DE102006032610B4

DE102006032610B4 - Verfahren zur parallelen Isolierung viraler Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102006032610B4
Application number: DE200610032610
Authority: DE
Inventors: Timo Dr. Hillebrand
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2006-07-11
Filing date: 2006-07-11
Publication date: 2011-05-26
Anticipated expiration: 2026-07-12
Also published as: WO2008006865A1; DE102006032610A1; EP2041310A1; DE102006032610C5

Abstract

Verfahren zur parallelen Isolierung doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäuren zu trennen, wobei die Proben mit Lysepuffern, die hohe Salzkonzentrationen oder niedrige Salzkonzentrationen oder proteolytische Enzyme enthalten, versetzt werden, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
a) die nukleinsäurehaltige Probe wird vor deren Lyse oder die bereits lysierte oder homogenisierte Probe wird mit einem Bindungspuffer, der mindestens ein nichtionisches Detergenz in Konzentration von 10 bis 50% enthält, so eingestellt, dass die Gesamtnukleinsäure an einen festen Träger adsorbiert wird
b) Entfernen des Trägers mit der adsorbierten Gesamtnukleinsäure
c) Waschen und Eluieren der adsorbierten Gesamtnukleinsäure nach bekannten Verfahren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen, einfachen und hochsensitiven Isolierung viraler Nukleinsäuren.
Die Untersuchung diagnostisch relevanter biologischer Proben (Serum, Plasma, Blut, Liquor, Tupferproben, Organabriebe etc.) zum Nachweis infektiöser Erreger gewinnt immer mehr an Bedeutung. Virusinfektionen wie HIV, HCV oder HBV breiten sich weltweit immer stärker aus. Darüber hinaus erfordert das massenhafte Auftreten neuartiger Viruserkrankungen (z. B. Vogelgrippe) ein schnelles und flexibles Reagieren für den sensitiven diagnostischen Virusnachweis. Neue Testverfahren auf Basis der Verwendung sensitiver Amplifikationstechniken wie Real Time-PCR ermöglichen einen hocheffizienten Virusnachweis und werden immer stärker als diagnostische Instrumentarien eingesetzt. Dem Schritt der molekularen Probenvorbereitung in der Form der Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren kommt immer größere Bedeutung zu.
Die Sensitivität des Testsystems wird durch den Prozess der Isolierung der Nukleinsäure maßgeblich beeinflusst.
Es existieren eine Reihe von Extraktionsverfahren, welche die Isolierung viraler Nukleinsäuren ermöglichen. Das Patent US 5,234,809 A beschreibt einen Prozess zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase. Die dann bindende feste Phase besteht dabei aus silikatischen mineralischen Partikeln, welche > 50 nm sind. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung. Allerdings zeigt sich in der praktischen Anwendung, das dass in der Patentschrift beschriebene Verfahren eine Reihe von Nachteilen mit sich bringt. Die Verwendung von partikulären Systemen für die Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren ist prinzipiell sehr umständlich zu handhaben. Darüber hinaus zeigt sich, dass die Nutzung von Puffern auf der Basis der Verwendung chaotroper Salze in Bezug auf eine notwendige hochsensitive Virusdetektion oftmals nicht ausreicht.
Eine Verbesserung des Verfahrens offenbart die Patentschrift WO 95/01359 A1 . Das Verfahren beschreibt die chromatographische Reinigung und Trennung von Nukleinsäuregemischen aus einer Lösung, die eine hohe Salzkonzentration und eine hohe Alkoholkonzentration aufweist.
Die Lösung wird wiederum mit einem Trägermaterial zur Anbindung der Nukleinsäuren in Kontakt gebracht, nachfolgend wird das Trägermaterial mit an sich bekannten alkoholischen Waschpuffern gewaschen und die gebundene Nukleinsäure final mittels Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer wieder vom Trägermaterial abgelöst.
Das Verfahren realisiert eine effiziente Isolierung und ggf. auch Trennung von Nukleinsäuren/Nukleinsäuregemischen und ist einfach und schnell in der Durchführung. Die Verbessung gegenüber der oben zitierten Patentschrift wird durch die Zugabe eines Alkohols zum initialen Lysepuffer erreicht. Dieser Schritt ermöglicht eine Effizienzsteigerung des Extraktionsprozesses, welche es gestattet, auch sensitiv Nukleinsäure-Targets aus einer klinischen Probe zu isolieren. Ein weiteres Verfahren der Trennung und Isolierung von einzelsträngigen und doppelsträngigen Nukleinsäuren wird in der Patentschrift EP 1146049 A2 offenbart.
Das Verfahren basiert auf der Behandlung einer Nukleinsäuren enthaltenden Quelle mit mindestens einem mineralischen Trägermaterial in der Form das:

1. die einzelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, indem man die Behandlungsbedingungen durch ein wässriges Gemisch von chaotropen Salzen und niederen aliphatischen Alkoholen einstellt, derart, dass nachfolgend vorrangig die einzelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die doppelsträngige Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene einzelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
2. die doppelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, indem man die Behandlungsbedingungen durch ein Gemisch von Erdalkali-Ionen komplexierenden Substanzen ohne niedere aliphatische Alkohole einstellt, derart dass nachfolgend vorrangig die doppelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die einzelsträngige Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
3. die doppelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, in dem man die Behandlungsbedingungen durch die Anwesenheit eines Sarkosinats aber ohne niedere aliphatische Alkohole einstellt, derart, dass nachfolgend vorrangig die doppelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die einzelsträngige Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
4. die doppelsträngige oder einzelsträngige Nukleinsäuren isoliert wird, in dem man die Behandlungsbedingungen durch ein wässriges Gemisch von chaotropen Salzen und niederen aliphatischen Alkoholen einstellt, derart, dass beide Nukleinsäurefraktionen an einen mineralischen Träger adsorbieren. Die Trennung der Nukleinsäuren erfolgt durch eine selektive Elution. Dabei wird die doppelsträngige Nukleinsäure mittels einer Lösung verminderter Ionenstärke und niederen aliphatischen Alkoholen vom Trägermaterial abgelöst. Die verbleibende einzelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial abgelöst.

Alternativ dazu kann die einzelsträngige Nukleinsäure mittels einer Lösung, welche Erdalkali-Ionen komplexierende Substanzen und/oder Sarkosinate enthält, selektiv vom Trägermaterial eluiert werden. Die nunmehr verbleibende doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend wiederum gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial abgelöst.
Das Verfahren ist wiederum einfach in der Durchführung und kann DNA oder RNA aus biologischen Proben isolieren. Auch wenn sich das Patent auf die Trennung von Nukleinsäuregemischen bezieht, wird dem Fachmann beim Lesen des Unteranspruches 4 klar, das wiederum, wie schon in der Patentschrift WO 95/01359 A1 beschrieben, durch die Kombination einer Salzlösung mit einem Alkohol, die Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Material realisiert wird. Entscheidend für den Schritt der Anbindung von Nukleinsäuren an mineralische Materialien ist dabei wiederum die Existenz eines Alkohols in den für den Extraktionsprozess eingesetzten Puffer. Damit weist der Stand der Technik darauf hin, das eine Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Proben unter Verwendung von chaotropen Salzen allein funktioniert, das Verfahren aber erst durch die Zugabe eines Alkohols (d. h. eine Kombination aus einer salzhaltigen Lösung mit einem aliphatischen Alkohol) wirklich effizient wird.
Der Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, die Nachteile, die im Stand der Technik genannt wurden, zu beseitigen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe konnte in überraschender Weise einfach gelöst werden. Das Verfahren ist durch den Patentanspruch 1 mit seinen Verfahrensalternativen charakterisiert. Die Unteransprüche 2 bis 8 betreffen spezifische Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Erfindungsgemäß wurde ein alternatives Verfahren bereitgestellt, welches es erlaubt, schnell, einfach und preiswert Nukleinsäuren aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe zu isolieren, ohne dass die für die selektive Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Lösungen einen Alkohol enthalten. Dabei gestattet das Verfahren, gleichzeitig und damit keine Trennung von Nukleinsäuregemischen bewirkend, DNA (doppelsträngige Nukleinsäure) und RNA (einzelsträngige Nukleinsäure) aus einer Ausgangsprobe zu isolieren. Insbesondere ist das Verfahren in der Lage, hochsensitiv virale Nukleinsäuren aus diagnostisch relevanten biologischen Proben zu isolieren.
Überraschender Weise kann eine hocheffiziente Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe auch auf einem ganz anderen Weg, als im Stand der Technik beschrieben, erreicht werden, wobei gänzlich auf die dafür bisher notwendige essentielle Komponente Alkohol verzichtet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Lyse einer biologischen Probe mit an sich bekannten Lysepuffern. Die Lysepuffer enthalten z. B. bekannte chaotrope Salze hoher Ionenstärken oder Kombinationen von chaotropen Salzen hoher Ionenstärken mit einem Sarkosinat und ggf. weiteren Zusätzen. Diese Puffersysteme erlauben in ihrer bekannten Funktion den Aufschluss und eine Denaturierung einer biologischen Probe und bewirken auch eine Inaktivierung endogener RNasen. Dies ist insbesondere in Hinblick auf die Isolierung von RNA wesentlich. Es können auch Lysepuffer verwendet werden, welche eine Kombination von chaotropen Salzen und anderen Salzen darstellen und welche zur Unterstützung des Lyseprozesses ggf. noch Detergenzien und ggf. weitere Zusätze enthalten, wobei bei den chaotropen Salzen keine an sich bekannten hohen Ionenstärken benötigt werden. Eine solche Kombination erlaubt dann eine effiziente Einbeziehung proteolytischer Enzyme (z. B. Proteinase K) für einen wirksamen Aufschluss des Ausgangsmaterials.
Nach Lyse des Ausgangsmaterials werden dann die Bindungsbedingungen zur Anbindung der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial eingestellt.
Dies erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren nicht durch die Zugabe eines Alkohols, sondern überraschender Weise durch die Zugabe eines nichtionischen Detergenzes, wie z. B. Tween-20, Tween-80 oder Triton X-100 in einer hohen Konzentration. Die Zugabe des Detergenzes ist dabei der essentielle Schritt. Das Detergenz ersetzt erfindungsgemäß komplett die Funktion der Zugabe einer bisher dazu notwendigen alkoholischen Komponente. Der Lyseansatz, welcher mit dem Detergenz gemischt wird, wird nachfolgend mit einem Träger, vorzugsweise ein mineralischer Träger oder oberflächenfunktionalisierte Magnetpartikel oder Eisenoxydpartikel, in Kontakt gebracht, wodurch die zu isolierenden Nukleinsäuren an den mineralischen Träger adsorbieren. Der mineralische Träger wird nachfolgend mit an sich bekannten Waschpuffern gewaschen und final wiederum mittels Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer vom mineralischen Material abgelöst. Die für die Anbindung der Nukleinsäuren benötigte Detergenz-Komponente kann darüber hinaus auch als ein Gemisch von Detergenz mit weiteren Salzen und ggf. weiteren Zusätzen vorliegen. Damit können immer jeweils optimale Bindungsbedingungen in der Kombination von Salz/Detergenz erreicht werden, ohne das dies auf die initiale Nutzung eines effizienten Lyepuffers einen Einfluss hat. So kann z. B. ein Lysepuffer zum initialen Probenaufschluss eingesetzt werden, welcher nur eine geringe Salzkonzentration aufweist (welche nicht ausreichend wäre, um in der Kombination mit einem Detergenz eine effiziente Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren zu vermitteln). Nach Probenaufschluss wird dem Reaktionsansatz dann ein Bindungspuffer zugegeben, welcher ein nichtionisches Detergenz hoher Konzentration sowie zusätzlich eine hohe Salzkonzentration aufweist. Damit werden dann die Bindungsbedingungen eingestellt, die eine quantitative Isolierung der viralen Nukleinsäuren effizient vermitteln. Entscheidend ist immer, dass über den Bindungspuffer auf der Basis einer hohen Konzentration nichtionischer Detergenzien auch die weiteren Komponenten bereitgestellt werden, welche eine effiziente Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren ermöglichen.
Das Verfahren ist damit komplett alternativ zu den beschriebenen Verfahren, welche für eine effiziente Anbindung von Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien einen Alkohol benötigen. Es erlaubt darüber hinaus die parallele Isolierung doppelsträngiger und einzelsträngige Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe, ohne die doppelsträngige und einzelsträngige Nukleinsäuren zu trennen. Darüber hinaus besteht ein entscheidender Vorteil auch darin, dass in Bezug auf die Auswahl des Lysepuffers eine hohe Flexibilität erreicht wird. Damit können auch an sich bekannte, effizient wirkende Lysepuffer einschließlich proteolytischer Enzyme verwendet werden. Die Einstellung der Bindungsbedingungen für Nukleinsäuren für deren Adsorption an ein mineralisches Trägermaterial erfolgt immer nach der Lyse des Ausgangsmaterials durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Bindungspuffers, enthaltend eine hohe Konzentration eines nichtionischen Detergenzes und ggf. enthaltend weitere Zusätzen.
Die Erfindung ermöglicht erstmals die parallele Isolierung doppelsträngiger und einzelsträngiger Nukleinsäuren aus einer nukleinsäurehaltigen Probe, wobei die nukleinsäureenthaltende Probe mit einem Puffer, der entweder aus einer Salzlösung aus chaotropen Salzen oder einer Salzlösung aus chaotropen Salzen geringer Ionenstärke (kleiner 100 mM) und anderen nichtchaotropen Salzen besteht, sowie ggf. weiteren Zusätzen wie Detergenzien (SDS, Sarkosinat, LDS), proteolytischen Enzymen, komplexierenden Verbindungen (EDTA, EGTA), inkubiert wird, unter diesen Bedingungen ein Aufschluss der biologischen Probe erfolgt, so dass die Nukleinsäuren in den Puffer freigesetzt werden,
Erfindungsgemäß werden durch die Zugabe eines Bindungspuffers bestehend aus:

a) einem nichtionischen Detergenz oder
b) einem Gemisch eines nichtionischen Detergenzes mit Wasser oder
c) einem Gemisch eines nichtionischen Detergenzes mit einer Salzlösung

Das mineralische Material nachfolgend mit Waschpuffer wäscht und die Nukleinsäuren mittels Wasser oder Niedrigsalzpuffer vom mineralischen Material wieder ablöst.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der in den Ansprüchen 9 bis 11 beschrieben wird.
Die erfindungsgemäße Verwendung besteht darin, dass nichtionische Detergenzien in einer Konzentration von 5–50%; vorzugsweise 10–30%, in Abwesenheit von Alkohol, zur parallelen Isolierung einzel- und doppelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren zu trennen, durch Bindung der Gesamtnukleinsäuren an einen festen Träger, eingesetzt werden. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft bei der Isolierung von viralen Nukleinsäuren.
Das Verfahren soll nachfolgend anhand eines Beispiels beschrieben werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu werden.
Ausführungsbeispiel
Beispiel: Isolierung viraler Nukleinsäuren aus Blutplasma
Zwei Blutplasma-Proben wurden mit HIV Viren und HBV Viren gespiked und für die Isolierung der viralen Nukleinsäure eingesetzt. 150 μl der Probe wurden in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Probe wurde nachfolgend mit 450 μl eines Lysepuffers (4 M Guanidinthiocyanat, 80 mM tri-Natriumcitrat-Dihydrat) versetzt und 10 s gevortext. Anschließend wurde die Probe bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Nach der Lyse und Denaturierung der Ausgangsprobe wurden 600 μl eines Bindungspuffers (30% Tween-20, 5 mM EDTA, 20 mM tri-Natriumcitrat-Dihydrat) zugegeben und die Probe vollständig durchmischt. Der Ansatz wurde nachfolgend über eine Filtersäule, welche ein kommerziell verfügbares Glasfaser-Filterpapier (Fa. Whatmann) enthielt, zentrifugiert. Die Filtersäule wurde nachfolgend mit alkoholischen Waschpuffern gewaschen. Danach kurz zentrifugiert, um das Filtermaterial zu trocknen. Die Elution der gebundenen viralen Nukleinsäure erfolgte mittels der Zugabe von 50 μl RNAse freiem Wasser.
Die isolierte Nukleinsäure wurde dann zum spezifischen Virusnachweis von HIV bzw. HBV mittels Real-Time PCR analysiert. Der Nachweis der viralen Nukleinsäuren war erfolgreich. Ergebnisse:

Plasma Probe Virusnachweis CT-Wert

Probe 1 HIV 1000 IU/ml 34,33

Probe 1 HBV 500 IU/ml 30,52

Probe 2 HIV 1000 IU/ml 34,86

Probe 2 HBV 500 IU/ml 30,78

Claims

Verfahren zur parallelen Isolierung doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäuren zu trennen, wobei die Proben mit Lysepuffern, die hohe Salzkonzentrationen oder niedrige Salzkonzentrationen oder proteolytische Enzyme enthalten, versetzt werden, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) die nukleinsäurehaltige Probe wird vor deren Lyse oder die bereits lysierte oder homogenisierte Probe wird mit einem Bindungspuffer, der mindestens ein nichtionisches Detergenz in Konzentration von 10 bis 50% enthält, so eingestellt, dass die Gesamtnukleinsäure an einen festen Träger adsorbiert wird b) Entfernen des Trägers mit der adsorbierten Gesamtnukleinsäure c) Waschen und Eluieren der adsorbierten Gesamtnukleinsäure nach bekannten Verfahren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäuren um virale Nukleinsäuren handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei Lysepuffern niedriger Salzkonzentrationen, also kleiner als 100 mmol/l, das nichtionische Detergenz zusätzlich eine Salzlösung größer 1 mol/l enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Detergenz-Konzentration zur Anbindung der Nukleinsäuren 10–30%, im finalen Gemisch von Lysepuffer/Bindungspuffer beträgt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Detergenz Tween-20, Tween-80 oder Triton X-100 eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindungspuffer zusätzlich a) SDS, Sarkosinat, LDS und/oder b) komplexierende Verbindungen, insbesondere EDTA oder EGTA, enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als fester Träger ein mineralischer Träger oder magnetische Eisenoxidpartikel, vorzugsweise mit modifizierten Oberflächen, eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger Bestandteil einer Mini-Zentrifugationssäule ist.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend • Lysepuffer • eine Lösung eines nichtionischen Detergenzes zur Anbindung der Nukleinsäuren, so dass deren Konzentration so gewählt wird dass die finale Detergenz-Konzentration im Bindungspuffer zwischen 10 und 50% beträgt • mindestens einen festen Träger • Wasch- und Elutionspuffer.
Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Salzlösung größer 1 mol/l umfasst.
Kit nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich a) SDS, Sarkosinat, LDS und/oder b) komplexierende Verbindungen, insbesondere EDTA oder EGTA, enthält.
Verwendung von nichtionischen Detergenzien in einer Konzentration von 10–50%; vorzugsweise 10–30%, zur parallelen Isolierung einzel- und doppelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäuren zu trennen, durch Bindung der Gesamtnukleinsäuren an einen festen Träger.
Verwendung nach Anspruch 12 zur Isolierung von viralen Nukleinsäuren.