protein to inhibit or stimulate, or may be used to determine the Activity of a kinase used in a biological sample become. A biological sample consists of living or dead cells of eukaryotic (including vertebrates, in particular Mammals, especially dogs, rats, mice, cattle, and pigs Humans) or prokaryotic organisms (including Bacteria, yeast) organisms.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer Kinase, wobei

a) eine Kinase (z. B. Tyrosinkinase, Serin/Threonin-Kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK, TAK1, ABL, PDK4 oder andere) in wässriger Lösung bereitgestellt wird,
b) eine Lösung, die ATP enthält, bereitgestellt wird,
c) eine Lösung, die Luciferin und Luciferase enthält, bereitgestellt wird,
d) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
e) die Kinase in wässriger Lösung aus a) und die chemische Verbindung aus d) inkubiert werden,
f) die Aktivität der Proteinkinase z. B. mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird. Dies kann durchgeführt werden, indem entweder Kinase, Verbindung und ATP für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert werden und danach Luciferin/Luciferase zur Bestimmung des restlichen ATP zugefügt werden, oder indem Kinase, Verbindung, ATP und Luciferin/Luciferase zusammen inkubiert werden und das Abklingen der ATP-Konzentration überwacht wird,
g) das Ergebnis von d) möglicherweise durch Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubierung gemäß c) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder die Kinase weggelassen wird,
h) das Ergebnis von d) und/oder e) möglicherweise durch die Ergebnisse aus einem Kontrollexperiment abgewogen wird, wobei die Verbindung gemäß b) ein bekannter Kinaseantagonist ist.

The invention further relates to a method for identifying an antagonist of a kinase, wherein

a) a kinase (eg tyrosine kinase, serine / threonine kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK, TAK1, ABL, PDK4 or others) is provided in aqueous solution,
b) providing a solution containing ATP,
c) providing a solution containing luciferin and luciferase,
d) a chemical compound is provided,
e) the kinase is incubated in aqueous solution from a) and the chemical compound from d),
f) the activity of the protein kinase z. B. by ATP, luciferin and luciferase is determined. This can be done by by incubating either kinase, compound and ATP for a certain period of time and then adding luciferin / luciferase to determine residual ATP or by incubating kinase, compound, ATP and luciferin / luciferase together and decaying ATP concentration is monitored
g) the result of d) is possibly weighed by results of one or more control experiments, wherein the incubation according to c) is carried out by omitting the chemical compound and / or the kinase,
h) the result of d) and / or e) is possibly weighed by the results of a control experiment, the compound according to b) being a known kinase antagonist.

Da ein Antagonist eine Verbindung ist, die die Aktivität einer Kinase inhibiert, wird ein positives Ergebnis zum Identifizieren eines Antagonisten durch diesen Assay durch verringerte Aktivität der Kinase gezeigt, die dazu führt, dass weniger ATP hydrolysiert wird.There an antagonist is a compound that has the activity of a Kinase inhibited, will be a positive result to identify of an antagonist by this assay due to decreased activity of the kinase that results in less ATP being hydrolyzed becomes.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Identifizieren eines Agonisten einer Kinase, wobei

a) eine Kinase (z. B. Tyrosinkinase, Serin/Threonin-Kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDk2, MKK1, ROCK, MCK, TAK1, ABL, PDK4 oder andere) in wässriger Lösung, die ferner ATP, Luciferin, Luciferase und möglicherweise zusätzliche Verbindungen, jedoch kein Peptid-, Protein-, Zucker- oder Lipidsubstrat der Kinase umfasst, bereitgestellt wird,
b) eine Lösung bereitgestellt wird, die ATP und mögliche zusätzliche Komponenten umfasst,
c) eine Lösung bereitgestellt wird, die Luciferin, Luciferase und mögliche zusätzliche Komponenten umfasst,
d) ein Inhibitor der Kinase bereitgestellt wird,
e) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
f) die Kinase in wässriger Lösung gemäß a), der Inhibitor gemäß b) und die chemische Verbindung gemäß c) inkubiert werden,
g) die Aktivität der Kinase z. B. mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird,
h) das Ergebnis von e) möglicherweise durch die Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubation gemäß d) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder die Kinase weggelassen wird; dies kann erfolgen, indem entweder Kinase, Inhibitor, Verbindung und ATP für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert werden und danach zur Bestimmung des restlichen ATP Luciferin/Luciferase zugegeben wird, oder indem Kinase, Inhibitor, Verbindung, ATP und Luciferin/Luciferase zusammen inkubiert werden und das Abklingen der ATP-Konzentration aufgezeichnet wird,
i) das Ergebnis von e) und/oder f) möglicherweise durch die Ergebnisse aus einem Kontrollexperiment abgewogen wird, wobei die Verbindung gemäß b) ein bekannter Kinaseagonist ist.

The invention also relates to a method for identifying an agonist of a kinase, wherein

a) a kinase (eg tyrosine kinase, serine / threonine kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDk2, MKK1, ROCK, MCK, TAK1, ABL, PDK4 or others) in aqueous solution, which also contains ATP, luciferin , Luciferase and possibly additional compounds, but does not include a peptide, protein, sugar or lipid substrate of the kinase is provided,
b) providing a solution comprising ATP and possible additional components,
c) providing a solution comprising luciferin, luciferase and possible additional components,
d) an inhibitor of the kinase is provided,
e) a chemical compound is provided,
f) the kinase is incubated in aqueous solution according to a), the inhibitor according to b) and the chemical compound according to c),
g) the activity of the kinase z. B. determined by ATP, luciferin and luciferase,
h) the result of e) is possibly weighed by the results of one or more control experiments, wherein the incubation according to d) is carried out by omitting the chemical compound and / or the kinase; this can be done by incubating either kinase, inhibitor, compound and ATP for a certain period of time and then adding to the residual ATP luciferin / luciferase, or by incubating the kinase, inhibitor, compound, ATP and luciferin / luciferase together, and Decay of the ATP concentration is recorded
i) the result of e) and / or f) is possibly weighed by the results of a control experiment, the compound according to b) being a known kinase agonist.

Da ein Agonist eine Verbindung ist, die die Aktivität einer Kinase stimuliert, wird ein positives Ergebnis zum Identifizieren eines Agonisten durch diesen Assay durch erhöhte Aktivität der Kinase gezeigt, die dazu führt, dass mehr ATP hydrolysiert wird.There an agonist is a compound that has the activity of a Kinase stimulates, will be a positive result to identify of an agonist by this assay by increased activity the kinase that causes more ATP to hydrolyze becomes.

Das Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten wie zuvor beschrieben kann in einer Ausführungsform der Erfindung als High-Throughput-Screening (HTS) durchgeführt werden.The A method for identifying an antagonist or agonist such as previously described, in one embodiment of the invention as high-throughput screening (HTS).

Die Erfindung wird nachfolgend genauer definiert, ohne den Schutzumfang der Ansprüche auf eine einzige Definition zu begrenzen.The The invention will be further defined below, without the scope of protection of the claims to a single definition.

Eine Proteinkinase ist ein Enzym, das andere Proteine oder sich selbst (Autophosphorylierung) phosphoryliert. Proteinphosphorylierung ist ein Regulierungsmechanismus einer lebenden Zelle, der eine Rolle bei der Steuerung von Zellfunktionen spielt (z. B. Differenzierung, Entwicklung, Signalgebung, Metabolismus, Zellzyklus, Fortpflanzung und anderen). Die Phosphorylierung eines Proteins ändert üblicherweise die funktionale Aktivität des Proteins. Deregulierte Kinasen können zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen, wie z. B. Krebs, metabolischen Erkrankungen (z. B. Diabetes), verringerter Fähigkeit zur Bekämpfung von viralen oder bakteriellen Infektionen, Erkrankungen der Atemwege, Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Erkrankungen vitaler Organfunktionen (z. B. Herz, Lunge) und dergleichen.A Protein kinase is an enzyme that is other proteins or itself (Autophosphorylation) phosphorylated. Protein phosphorylation a regulatory mechanism of a living cell that plays a role plays in the control of cell functions (eg differentiation, Development, signaling, metabolism, cell cycle, reproduction and others). The phosphorylation of a protein usually changes the functional activity of the protein. Deregulated kinases can lead to serious side effects, such as As cancer, metabolic diseases (eg diabetes), reduced Ability to combat viral or bacterial Infections, respiratory diseases, diseases of the central Nervous system, diseases of vital organ functions (eg heart, Lung) and the like.

Der Begriff Proteinkinase soll sich auf die Enzymklasse als solche beziehen, um die Proteinkinasegruppe von anderen Enzymen oder Rezeptoren (z. B. Phosphatasen, GPCR) zu differenzieren. Der Begriff Proteinkinaseprotein oder Kinaseprotein wird zur Bezeichnung des Proteins oder eines Fragments eines Proteins einer Proteinkinase verwendet. Tyrosinkinasen (EC 2.7.10.1) phosphorylieren Tyrosin-Aminosäurereste.Of the Term protein kinase should refer to the enzyme class as such, to the protein kinase group of other enzymes or receptors (eg. B. phosphatases, GPCR) to differentiate. The term protein kinase protein or kinase protein is used to denote the protein or a protein Fragment of a protein of a protein kinase used. tyrosine kinases (EC 2.7.10.1) phosphorylate tyrosine amino acid residues.

Tyrosinkinasen sind an der Signalweiterleitung beteiligt. Sie spielen eine bedeutende Rolle als Wachstumsfaktorrezeptoren (z. B. Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor – EGFR; Insulinrezeptor – IR und andere) sowie in der nachgeordneten Signalgebung von Wachstumsfaktoren. Serin/Threonin-Kinasen (EC 2.7.11.1) phosphorylieren die OH-Gruppe von Serin oder Threonin. Diese Kinasen werden oft durch chemische Signale reguliert, wie z. B. cAMP, cGMP, Diacylglycerin, Ca²⁺ oder andere. Serin/Threonin-Kinasen sind beispielsweise Phosphorylasekinase, Proteinkinase A, Proteinkinase B oder Proteinkinase C. Phosphorylasekinase (EC 2.7.11.19) ist ein hexadecameres Enzym, das aus vier unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Proteinkinase A (EC 2.7.11.1) besteht aus zwei Domänen. Die Bindungsstellen für ATP und Substrat sind zwischen den beiden Domänen angeordnet. Proteinkinase B (auch als Akt-Kinase bekannt) ist ein Schlüsselenzym von zahlreichen intrazellulären Signalgebungswegen. Die Aktivierung von Proteinkinase B stört die apoptotische Signalweiterleitung. Gleichzeitig führt sie zur Proliferation von Zellen. Proteinkinase C (EC 2.7.11.1) besteht aus einer Familie von etwa 10 Isozymen.Tyrosine kinases are involved in signal transduction. They play an important role as growth factor receptors (eg epidermal growth factor receptor - EGFR, insulin receptor - IR and others) as well as in the downstream signaling of growth factors. Serine / threonine kinases (EC 2.7.11.1) phosphorylate the OH group of serine or threonine. These kinases are often regulated by chemical signals, such as. CAMP, cGMP, diacylglycerol, Ca ²⁺ or others. Serine / threonine kinases are, for example, phosphorylase kinase, protein kinase A, protein kinase B or protein kinase C. Phosphorylase kinase (EC 2.7.11.19) is a hexadecameric enzyme which is composed of four different subunits. Protein kinase A (EC 2.7.11.1) consists of two domains. The binding sites for ATP and substrate are located between the two domains. Protein kinase B (also known as Akt kinase) is a key enzyme of numerous intracellular signaling pathways. Activation of protein kinase B interferes with apoptotic signal transduction. At the same time it leads to the proliferation of cells. Protein kinase C (EC 2.7.11.1) consists of a family of about 10 isozymes.

Andere wichtige Kinasen sind die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK; EC 2.7.11.1). Die MAPKs werden durch extrazelluläre Signalmoleküle (Mitogene) getriggert. Sie sind an der Regulierung zahlreicher zellulärer Aktivitäten beteiligt, z. B. Differenzierung, Genexpression, Mitose und Apoptose. Extrazelluläre Stimuli führen die Aktivierung einer MAPK über eine Signalgebungskaskade herbei, die MAPK, MAPK-Kinase (MAPKK) und MAPKK-Kinase (MAPKKK) umfasst.Other important kinases are the mitogen-activated protein kinases (MAPK; EC 2.7.11.1). The MAPKs are produced by extracellular signaling molecules (Mitogens) triggered. They are in the regulation of numerous cellular Activities involved, eg. B. differentiation, gene expression, Mitosis and apoptosis. Extracellular stimuli lead Activation of MAPK via a signaling cascade the MAPK, MAPK kinase (MAPKK) and MAPKK kinase (MAPKKK) includes.

Bei Säugern sind unterschiedliche Gruppen von MAPKs bekannt: ERK (extrazelluläre signalregulierte Kinase), JNK (c-Jun N-terminale Kinase), p38-Isoformen und andere. MEK (= MAP/ERK-Kinase) ist eine gemischte Serin/Threonin- und Tyrosinkinase. MEK spielt die Rolle einer MAPKK.at Mammals are known to have different groups of MAPKs: ERK (extracellular signal regulated kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase), p38 isoforms and others. MEK (= MAP / ERK kinase) is a mixed serine / threonine and tyrosine kinase. MEK plays the role of a MAPKK.

Andere wichtige Kinasen sind z. B.
EGFR (epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor),
VEGFR (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor),
NGFR (Nervenwachstumsfaktorrezeptor),
CDK2 (Cyclin-abhängige Kinase 2),
Rock (Rho-assozierte Kinase),
MLK (Myosin-Leichtkettenkinase),
ABL (Abelson-Kinase) oder PDK4 (Phosphoinositid-abhängige Kinase 4) oder andere.Other important kinases are z. B.
EGFR (epidermal growth factor receptor),
VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor),
NGFR (Nerve Growth Factor Receptor),
CDK2 (cyclin-dependent kinase 2),
Rock (Rho-associated kinase),
MLK (myosin light chain kinase),
ABL (Abelson kinase) or PDK4 (phosphoinositide-dependent kinase 4) or others.

TGF-β-assoziierte Kinase 1 (TAK1) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die ein Mitglied der Mitogen-aktivierten Kinase Kinase Kinase-(MAPKKK)-Familie ist. Sie gehört zu dem entzündungsfördernden zellulären Signalgebungsweg, indem die JNK, p38- und NF-_KB-Wege aktiviert werden. In der Zelle ist TAK1 Teil eines Proteinkomplexes, der Adapterproteine wie TAB1, TAB2 oder TAB3 enthält. Dieser Komplex wird wiederum durch TRAF6 aktiviert, eine RING-Domänen-Ubiquitinligase, die die Synthese von Lys63-verlinkten Polyubiquitinketten erleichtert.TGF-β-associated kinase 1 (TAK1) is a serine / threonine kinase that is a member of the mitogen-activated kinase kinase kinase (MAPKKK) family. It belongs to the proinflammatory cellular signaling pathway by activating the JNK, p38 and NF- _K B pathways. In the cell, TAK1 is part of a protein complex that contains adapter proteins such as TAB1, TAB2 or TAB3. This complex is in turn activated by TRAF6, a RING domain ubiquitin ligase that facilitates the synthesis of Lys63-linked polyubiquitin chains.

Es ist gezeigt worden, dass TAK1 im Myokard nach Drucküberlastung aktiviert wird. Ihre Inhibierung könnte für die Behandlung der koronaren Herzerkrankung und der Prävention von Herzversagen vorteilhaft sein.It TAK1 has been shown to be in the myocardium after pressure overload is activated. Their inhibition could be for the Treatment of coronary heart disease and prevention of heart failure be beneficial.

Die wässrige Lösung einer Kinase enthält die Kinase in einer Menge von üblicherweise 1 ng bis zu 100 μg pro ml. Die wässrige Lösung kann neben der Kinase eine Puffersubstanz (z. B. Tris oder Hepes bei einem definierten pH-Wert, z. B. zwischen 6,5 bis zu 7,5), zweiwertige oder einwertige Kationen oder Anionen (z. B. Na⁺, K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Cl^–), Stabilisierungsmittel (z. B. Glykol oder Glycerin), Konservierungsmittel (z. B. Alkohole, Antibiotika) oder andere Substanzen enthalten. Lyophilisierte Proteine (wie z. B. Proteinkinasen) sind einem Dehydratisierungsprozess (Lyophilisierung, auch als Gefriertrocknen bekannt) unterzogen worden, wobei das gefrorene Material unter reduziertem Umgebungsdruck angeordnet wird, damit das gefrorene Wasser in dem Material direkt aus der festen Phase in die Gasphase sublimieren kann.The aqueous solution of a kinase contains the kinase in an amount of usually 1 ng up to 100 μg per ml. The aqueous solution may contain, in addition to the kinase, a buffer substance (eg Tris or Hepes at a defined pH, eg. . from 6.5 up to 7.5), divalent or monovalent cations or anions (e.g., Na ^+, K ^+, Mg ² ^+, Ca ² ^+, Cl ^-.), stabilizing agents (such as glycol or glycerol) Preservatives (eg alcohols, antibiotics) or other substances. Lyophilized proteins (such as protein kinases) have undergone a dehydration process (lyophilization, also known as freeze-drying) wherein the frozen material is placed under reduced ambient pressure to sublime the frozen water in the material directly from the solid phase to the gas phase can.

Ein Antagonist ist eine Substanz (z. B. chemische Verbindung, kleines organisches Molekül, Peptid, Protein oder andere), die die normale physiologische Funktion eines Proteins inhibiert, wie z. B. eines Enzyms oder Rezeptors oder anderer.One Antagonist is a substance (eg chemical compound, small organic molecule, peptide, protein or others) that inhibits the normal physiological function of a protein, such as z. As an enzyme or receptor or other.

Antagonisten können mit einem Agonisten um die Bindungsstelle eines Proteins konkurrieren (= kompetitiver Antagonist) oder können durch andere Mittel antagonisieren (= nicht-kompetitive Antagonisten). Ein Agonist ist eine Substanz (z. B. chemische Verbindung, kleines organisches Molekül, Peptid, Protein oder andere), die an ein Protein (z. B. ein Enzym, einen Rezeptor oder andere) bindet, um die jeweilige Aktivität in einer Zelle zu triggern. Sowohl Antagonisten als auch Agonisten können als aktive Bestandteile in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit beitragen.Antagonists can compete with an agonist for the binding site of a protein (= competitive antagonist) or can antagonize by other means (= non-competitive antagonists). An agonist is a substance (eg, chemical compound, small organic molecule, peptide, protein, or others) that binds to a protein (eg, an enzyme, a receptor, or others) to monitor its activity to trigger a cell. Both antagonists and agonists may contribute to the treatment of a disease as active ingredients in a pharmaceutical composition.

Eine chemische Verbindung wird insbesondere durch chemische Synthese oder durch Reinigung aus einer biologischen Quelle bereitgestellt.A chemical compound is made in particular by chemical synthesis or by purification from a biological source.

Der Fachmann verwendet Routineverfahren zur chemischen Synthese einer Verbindung oder zur Reinigung aus einer biologischen Quelle. Derartige Verfahren stehen dem Fachmann in Lehrbüchern wie "Organic Synthesis Workbook", 1995, John Wiley & Sons, ISBN 3-527-30187-9 , "The Organic Chemistry of Drug Synthesis", 1998, John Wiley & Sons, ISBN 0-471-24510-0 , oder "Bioactive Compounds from Natural Sources", 2001, Taylor & Francis, ISBN 0-7484-0890-8 zur Verfügung.The person skilled in the art uses routine methods for the chemical synthesis of a compound or for purification from a biological source. Such methods are available to those skilled in textbooks such as "Organic Synthesis Workbook", 1995, John Wiley & Sons, ISBN 3-527-30187-9 . "The Organic Chemistry of Drug Synthesis", 1998, John Wiley & Sons, ISBN 0-471-24510-0 , or "Bioactive Compounds from Natural Sources", 2001, Taylor & Francis, ISBN 0-7484-0890-8 to disposal.

Die durch Synthese oder Reinigung erhaltenen Verbindungen können in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden. Geeignete Lösungsmittel können Wasser, Puffersubstanzen (z. B. Tris, HEPES, MOPS, usw.), einwertige und/oder zweiwertige Ionen (z. B. K⁺, Na⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, usw.), Säuren (z. B. HCl, H₂SO₄, Ameisensäure, Essigsäure, usw.), Basen (z. B. NaOH, usw.), Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol, Glycerin), Detergentien (z. B. Na-Dodecylsulfat), organische Lösungsmittel (z. B. Formamid, Aceton, Dimethylsulfoxid, usw.) und andere Komponenten (z. B. Solubilisierungsmittel oder Stabilisatoren) enthalten.The compounds obtained by synthesis or purification can be dissolved in a suitable solvent. Suitable solvents may be water, buffer substances (eg., Tris, HEPES, MOPS, etc.), monovalent and / or divalent ions (eg. As K ^+, Na ^+, Mg ² ^+, Ca ² ^+, etc.), Acids (e.g., HCl, H ₂ SO ₄ , formic acid, acetic acid, etc.), bases (e.g., NaOH, etc.), alcohol (e.g., methanol, ethanol, glycerin), detergents (e.g. Na-dodecyl sulfate), organic solvents (e.g., formamide, acetone, dimethyl sulfoxide, etc.) and other components (e.g., solubilizers or stabilizers).

Das Inkubieren von z. B. einer Proteinkinase und einer chemischen Verbindung wird durchgeführt, indem diese Komponenten in Kontakt gebracht werden und für eine bestimmte Zeit (z. B. 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 Minuten oder mehr) auf einer vorgewählten Temperatur (zwischen 20°C und 40°C, z. B. 37°C) gehalten werden.The Incubate z. A protein kinase and a chemical compound is done by bringing these components into contact and for a certain time (eg 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 minutes or more) on a preselected Temperature (between 20 ° C and 40 ° C, eg 37 ° C) being held.

Der Fachmann kann die Komponenten des erfindungsgemäßen Assays unter Verwendung von Routinelaborverfahren in Kontakt miteinander bringen. Das Kontaktieren kann beispielsweise in Erlenmeyer-Kolben, Röhrchen, Eppendorf-Gefäßen oder in Mikrotiterplatten stattfinden. Für das Kontaktieren können temperaturgeregelte Inkubatoren verwendet werden, bei denen eine konstante Temperatur von beispielsweise 30°C oder 37°C und feste CO₂- oder Feuchtigkeitsbedingungen eingestellt werden können. Das Kontaktieren kann insbesondere auch in Laborrobotervorrichtungen durchgeführt werden. Es kann für unterschiedliche Zeitspannen von wenigen Sekunden bis Minuten und bis zu mehrere Stunden kontaktiert werden. Die in jedem Fall zu wählenden Bedingungen hängen von der Identität und Konzentration der Kinase, der Zusammensetzung des Lösungsmittels und der chemischen Verbindung ab.The person skilled in the art can bring the components of the assay according to the invention into contact with one another using routine laboratory procedures. The contacting can take place, for example, in Erlenmeyer flasks, tubes, Eppendorf tubes or in microtiter plates. For the contacting temperature-controlled incubators can be used, in which a constant temperature of for example 30 ° C or 37 ° C and fixed CO ₂ or humidity conditions can be set. The contacting can also be carried out in particular in laboratory robot devices. It can be contacted for different time periods from a few seconds to minutes and up to several hours. The conditions to be chosen in each case depend on the identity and concentration of the kinase, the composition of the solvent and the chemical compound.

ATP ist Adenosin-5'-triphosphat.ATP is adenosine 5'-triphosphate.

Luciferin ist ein Licht emittierendes Pigment, das sich in Organismen wie Glühwürmchen, Bakterien oder Dinoflagelaten findet. Luciferase ist ein Enzym, das Luciferin unter Erzeugung von Oxyluciferin und Licht oxidieren kann.luciferin is a light-emitting pigment that is found in organisms such as Fireflies, bacteria or dinoflagelates finds. Luciferase is an enzyme that releases luciferin to produce oxyluciferin and can oxidize light.

Screening bedeutet das Untersuchen einer großen Anzahl von Verbindungen, um pharmakologisch aktive Substanzen bei der Arzneimittelforschung zu identifizieren.screening means examining a large number of connections, to pharmacologically active substances in drug research to identify.

Beim High-Throughput-Screening (HTS) werden große Bibliotheken, die aus chemischen Verbindungen bestehen, auf ihre Fähigkeit zum Aktivieren oder Inhibieren eines Ziels (Targets) (z. B. Proteinkinase) getestet. Eine weitere Anwendung von HTS ist das Testen der Selektivität einer Verbindung.At the High Throughput Screening (HTS) becomes large libraries, which consist of chemical compounds, on their ability to activate or inhibit a target (eg protein kinase) tested. Another application of HTS is the testing of selectivity a connection.

Das Testen wird bei HTS üblicherweise auf Platten (Platten mit 24, 96, 384, 1536 (und mehr) Mulden) in einem automatisierten Verfahren mittels Laborrobotern durchgeführt. 3. Materialien und Verfahren 3.1. Materialien Material Molekulargewicht oder Anbieter, Katalog Nr. Mikroplatte, 384K, PS, weiß, kleines Volumen Greiner 784075 Mikroplatte, 384 Mulden, schwarz, nicht bindend Corning, 3654 TAK1-TAB1 Fusion, human 42,8 kDa Biomol, 14-600 Adenosin-5'-triphosphat (ATP) 551,1 g/Mol Sigma, A-2383 ATP-Monitoringlösung (ViaLight HS) Cambrex, LT07111 Staurosporin 466,5 g/Mol Calbiochem, 569397 Tris(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid 157,6 g/Mol Merck 108219 Rinderserum-Albumin (BSA) Sigma, A-7030 Magnesiumchlorid 95,21 g/Mol Merck, 814733 Dithiothreitol (DTT) 154,2 g/Mol Sigma, D 5545 DMSO Merck, 102931 Pluronic F-68 10% Lösung Sigma, P5556 Salzsäure 1 M Merck, 109057 Milli-Q-H₂O Testing in HTS is usually performed on plates (plates with 24, 96, 384, 1536 (and more) wells) in an automated procedure using laboratory robots. 3. Materials and Methods 3.1. materials material Molecular weight or Supplier, catalog no. Microplate, 384K, PS, white, small volume Greiner 784075 Microplate, 384 wells, black, non-binding Corning, 3654 TAK1-TAB1 fusion, human 42.8 kDa Biomol, 14-600 Adenosine 5'-triphosphate (ATP) 551.1 g / mol Sigma, A-2383 ATP monitoring solution (ViaLight HS) Cambrex, LT07111 staurosporine 466.5 g / mol Calbiochem, 569397 Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride 157.6 g / mol Merck 108219 Bovine serum albumin (BSA) Sigma, A-7030 magnesium chloride 95.21 g / mol Merck, 814733 Dithiothreitol (DTT) 154.2 g / mol Sigma, D 5545 DMSO Merck, 102931 Pluronic F-68 10% solution Sigma, P5556 hydrochloric acid 1 m Merck, 109057 Milli-QH ₂ O

Charakteristika des Enzyms:Characteristics of the enzyme:

1) TAK1-TAB1 fusion, active
2) human recombinant enzyme expressed in Sf21 cells, N-terminal His-tagged
3) contains TAK1 amino acids 1-303, fused at TAB1 amino acids 437 end
4) MW = 42.8 kD
5) purified using Ni 2+ / NTA-agarose, purity> 90% according to SDS PAGE Coomassie
6) delivered as 0.92 mg / ml solution in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 30 mM NaCl, 0.1 mM EGTA, 0.03% Brij-35, 0.2 mM PMSF, 1 mM Benzamidine, 0.1% 2-mercaptoethanol
7) aliquoted and stored at -70 ° C.

3.2. Herstellung der Reagentien 3.2.1. Vorratslösungen Name Zusammensetzung Herstellung Lagerung Tris-Puffer 25 mM, pH 7,4 3 g Tris wurden in H₂O gelöst, der pH-Wert mit HCl eingestellt, mit H₂O auf 1 L aufgefüllt RT BSA 10% 100 g BSA wurden in 1 L H₂O gelöst –20°C ATP 1 mM 551 mg ATP wurden in 1 L H₂O gelöst –20°C MgCl₂ 1 M 95,2 g MgCl₂ wurden zu 1 L H₂O gegeben RT TAK1 0,92 mg/ml wurde wie von Upstate erhalten verwendet –70°C Luciferin/Luciferase 20 ml Tris-Ac (aus dem VialightKit)-Puffer wurden zu einer lyophilisierten Ampulle gegeben –20°C DTT 1 M 1,5 g wurden in 10 ml H₂O gelöst –20°C Staurosporin 1 mM 250 μg Staurosporin wurden in 536 μl DMSO gelöst –20°C 3.2.2. Puffer und Reagentien Name Herstellung Zusammensetzung Stabilität Reaktionspuffer 1 ml: 986 μl Tris-Puffer, 10 μl MgCl₂, 2 μl BSA, 2 μl DTT 25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0,02% BSA 6 h Enzymlösung 1 ml: 997,2 μl Reaktionspuffer, 2,5 μl TAK1 Reaktionspuffer 2,3 μg/ml TAK1 6 h ATP-Lösung 1 ml: 994 μl Reaktionspuffer, 6 μl ATP Reaktionspuffer, 6 μM ATP 6 h Testverbindungen 1 μl (10 mM in DMSO) wurden mit 20 μl Reaktionspuffer verdünnt, der 20% DMSO enthielt, 10 μl wurden weiter mit 70 μl Reaktionspuffer verdünnt 60 μM Verbindung in Reaktionspuffer, 3% DMSO 6 h Detektierungslösung 1 ml: 323 μl Luciferin/Luciferase 667 μl Tris-Puffer, 2 μl Staurosporinvorrat (1 mM) 1:3 in Tris-Puffer, 2 μM Staurosporin 8 h 3.2. Preparation of the Reagents 3.2.1. stock solutions Surname composition manufacturing storage Tris-buffer 25 mM, pH 7.4 3 g Tris were dissolved in H ₂ O, the pH adjusted with HCl, made up to 1 L with H ₂ O. RT BSA 10% 100 g of BSA were dissolved in 1 LH ₂ O. -20 ° C ATP 1 mm 551 mg of ATP were dissolved in 1 LH ₂ O. -20 ° C MgCl ₂ 1 m 95.2 g of MgCl ₂ were added to 1 LH ₂ O. RT TAK1 0.92 mg / ml was used as received from Upstate -70 ° C Luciferin / luciferase 20 ml of Tris-Ac (from the VialightKit) buffer was added to a lyophilized vial -20 ° C DTT 1 m 1.5 g were dissolved in 10 ml H ₂ O. -20 ° C staurosporine 1 mm 250 μg of staurosporine were dissolved in 536 μl of DMSO -20 ° C 3.2.2. Buffers and reagents Surname manufacturing composition stability reaction buffer 1 ml: 986 μl Tris buffer, 10 μl MgCl ₂ , 2 μl BSA, 2 μl DTT 25mM Tris-HCl, pH 7.4, 10mM MgCl ₂ , 2mM DTT, 0.02% BSA 6 h enzyme solution 1 ml: 997.2 μl reaction buffer, 2.5 μl TAK1 Reaction buffer 2.3 μg / ml TAK1 6 h ATP solution 1 ml: 994 μl reaction buffer, 6 μl ATP Reaction buffer, 6 μM ATP 6 h test compounds 1 μl (10 mM in DMSO) was diluted with 20 μl reaction buffer containing 20% DMSO, 10 μl was further diluted with 70 μl reaction buffer 60 μM compound in reaction buffer, 3% DMSO 6 h Detektierungslösung 1 ml: 323 μl luciferin / luciferase 667 μl Tris buffer, 2 μl staurosporine stock (1 mM) 1: 3 in Tris buffer, 2 μM staurosporine 8 h

3.3. Experimentelles Verfahren:3.3. Experimental procedure:

3.3.1. Pipettierstufen3.3.1. pipetting steps

1) 2 μl compound (60 μM in reaction buffer, 3% DMSO, control rolls: reaction buffer, 3% DMSO)
2) + 2 μl of enzyme solution (2.3 μg / ml TAK1 in reaction buffer, low control: reaction buffer)
3) Incubate at room temperature for 30 minutes
4) + 2 μl ATP solution (6 μM in reaction buffer)
5) Incubate for 60 minutes at 32 ° C
6) +6 μl detection solution
7) Centrifuge, incubate for 10 minutes at room temperature
8) Reading the luminescence with Tecan Ultra

3.3.2. Kontrollen und Standards:3.3.2. Controls and standards:

1) high control: Tris buffer, 4% DMSO instead of connection solution
2) low control: Tris buffer, 4% DMSO instead of compound, Reaction buffer instead of enzyme solution
3) Standard: 5Z-7-Oxozeaenol, 200 nM in Tris buffer, 4% DMSO

3.3.3. Reagenzkonzentrationen in dem Assay Komponente Konzentration während der Reaktion Konzentration während des Detektierens Puffer 25 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0,02% BSA, pH 7,4 37,5 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01% BSA, pH 7,4 DMSO 1% 0,5% TAK1 770 ng/ml (18 nM) 385 ng/ml ATP 2 μM 1 μM Staurosporin - 1 μM 3.3.3. Reagent concentrations in the assay component Concentration during the reaction Concentration during detection buffer 25mM Tris-HCl, 10mM MgCl ₂ , 2mM DTT, 0.02% BSA, pH 7.4 37.5 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT, 0.01% BSA, pH 7.4 DMSO 1% 0.5% TAK1 770 ng / ml (18 nM) 385 ng / ml ATP 2 μM 1 μM staurosporine - 1 μM

3.3.4. Anmerkungen:3.3.4. Remarks:

1) The pipetting steps were performed with a CyBio Cybi Well 384 tip system performed.
2) The luciferin / luciferase solution is photosensitive. It is made by using black original plates and covering the Test plates protected from light after pipetting.
3) The peaks were washed during the transfer transfer between the compound transfer steps with 10% isopropanol, 0.001% Pluronic F-68 in H 2 O and at all other delivery steps with 10% isopropanol in Tris buffer.

3.3.5. Dosis-Reaktions-Messungen3.3.5. Dose-response measurements

Verbindungen:Links:

1) 3 μl 10 mM in DMSO, 24 μl Reaction buffer, 3% DMSO, gave 1.1 mM compound in reaction buffer, 13.8% DMSO
2) 19.5 μl were transferred to daughter plate, 70 μl reaction buffer without DMSO was added, giving 240 μM Compound in reaction buffer, 3% DMSO (80 μM compound, 1% DMSO in kinase reaction)
3) Serial dilution: 1 + 1 (25 + 25 μl) in reaction buffer, 3% DMSO
4) Test concentrations: 80, 40, ..., 0.625 μl, [DMSO] = 1%

Reaktion:Reaction:

• protocol as for primary Screening described

3.4. Datenanalyse3.4. data analysis

3.4.1. Berechnung der prozentualen Inhibierungswerte3.4.1. Calculation of percent inhibition values

Die Daten sind als relative Zählwerte angegeben:

wobei RLU relative Lumineszenzeinheiten sind.The data is given as relative counts:

where RLU are relative luminescent units.

Die prozentualen Inhibierungswerte wurden wie folgt berechnet:

The percent inhibition values were calculated as follows:

3.4.2. Berechnung der IC₅₀-Werte3.4.2. Calculation of IC ₅₀ values

IC₅₀-Werte wurden bestimmt, indem die Datenpunkte an die nachfolgend gezeigte Gleichung (Parameter C) angepasst wurden. Parameter A wurde auf Null gesetzt. Wenn durch die Daten kein klares Maximum definiert war, wurde Parameter B auf 100 gesetzt.IC ₅₀ values were determined by fitting the data points to the equation shown below (parameter C). Parameter A has been set to zero. If no clear maximum was defined by the data, parameter B was set to 100.

3.4.3. Berechnung der Assay-Qualitätsparameter3.4.3. Calculation of the Assay Quality Parameters

Die Assay-Qualitätsparameter wurden auf Basis von hohen und niedrigen Kontrollen bestimmt, die als interne Standard auf jeder Assay-Platte laufen gelassen wurden. Die folgenden Qualitätsparameter gemäß Referenz 4 wurden als Maß zur Beurteilung der Eignung eines Assays für High-Throughput-Screening verwendet. Signal zu Hintergrund (S/B)

Z-Faktor

Z'-Faktor (Ref. 4)

The assay quality parameters were determined based on high and low controls run as internal standards on each assay plate. The following quality parameters according to Reference 4 were used as a measure to assess the suitability of an assay for high throughput screening. Signal to background (S / B)

Z factor

Z'-factor (ref 4)

4. Ergebnisse4. Results

4.1. TAK1-Assay-Entwicklung4.1. TAK1 Assay Development

Die Abhängigkeit der TAK1-katalysierten ATP-Hydrolyse von der Mg² ⁺-Konzentration wurde getestet. Die Maximalgeschwindigkeit wurde bei einer Konzentration von 10 mM beobachtet. Die Abnahme bei höherer Mg² ⁺-Konzentration könnte auf die Bindung eines zweiten Mg²⁺ an die aktive Stelle zurückzuführen sein (1).The dependence of the TAK1-catalyzed ATP hydrolysis by the Mg ^²⁺ concentration was tested. The maximum rate was observed at a concentration of 10 mM. The decrease at higher Mg ^²⁺ concentration could be due to the binding of a second Mg ²⁺ at the active site to be ( 1 ).

Der Km-Wert von ATP in Bezug auf TAK1 ist 32 μM (2).The Km value of ATP with respect to TAK1 is 32 μM ( 2 ).

Der IC₅₀-Wert von 5Z-7-Oxozeaenol (resorcyclisches Lacton aus einem Pilz) war gemäß Bestimmung 50 nM. TAK1 war mit 1 μM ATP (3) inkubiert worden.The IC ₅₀ value of 5Z-7-oxozeaenol (mushroom resorcylic lactone) was 50 nM as determined. TAK1 was immunized with 1 μM ATP ( 3 ) was incubated.

TAK1 erwies sich unter Reaktionsbedingungen für mehr als 6 Stunden als stabil (4).TAK1 proved to be stable under reaction conditions for more than 6 hours ( 4 ).

Die DMSO-Toleranz für TAK1 war akzeptabel (5).The DMSO tolerance for TAK1 was acceptable ( 5 ).

4.2. TAK1-Validierungs-Screening4.2. TAK1 validation screening

Eine Validierungsbibliothek, die aus 1540 Testverbindungen bestand, wurde einem Screening auf TAK1-Inhibitoren unterzogen.A Validation library, which consisted of 1540 test compounds screened for TAK1 inhibitors.

Die Screening-Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: [Verbindung]/μM 20 Anzahl der Platten 6 Anzahl der Verbindungen 1540 Mittelwert % Inhibierung ± Standardabweichung (SD)^* 9,1 ± 14,5 Schwellenwert für Positivwerte (% Inhibierung) 33 Anzahl der Positivwerte 344 Z'-Faktor (Durchschnitt pro Platte ± SD) 0,74 ± 0,06

*Für Verbindungen mit zwischen –50 und 50% Inhibierung. Der hohe mittlere % Inhibierungswert und die vergleichsweise hohe SD sind das Ergebnis der hohen Trefferrate.

The screening results are summarized in the following table:

[Link] / uM 20 Number of plates 6 Number of connections 1540 Mean% inhibition ± standard deviation (SD) ^* 9.1 ± 14.5 Threshold for positive values (% inhibition) 33 Number of positive values 344 Z'-factor (average per plate ± SD) 0.74 ± 0.06

* For compounds with between -50 and 50% inhibition. The high mean% inhibition value and the comparatively high SD are the result of the high hit rate.

4.3. Test von TBK14.3. Test of TBK1

Protokoll TBK1Protocol TBK1

Reaktionspuffer:Reaction buffer:

1) 50 mM Hepes-NaOH, pH 7.5
2) 5 mM DTT
3) 0.1% Tween 20
4) 10mM MgCl 2

Konzentrationen während der enzymatischen Reaktion:Concentrations during the enzymatic Reaction:

1) [Enzyme] = 60 nM
2) [ATP] = 1 μM

Pipettierstufen:pipetting steps:

1) preheat all reagents 30 ° C
2) 2 μl reaction buffer, 16% DMSO (or compound in reaction buffer, 16% DMSO)
3) + 3 μl of enzyme in reaction buffer
4) + 3 μl of ATP in reaction buffer
5) Incubate at 30 ° C
6) + 8 μl ATP monitoring solution (Cambrex, LT07-111) 1: 3 in 50mM Tris-HCl, pH 7.4
7) Reading the luminescence with Tecan Ultra

ErgebnisResult

Die Aktivität von TBK1 und Inhibierung der Aktivität von TBK1 konnten erfolgreich bestimmt werden, indem die Veränderung der ATP-Konzentration gemessen wurde. Es war kein Proteinkinasesubstrat, z. B. Peptid oder Protein, vorhanden (6).The activity of TBK1 and inhibition of TBK1 activity could be successfully determined by measuring the change in ATP concentration. It was not a protein kinase substrate, e.g. Peptide or protein ( 6 ).

4.4. Anwendung des Assays auf die Kinasen PKA und Abl4.4. Application of the assay to the kinases PCA and Abl

Die Inhibierung von PKA und Abl konnte genau bestimmt werden, indem die Assaybedingungen wie bereits genannt verwendet wurden (7, 8).The inhibition of PKA and Abl could be accurately determined by using the assay conditions as already mentioned ( 7 . 8th ).

Es konnte gezeigt werden, dass die PKA-Inhibierung durch PKA-Inhiitor zu einem IC₅₀-Wert von 105 nm führte (9). Der entsprechende Literaturwert für die Inhibierung der durch PKA katalysierten Phosphorylierung eines Peptidsubstrats ist 135 nM ( Davies et al., Biochem. J. 351, 95–105 (2000) ).It could be shown that PKA inhibition by PKA inhibitor led to an IC ₅₀ value of 105 nm ( 9 ). The corresponding literature value for the inhibition of the PKA-catalyzed phosphorylation of a peptide substrate is 135 nM ( Davies et al., Biochem. J. 351, 95-105 (2000) ).

4.5. Dosis-Reaktions-Messungen für TAK14.5. Dose-response measurements for TAK1

1) Examples of dose-response curves obtained for compounds that inhibit TAK1 are in 10 shown.

4.6. Detektierung der TAK1-Aktivität durch Bestimmung des erzeugten ADP4.6. Detection of TAK1 activity by determining the generated ADP

Beschreibung der FigurenDescription of the figures

1: Mg² ⁺-Abhängigkeit von TAK1-katalysierter ATP-Hydrolyse. Die Maximalgeschwindigkeit wurde bei einer Konzentration von 10 nM beobachtet. Die Abnahme bei höheren Mg² ⁺-Konzentrationen könnte auf die Bindung eines zweiten Mg²⁺-Ions an die aktive Stelle zurückzuführen sein. 1 : Mg ^²⁺ dependency of TAK1-catalyzed ATP hydrolysis. The maximum speed was observed at a concentration of 10 nM. The decrease at higher Mg ^²⁺ concentrations may be due to the binding of a second Mg ²⁺ ion at the active site.

2: ATP-Abhängigkeit von TAK1-ATPase-Aktivität. Die Km für ATP wurde mit 32 μM bestimmt. 2 : ATP dependence on TAK1 ATPase activity. The Km for ATP was determined to be 32 μM.

3: IC₅₀ von 5Z-7-Oxozeaenol, einem resorcyclischen Lacton aus einer Pilzquelle, wurde mit 50 nM bestimmt, was in guter Übereinstimmung mit dem Wert von 26 nM ist (beobachtet bei 1 μM ATP nach verlängertem Inkubieren mit TAK1), der in der Literatur angegeben ist ( Ninomiya-Tsuji et al., JBC 278, 18485–18490, 2003 ). 3 : IC ₅₀ of 5Z-7-Oxozeaenol, a resorcyclischen lactone from a fungal source, was determined to be 50 nM, which is (observed at 1 uM ATP after prolonged incubation with TAK1), which in the in good agreement with the value of 26 nM Literature is given ( Ninomiya-Tsuji et al., JBC 278, 18485-18490, 2003 ).

4: Stabilität von TAK1 bei Raumtemperatur. Es wurde gefunden, dass das Enzym > 6 Stunden in dem Reaktionspuffer stabil war. 4 : Stability of TAK1 at room temperature. It was found that the enzyme was stable in the reaction buffer for> 6 hours.

5: DMSO-Toleranz des Assays 5 : DMSO tolerance of the assay

6: Inhibierung von TBK1 6 : Inhibition of TBK1

7: Hydrolyse von ATP durch Abl 7 : Hydrolysis of ATP by Abl

8: Hydrolyse von ATP durch PKA 8th : Hydrolysis of ATP by PKA

9: Inhibierung von PKA durch PKA-Inhibitor H89 9 : Inhibition of PKA by PKA inhibitor H89

10: Inhibierung von TAK1 durch Testverbindungen. Die IC₅₀-Werte der Verbindungen A (Kreuzsymbole), B (x Kreuzsymbole) C (Kreise), D (Dreiecke) und E (Quadrate) wurden mit 64,2, 16,5, 5,4, 1,7 beziehungsweise < 0,6 μM bestimmt. 10 : Inhibition of TAK1 by test compounds. The IC ₅₀ values of the compounds A (cross symbols), B (x cross symbols) C (circles), D (triangles) and E (squares) were 64.2, 16.5, 5.4, 1.7 and <, respectively 0.6 μM determined.

11: Bestimmung der TAK1-Aktivität durch Messen der Menge an erzeugtem ADP. Messung der TAK1-Aktivität bei 2 μM ATP in Abwesenheit eines Protein-, Peptid-, Zucker- oder Lipidsubstrats. Die ATP-Hydrolyse wurde detektiert, indem die Konzentration des erzeugten ADPs unter Verwendung der Transcreener-Technologie gemessen wurde (Bell Brook Labs, Madison, Wisconsin, USA). 11 Determination of TAK1 activity by measuring the amount of ADP produced. Measurement of TAK1 activity at 2 μM ATP in the absence of a protein, peptide, sugar or lipid substrate. The ATP hydrolysis was detected by measuring the concentration of ADP generated using the Transcree ner technology (Bell Brook Labs, Madison, Wisconsin, USA).

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Armstrong et al., PNAS 76, 722, 1976 [0003]
- "Organic Synthesis Workbook", 1995, John Wiley & Sons, ISBN 3-527-30187-9 [0037]
- "The Organic Chemistry of Drug Synthesis", 1998, John Wiley & Sons, ISBN 0-471-24510-0 [0037]
- "Bioactive Compounds from Natural Sources", 2001, Taylor & Francis, ISBN 0-7484-0890-8 [0037]
Davies et al., Biochem. J. 351, 95-105 (2000) [0061]
Ninomiya-Tsuji et al., JBC 278, 18485-18490, 2003 [0064]

Claims

Method for detecting the activity a kinase by quantifying the hydrolysis of ATP.

The method of claim 1, wherein a) a kinase protein incubated together with ATP in an aqueous solution becomes, b) the amount of ATP that has been hydrolyzed determined becomes.

The method of claim 2, wherein the amount of ATP, which has been hydrolyzed, determined by luciferin / luciferase becomes.

The method of claim 1, wherein a) a kinase protein incubated together with ATP in an aqueous solution becomes, b) the amount of ADP and / or Pi that has been released is determined.

The method of claim 1, wherein a) a kinase protein incubated together with ATP and a detection system, b) the amount of ATP that is hydrolyzed by means of the detection system of a) is determined.

The method of claim 5, wherein the detection system Luciferin / luciferase is.

The method of claim 5, wherein the detection system is specific for ADP and / or Pi.

Method according to one or more of the claims 1-7, wherein the kinase is a tyrosine kinase or a serine / threonine kinase type of kinases is selected.

Method according to one or more of the claims 1 to 8, wherein the protein kinase from the following group EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK.

Method according to one or more of the claims 1 to 9, wherein the protein kinase is selected from TAK1, ABL, PDK4 is.

Method according to one or more of the claims 1 to 9, wherein the aqueous solution is more than one protein kinase protein includes.

Use of a method according to one or more of claims 1 to 11 for identification or profiling a compound that is capable of the activity of a Inhibit or stimulate kinase protein.

Use of a method according to one or more of claims 1 to 11 for the determination of the activity a kinase in a biological sample.

Method of identifying an antagonist a kinase, where a) a kinase in aqueous solution is provided, the possible additional Includes components, b) provided a solution will, the ATP and possible additional components contains c) a solution is provided, the luciferin, luciferase and possible additional Contains components, d) a chemical compound provided, e) the kinase in aqueous solution from a) and the chemical compound from b) are incubated, f) the activity of the kinase using ATP, luciferin and luciferase it is determined g) the result of d) possibly balanced by the results of one or more control experiments is carried out, wherein the incubation according to c) performed is made by the chemical compound and / or the protein kinase protein is omitted or will be.

A method of identifying an agonist of a protein kinase comprising: a) providing a kinase in aqueous solution comprising possible additional compounds, b) providing a solution containing ATP and possible additional components, c) providing a solution comprising luciferin, Luciferase and possible additional components, d) an inhibitor of the protein kinase is provided, e) a chemical compound is provided, f) the kinase in aqueous solution according to a), the inhibitor according to b) and the chemical compound according to c) g) the activity of the protein kinase is determined by means of ATP, luciferin and luciferase, h) the result of e) is possibly weighed out by results of one or more control experiments, wherein the incubation according to d) is carried out by the chemical compound and / or the protein kinase is omitted.

A method of identifying an agonist Claim 15, wherein no inhibitor is included.

Method of identifying an antagonist or agonists according to claims 14 to 16, characterized that the kinase protein from a tyrosine kinase or a serine / threonine kinase type of the Protein kinases is selected.

Method of identifying an antagonist or agonists according to claims 14 to 16, characterized that the protein kinase protein from the group of EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK is selected.

Method of identifying an antagonist or agonists according to claims 11 to 13, characterized that the protein kinase protein is selected from TAK1, ABL or PDK4 becomes.

Method of identifying an antagonist or agonists according to one or more of claims 14 to 19, with such a method as high-throughput screening (HTS) is performed.