DE102006012162A1

DE102006012162A1 - Knochen Reparaturmaterial unter Verwendung einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein Gerüst

Info

Publication number: DE102006012162A1
Application number: DE102006012162A
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Okihana
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-16
Publication date: 2006-11-30
Also published as: US20060212125A1; FR2883187A1; JP2006289062A; GB2424580A; GB0605448D0

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verbundmaterial zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus, umfassend A) eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und B) ein Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus, umfassend A) das Bereitstellen einer gesammelten Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und B) das Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie auf einem Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, bereit.

Description

BEZUGNAHME UND VERWANDTE ANMELDUNGEN

Die vorliegende Erfindung beansprucht die Priorität der japanischen Patentanmeldungen Nr. 2005-80677 und 2006-61931, jeweils eingereicht am 18. März 2005 bzw. 07. März 2006, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Material zum Verstärken und Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus gerichtet. Insbesondere ist die Erfindung auf ein Verbundmaterial unter Verwendung einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein Gerüst, ebenso wie auf ein Verfahren zur Herstellung und die Verwendung davon, gerichtet.

Die Förderung von Knochenbildung ist ein bevorzugtes Verfahren um viele Erkrankungen, die mit dem Knochen, oder Schädigung oder Defizienzen des Knochens assoziiert sind, zu behandeln. Wenn das Knochengewebe eine Schädigung, wie einen Bruch erleidet, proliferieren und differenzieren sich Osteoblasten, Knochenbildungszellen, um den Knochen zu regenerieren. In einem geringen Fall der Schädigung erlaubt die Immobilisierung des Knochens an dem betroffenen Bereich, dass Osteoblasten aktiviert werden, wodurch der bestimmte Bereich repariert wird. Unter Umständen, unter denen Osteoblasten nicht wirksam aktiviert werden können, wie im Fall eines komplexen Bruchs oder einer Schädigung in einer Sehne, oder einer Schädigung in Kombination mit Osteomyelitis, wurde die autologe Knochentransplantation im Allgemeinen als ein Standardverfahren zum Reparieren von Schädigung oder Defizienzen erachtet. Wenn der defekte Bereich zu groß ist, um mit autologem Knochen repariert zu werden, kann künstlicher Knochen in teilweiser Kombination mit autologem Knochen verwendet werden. Jedoch sind im Menschen die Quellen für autologen Knochen begrenzt. Zusätzlich ist das Bereitstellen von autologem Knochen von hohen Kosten und Schmerzen für den Spender begleitet. Darüber hinaus verursacht die Verwendung von autologem Knochen eine neue Defizienz in einem Bereich, der ursprünglich normal war, und von dem der autologe Knochen erhalten wurde. Es besteht der weitere Nachteil, dass eine zusätzliche Operation benötigt wird, um den Knochen zu gewinnen, wobei die Menge des Knochens, der gewonnen werden kann, begrenzt ist.

In den Vereinigten Staaten wird allogener Knochen, der von Kadavern erhalten wurde, häufig verwendet. Hingegen ist in Japan die Verwendung von Kadavergeweben ungewöhnlich, und somit werden sie nicht so häufig verwendet. Obwohl Knochenbanken ein alternativer Weg sind, um autologen Knochen bereitzustellen, ist die bislang an autologem Knochen auf diese Weise bereitgestellte Menge klein.

Zum Beispiel wird allogener Knochen, der aus Kadavern erhalten wurde, häufig in den Vereinigten Staaten verwendet. Jedoch verursacht es das Problem der häufigen Übertragung von Infektion.

Deshalb wurden verschiedene chirurgische Verfahren, wie die Verwendung von künstlichen Knochenimplantaten und Knochen Reparaturmaterialien verwendet. Jedoch ist nach diesen chirurgischen Verfahren die Prognose für solche Verfahren nicht immer gut, und vielfache Operationen werden häufig benötigt.

Die japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 2003-38635 beschreibt ein Material zum Reparieren des Knorpel-Knochen defekten Bereichs, wobei Knorpelzellen oder Knochenmarkszellen in lösliches Atelocollagen eingebettet sind und anschließend innerhalb eines porösen Körpers aus Beta-Tricalciumphosphat verfestigt werden. Diese Veröffentlichung beschreibt jedoch nicht die Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie. Darüber hinaus erfordert dieses Verfahren, dass die Zellen in löslichem Atelocollagen eingebettet sind und anschließend koagulieren.

Die japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. H10-243996 beschreibt ein Biomaterial zum Verstärken der Kalzifizierung von hartem Gewebe, wobei die Hauptbestandteile Calciumphosphat Verbindungen und Aggregate von Knochenzellen sind. Das Verfahren beabsichtigt nicht die Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie. Darüber hinaus bilden die Knochenzellen in dieser Erfindung Aggregate, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie auf einem Gerüst kultiviert werden.

Die japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 2004-8634 beschreibt ein Gerüst, das aus einem Material besteht, das aus bioabbaubaren Molekülen mit verringertem Calciumphosphat hergestellt wurde, das in der Lage ist, wirksam eine Schnittstelle zwischen hartem und weichem Gewebe zu regenerieren. In diesem Verfahren muss verringertes Calciumphosphat verwendet werden. Es ist nicht beabsichtigt, das Gerüst, das in diesem Dokument beschrieben ist, mit Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie zu verwenden.

Die WO 98/16209 beschreibt ein synthetisches, wenig kristallines Apatit (PCA) Calciumphosphat, das ein biologisch aktives Mittel und/oder Zellen enthält. In diesem Verfahren muss das verwendete Calciumphosphat wenig kristallin sein. Dieses Dokument beschreibt in vivo und in vitro Beispiele von Knorpelbildung (Chondrogenese) unter Verwendung einer Zusammensetzung des PCA Materials, das mit Knorpelzellen inokuliert ist (Beispiele 28 – 31). Jedoch sind dies Beispiele der Knorpelbildung anstelle der Knochenbildung (Osteogenese). Obwohl dieses Dokument ein Beispiel heterotropher Knochenbildung (Beispiel 27) beschreibt, ist es auf die Verwendung von Knochenmarkszellen gerichtet. In diesem Dokument sind keine Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie beschrieben.

Deshalb weisen herkömmliche künstliche Knochenimplantate und Knochen Reparaturmaterialien dahingehend ein Problem auf, dass sie nicht einfach verwendet werden können.

Darüber hinaus weisen herkömmliche künstliche Knochenimplantate und Knochen Reparaturmaterialien auch Nachteile im Vergleich zu autologem Knochen auf, wie schlechte osteogene Fähigkeit, Schwierigkeiten bei der Knochenbildung, geringere Festigkeit und Brüchigkeit.

Obwohl der Anteil der Verwendung von künstlichem Knochen aufgrund der oben beschriebenen Gründe ansteigt, verbleibt sie bei 20 – 30 %, und autologer Knochen wird in den verbleibenden 60 – 80 % der Fälle verwendet. Um die obigen Nachteile des künstlichen Knochens zu verbessern, haben Versuche begonnen, die regenerative Medizin unter Verwendung des regenerativen Potenzials von Zellen zu verwenden. Diese Versuche wurden auch auf die Behandlung von Knochendefizienz angewendet. Es werden allgemein Stammzellen, die von Knochenmark abgeleitet sind, in einer solchen regenerativen Medizin verwendet.

Es wurde gezeigt, dass Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie Knochenbildung induzieren, wenn sie pelletiert und implantiert werden (Okihana H. und Shimomura Y., Bone 13, 387 – 393 (1992)). Wenn Zellen ohne Pelettieren implantiert werden, verteilen sie sich im Allgemeinen und können keinen Knochen bilden, so dass solche Zellen einen defekten Bereich des Knochens nicht adäquat behandeln können. Wenn sie jedoch pelletiert werden, ist es schwierig eine Größe zu erreichen, die für die aktuelle Behandlung des Knochendefizits geeignet ist. Herkömmlich ist die Knochenreparatur unter Verwendung von Knochenmarkszellen, mesenchymalen Stammzellen, Osteoblasten, die in der regenerativen Medizin verwendet werden, immer noch überlegen gegenüber der Verwendung von auto logem Knochen und ist für die herkömmliche Verwendung nicht akzeptabel (siehe z.B. WO 97/40137, WO 96/23059, japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 2003-199815, japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 2003-52365, US Patent Nr. 5,486,359, US Patent Nr. 5,226,914, WO 97/40137, WO 99/46366, Ohguchi, H. et al., Acta Orthop. Scand., 60:334 – 339 (1989), Caplan, A. I.: J. Orthop. Res., 9: 641 – 650 (1991), Bruder, S. et al.: J. Bone Joint Surg., 80A: 985 – 996 (1998), Yoshikawa, T. et al.: Biomed Material Eng., 8: 311 – 320 (1998), Pittenger, M. F. et al.: Science, 284: 143 – 147 (1999), Bianco, P. & Robey, P. G.: Nature, 414: 118 – 121 (2001), Quarto, R. et al.: New Eng. J. Med., 344: 385 – 386 (2001), und Okihana: Medical Science Digest Vol. 30 (1) (2004)).

Einhorn, T. A. et al., J. Bone Joint Surg., 66A: 274 – 279 (1984) beschreibt, dass die Transplantation von allogenem Knochen in einen defekten Bereich von Knochen in der Ratte zu Knochenbildung führt. Jedoch weist die Transplantation von allogenem Knochen, um den defekten Bereich des Knochens in Menschen zu behandeln, viele Beschränkungen auf und ist deshalb unrealistisch. Deshalb werden alternative Verfahren zu der allogenen Knochentransplantation benötigt.

Bruder, S. P. et al., J. Bone Joint Surg., 80A: 985 – 996 (1988) beschreibt ein Experiment, wobei ein keramisches Implantat und mesenchymale Stammzellen in einen defekten Bereich eines Oberschenkels in einem Hund implantiert wird. Dieser Artikel berichtet, dass die Transplantation eines keramischen Implantats und mesenchymaler Stammzellen in einen defekten Bereich des Knochens zu Knochenadhäsion führt.

Jedoch ist die Erfolgsrate der Transplantation eines keramischen Implantats und mesenchymaler Stammzellen in einen defekten Bereich des Knochens nicht so hoch wie bei autologem Knochen, und deshalb wird dieses Verfahren nicht als praktikabel angesichts seines Kulturzeitraums oder Kosten erachtet.

Mesenchymale Stammzellen im Knochenmark sind Mitglieder der Zelllinie, die in Knochen differenziert, und sie wurden experimentell in Kombination mit einem Ge rüst für die Transplantation in einen defizienten Bereich eines Knochens verwendet (Bruder, S. P. et al. (1988), supra). Es wird außerdem angenommen, dass Osteoblasten oder Vorläuferzellen davon (wie mesenchymale Stammzellen) essenziell für eine gute Knochenbildung sind. Während jedoch der Versuch, ein Gerüst für Knochenbildung und Osteoblasten zusammen in einen defizienten Bereich eines Knochens zu transplantieren, um Knochenbildung zu induzieren, beschrieben wurde (WO 98/16209), gibt es keine Beschreibungen irgendeiner praktischen Anwendung dieser Technik, was nahe legt, dass es keine praktikable Technik ist, ähnlich zu der Verwendung von mesenchymalen Stammzellen.

Ich habe gezeigt, dass Knochenbildung durch wachsende Knorpelzellen induziert werden kann, d.h. eine andere Zelle als Osteoblasten oder Vorläuferzellen. Jedoch gibt es keine Berichte der Verwendung von wachsenden Knorpelzellen in Verbindung mit einem Gerüst. Deshalb ist es nicht möglich, die Menge der Knochenbildung abzuschätzen, die durch die Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie mit einem Gerüst erreicht wird. Weil die Knochenbildung im Allgemeinen durch Osteoblasten induziert wird, war es nicht realistisch, andere Zellen als Osteoblasten zu verwenden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verbundmaterial vergleichbar zu autologem Knochen, oder mindestens zu allogenem Knochen, ebenso wie ein Verfahren für die Herstellung und die Verwendung davon, bereitzustellen, das zur Verfügung steht, um Knochendefizienzen im großen Maßstab, Knochentumore, komplexe Brüche und ähnliches, in einem biologischen Organismus zu behandeln.

Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verbundmaterial bereitzustellen, das nützlicher ist als herkömmliche künstliche Knochenimplantate und Knochen Reparaturmaterialien bezüglich der Geschwindigkeit von Knochenregeneration, Stärke des regenerierten Knochens und ähnlichem.

Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verbundmaterial bereitzustellen, das verwendet werden kann, um die Knochenbildung in einem defekten Bereich des Knochens mit einer Größe zu verbessern, die nicht durch Fixierung alleine repariert werden kann.

Die oben genannten Ziele wurden teilweise durch die vorliegende Erfindung gelöst, weil gefunden wurde, dass ein Verbundmaterial, das eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst, das mit einem biologischen Organismus bioverträglich ist umfasst, eine Eigenschaft aufweist, welche die unerwartete Progression von Knochenbildung als eine Kombination von Zelle und einem Gerüst bewirkt. Insbesondere habe ich gefunden, dass die Kombination einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträgliches Gerüst unerwartet höhere Geschwindigkeiten von Knochenbildung zeigt als die Kombination eines Osteoblasten und eines Gerüsts, von dem angenommen wurde, dass es essentiell für Knochenbildung ist, und dass die Kombination von Gerüst und Zellen, von der herkömmlich nicht angenommen wurde, dass sie praktikabel ist, verwendet werden kann, um ein Knochendefizit auf einer praktikablen Ebene zu behandeln. Unter Berücksichtigung, dass bis jetzt, gemäß dem allgemeinen Wissen innerhalb des Standes der Technik, die Knochenbildung durch Osteoblasten durchgeführt wird, und dass es deshalb nicht praktikabel ist, andere Zellen als Osteoblasten zu verwenden, um die Knochenbildung zu fördern, ist die Geschwindigkeit der Knochenbildung, die durch die vorliegende Erfindung erreicht wird, signifikant hervorragend.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung eines Verbundmaterials im Vergleich zu autologem Knochen oder mindestens zu allogenem Knochen bereit.

Um die oben genannten Ziele zu erreichen, stellt die Erfindung folgendes bereit: In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verbundmaterial zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus bereit, umfassend:

A) eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, und
B) ein Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.

In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verbundmaterial zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus bereit, wobei die Knochenbildung zur Reparatur eines defekten Bereichs des Knochens dient.

In einer anderen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verbundmaterial verwendet, um die Knochenbildung in einem defekten Bereich des Knochens zu verbessern, der eine Größe aufweist, die nicht durch Fixierung alleine repariert werden kann.

In einer Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, in einem Bereich enthalten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Oberfläche und einem Bereich innerhalb einer inneren Pore des Gerüsts, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.

In einer anderen Ausführungsform exprimiert die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, mindestens einen Marker, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Typ X Collagen, alkalischer Phosphatase, Osteonektin, Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan oder Bestandteile davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen und Chondromodulin.

In einer weiteren Ausführungsform wird die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, durch morphologische Hypertrophie gekennzeichnet.

In einer anderen Ausführungsform wird die Knorpelzelle, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, bestimmt, dass sie das Potenzial für Hypertrophie aufweist indem ihre signifikante Proliferation beobachtet wird durch Herstellen eines Pellets der Zellen durch Zentrifugation von 5 × 10⁵ Zellen in einem Kulturmedium, Kultivieren des Pellets für einen vorbestimmten Zeitraum und Vergleichen einer Größe der Zellen, die unter einem Mikroskop vor Kultur mit jener nach der Kultur beobachtet werden.

In einer Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, von einem Säugetier abgeleitet.

In einer anderen Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einem Hund, einer Katze oder einem Pferd abgeleitet.

In einer alternativen Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, von einem allogenen Individuum abgeleitet.

In einer anderen Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, von einem heterologen Individuum abgeleitet.

In einer Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, eine Zelle, die von einem Abschnitt erhalten wurde, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Knorpel-Knochenübergang der Rippen, der epiphysialen Linie von Röhrenkno chen, der epiphysialen Linie von Wirbeln, der Knorpel Proliferationszone von Knöchelchen, des Perichondriums, der Knochenorgananlage, die aus Knorpel des Fötus gebildet wird, dem Kallusbereich einer heilenden Knochenfraktur und dem knorpeligen Teil der Knochen Proliferationsphase.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die epiphysiale Linie des Röhrenknochens ein Bereich, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oberschenkelknochen, Schienbein, Wadenbein, Oberarmknochen, Elle und Speiche.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Knorpel Proliferationszone des Knöchelchens ein Bereich, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Handknochen, Fußknochen und Brustbein.

In einer Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, auf eine Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml bis 1 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt.

In einer Ausführungsform wird die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, in einem Medium kultiviert, das eines umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ham's F12 (HamF12), Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM), minimales essenzielles Medium (MEM), minimales essenzielles Medium-Alpha (Alpha-MEM), Eagle's basales Medium (BME), Fitton-Jackson modifiziertes Medium (BGJb) und eine Kombination davon.

In einer weiteren Ausführungsform schließt das Medium, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ein Material ein, das die Proliferation, Differenzierung oder beides von Zellen verstärkt.

In einer anderen Ausführungsform schließt das Medium, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, mindestens einen Bestandteil ein, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta), dem Knochen morphogenetischen Faktor (BMP), dem Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), dem Kolonie stimulierenden Faktor (CSF), Ascorbinsäure, Dexamethason, Glycerophosphorsäure, dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), dem Plättchen-reichen Plasma (PRP), dem Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).

In einer Ausführungsform umfasst das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ein Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Tonerde, Zirkonerde, Apatit-Wollastonit abgelagertem Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, Seide, Cellulose, Dextran, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglykolsäure, Methylpolymethacrylat, Polycyanacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Ethylen-Vinylacetat Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.

In einer weiteren Ausführungsform ist das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, aus Calciumphosphat, Gelatine, Collagen oder einer Kombination davon aufgebaut.

In einer Ausführungsform ist das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, aus Hydroxyapatit aufgebaut.

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus bereit, umfassend die Schritte:

A) Bereitstellen einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, und
B) Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie auf einem Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.

In einer Ausführungsform umfasst Schritt A) des Verfahrens zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus gemäß der vorliegenden Erfindung das Bereitstellen der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, wobei das Potenzial für Hypertrophie durch die Expression von mindestens einem, der ausgewählt ist, aber nicht beschränkt ist auf die Gruppe bestehend aus Typ X Collagen, alkalische Phosphatase, Osteonektin, Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan oder Bestandteile davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen und Chondromodulin, als ein Marker, identifiziert wird.

In einer anderen Ausführungsform umfasst Schritt A) des Verfahrens zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus gemäß der vorliegenden Erfindung die Schritte:
Bereitstellen der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, wobei das Potenzial für Hypertrophie unter Verwendung ihrer Hypertrophie als ein Marker identifiziert wird;
Herstellen eines Pellets aus den Zellen durch Zentrifugation von 5 × 10⁵ Zellen in Kulturmedium;
Kultivieren des Pellets für einen vorbestimmten Zeitraum;
Vergleichen der Größe der Zellen, die unter einem Mikroskop beobachtet werden, vor der Kultur mit jenen nach der Kultur; und
Bestimmen der Knorpelzelle, dass sie das Potenzial für Hypertrophie aufweist, wenn eine signifikante Proliferation beobachtet wird.

In einer Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, von einem Säugetier abgeleitet.

In einer anderen Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einem Hund, einer Katze oder einem Pferd abgeleitet.

In einer Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, eine Zelle, die von einem Bereich erhalten wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Knorpel-Knochenübergang der Rippen, der epiphysialen Linie von Röhrenknochen, der epiphysialen Linie von Wirbeln, der Knorpel Proliferationszone von Knöchelchen, des Perichondriums, der Knochenorgananlage, die aus Knorpel des Fötus gebildet wird, dem Kallusbereich einer heilenden Knochenfraktur und dem knorpeligen Teil der Knochen Proliferationsphase.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die epiphysiale Linie des Röhrenknochens ein Bereich der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oberschenkelknochen, Schienbein, Wadenbein, Oberarmknochen, Elle und Speiche.

In einer Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, auf eine Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml bis 1 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt.

In einer Ausführungsform umfasst Schritt B) des Verfahrens zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus gemäß der vorliegenden Erfindung das Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Medium, das eines umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ham's F12 (HamF12), Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM), minimales essenzielles Medium (MEM), minimales essenzielles Medium-Alpha (Alpha-MEM), Eagle's basales Medium (BME), Fitton-Jackson modifiziertes Medium (BGJb) und einer Kombination davon.

In einer anderen Ausführungsform umfasst Schritt B) des Verfahrens zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus gemäß der vorliegenden Erfindung das Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Medium, das eine Substanz, welche die Proliferation, Differenzierung oder beides von Zellen verstärkt, einschließt.

In einer Ausführungsform umfasst Schritt B) des Verfahrens zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus gemäß der vorliegenden Erfindung das Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Medium, das mindestens einen Bestandteil einschließt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta), dem Knochen morphogenetischen Faktor (BMP), dem Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), dem Kolonie stimulierenden Faktor (CSF), Ascorbinsäure, Dexamethason, Glycerophosphorsäure, dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), dem Plättchen-reichen Plasma (PRP), dem Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).

In einer Ausführungsform schließt das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, das in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, ein Material ein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Tonerde, Zirkonerde, Apatit-Wollastonit abgelagertem Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, Seide, Cellulose, Dextran, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglykolsäure, Methylpolymethacrylat, Polycyanacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Ethylen-Vinylacetat Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.

In einer weiteren Ausführungsform ist das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, das in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, Calciumphosphat, Gelatine oder Collagen.

In einer alternativen Ausführungsform ist das Gerüst, das mit biologischen Organismus bioverträglich ist, das in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, Hydroxyapatit.

In einer Ausführungsform ist die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, eine Zelle, die in einem Bereich kultiviert wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Oberfläche und innerhalb einer inneren Pore des Gerüsts, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, bei 37°C in der Anwesenheit von 5 – 10 % CO₂.

In einer weiteren Ausführungsform wird die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, für einen ausreichenden Zeitrum kultiviert, so dass die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie an dem Gerüst fixiert wird, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Verbundmaterials zur Herstellung eines Implantats oder eines Knochen Reparaturmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus bereit, wobei das Verbundmaterial umfasst:

In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reparieren eines defekten Bereichs eines Knochens bereit, umfassend das Implantieren eines Verbundmaterials einschließlich einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und eines Gerüsts, das mit einem biologischen Organismus bioverträglich ist, in den defekten Bereich des Knochens.

In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verbundmaterial verwendet, um die Knochenbildung in dem defekten Bereich des Knochens zu verbessern, der eine Größe aufweist, die nicht mehr durch Fixierung alleine repariert werden kann.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie bereit, umfassend die Schritte des Erhaltens von Zellen aus dem Xiphoideusfortsatz Übergang, der an dem unteren Abschnitt des Brustbeins angeordnet ist.

(Wirkung der Erfindung)

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verbundmaterial bereit, das vergleichbar ist mit autologem Knochen, ebenso wie ein Verfahren für die Herstellung und die Verwendung davon, das zur Verfügung steht, um Knochendefekte in großem Maßstab, Knochentumore, komplexe Brüche und ähnliches in einem biologischen Organismus zu behandeln. Ein solches Verbundmaterial kann Knochendefekte einer Größe reparieren, die unter Verwendung von Verbundmaterialien des Standes der Technik schwierig zu reparieren sind, durch seine unerwartete Wirksamkeit in der Förderung der Knochenbildung, was zu der Regeneration des Knochens führt, wodurch es möglich wird, Bereiche zu behandeln, die eine schlechte Prognose nach der Implantierung von künstlichen Materialien des Standes der Technik haben. Das erfindungsgemäße Verbundmaterial schließt ein bioverträgli ches Gerüst ein und funktioniert in der aktuellen Implantierungstherapie. Ein solches Verbundmaterial wurde bislang nicht durch den Stand der Technik bereitgestellt, und somit wird es durch die vorliegende Erfindung zum ersten Mal bereitgestellt.

Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den Zeichnungen und dem Studium der folgenden detaillierten Beschreibung deutlich.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1A zeigt den Xiphoideusfortsatz Übergang, der am unteren Abschnitt des Brustbeins angeordnet ist.

1B zeigt die wachsende Knorpelschicht (Mitte), das Brustbein bestehend aus Knochen (rechts) und die Schicht, die Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie enthält (links).

1C zeigt eine mikroskopische Aufnahme von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie (wachsende Knorpelzellen, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind) eine Woche nach dem Kultivieren eines Pellets aus 5 × 10⁵ Zellen, gefärbt mit Hämatoxilineosin (HE). Hypertrophie der Zellen kann im Vergleich zu 8 beobachtet werden. Balken = 30 μm.

Die 2A – D zeigen Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, verdünnt in Zellsuspension, inokuliert in Hydroxyapatit und gefärbt mit alkalischer Phosphatase. Die Zellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden in Hydroxyapatit inokuliert, in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für 3 Stunden (A), 1 Tag (B), 3 Tage (C) und 1 Woche (D) inkubiert und mit alkalischer Phosphatase gefärbt. Die Zellen wurden mit alkalischer Phosphatase rot gefärbt.

2E zeigt das Ergebnis einer Toluidin Blau Färbung von Proben, die mit alkalischer Phosphatase in 2A gefärbt sind. Mit Toluidin Blau wurden dieselben Bereiche wie in 2A gefärbt, was die Anwesenheit von Zellen anzeigt. Der untere Abschnitt von 2E ist eine Schnittansicht des Hydroxyapatits, das mit Toluidin Blau gefärbt wurde.

Die 2F – H zeigen das Ergebnis von Toluidin Blau Färbung der Proben, die mit alkalischer Phosphatase in den 2B – D gefärbt wurden. Mit Toluidin Blau wurden dieselben Bereiche wie in den 2B – D blau gefärbt, was die Anwesenheit von Zellen anzeigt.

3A zeigt die HE Färbung von implantierten Bereichen in Ratten 4 Wochen nach der subkutanen Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind, und Gelatine als einem bioverträglichen Gerüst. Balken = 100 μm.

3B zeigt die HE Färbung von implantierten Bereichen in Ratten 4 Wochen nach der subkutanen Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind, und Collagen als einem bioverträglichen Gerüst. Balken = 100 μm.

3C zeigt die HE Färbung von implantierten Bereichen in Ratten 4 Wochen nach der subkutanen Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind, und Hydroxyapatit als einem bioverträglichen Gerüst. Balken = 200 μm.

4 zeigt die HE Färbung 4 Wochen nach der subkutanen Implantierung von Hydroxyapatit alleine in Ratten.

5A zeigt Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein abgeleitet sind, verdünnt in Zellsuspension, inokuliert in Hydroxyapatit und gefärbt mit alkalischer Phosphatase. Die Zellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden in Hydroxyapatit inokuliert, in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für eine Woche inkubiert und mit alkalischer Phosphatase gefärbt. Die Zellen wurden mit alkalischer Phosphatase rot gefärbt.

5B zeigt Knorpelzellen, die aus anderen Bereichen als dem wachsenden Knorpelbereich des Brustbeins erhalten wurden, verdünnt in Zellsuspension, inokuliert in Hydroxyapatit und gefärbt mit alkalischer Phosphatase. 1 × 10⁶ Zellen/ml wurden in Hydroxyapatit inokuliert, in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für eine Woche inkubiert und mit alkalischer Phosphatase gefärbt. Die Zellen färbten sich nicht mit alkalischer Phosphatase.

6A zeigt Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Gelenkknorpel abgeleitet sind, verdünnt in Zellsuspension, inokuliert in Hydroxyapatit und gefärbt mit alkalischer Phosphatase. 1 × 10⁶ Zellen/ml wurden in Hydroxyapatit inokuliert, in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für eine Woche inkubiert und mit alkalischer Phosphatase gefärbt. Die Zellen färbten sich nicht mit alkalischer Phosphatase.

6B zeigt das Ergebnis von Toluidin Blau Färbung von Proben, die mit alkalischer Phosphatase in 6A gefärbt wurden. Mit Toluidin Blau wurden dieselben Bereiche wie in 6A blau gefärbt, was die Anwesenheit von Zellen anzeigt.

Die 7A – D zeigen ruhende Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, verdünnt in Zellsuspension, inokuliert in Hydroxyapatit und gefärbt mit alkalischer Phosphatase 1 × 10⁶ Zellen/ml wurden in Hydroxyapatit inokuliert, in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für 3 Stunden (A), 1 Tag (B), 3 Tage (C) und 1 Woche (D) inkubiert und mit alkalischer Phosphatase gefärbt. Die Zellen färbten sich nicht mit alkalischer Phosphatase.

Die 7E – H zeigen das Ergebnis von Toluidin Blau Färbung von Proben, die mit alkalischer Phosphatase in den 7A – D gefärbt wurden. Mit Toluidin Blau färbten sich die Proben blau, was die Anwesenheit von Zellen anzeigt.

8 zeigt eine mikroskopische Aufnahme von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie (ruhende Knorpelzellen, die von dem Rippenknorpel abgeleitet sind), eine Woche nach dem Kultivieren eines Pellets aus 5 × 10⁵ Zellen, gefärbt mit HE. Es wurde keine Hypertrophie der Zellen im Vergleich zu 1 beobachtet. Balken = 30 μm.

9 zeigt die Rate von Knochenbildung, die nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, und Hydroxyapatit, einem Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit, oder Hydroxyapatit alleine, in einen defekten Bereich des Knochens beobachtet wurd. Leer: die Rate von Knochenbildung 4 Wochen nach Implantierung von Hydroxyapatit alleine in einen defekten Bereich des Knochens in Rattenschädel, GC: die Rate der Knochenbildung 4 Wochen nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie (wachsende Knorpelzelle, die aus den Rippen/dem Rippenknorpel erhalten wurde) und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens in Rattenschädeln, RC: die Rate von Knochenbildung nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie (ruhende Knorpelzellen, die aus dem Rippenknorpel erhalten wurden) und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens in Rattenschädeln.

10 zeigt die Menge der Knochenbildung, die nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit, einem Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit oder Hydroxyapatit alleine in einen defekten Bereich des Knochens, beobachtet wurde. Leer: die Menge (Volumen) von Knochenbildung 4 Wochen nach Implantierung von Hydro xyapatit alleine in einen defekten Bereich des Knochens in Rattenschädeln, GC: die Menge (Volumen) von Knochenbildung 4 Wochen nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie (wachsende Knorpelzelle, erhalten aus den Rippen/dem Rippenknorpel) und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens in Rattenschädeln, RC: die Menge (Volumen) von Knochenbildung 4 Wochen nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie (ruhende Knorpelzellen, die aus dem Rippenknorpel erhalten wurden) und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens in Rattenschädeln.

BESTE ART UND WEISE DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden beschrieben. Es wird verstanden, außer es ist anders angegeben, dass die Darstellungen in der Einzahl in der vorliegenden Beschreibung den Plural davon einschließen. Deshalb wird verstanden, außer es ist spezifisch beschrieben, dass Einzahlartikel wie "a", "an" und "the" in der englischen Sprache, "un", "une", "le" und "la" in der französischen Sprache und "ein", "eine", "der", "die" und "das", und ähnliches, in der deutschen Sprache, oder andere, den Plural einschließen. Es wird ebenfalls verstanden, dass die hier verwendeten Begriffe die Definitionen aufweisen, die herkömmlich im Stand der Technik verwendet werden, außer es ist anders angegeben. Deshalb haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, außer es ist anders angegeben, dieselbe Bedeutung, wie sie der Fachmann für gewöhnlich versteht. Ansonsten geht die vorliegende Erfindung (einschließlich der Definitionen) vor.

(Definition von Begriffen)

Die Definitionen der Begriffe, die hier insbesondere verwendet werden, sind im Folgenden aufgezählt.

"Verbundmaterial", so wie hier verwendet, betrifft ein Material einschließlich einer Zelle und ein Gerüst.

"Verstärken von Knochenbildung", so wie hier verwendet, betrifft die Steigerung der Rate von Knochenbildung an einer Stelle, wo die Knochenbildung bereits stattgefunden hat.

So wie hier verwendet, betrifft "das Induzieren" von Knochenbildung das Bewirken von Knochenbildung an einer Stelle, wo die Knochenbildung nicht stattgefunden hat.

"Knochendefizit", so wie hier verwendet, umfasst, aber ist nicht beschränkt auf: Läsionen, wie Knochentumore, Knochenschwund (Osteoporose), rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Osteomyelitis und Osteonekrosis; Korrekturen, wie Immobilisierung des Knochens, Foraminotomie und Osteotomie; Trauma, wie ein komplexer Bruch; und Knochendefizite, die von einer Hüftspende (collecting ilium) abgeleitet sind.

So wie hier verwendet, betrifft "das Reparieren" von Knochendefizit Bereichen das Zurückführen des defekten Bereichs auf normal oder nahe normal.

"Größe, die nicht durch Fixierung alleine repariert werden kann", so wie hier verwendet, betrifft eine Läsion einer Größe, welche die Verwendung von Implantaten oder Knochen Reparaturmaterialien für die Reparatur benötigt.

"Wachsende Knorpelzelle" oder "wachsender Chrondozyte" wird hier austauschbar verwendet und betrifft eine Zelle in einem Gewebe, das sich während Entwicklungs- und Wachstumsstufen, und Zeiträumen der Knochenerholung und Proliferation (d.h. wachsender Knorpel) zu Knochen bildet. Wachsende Knorpelzelle betrifft allgemein ein Gewebe, das Knochen während der Wachstumsstufe bildet, während es hier ein Gewebe bedeutet, das Knochen während Entwicklungs- oder Wachstumsstufen, und Zeiträumen der Knochenerholung oder Proliferation bildet.

Die wachsende Knorpelzelle wird auch als hypertrophischer Knorpel, kalzifizierter Knorpel oder epiphysialer (Linie) Knorpel bezeichnet. Wenn eine wachsende Knorpelzelle in Menschen verwendet wird, sind Zellen, die von einem Menschen abgeleitet sind, bevorzugt, aber es ist auch möglich, nicht menschliche Zellen zu verwenden, weil Probleme wie immunologische Abstoßung unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, verwendet werden können.

Die erfindungsgemäße wachsende Knorpelzelle ist von einem Säugetier abgeleitet, vorzugsweise von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einem Hund, einer Katze oder einem Pferd.

Die erfindungsgemäße wachsende Knorpelzelle kann aus dem Knorpel-Knochenübergang der Rippen, der epiphysialen Linie von Röhrenknochen (z.B. Oberschenkel, Schienbein, Wadenbein, Oberarmknochen, Elle und Speiche), der eiphysialen Linie der Wirbel, der Knorpel Proliferationszone des Handknochens, Fußknochens, Brustknochen und anderer, dem Perichondrium, der Knochen Organanlage, die aus Knorpel des Fötus gebildet wird, der Kallusregion eines heilenden Knochenbruchs und dem knorpeligen Teil der Knochen Proliferationszone entnommen werden. Diese Knorpelzellen können zum Beispiel durch die Verfahren hergestellt werden, die in den Beispielen der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind.

"Eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie", so wie hier verwendet, betrifft eine Zelle, die hypertrophisches Wachstum in der Zukunft durchlaufen kann. Eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie schließt eine "wachsende Knorpelzelle" ein, die direkt aus einem lebenden Organismus gewonnen wird, ebenso wie andere Zellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die durch ein Verfahren zur Bestimmung "des Potenzials für Hypertrophie", das im Folgenden definiert ist, bestimmt werden.

Die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie ist typischerweise von einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einem Hund, einer Katze oder einem Pferd abgeleitet. Wenn Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie in Menschen verwendet werden, sind die Zellen vorzugsweise von einem Menschen abgeleitet, aber es ist auch möglich, nicht menschliche Zellen zu verwenden, weil Probleme, wie immunologische Abstoßung unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, verhindert werden können. Die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann zum Beispiel aus dem Knorpel-Knochenübergang der Rippen, der epiphysialen Linie von Röhrenknochen (z.B. Oberschenkel, Schienbein, Wadenbein, Oberarmknochen, Elle und Speiche), der epiphysialen Linie der Wirbel, der Knorpel Proliferationszone von z.B. Handknochen, Fußknochen, dem Brustbein, dem Perichondrium, der Knochen Organanlage, die aus Knorpel des Fötus gebildet wird, der Kallusregion eines heilenden Knochenbruchs, und dem knorpeligen Teil der Knochen Proliferationsphase erhalten werden. Die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann durch Induzieren der Differenzierung einer undifferenzierten Zelle erhalten werden.

Die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann morphologisch durch Hypertrophie gekennzeichnet sein.

"Hypertrophie", so wie hier verwendet, kann morphologisch unter einem Mikroskop bestimmt werden. So wie hier verwendet, betrifft eine hypertrophe Zelle eine Zelle, die benachbart zu der Wachstumsschicht beobachtet wird, die sich säulenartig ausrichtet, oder betrifft alternativ eine Zelle, die größer ist als die umgebenden Zellen.

Zellen werden bestimmt, dass sie das Potenzial für Hypertrophie aufweisen, wenn eine signifikante Proliferation beobachtet wird durch das Herstellen eines Pellets der Zellen durch Zentrifugation von 5 × 10⁵ Zellen in Kulturmedium, Kultivieren des Pellets für einen vorbestimmten Zeitraum, und Vergleichen der Größe der Zellen, die vor und nach der Kultur unter einem Mikroskop beobachtet werden.

"Ruhende Knorpelzelle" und "ruhende Knorpelzelle" werden hier austauschbar verwendet, um eine Knorpelzelle oder eine Chondrozyte zu bezeichnen, die in einem Bereich außerhalb des Knorpel-Knochenübergangs der Rippen angeordnet ist, was ein Gewebe ist, das als Knorpel während der gesamten Lebenszeit besteht. Eine Zelle, die in dem ruhenden Knorpel angeordnet ist, wird als eine ruhende Knorpelzelle bezeichnet.

"Gelenkknorpelzelle", so wie hier verwendet, betrifft eine Zelle im knorpeligen Gewebe (Gelenkknorpel), das an einer Gelenkoberfläche angeordnet ist.

Die Knorpelzelle, so wie hier verwendet, wird durch Identifizieren der Expression von mindestens einem, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan (Aglykan) oder Bestandteile davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen und Chondromodulin als ein Marker bestimmt. Unter den Knorpelzellen wird eine hypertrophe Zelle weiterhin durch Identifizieren der Expression von mindestens einem, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ X Collagen, alkalische Phosphatase und Osteonektin, bestimmt. Knorpelzellen, die keines von Typ X Collagen, alkalische Phosphatase oder Osteonektin exprimieren, werden dahingehend bestimmt, dass sie kein hypertrophes Potenzial aufweisen. Deshalb wird die hier beschriebene Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie auch durch Identifizieren der Expression mindestens eines, ausgewählt aus Knorpelmarkern und mindestens eines, ausgewählt aus Markern für Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, anstelle dem Beobachten der morphologischen Hypertrophie, bestimmt. Die Anordnung oder Expression dieser Marker wird durch irgendein Verfahren zum Analysieren von Proteinen oder RNA, die aus kultivierten Zellen extrahiert wird, wie spezifischer Färbung, immunhistochemischen Verfahren, in situ Hybridisierung, Western Blotten oder PCR identifiziert.

"Knorpelzellen Marker", so wie hier verwendet, betrifft irgendwelche Substanzen, deren Anordnung oder Expression in einer Knorpelzelle bei der Identifizierung der Knorpelzelle hilft. Vorzugsweise betrifft er irgendwelche Substanzen, die verwen det werden können, um die Knorpelzelle durch ihre Anordnung oder Expression (zum Beispiel Anordnung oder Expression von Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan (Aglykan) oder Bestandteile davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen und Chondromodulin) zu identifizieren.

"Marker für eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie", so wie hier verwendet, betrifft irgendwelche Substanzen, deren Anordnung oder Expression in einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie bei der Identifizierung der Knorpelzelle hilft. Vorzugsweise betrifft er irgendeine Substanz, die verwendet werden kann, um die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie durch ihre Anordnung oder Expression (zum Beispiel Anordnung oder Expression von Typ X Collagen, alkalische Phosphatase und Osteonektin) zu identifizieren.

"Knorpelproteoglykan", so wie hier verwendet, betrifft ein Makromolekül, wobei eine Vielzahl von Glucosaminglykanen, wie Chondroitintetrasulfat, Chondroitinhexasulfat, Keratansulfat, O-verknüpftes Oligosaccharid, N-verknüpftes Oligosaccharid und andere, mit einem Kernprotein kombiniert sind. Das Knorpelproteoglykan bindet weiterhin die Hyaluronsäure über ein Verknüpfungsprotein, um ein Knorpelproteoglykan Aggregat zu bilden. In knorpeligem Gewebe ist das Glucosaminoglykan reich und macht 20 – 40 % des Trockengewichts des Gewebes aus. Knorpelproteoglykan wird auch als Aglykan bezeichnet.

"Knochenproteoglykan", so wie hier verwendet, betrifft ein Makromolekül, das ein kleineres Molekulargewicht als Knorpelproteoglykan aufweist, wobei Glucosaminoglykane, wie Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, O-verknüpfte Oligosaccharide, N-verknüpfte Oligosaccharide und andere mit einem Kernprotein kombiniert sind. In Knochengewebe nimmt Glucosaminoglykan 1 % oder weniger des Trockengewichts des entkalkten Knochens ein. Knochenproteoglykan kann Decorin und Biglykan einschließen.

"Osteoblast", so wie hier verwendet, ist eine Zelle, die in der Knochenmatrix angeordnet ist und welche die Knochenmatrix bildet und kalzifiziert. Osteoblasten sind eine Zelle mit 20 – 30 μm Durchmesser und von kubischer oder säulenförmiger Form. So wie hier verwendet, kann Osteoblast einen "Präosteoblasten" einschließen, der eine Vorläuferzelle von Osteoblasten ist.

Osteoblasten werden durch die Expression von mindestens einem, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ I Collagen, Knochenproteoglykan (z.B. Decorin, Biglykan), alkalische Phosphatase, Osteocalcin, Matrix Gla Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochensialinsäureprotein, Osteonektin und Pleiotrophin als einem Marker bestimmt. Zusätzlich können Osteoblasten durch Identifizieren der Knorpelmarker, (wie Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan (Aglykan) oder Bestandteilen davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen, oder Chondromodulin) bestimmt werden, die davon nicht exprimiert werden. Diese Marker werden durch ihre Anordnung oder Expression durch irgendwelche Verfahren zum Analysieren von Proteinen oder RNA, die aus kultivierten Zellen extrahiert werden, wie spezifischer Färbung, immunhistochemischen Verfahren, in situ Hybridisierung, Western Blotten oder PCR, identifiziert.

"Osteoblast Marker", so wie hier verwendet, betrifft irgendwelche Substanzen, deren Anordnung oder Expression in einem Osteoblasten bei der Identifizierung des Osteoblasten hilft. Vorzugsweise betrifft er irgendwelche Substanzen, die verwendet werden können, um Osteoblasten durch ihre Anordnung oder Expression (zum Beispiel Anordnung oder Expression von Typ I Collagen, Knochenproteoglykan (z.B. Decorin, Biglykan), alkalische Phosphatase, Osteocalcin, Matrix Gla Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochensialinsäureprotein, Osteonektin oder Pleiotrophin) zu identifizieren. Osteoglycin wird als osteoinduktiver Faktor (OIF) bezeichnet. Osteopontin wird als BSP-I oder 2ar bezeichnet. Knochensialinsäureprotein wird als BSP-II bezeichnet. Pleitrophin wird als Osteoblasten spezifisches Protein (OSF-1) bezeichnet. Osteonektin wird als SPARC oder BM-40 bezeichnet.

Osteoblasten können zum Beispiel identifiziert werden durch:
Feststellen, dass eine Zelle positiv hinsichtlich eines Markers ist, der nur Osteoblasten identifiziert;
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Osteoblasten und Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert, während er Knorpelzellen nicht identifiziert, und Feststellen, dass die Zelle für einen Marker positiv ist, der Osteoblasten und Knorpelzellen identifiziert, während er Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie nicht identifiziert;
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Osteoblasten und Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert, aber für einen Marker negativ ist, der Osteoblasten nicht identifiziert, während er Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert; oder
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Osteoblasten und Knorpelzellen als positiv identifiziert, aber die für einen Marker negativ ist, der Osteoblasten nicht identifiziert, während er Knorpelzellen identifiziert.
Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie können zum Beispiel identifiziert werden durch:
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der nur Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert;
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Osteoblasten identifiziert, während er Knorpelzellen nicht identifiziert, und Feststellen, dass die Zelle für einen Marker positiv ist, der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Knorpelzellen identifiziert, während er Osteoblasten nicht identifiziert;
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Osteoblasten identifiziert, aber die für einen Marker negativ ist, der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie nicht identifiziert, während er Osteoblasten identifiziert; oder
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Knorpelzellen identifiziert, aber die für einen Marker negativ ist, der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie nicht identifiziert, während er Knorpelzellen identifiziert.
Knorpelzellen (ohne das Potenzial für Hypertrophie) können zum Beispiel identifiziert werden durch:
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der nur Knorpelzellen identifiziert;
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Knorpelzellen und Osteoblasten identifiziert, während er Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie nicht identifiziert, und Feststellen, dass die Zelle für einen Marker positiv ist, der Knorpelzellen und Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert, während der Osteoblasten nicht identifiziert;
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Knorpelzellen und Osteoblasten identifiziert, aber die negativ für einen Marker ist, der Knorpelzellen nicht identifiziert, während der Osteoblasten identifiziert; oder
Feststellen, dass eine Zelle für einen Marker positiv ist, der Knorpelzellen und Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert, aber die negativ für einen Marker ist, der Knorpelzellen nicht identifiziert, während Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert werden.

Knorpelzellen, Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Osteoblasten können hier zum Beispiel unter Verwendung der Kombination von Markern, die in Tabelle 1 unten aufgelistet sind, identifiziert werden: (TABELLE 1)

•:: exprimiert
-:: nicht exprimiert

"Mesenchymale Stammzellen", so wie hier verwendet, betrifft eine Stammzelle, die in mesenchymalem Gewebe beobachtet wird. Das mesenchymale Gewebe schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf Knochenmark, Fettgewebe, vaskuläres Endothel, glatte Muskulatur, Herzmuskel, Skelettmuskel, Knorpel, Knochen und Ligament (Gewebeband). Mesenchymale Stammzellen sind typischerweise abgeleitet von Knochenmark, Fettgewebe, Synovialgewebe, Muskelgewebe, peripherem Blut, Plazentagewebe, Menstruationsblut oder Nabelschnurblut.

(Gerüst)

"Gerüst", so wie hier verwendet, betrifft ein Material, um Zellen zu stützen bzw. zu tragen. Das Gerüst weist konstante Stärke und Bioverträglichkeit auf. So wie hier verwendet, wird das Gerüst aus biologischen Materialien oder natürlich bereitgestellten Materialien oder natürlich vorkommenden Materialien oder synthetisch bereitgestellten Materialien hergestellt. So wie hier verwendet, wird das Gerüst aus anderen Materialien als Organismen, wie Geweben oder Zellen (d.h. nicht zelluläres Material) gebildet. So wie hier verwendet ist das Gerüst eine Zusammensetzung, die aus anderen Materialien als Organismen, wie Geweben oder Zellen gebildet wird, einschließlich Materialien, die von lebenden Organismen abgeleitet sind, wie Collagen oder Hydroxyapatit. So wie hier verwendet bedeutet "Organismus" ein Materialsystem, das derart organisiert ist, dass es eine lebende Funktion aufweist. Dies bedeutet, dass der Begriff Organismus Lebewesen von anderen Materialsystemen unterscheidet. Das Konzept des Organismus umfasst Zellen, Gewebe oder andere, während Materialien, die von Lebewesen abgeleitet, extrahiert aus dem Organismus sind, nicht in den Organismus eingeschlossen sind. Der Gerüstbereich, an den die Zellen fixiert sind, schließt eine Oberfläche des Gerüsts, oder eine innere Pore des Gerüsts ein, wenn es eine solche innere Pore aufweist, die Zellen enthält. Zum Beispiel schließt ein Gerüst, das aus Hydroxyapatit hergestellt ist, viele Poren ein, die normalerweise ausreichend Zellen enthalten können.

Das Material für das Gerüst schließt ein aber ist nicht beschränkt auf ein Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Tonerde, Zirkonerde, Apatit-Wollastonit abgelagertem Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, Seide, Cellulose, Dextran, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglykolsäure, Methylpolymethacrylat, Polycyanacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Ethylen-Vinylacetat Copolymer, Nylon und Kombinationen davon. Vorzugsweise sind die Gerüstmaterialien Calciumphosphat, Gelatine oder Collagen. Weiter bevorzugt ist das Gerüstmaterial Hydroxyapatit.

Dieses Gerüst kann in irgendeiner Form bereitgestellt werden, wie eine granuläre Form, Blockform oder Schwammform. Dieses Gerüst kann porös oder nicht porös sein. Für solche Gerüste können jene, die kommerziell erhältlich sind (z.B. von PENTAX Corporation, OLYMPUS Corporation, Kyocera Corporation, Mutsubishi Pharma Corporation, Dainippon Sumitomo Pharmaceuticals, Kobayashi Pharmaceuticals Co. Ltd., Zimmer Inc.) verwendet werden. Standardverfahren zur Herstellung und Charakterisierung von Gerüsten sind im Stand der Technik bekannt, die nur routinemäßige Versuche und Techniken erfordern, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind. Siehe zum Beispiel US Patent Nr. 4,975,526; Nr. 5,011,691; Nr. 5,171,574; Nr. 5,266,683; Nr. 5,354,557 und Nr. 5,468,845, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Andere Gerüste sind auch zum Beispiel in den folgenden Dokumenten beschrieben: Artikel für bioverträgliche Materialien, wie LeGeros und Daculsi, Handbook of Bioactive Ceramics, II S. 17 – 28 (1990, CRC Press); andere veröffentlichte Beschreibungen, wie Yan Cao, Jie Wenig, Biomaterials 17 (1996) S. 419 – 424; LeGeros, Adv. Dent. Res. 2, 164 (1988); Johnson et al., J. Orthopaedic Research, 1996, Vol. 14, S. 351 – 369; und Piattelli et al., Biomaterials 1996, Vol. 17, S. 1767 – 1770, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.

"Calciumphosphat", so wie hier verwendet, ist ein generischer Begriff für Phosphate aus Calcium, die zum Beispiel einschließen, aber nicht beschränkt sind auf Verbindungen, die durch die folgenden chemischen Formeln dargestellt sind: CaHPO₄, Ca₃(PO₄)₂, Ca₄O(PO₄)₂, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, CaP₄O₁₁, Ca(PO₃)₂, Ca₂P₂O₇ oder Ca(H₂PO₄)₂·H₂O.

"Hydroxyapatit", so wie hier verwendet, betrifft eine Verbindung, deren allgemeine Zusammensetzung Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ ist, was ein Hauptbestandteil des harten Gewebes von Säugetieren (Knochen und Zähne), wie Collagen, ist. Obwohl Hydroxyapatit eine Reihe von Calciumphosphaten, wie oben beschrieben, enthält sind PO₄ und OH Bestandteile innerhalb des Apatits in den harten Geweben von biologischen Organismen häufig mit einem CO₃ Bestandteil in Körperflüssigkeiten substituiert. Weiterhin ist Hydroxyapatit ein Material, dessen Sicherheit durch das Mi nisterium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt in Japan und die FDA (US Nahrungs- und Arzneimittelzulassung) festgestellt wurde. Obwohl viele kommerziell erhältliche Hydroxyapatite im Körper nicht absorbierbar sind und im Körper kaum absorbiert verbleiben, sind andere absorbierbar.

Ein Gerüst, das mit einem biologischen Organismus bioverträglich ist, schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf ein Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Tonerde, Zirkonerde, Apatit-Wollastonit abgelagertem Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, Seide, Cellulose, Dextran, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglykolsäure, Methylpolymethacrylat, Polycyanacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Ethylen-Vinylacetat Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.

"Collagen", so wie hier verwendet, weist eine ähnliche Bedeutung zu jener auf, die im Stand der Technik in ihrer breitesten Bedeutung verwendet wird. Es ist ein Hauptbestandteil der extrazellulären Matrizes von Tieren. Collagen ist z.B. erhältlich von Nitta Gelatin Inc., dem Japanischen Institut für Leather Research, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Nacalai tesque, Funakoshi Co. Ltd., Sigma-Aldrich und Merck. Collagene aus anderen Quellen können in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.

"Gelatine", so wie hier verwendet, weist eine ähnliche Bedeutung auf, wie jene, die im Stand der Technik in ihrer breitesten Bedeutung verwendet wird. Es kann erhalten werden durch Degradieren (wie thermisches Degradieren) von Collagen, das aus der Haut, Sehnen oder Knochen von Tieren gesammelt wird. Gelatine wird als ein wasserlösliches Protein erachtet, das irreversibel als ein Ergebnis der Spaltung der ionischen Bindung oder der Wasserstoffbindung zwischen Peptidketten von Collagen umgewandelt wird. Gelatine kann erhalten werden z.B. von Nitta Gelatin Inc., Japan Institut of Leather Research, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Nacalai tesque, Funakoshi Co. Ltd., Sigma-Aldrich und Merck. Gelatinen aus anderen Quellen können in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.

"Bioverträglich", so wie hier verwendet, betrifft die Kompatibilität mit den Geweben oder Organen von biologischen Organismen ohne Toxizität, Immunantworten, Schäden oder andere gegenteilige Wirkungen hervorzurufen. Bioverträgliche Materialien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Tonerde, Zirkonerde, Apatit-Wollastonit abgelagertem Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, Seide, Cellulose, Dextran, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglykolsäure, Methylpolymethacrylat, Polycyanacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Ethylen-Vinylacetat Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.

"Zelluläre physiologisch aktive Substanz" oder "physiologisch aktive Substanz" werden hier austauschbar verwendet, um eine Substanz, die Zellen oder Gewebe beeinflusst, zu bezeichnen. Solche Wirkungen umfassen zum Beispiel, aber sind nicht beschränkt auf die Kontrolle oder Modifikation der Zellen oder Gewebe. Die physiologisch aktive Substanz schließt Zytokine oder Wachstumsfaktoren ein. Die physiologisch aktive Substanz kann eine natürlich vorkommende oder synthetisierte Substanz sein. Vorzugsweise wird die physiologisch aktive Substanz in einer Zelle hergestellt. Sie schließt auch Substanzen ein, die in einer Zelle hergestellt werden, oder Substanzen mit einer ähnlichen Funktion, aber modifiziert von jener, die in einer Zelle hergestellt wird. In der vorliegenden Erfindung kann die physiologisch aktive Substanz in der Form eines Proteins, einschließlich Peptiden, oder in der Form von Nukleinsäuren, oder in anderen Formen vorliegen.

"Zytokin", so wie hier verwendet, ist definiert, dass es eine ähnliche Bedeutung aufweist, wie jene, die im Stand der Technik in ihrer breitesten Bedeutung verwendet wird. Sie betrifft eine physiologisch aktive Substanz, die in einer Zelle hergestellt wird, welche dieselbe oder eine andere Zelle beeinflusst. Im Allgemeinen ist ein Zytokin ein Protein oder Polypeptid und weist Aktivitäten auf, welche die Immunantwort kontrollieren, das endokrine System modulieren, das Nervensystem modulieren, eine Antitumorwirkung ausüben, eine antivirale Wirkung ausüben, das Zellwachstum modulieren, die Zelldifferenzierung modulieren, die zelluläre Funktion modulieren, und andere. In der vorliegenden Erfindung können Zytokine in der Form von Protein oder Nukleinsäuren vorkommen. Jedoch zum Zeitpunkt des aktuellen Beeinflussens von Zellen liegen Zytokine häufig in der Form von Protein, einschließlich Peptiden vor.

"Wachstumsfaktor" oder "zellulärer Wachstumsfaktor", die hier austauschbar verwendet werden, betreffen eine Substanz, welche die Induktion des Wachstums und der Differenzierung von Zellen verstärkt oder kontrolliert. Ein Wachstumsfaktor ist auch ein Proliferations- oder Entwicklungsfaktor. In Zellkultur oder Gewebekultur können Wachstumsfaktoren zu dem Medium hinzugefügt werden und substituieren die Funktion von Makromolekülen im Serum. Es ist bewiesen, dass, zusätzlich zum Zellwachstum, viele Wachstumsfaktoren als Faktoren wirken, welche die Differenzierung regulieren.

Zytokine, die mit Knochenbildung assoziiert sind, schließen typischerweise Faktoren wie den transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta), den Knochen morphogenetischen Faktor (BMP), den Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), den Kolonie stimulierenden Faktor (CSF), Ascorbinsäure, Dexamethason, Glycerophosphorsäure, den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), den Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), den Plättchen-reichen Plasma (PRP), den Plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF); und Verbindungen, wie Ascorbinsäure, Dexamethason und Glycerophosphorsäure, ein.

Weil physiologisch aktive Substanzen, wie Zytokine und Wachstumsfaktoren, im Allgemeinen Redundanz aufweisen, können Zytokine und Wachstumsfaktoren, die unter einem anderen Namen und Funktion bekannt sind (wie Zelladhäsionsaktivität oder Zell-Matrixadhäsionsaktivität) ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange sie die Aktivität der physiologisch aktiven Substanz, die in der Erfindung verwendet wird, aufweisen. Zytokine oder Wachstumsfaktoren können in der Ausführung der Erfindung verwendet werden, solange sie die bevorzugte Aktivität (wie Stammzell Wachstumsaktivität oder Osteoblasten Differenzierungsaktivität) für die vorliegende Erfindung aufweisen.

"Abgeleitet von syngenetisch", so wie hier verwendet, bedeutet abgeleitet von einer autologen, reinen Linie, oder einer Inzuchtlinie.

"Abgeleitet von einem allogenen Individuum", so wie hier verwendet, bedeutet abgeleitet von einem anderen Individuum derselben Spezies, die genetisch verschieden ist.

"Abgeleitet von einem heterologen Individuum", so wie hier verwendet, bedeutet abgeleitet von einem heterologen Individuum. Somit sind zum Beispiel, wenn der Empfänger ein Mensch ist, Zellen aus der Ratte "abgeleitet von einen Individuum, das heterolog in Bezug auf den biologischen Organismus" ist.

"Subjekt", so wie hier verwendet, bedeutet einen biologischen Organismus, auf den eine Behandlung der vorliegenden Erfindung angewendet wird. Es bezieht sich auch auf einen "Patienten". Das Subjekt oder der Patient kann ein Mensch, eine Mause, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Hund, eine Katze oder ein Pferd, vorzugsweise ein Mensch sein.

"Implantat" oder "Knochen Reparaturmaterial", so wie hier verwendet, wird verwendet, dass es die Bedeutung, die allgemein im Stand der Technik verwendet wird, aufweist. So wie hier verwendet, werden sie im Wesentlichen in der gleichen Bedeutung verwendet, aber wie insbesondere definiert bedeutet "Implantat" jedes Material, das zum Auffüllen verwendet wird, während "Knochen Reparaturmaterial" ein Material bedeutet, das zur Reparatur eines defekten Bereichs des Knochens verwendet wird.

(Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen)

Die besten Weisen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden beschrieben. Es wird verstanden, dass die unten bereitgestellten Ausführungsformen für den Zweck des besseren Verständnisses der Erfindung bereitgestellt werden und dass der Schutzumfang der Erfindung durch die folgende Beschreibung nicht beschränkt werden sollte. Deshalb ist es für den Fachmann offensichtlich, dass er die Beschreibungen hier lesen kann und sie in geeigneter Weise innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung modifizieren kann.

(Verbundmaterial)

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verbundmaterial zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus bereit. Herkömmlich haben künstliche Knochenimplantate oder Knochen Reparaturmaterialien, um Knochenbildung in einem defekten Bereich des Knochens zu verstärken oder zu induzieren, keine ausreichend befriedigenden Ergebnisse bezüglich der Rate der Knochenregeneration, der Stärke des regenerierten Knochens oder ähnlichem erreicht. Die Wirkung der Erfindung ist es, ein Verbundmaterial bereitzustellen, das Knochendefizienzen reparieren kann, wobei die Regenerationseffizienz im Stand der Technik schlecht ist, und Regeneration des Knochens induzieren kann, wodurch es möglich wird, Bereiche zu behandeln, in denen Implantierungstherapie mit Artefakten herkömmlich schwierig ist. Das erfindungsgemäße Verbundmaterial kann auch verwendet werden, um die Knochenbildung in einem defekten Bereich des Knochens mit einer Größe zu verbessern, die nicht durch Fixierung alleine repariert werden kann. Ein solches Verbundmaterial umfasst A) eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und B) ein Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform exprimiert die erfindungsgemäße Knorpelzelle mindestens einen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ X Collagen, alkalische Phosphatase, Osteonektin, Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan oder Bestandteile davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen und Chondromodulin, als einen Marker. Somit ist die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie durch morphologische Hypertrophie gekennzeichnet und exprimiert mindestens einen, ausgewählt aus dieser Markergruppe. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert werden, indem die Expression der oben genannten Knorpelzellenmarker bestätigt wird und ihre morphologische Hypertrophie unter einem Mikroskop untersucht wird.

In einer anderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie von einem Säugetier, vorzugsweise einem Mensch, einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einem Hund, einer Katze oder einem Pferd abgeleitet. Die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann isoliert oder induziert werden von zum Beispiel einem Bereich, wie dem Knorpel-Knochenübergang der Rippen, der epiphysialen Linie von Röhrenknochen (z.B. Oberschenkel, Schienbein, Wadenbein, Oberarmknochen, Elle und Speiche), der epiphysialen Linie von Wirbeln, der Knorpel Proliferationszone von Knöchelchen (z.B. Handknochen, Fußknochen und Brustbein), dem Perichondrium, der Knochen Organanlage, die aus Knorpel des Fötus gebildet wird, dem Kallusbereich eines heilenden Knochenbruchs und denn knorpeligen Teil der Knochen Proliferationsphase. Die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann erhalten werden durch Induzieren der Differenzierung.

Die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie ist normalerweise auf eine Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml bis 1 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt, jedoch können Zelldichten von weniger als 1 × 10⁴ Zellen/ml oder mehr als 1 × 10⁷ Zellen/ml ebenfalls verwendet werden. Wenn die Zelldichte weniger als 1 × 10⁴ Zellen/ml beträgt, kann die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Inkubator proliferiert werden. Wenn die Zelldichte mehr als 1 × 10⁷ Zellen/ml beträgt, können sie ohne irgendeine Behandlung verwendet werden, aber wahlweise können sie in einem größeren Gerüst inokuliert werden oder auf eine geeignete Konzentration in Kulturmedium verdünnt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung kann die Zelldichte der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertro phie zum Beispiel 0,5-1 × 10⁶/cm³ (ml) oder 1 × 10⁵/cm³ (ml) sein. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Dichte der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie 4 × 10⁴/cm³ (ml) sein.

Die Zelle, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann in irgendeinem Medium kultiviert werden, das einschließt, aber nicht beschränkt ist auf: Ham's F12 (HamF12), Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM), minimales essenzielles Medium (MEM), minimales essenzielles Medium-Alpha (Alpha-MEM), Eagle's basales Medium (BME), Fitton-Jackson modifiziertes Medium (BGJb) oder eine Kombination davon. Die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann eine Zelle sein, die in einem Medium kultiviert wird, das Substanzen enthält, welche die Proliferation, Differenzierung oder beides der Zellen verstärken, die vorzugsweise einschließen, aber nicht beschränkt sind auf Medien, die Substanzen enthalten, wie mindestens einen Bestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta), dem Knochen morphogenetischen Faktor (BMP), dem Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), dem Kolonie stimulierenden Faktor (CSF), Ascorbinsäure, Dexamethason, Glycerophosphorsäure, dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), dem Plättchen-reichen Plasma (PRP), dem Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).

Ham's F12 Medium, das hier verwendet wird, umfasst zum Beispiel CaCl₂ (Anhydrat), 33,20 mg/L, CuSO₄·5 H₂O 0,0025 mg/L, FeSO₄·7 H₂O 0,83 mg/L, KCl 223,60 mg/L, MgCl₂ (Anhydrat) 57,22 mg/L, NaCl 7599,00 mg/L, NaHCO₃ 1176,00 mg/L, Na₂HPO₄ (Anhydrat) 142,00 mg/L, ZnSO₄·7 H₂O 0,86 mg/L, D-Glucose 1802,00 mg/L, Hypoxanthin·Na 4,77 mg/L, Linolsäure 0,08 mg/L, Liponsäure 0,21 mg/L, Phenol rot 1,20 mg/L, Putrescin 2 HCl 0,161 mg/L, Natriumpyruvat 110,00 mg/L, Thymidin 0,70 mg/L, L-Alanin 8,9 mg/L, L-Arginin·HCl 211,00 mg/L, L-Asparagin·H₂O 15,00 mg/L, L-Asparaginsäure 13,00 mg/L, L-Cystein HCl·H₂O 35,00 mg/L, L-Glutamat 14,70 mg/L, L-Alanyl-L-Glutamin 217,00 mg/L, Glycin 7,50 mg/L, L-Histidin HCl·H₂O 21,00 mg/L, L-Isoleucin 4,00 mg/L, L-Leucin 13,00 mg/L, L-Lysin·HCl 36,50 mg/L, L-Methionin 4,50 mg/L, L-Phenylalanin 5,00 mg/L, L-Prolin 34,50 mg/L, L-Serin 10,50 mg/L, L-Threonin 12,00 mg/L, L-Tryptophan 2,00 mg/L, L-Tyrosin·2 Na·2 H₂O 7,80 mg/L, L-Valin 11,70 mg/L, Biotin 0,007 mg/L, D-Ca Pantothenat 0,50 mg/L, Cholinchlorid 14,00 mg/L, Folsäure 1,30 mg/L, i-Inositol 18,00 mg/L, Niacinamid 0,04 mg/L, Pyridoxin NCl 0,06 mg/L, Riboflavin 0,04 mg/L, Thiamin HCl 0,30 mg/L und Vitamin B₁₂ 1,40 mg/L.

MEM Medium, das hier verwendet wird, umfasst zum Beispiel CaCl₂ (Anhydrat) 200,00 mg/L, KCl 400,00 mg/L, MgSO₄ (Anhydrat) 98,00 mg/L, NaCl 6800,00 mg/L, NaNCO₃ 2200,00 mg/L, NaH₂PO₄·H₂O 140,00 mg/L, D-Glucose 1000,00 mg/L, Phenol rot 10,00 mg/L, L-Arginin·HCl 126,00 mg/L, L-Zystein·2 HCl 31,00 mg/L, L-Glutamin 292,00 mg/L, L-Histamin HCl·H₂O 42,00 mg/L, L-Isoleucin 52,00 mg/L, L-Leucin 52,00 mg/L, L-Lysin HCl 73,00 mg/L, L-Methionin 15,00 mg/L, L-Phenylalanin 32,00 mg/L, L-Threonin 48,00 mg/L, L-Tryptophan 10,00 mg/L, L-Tyrosin·2 Na·2 H₂O 52,00 mg/L, L-Valin 46,00 mg/L, D-Ca Pantothenat 1,00 mg/L, Cholinchlorid 1,00 mg/L, Folsäure 1,00 mg/L, i-Inositol 2,00 mg/L, Niacinamid 1,00 mg/L, Pyridoxal HCl 1,00 mg/L, Riboflavin 0,10 mg/L, Thiamin HCl 1, 00 mg/L.

Das Gerüst, das mit einem biologischen Organismus bioverträglich ist, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Gerüst sein, solange es Biokompatibilität aufweist. Solche Gerüste schließen zum Beispiel ein Material ein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Tonerde, Zirkonerde, Apatit-Wollastonit abgelagertem Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, Seide, Cellulose, Dextran, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglykolsäure, Methylpolymethacrylat, Polycyanacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Ethylen-Vinylacetat Copolymer, Nylon und eine Kombination davon. Vorzugsweise ist das Gerüst, das mit einem biologischen Organismus bioverträglich ist, Calciumphosphat, Gelatine oder Collagen, und weiter bevorzugt Hydroxyapatit in verschiedenen Formen (z.B. kristallines Hydroxyapatit oder unverringertes Hydroxyapatit). Die Bioverträglichkeit des Gerüsts kann mit mindestens einem Test gemessen werden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem intraostealen Implantierungstest, einem reversen Mutationstest, einem Chromosomen Aberrationstest, einem Zytotoxizitätstest, einem intramuskulären Implantierungstest, einem Hautempfindlichkeitstest, einem Haut- oder einem intradermalen Irritationstest, einem Pyrogentest, einem Hämolysetest, einem Antigenitätstest, einem akuten Toxizitätstest und einem Wiederholungs-Dosistest. Vorzugsweise kann die Kompatibilität des Gerüsts mit allen der oben beschriebenen Tests gemessen werden.

Ein subkutaner Test für Knochenbildung ist ein Test zum Bewerten der osteogenen Funktion, um Knochen in einem Bereich zu bilden, wo herkömmlich kein Knochen existiert, was auch als Parosteosis bezeichnet wird. Weil dieser Test einfach durchgeführt werden kann wird er weitreichend im Stand der Technik verwendet. Im Fall von Knochenbehandlung kann ein Knochen Defizittest als eine Verfahren zum Testen verwendet werden.

Knochenbildung wird durch Osteoblasten durchgeführt, die bereits in der unmittelbaren Umgebung eines Defizits vorkommen und auch durch jene, die induziert werden/dorthin wandern. Deshalb wird für gewöhnlich angenommen, dass die Rate der Knochenbildung bessert ist in einem Knochen Defizittest als in einem subkutanen Test. Es ist gut bekannt, dass das Ergebnis des subkutanen Tests mit der Rate der Knochenbildung in dem aktuellen Knochendefizit übereinstimmt (siehe z.B. Urist, M. R.: Science, 150: 893 – 899 (1965), Wozney, J. M. et al.: Science, 242: 1528 – 1532 (1988), Johnson, E. E. et al.: Clin. Orthoped., 230: 257 – 265 (1988), Ekelund, A. et al.: Clin. Orthoped., 263: 102 – 112 (1991) und Riley, E. H. et al.: Clin. Orthoped., 324: 39 – 46 (1996)). Wenn deshalb Knochenbildung als das Ergebnis des subkutanen Tests beobachtet wird, versteht der Fachmann, dass Knochenbildung auch in dem Knochen Defizienztest induziert werden sollte.

(Verfahren zur Herstellung)

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus bereit, umfassend: A) Bereitstellen einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, und B) Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie auf einem Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist. Die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann auf einer Oberfläche oder innerhalb einer inneren Pore des bioverträglichen Gerüsts, vorzugsweise bei 37°C in der Anwesenheit von 5 – 10 % CO₂ kultiviert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann Schritt A) das Bereitstellen der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie umfassen, wobei das Potenzial für Hypertrophie durch die Expression von mindestens einem, ausgewählt aus, aber nicht beschränkt auf die Gruppe bestehend aus Typ X Collagen, alkalische Phosphatase, Osteonektin, Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan oder Bestandteile davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen und Chondromodulin als ein Marker, identifiziert werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann Schritt A) das Bereitstelen der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie umfassen, wobei das Potenzial für Hypertrophie unter Verwendung ihrer Hypertrophie als ein Marker identifiziert wird. Die Hypertrophie kann unter einem Mikroskop nach dem Herstellen eines Pellets aus den Zellen durch Zentrifugation von 5 × 10⁵ Zellen in HamF12 Kulturmedium, und dem direkten Kultivieren des Pellets beobachtet werden.

"HamF12 Wachstumsmedium", so wie hier verwendet, betrifft HamF12 Medium enthaltend 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/L Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum.

"MEM Wachstumsmedium", so wie hier verwendet, betrifft MEM Medium enthaltend 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/L Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B, ergänzt mit 15 % fötalem Rinderserum.

In der vorliegenden Erfindung wird die Kultur der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie unter Verwendung von Zellen hergestellt, die durch ein oben beschriebenes Verfahren isoliert oder induziert wurden. Die erfindungsgemäße Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann auf der Oberfläche kultiviert werden, oder falls das Gerüst eine innere Pore einschließt, innerhalb der Pore eines Gerüsts, das mit einem biologischen Organismus bioverträglich ist. Die Zelldichte der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann zum Beispiel auf 1 × 10⁷ Zellen/ml bis 1 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt werden. Jedoch können Zelldichten von weniger als 1 × 10⁴ Zellen/ml oder mehr als 1 × 10⁷ Zellen/ml ebenfalls verwendet werden. Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie können in einem Inkubator proliferiert werden, wenn die Zelldichte weniger als 1 × 10⁴ Zellen/ml beträgt. Wenn die Zelldichte der erfindungsgemäßen Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie mehr als 1 × 10⁷ Zellen/ml beträgt, können sie ohne irgendeine Behandlung verwendet werden, aber wahlweise können sie auf einem größeren Gerüst inokuliert oder auf eine geeignete Konzentration in Kulturmedium verdünnt werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Zelldichte der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie zum Beispiel 0,5 – 1 × 10⁶/cm³ (ml) oder 1 × 10⁵/cm³ (ml) sein. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Zelldichte einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie 4 × 10⁴/cm³ (ml) betragen.

Das Medium, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Medium sein, in dem die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie proliferiert werden kann. Zum Beispiel schließt ein solches Medium ein, aber ist nicht beschränkt auf Ham's F12 (HamF12), Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM), minimales essenzielles Medium (MEM), minimales essenzielles Medium-Alpha (Alpha-MEM), Eagle's basales Medium (BME), Fitton-Jackson modifiziertes Medium (BGJb) oder eine Kombination davon.

In einer anderen Ausführungsform kann das Medium, das zum Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, irgendeine Substanz enthalten, welche die Proliferation, die Differenzierung oder beides von Zellen verstärkt. Zum Beispiel schließen solche Substanzen ein, aber sind nicht beschränkt auf mindestens einen Bestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta), dem Knochen morphogenetischen Faktor (BMP), dem Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), dem Kolonie stimulierenden Faktor (CSF), Ascorbinsäure, Dexamethason, Glycerophosphorsäure, dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), dem Plättchen-reichen Plasma (PRP), dem Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und andere.

In einer anderen Ausführungsform kann die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie aus irgendeinem Bereich einschließlich des Knorpel-Knochenübergangs der Rippen, der epiphysialen Linie von Röhrenknochen (z.B. Oberschenkel, Schienbein, Wadenbein, Oberarmknochen, Elle und Speiche), der epiphysialen Linie von Wirbeln, der Knorpel Proliferationszone von Knöchelchen (z.B. Handknochen, Fußknochen und Brustbein), dem Perichondrium, der Knochen Organanlage, die vom Knorpel des Fötus gebildet wird, dem Kallusbereich eines heilenden Knochenbruchs und dem knorpeligen Teil der Knochen Profliferationsphase, erhalten werden.

Das Gerüst, das mit einem biologischen Organismus bioverträglich ist, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Gerüst sein, solange es, wie oben erwähnt, bioverträglich ist.

So wie hier verwendet betrifft "Fixierung" von Zellen an das Gerüst eine Bedingung, in der die Integrität des Gerüsts und der Zellen aufrechterhalten wird, nachdem die Zellen mit dem Gerüst inokuliert wurden. Die Zellen werden als fixiert an das Gerüst bezeichnet, indem die Integrität der inokulierten Zellen beobachtet wird und das Gerüst aufrechterhalten wird, nachdem das Gerüst mit dem die Zellen inokuliert wurden, in eine andere Bedingung (z.B. ein anderes Medium) überführt wird. Die andere Bedingung kann zum Beispiel ein Gefäß sein, das dieselbe Art von Medium enthält, das zuvor während der Kultur verwendet wurde. Wenn die Verträglichkeit für Transplantation untersucht wird, schließen bevorzugte Bedingungen ein, aber sind nicht beschränkt auf jene, in welche die Proben transplantiert werden sollen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der Zeitraum zum Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie auf dem Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, ein Zeitraum sein, der ausreichend ist, um die Zelle mit dem Potenzial für Hypertrophie an dem Gerüst zu fixieren. Dieser Zeitraum beträgt vorzugsweise, aber ist nicht beschränkt auf 3 Stunden bis 3 Monate. Weiter bevorzugt beträgt der Zeitraum 3 Stunden bis 3 Wochen, noch weiter bevorzugt einen halben Tag bis eine Woche. Der Zeitraum zum Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann weniger als 3 Stunden betragen, weil die Zelle an das bioverträgliche Gerüst innerhalb von mindestens 1 Stunde anheften kann. Der Zeitraum zum Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie kann mehr als 3 Monate betragen, weil die Zellen mit einem größeren Gerüst inokuliert werden können, oder ihre Zelldichte kann erneut eingestellt werden, wenn sie übermäßig proliferieren.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in Schritt B), kann die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Medium kultiviert werden, das eine Substanz zum Verstärken der Proliferation, der Differenzierung oder von beiden der Zelle enthält.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in Schritt B) kann die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Medium kultiviert werden, das mindestens einen Bestandteil umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta), dem Knochen morphogenetischen Faktor (BMP), dem Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), dem Kolonie stimulierenden Faktor (CSF), Ascorbinsäure, Dexamethason, Glycerophosphorsäure, dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), dem Plättchen-reichen Plasma (PRP), dem Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).

(Kit)

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit aus dem Verbundmaterial zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus, umfassend: A) ein Verbundmaterial, das eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, enthält, und B) ein Verabreichungsmittel, bereit. Das Verbundmaterial, das in dem erfindungsgemäßen Kit verwendet wird, kann in irgendeiner Form verwendet werden, wie in dem obigen Abschnitt "Verbundmaterial" beschrieben.

(Verwendung des Verbundmaterials)

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verwendungen eines Verbundmaterials bereit, um ein Implantat oder ein Knochen Reparaturmaterial zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus herzustellen, wobei das Verbundmaterial umfasst: A) eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, und B) ein Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist. Für die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, das in der Verwendung des erfindungsgemäßen Verbundmaterials verwendet wird, kann irgendeine Form verwendet werden, die in dem obigen Abschnitt 'Verbundmaterial" beschrieben ist.

(Behandlungsverfahren)

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reparieren eines defekten Bereichs von Knochen bereit, welches das Implantieren eines Verbundmaterials einschließlich einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hy pertrophie und einem Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, in den defekten Bereich des Knochens umfasst. Der defekte Bereich des Knochens kann eine Größe aufweisen, die nicht durch Fixierung alleine repariert werden kann. Das Verfahren zum Implantieren, das in diesem Verfahren verwendet wird, umfasst, aber ist nicht beschränkt auf das visuelle Implantieren des Verbundmaterials in eine defekte Stelle des Knochens während einer Operation. Für das Verbundmaterial, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung verwendet wird, kann irgendeine Form verwendet werden, die in dem obigen Abschnitt "Verbundmaterial" beschrieben ist. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Verbundmaterial in einen biologischen Organismus zusammen mit einer medizinischen Vorrichtung, wie einem Implantat (z.B. künstliche Sehne), einer Platte, einem Käfig, einem Nagel oder einem Zapfen implantiert werden.

(Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie)

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie bereit. Dieses Verfahren umfasst das Erhalten von Zellen aus dem Xiphoideusfortsatz Übergang, der an dem unteren Abschnitt des Brustbeins (corpus sterni) angeordnet ist. In der vorliegenden Erfindung betrifft "der Xiphoideusfortsatz Übergang, der an dem unteren Abschnitt des Brustbeins angeordnet ist", die Grenzzone zwischen dem unteren Abschnitt des Brustbeins (Knochenabschnitt) und dem Xiphoideusfortsatz (Knorpelanteil, der auch als Chondroxiphoid bezeichnet wird). Während von dem Brustbein herkömmlich angenommen wird, dass es wachsende Knorpelzellen enthält, wurden solche Zellen bislang nicht gesammelt. Ich habe gefunden, dass "der Xiphoideusfortsatz Übergang, der an dem unteren Abschnitt des Brustbeins angeordnet ist", wachsende Knorpelzellen (1B) enthält, und dass die Zellen darauf einfach erhalten werden können. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Herstellung von wachsenden Knorpelzellen bereit. Ich habe auch gefunden, dass "der Xiphoideusfortsatz Übergang, der an dem unteren Abschnitt des Brustbeins angeordnet ist", genauso reich oder noch reicher an wachsenden Knorpelzellen ist wie die Rippen/der Rippenknorpel, die eine herkömmli che Quelle von wachsenden Knorpelzellen sind, und dass die wachsenden Knorpelzellen einfach davon gesammelt werden können.

Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung durch Beispiele beschrieben. Die unten beschriebenen Beispiele werden nur für darstellende Zwecke bereitgestellt. Folglich ist der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht durch die oben beschriebenen Ausführungsformen oder die unten beschriebenen Beispiele beschränkt sondern ist nur durch die angehängten Patentansprüche beschränkt.

BEISPIELE

(Beispiel 1: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus den Rippendem Rippenknorpel)

Männliche Ratten (Wistar), die 4 – 8 Wochen alt waren, wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Die Brust der Ratten wurde unter Verwendung einer Rasierklinge rasiert und ihre gesamten Körper wurden in Hibitan (10-fach Verdünnung) eingetaucht, um desinfiziert zu werden. Die Brust der Ratten wurde geöffnet, und die Rippen/der Rippenknorpel wurde aspetisch entfernt. Der durchsichtige wachsende Knorpelbereich wurde aus dem Grenzbereich der Rippen/dem Rippenknorpel gesammelt. Der wachsende Knorpel wurde zerteilt und in 0,25 % Trypsin-EDTA/Dulbecco's Phosphat gepufferter Salzlösung (D-PBS) bei 37°C für 1 Stunde unter Rühren inkubiert. Die Zusammensetzung von D-PBS ist KCl 0,20 g/L, NaH₂PO₄ 0,20 g/L, NaCl 8,00 g/L, Na₂HPO₄·7 H₂O 2,16 g/L. Die Abschnitte wurden anschließend gewaschen und durch Zentrifugation (100 rpm (170 × g) × 5 min.) gesammelt, gefolgt durch Inkubation in 0,2 Collagenase (Invitrogen)/D-PBS bei 37°C für 2,5 Stunden unter Rühren. Nach dem Sammeln durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) wurden die Zellen in HamF12 Wachstumsmedium (d.h. HamF12 enthaltend 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/L Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum) mit 0,2 % Dispase (Invitrogen) in einer Rührflasche über Nacht bei 37°C unter Rühren inkubiert. Am folgenden Tag wurde die resultierende Zellsuspension filtriert, und die Zellen wurden gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) gesammelt. Die Zellen wurden Trypan Blau gefärbt und unter einem Mikroskop gezählt.

Die Zellen wurden bewertet, die nicht gefärbten Zellen wurden als lebende Zellen erachtet, und jene, die blau gefärbt waren, wurden als tote Zellen erachtet.

(Identifizierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie)

Weil die Zellen, die in Beispiel 1 erhalten wurden, durch die Enzyme, die in der Zelltrennung verwendet wurden (z.B. Trypsin, Collagenase und Dispase) beeinträchtigt waren, wurden sie kultiviert um sich zu erholen. Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie wurden identifiziert unter Verwendung ihrer Expression von Knorpelzellenmarkern und ihrer morphologischen Hypertrophie unter einem Mikroskop.

(Expression von spezifischen Markern für Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie)

Eine Zellsuspension, die unter Verwendung eines Verfahrens wie oben beschrieben hergestellt wurde, wird mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt. Die SDS behandelte Lösung wird einer SDS Polyacrylamid Elektrophorese unterzogen. Das Gel wird auf eine Transfermembran geblottet (Western Blotten), mit einem primären Antikörper gegen Knorpelzellenmarker umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Glucosidase, oder einem fluoreszierenden Tag, wie Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Phyoerythrin (PE), Texas Rot, 7-Amino-4-methylkumarin-3-acetat (AMCA) oder Rhodamin markiert ist, nachgewiesen.

Die Zellkulturen, die unter Verwendung eines Verfahrens, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, werden mit 10 % neutralem Formalinpuffer fixiert, mit einem primären Antikörper gegen Knorpelzellenmarker umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenztag, wie FITC, PE, Texas Rot, AMCA oder Rhodamin markiert ist, nachgewiesen.

(Histologische Bewertung des Potenzials für Hypertrophie in Knorpelzellen)

5 × 10⁵ Zellen in HamF12 Wachstumsmedium wurden zentrifugiert, um ein Pellet der Zellen herzustellen. Das Pellet wurde für einen vorbestimmten Zeitraum kultiviert, mit 10 % neutralem gepufterten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wurde zerteilt und mit Hämatoxilin und Eosin (HE Färbung) gefärbt. Die Zellgröße vor und nach der Kultur wurde unter einem Mikroskop verglichen. Wenn eine signifikante Proliferation beobachtet wurde, wurden die Zellen bestimmt, dass sie das Potenzial für Hypertrophie (1C) aufweisen.

(Analyse unter Verwendung von Markergenen)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in den vorliegenden Beispielen erhalten wurden, werden hinsichtlich der Menge an mRNA Transkripten von Typ X Collagen, alkalische Phosphatase, Typ II Collagen oder Knorpelproteoglykan analysiert, die Marker für Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie sind. mRNA Spezies werden unter Verwendung von Realtime PCR, wie unten, nachgewiesen.

(Realtime PCR)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, werden als eine Probe verwendet, mit Hydroxyapatit in HamF12 Wachstumsmedium (1/10⁶ Zellen/ml) inokuliert und in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für 1 Woche kultiviert. Knorpelzellen (1/10⁶ Zellen/ml) werden als eine Kontrolle verwendet. Gesamt RNA wird aus der Probe extrahiert.

Die Zellen werden in ein Mahlgefäß mit flüssigem Stickstoff gegeben und mit einer Mahlmaschine gemahlen. Anschließend werden die Proben in ein 2,0 ml Röhrchen transferiert, 1 ml ISOGEN (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) wird zu den Proben hinzugefügt, die Proben werden mit einem Vortex Mischer gemischt und mit einem Polytron gemahlen, bis sie homogen sind. Nachdem die Proben bei RT für 5 Minuten inkubiert wurden, werden sie kräftig mit 0,2 ml Chloroform gevortext. Nach einer weiteren Inkubation bei 4°C für 5 Minuten werden die Proben bei 12.000 × g, 4°C für 15 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Phase wird von dem Röhrchen gesammelt und mit 0,6 ml Isopropanol gevortext. Die Lösung wird bei RT für 10 Minuten inkubiert, anschließend bei –30°C über Nacht gelagert. Am folgenden Tag wird die Lösung bei 12.000 × g, 4°C für 15 Minuten zentrifugiert, anschließend wird der Überstand entfernt, getrocknet und mit 1 ml 75 % Ethanol gewaschen, um Gesamt RNA zu erhalten.

cDNA wird aus der Gesamt RNA unter Verwendung eines High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) synthetisiert. Typ X Collagen, alkalische Phosphatase, Typ II Collagen und Knorpelproteoglykan werden von Applied Biosystems bezogen. Anschließend werden unter Verwendung von cDNA als Matrize die Expression von Typ X Collagen, alkalischer Phosphatase, Typ II Collagen und Knorpelproteoglykan unter Verwendung des Taqman Assays (Taqman^® Gene Expression Assays (Applied Biosystems)) nachgewiesen.

Es wurde Realtime PCR Lösung (25 μL 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix, 2,5 μL 20 × Taqman^® Gene Expression Assay Mix, 21,5 μL RNase freies Wasser und 1 μL cDNA Matrize) hergestellt und in einer 96 Vertiefungs PCR Platte verteilt. Anschließend wurde eine PCR für 40 Zyklen bei 2 Minuten bei 50°C, 15 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 60°C unter Verwendung eines PCR Master Mix (Applied Biosystems) gefahren. Die Daten werden mit einem Realtime PCR Zyklusgerät (ABI PRISM 7900 HT) nachgewiesen. Nach der PCR wurde das Festsetzen des Grenzwertes und das Berechnen des Grenzwertzyklus unter Verwendung der analytischen Software, die mit dem Instrument (PRISM 7900 HT) bereitgestellt wird, durchgeführt.

(Ergebnisse)

Es wurde gefunden, dass in Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie Typ II Collagen und Knorpelproteoglykan (d.h. Knorpelmarker) exprimiert werden, und dass die Expression von Typ X Collagen und alkalischer Phosphatase (d.h. Marker für Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie) signifikant höher ist in Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie als in der Knorpelzellenkontrolle.

(Identifizierung von Zellen mit dem Potenzial für Hypertrophie)

Um zu bestimmen, ob Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie in Zellsuspensionen vorkommen, in denen Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie verdünnt wurden, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie (1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden auf sieben Blöcken von scheibenförmigem Hydroxyapatit mit 85 % Porosität (5 mm im Durchmesser)/24 Vertiefungsplatte (1,43 × 10⁵ Zellen/scheibenförmiges Hydroxyapatit) inokuliert und in HamF12 Wachstumsmedium, in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für 3 Stunden, 1 Tag, 3 Tage oder eine Woche inkubiert. Diese Proben (Hydroxyapatit inokuliert mit Zellen) wurden anschließend mit alkalischer Phosphatase gefärbt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und mit Toluidin Blau gefärbt. Für die akalische Phosphatase Färbung wurden die Proben durch Eintauchen in 60 % Aceton/Zitronensäurepuffer für 30 Sekunden fixiert, in Wasser gespült und mit alkalischer Phosphatase Färbelösung (2 ml 0,25 % Naphthol AS-MX alkalische Phosphatase (Sgima-Aldrich) + 48 ml 0,025 % First Violet B Salzlösung (Sigma Aldrich) bei RT in der Dunkelheit für 30 Minuten inkubiert. Für die Toluidin Blau Färbung wurden die Proben mit Toluidin Blau Färbelösung (0,05 % Toluidin Blau Lösung, pH 7,0 Wake Pure Chemical Industries Ltd.) bei RT für 3 – 10 min. inkubiert. Für alle Kulturzeiträume zeigten die Proben rot gefleckte Färbungen mit alkalischem Phosphat (siehe 2A – D). Mit Toluidin Blau zeigt dieselbe Stelle der Proben blau gefleckte Färbung für alle Kulturzeiträume, was die Existenz von Zellen mit den gewünschten Eigenschaften (siehe 2E – H) anzeigt. Somit wurde gefunden, dass Zellen auf Hydroxyapatit mit alkalischer Phosphatase Aktivität existieren.

(Ergebnisse)

Die Zellen, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, exprimierten einen Knorpelzellenmarker, und es wurde bestimmt, dass sie morphologisch hypertroph sind. Dies zeigt, dass die Zellen, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie waren. Diese Zellen wurden in den folgenden Experimenten verwendet.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die aus den Rippen/dem Rippenknorpel erhalten wurden, und einem bioverträglichen Gerüst)

HamF12 Wachstumsmedium wurde zu Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, auf eine Endzelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml hinzugefügt. Die Zellsuspension wurde gleichmäßig jeweils mit Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit inokuliert und in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für eine Woche kultiviert.

Diese Kulturen wurden subkutan in Ratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung wurden die Ratten getötet und der implantierte Bereich durch entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wurde geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Knochenbildung wurde in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung von bioverträglichen Gerüsten, die jeweils aus Gelatine (3A), Collagen (3B) und Hydroxyapatit (3C) hergestellt wurden, beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 1A: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Pellets aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, das von den Rippen/dem Rippeknorpel abgeleitet ist)

(Herstellung eines Pellets aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, das von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet ist)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie wurden aus den Rippen/dem Rippenknorpel durch ein Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, gesammelt. HamF12 Wachstumsmedium wurde zu diesen Zellen (5 × 10⁵ Zellen) bis zu einer Endzelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/0,5 ml hinzugefügt. Die Zellsuspension wurde bei (100 rpm (170 × g) × 5 min.) zentrifugiert, um ein Pellet aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie herzustellen.

Das Pellet aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie wurde subkutan in Ratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung wurden die Ratten getötet, und der implantierte Bereich wurde entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wurde geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde geringe Knochenbildung beobachtet, wenn das Pellet aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie implantiert wurde, jedoch war der Bereich signifikant kleiner im Vergleich zu jenem, wenn Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus den Rippen/dem Rippenknorpel und einem bioverträglichen Gerüst implantiert wurde (siehe Beispiel 1).

(Vergleichsbeispiel 1B: Wirkung von subkutaner Implantierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel alleine abgeleitet waren)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie wurden durch ein Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, erhalten und subkutan alleine in Ratten implantiert.

Es wurde keine Knochenbildung beobachtet, wenn die Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie alleine implantiert wurden.

(Vergleichsbeispiel 1C: Wirkung von subkutaner Implantierung von Hydroxyapatit alleine)

Hydroxyapatit (Gerüst) wurde subkutan alleine in Ratten implantiert, unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist. Es wurde keine Knochenbildung beobachtet, wenn Hydroxyapatit alleine implantiert wurde (4).

(Zusammenfassung von Beispiel 1 und Vergleichsbeispiele 1A – 1C)

Die Knochenbildung war deutlicher nach der subkutanen Implantierung von Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst in Ratten, im Vergleich zu den pelletierten Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie alleine. Wenn im Gegensatz dazu die Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie oder Hydroxyapatit alleine implantiert wurden, wurde keine Knochenbildung beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das erfindungsgemäße Verbundmaterial verwendet werden kann, um Knochendefizienzen zu behandeln, die zu groß sind, um mit herkömmlichen Verbundmaterialien behandelt zu werden.

(Beispiel 2: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von Brustbein abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus dem Brustbein)

Männliche Ratten (Wistar), die 4 – 8 Wochen alt waren, wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Die Brust der Ratten wurde unter Verwendung einer Rasierklinge rasiert, und ihre ganzen Körper wurden in Hibitan (10-fach Verdünnung) eingetaucht, um desinfiziert zu werden. Die Brust der Ratten wurde aufgeschnitten, und der Xiphoideusfortsatz Übergang, der an dem unteren Abschnitt des Brustbeins angeordnet ist, und andere Bereiche wurden aspetisch von dem Brustbein entfernt. Der durchsichtige wachsende Knorpelbereich wurde von dem Xiphoideusfortsatz Übergang gesammelt, der an dem unteren Abschnitt des Brustbein angeordnet ist. Diese Proben wurden zerteilt und in 0,25 % Trypsin-EDTA/D-PBS bei 37°C unter Rühren für 1 Stunde inkubiert. Die Schnitte wurden anschließend gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.), gefolgt von Inkubation in 0,2 % Collagenase/D-PBS bei 37°C für 2,5 Stunden unter Rühren gesammelt. Nach dem Sammeln durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) wurden die Zellen mit 0,2 % Dispase/HamF12 Wachstumsmedium in einer Rührflasche über Nacht bei 37°C unter Rühren inkubiert. Wahlweise wurde die Übernachtbehandlung mit 0,2 % Dispase weggelassen. Am folgenden Tag wurde die Zellsuspension filtriert und gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) gesammelt. Die Zellen wurden mit Trypan blau gefärbt und unter einem Mikroskop gezählt.

Die Zellen wurden bewertet, Zellen die nicht gefärbt waren, wurden als lebende Zellen erachtet, und jene, die blau gefärbt waren, wurden als tote Zellen erachtet.

(Identifizierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie)

Unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden die Zellen als Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie identifiziert (5A). Die Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie wurden nicht in anderen Bereichen als dem wachsenden Knorpelbereich des Brustbeins beobachtet ( 5B).

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein erhalten wurden, und eines bioverträglichen Gerüsts)

Unter Verwendung der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, wird ein Verbundmaterial durch ein Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und subkutan in Ratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung wurden die Ratten getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wurde geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt waren.

(Vergleichsbeispiel 2A: Wirkung von subkutaner Implantierung des Pellets aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein abgeleitet sind)

(Herstellung des Pellets aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus dem Brustbein)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie werden vom Brustbein durch ein Verfahren wie in Beispiel 2 beschrieben, gesammelt. HamF12 Wachstumsmedium wird zu diesen Zellen (5 × 10⁵ Zellen) hinzugefügt, um auf eine Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/0,5 mL zu verdünnen. Die Zellsuspension wird zentrifugiert (1000 rpm (170 × g) × 5 min.), um ein Pellet aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie herzustellen.

Das Pellet aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie wird subkutan in Ratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Ratten getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde eine geringe Knochenbildung beobachtet, wenn das Pellet der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus dem Brustbein implantiert wurde, jedoch ist der Bereich signifikant kleiner im Vergleich dazu wenn das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein abgeleitet sind, und ein bioverträgliches Gerüst, implantiert wird (siehe Beispiel 2).

(Vergleichsbeispiel 2B: Wirkung von subkutaner Implantierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein abgeleitet sind, alleine)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die durch ein Verfahren wie in Beispiel 2 erhalten wurden, werden alleine subkutan in Ratten implantiert. Es wird keine Knochenbildung beobachtet, wenn die Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie alleine implantiert wurden.

(Zusammenfassung von Beispiel 2 und Vergleichsbeispielen 2A, 2B und 2C)

Die Knochenbildung ist deutlicher nach der subkutanen Implantierung von Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst in Ratten, im Vergleich zu den pelletierten Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie alleine. Andererseits wird keine Knochenbildung beobachtet, wenn Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie oder Hydroxyapatit alleine implantiert werden (siehe Vergleichsbeispiel 1C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um Knochendefizienzen zu behandeln, die zu groß sind, um mit Verfahren des Standes der Technik behandelt zu werden.

(Vergleichsbeispiel 3A: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörknorpel abgeleitet sind, und eines bioverträglichen Gerüsts)

(Herstellung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie vom Gehörknorpel.

Männliche Ratten (Wistar), die 4 – 8 Wochen alt waren, wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Die ganzen Körper der Ratten wurden in Hibitan (10-fache Verdünnung) eingetaucht, um desinfiziert zu werden. Die Ratten wurden um den Gehörknorpel geöffnet, die Haut abgetrennt und der Gehörknorpel aspetisch entfernt. Der Gehörknorpel wird geschnitten und in 0,25 % Trypsin-EDTA/D-PBS bei 37°C für 1 Stunde unter Rühren inkubiert. Die Schnitte werden anschließend gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) gesammelt, gefolgt von Inkubation in 0,2 % Collagenase/D-PBS bei 37°C für 2,5 Stunden unter Rühren. Nach dem Sammeln durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) werden die Zellen mit 0,2 % Dispase/HamF12 Wachstumsmedium in einer Rührflasche über Nacht bei 37°C unter Rühren inkubiert. Wahlweise wird die Übernachtbehandlung mit 0,2 % Dispase weggelassen. Am folgenden Tag wird die Zellsuspension filtriert und die Zellen gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) gesammelt. Die Zellen werden mit Trypan blau gefärbt und unter einem Mikroskop gezählt.

Die Zellen werden bewertet, Zellen die nicht gefärbt sind, werden als lebende Zellen erachtet, und jene, die blau gefärbt sind, werden als tote Zellen erachtet.

(Identifizierung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörnknorpel abgeleitet sind)

Unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wird bestimmt, ob die Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie in Zellsuspension gefunden werden, die durch Verdünnen von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörknorpel abgeleitet sind, gefunden werden oder nicht. Die Probe wird nicht im alkalischer Phosphatase gefärbt. Mit Toluidin Färbung zeigt die Probe blau gefleckte Färbung, was die Existenz von Zellen zeigt, was anzeigte, dass die Zellen, die auf dem Hydroxyapatit existieren, keine alkalische Phosphatase Aktivität aufweisen. Somit enthielt die Zellsuspension, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel verwendet wurde, nur Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie.

Durch Nachweisen der Anordnung oder Expression von Knorpelzellmarkern unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, und morphologisches Untersuchen der Zellen, wurde bestimmt, dass die erhaltenen Zellen Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie sind.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörknorpel erhalten wurden, und eines bioverträglichen Gerüsts)

Unter Verwendung der Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wurden, wird ein Verbundmaterial durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 beschrieben ist, und subkutan in Ratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Ratten getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufterten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die aus jeweils Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt waren.

(Vergleichsbeispiel 3B: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gelenkknorpel abgeleitet sind, und eines bioverträglichen Gerüsts)

(Herstellung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie vom Gelenkknorpel)

Männliche Ratten (Wistar), die 4 – 8 Wochen alt waren, wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Die Ratten wurden um ihren Kniegelenksbereich unter Verwendung einer Rasierklinge rasiert und ihre ganzen Körper wurden in Hibitan (10-fache Verdünnung) eingetaucht, um desinfiziert zu werden. Die Ratten wurden an ihrem Kniegelenksbereich geöffnet, und Gelenkknorpel wurde aspetisch ent fernt. Der Gelenkknorpel wurde geschnitten und in 0,25 % Trypsin-EDTA/D-PBS bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) gesammelt, gefolgt von Rühren mit 0,2 % Collagenase/D-PBS bei 37°C für 2,5 Stunden. Nach dem Sammeln mit Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) wurden die Zellen mit 0,2 % Dispase/HamF12 Wachstumsmedium in einer Rührflasche über Nacht bei 37°C gerührt. Wahlweise wurde die Übernachtbehandlung mit 0,2 % Dispase weggelassen. Am folgenden Tag wurde die Zellsuspension filtriert und die Zellen gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) gesammelt. Die Zellen wurden mit Trypan blau gefärbt und unter einem Mikroskop gezählt.

Die Zellen wurden bewertet, nicht gefärbte Zellen wurden als lebende Zellen erachtet, und jene, die blau gefärbt waren, werden als tote Zellen erachtet.

(Identifizierung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gelenkknorpel abgeleitet sind)

Unter Verwendung eines Verfahrens, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde bestimmt, ob Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie in Zellsuspensionen gefunden werden, die durch Verdünnen von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gelenkknorpel abgeleitet sind, gefunden werden oder nicht. Knorpelzelle ohne das Potenzial für Hypertrophie (1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden auf sieben Blöcken von scheibenförmigem Hydroxyapatit mit 85 % Porosität (5 mm im Durchmesser)/24-Vertiefungsplatte (1,43 × 10⁵ Zellen/scheibenförmigem Hydroxyapatit) inokuliert und in HamF12 Wachstumsmedium in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für eine Woche inkubiert. Diese Proben färbten sich nicht mit alkalischer Phosphatase. Mit Toluidin Blau zeigten diese Proben eine gefleckte blaue Färbung, was die Existenz von Zellen (siehe 6A) zeigte. Die Zellen, die auf dem Hydroxyapatit existierten, zeigten keine alkalische Phosphatase Aktivität (siehe 6B). Deshalb wurde gezeigt, das die Zellsuspension, die in den vorliegenden Vergleichsbeispielen verwendet wurde, Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie enthielt.

Durch den Nachweis der Anordnung oder Expression von Knorpelzellmarkern unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, und dem morphologischen Untersuchen der Zellen wurde bestimmt, dass die erhaltenen Zellen Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie waren.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gelenkknorpel erhalten wurden, und eines bioverträglichen Gerüsts).

Unter Verwendung der Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wurden, wurde ein Verbundmaterial durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 beschrieben ist, und subkutan in Ratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung wurden die Ratten getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Proben wurden geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde keine Knochenbildung auf irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt waren.

(Vergleichsbeispiel 3C: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Rippenknorpel abgeleitet sind, und eines bioverträglichen Gerüsts)

(Herstellung von ruhenden Knorpelzelle ohne das Potenzial für Hypertrophie vom Rippenknorpel)

Männliche Ratten (Wistar), die 4 – 8 Wochen alt waren, wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Die Brust der Ratten wurden unter Verwendung einer Rasierklinge rasiert und ihre ganzen Körper in Hibitan (10-fache Verdünnung) einge taucht, um desinfiziert zu werden. Die Brust der Ratten wurde geöffnet und der Rippenknorpel aspetisch entfernt. Der Bereich des undurchsichtigen ruhenden Knorpels wurde von dem Rippenknorpel gesammelt. Der ruhende Knorpel wurde geschnitten und in 0,25 % Trypsin-EDTA/D-PBS bei 37°C unter Rühren für 1 Stunde inkubiert. Die Schnitte wurden anschließend gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 3 min.) gesammelt, gefolgt von Inkubation in 0,2 % Collagenase (Invitrogen)/D-PBS bei 37°C für 2,5 Stunden unter Rühren. Nach dem Sammeln mit Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 3 min.) wurden die Zellen mit 0,2 % Dispase (Invitrogen)/HamF12 Wachstumsmedium in einer Rührflasche über Nacht bei 37°C unter Rühren inkubiert. Wahlweise wurde die Übernachtbehandlung mit 0,2 % Dispase weggelassen. Am folgenden Tag wurde die resultierende Zellsuspension filtriert und die Zellen gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 3 min.) gesammelt. Die Zellen wurden mit Trypan blau gefärbt und unter einem Mikroskop gezählt.

Die Zellen wurden bewertet, nicht gefärbte Zellen wurden als lebende Zellen erachtet, und jene, die blau gefärbt waren, wurden als tote Zellen erachtet.

(Identifizierung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Rippenknorpel abgeleitet sind)

Unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde bestimmt, ob Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie in Zellsuspensionen gefunden werden, die durch Verdünnen von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Rippenknorpel abgeleitet sind, gefunden werden oder nicht. Ruhende Knorpelzellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden auf scheibenförmigen Blöcken aus Hydroxyapatit mit 85 % Porosität (5 mm im Durchmesser)/24-Vertiefungsplatte (1,43 × 10⁵ Zellen/scheibenförmges Hydroxyapatit) inokuliert und in HamF12 Wachstumsmedium in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für 3 Stunden, 1 Tag, 3 Tage oder eine Woche inkubiert. Keine der Proben wurde durch alkalische Phosphatase gefärbt. Mit Toluidin Blau zeigten die Proben eine gefleckte blaue Färbung, was die Existenz von Zellen (siehe 7A – 7D) anzeig te. Deshalb wurde geschlossen, dass die Zellen, die auf dem Hydroxyapatit existierten, keine alkalische Phosphatase Aktivität aufwiesen (siehe 7E – 7H), was anzeigte, dass die Zellsuspension, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel verwendet wurde, Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie enthielt.

Durch den Nachweis der Anordnung oder Expression von Knorpelzellmarkern unter Verwendung eines Verfahrens, das im Beispiel 1 beschrieben ist und der morphologischen Untersuchung der Zellen wurde bestimmt, dass die erhaltenen Zellen Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie waren (8).

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Rippenknorpel abgeleitet sind, und eines bioverträglichen Gerüsts)

Unter Verwendung der ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wurden, wird ein Verbundmaterial durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 beschrieben ist, und subkutan in Ratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Ratten getötet und die implantierte Region entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt waren.

(Vergleichsbeispiel 4: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung Osteoblasten und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung von Osteoblasten)

Neugeborene männliche Ratten (Wistar) wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Die ganzen Körper der Ratten wurden in Hibitan (10-fache Verdün nung) eingetaucht, um desinfiziert zu werden. Die Köpfe der Ratten wurden geöffnet und die Schädel aseptisch entfernt. Der Schädel wird geschnitten und in 0,2 Collagenase/D-PBS bei 37°C für 1 Stunde unter Rühren inkubiert. Die Zellsuspension wird filtriert und die Zellen gewaschen und durch Zentrifugation (1000 rpm (170 × g) × 5 min.) isoliert. Die Zellen werden mit Trypan blau gefärbt und unter einem Mikroskop gezählt.

Die Zellen werden bewertet, nicht gefärbte Zellen werden als lebende Zellen erachtet, und jene, die blau gefärbt sind, werden als tote Zellen erachtet.

(Identifizierung von Osteoblasten)

Osteoblasten werden unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, identifiziert, mit der Ausnahme, dass ein Osteoblastenmarker als ein Marker und MEM Wachstumsmedium als ein Medium verwendet werden.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten und einem bioverträglichen Gerüst)

Unter Verwendung von Osteoblasten, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wurden, wird ein Verbundmaterial durch ein Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und subkutan in Ratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Ratten getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde eine geringe Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung von Osteoblasten und den bioverträglichen Gerüsten beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt waren. Diese Knochenbildung wird mit jener verglichen, die durch Implantierung von Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind und einem bioverträglichen Gerüst (siehe Beispiel 1) und vom Brustbein und einem bioverträgli chen Gerüst (siehe Beispiel 2) induziert wurden. Diese Vergleiche zeigen, dass Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst eine überlegene Fähigkeit zur Knochenbildung gegenüber Verbundmaterialien unter Verwendung von Osteoblasten aufweisen.

(Vergleichsbeispiel 5: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung von mesenchymalen Stammzellen)

Ratten (Wistar), die 4 – 8 Wochen alt waren, wurden als Subjekt verwendet. Der Oberschenkelknochen der Ratten wird aspetisch entfernt, die Enden entfernt, sie werden getötet und ihr Knochenmark mit MEM Wachstumsmedium gewaschen. Die gewaschenen Knochenmarkszellen werden in einer 75 cm³ Kulturflasche (T-75) inokuliert. Nach Inkubation in 5 % CO₂ bei 37°C für eine Woche bis zehn Tage wurden Zellen, die an der Flasche angeheftet waren, in den folgenden Experimenten als mesenchymale Stammzellen, die vom Knochenmark abgeleitet sind, verwendet.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung eines Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass mesenchymale Stammzellen, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden und MEM Wachstumsmedium verwendet wird. Das Verbundmaterial wird weiterhin MEM Differenzierungsmedium in 5 % CO₂ bei 37°C für 2 Wochen inkubiert, um die mesenchymalen Stammzellen oder auf innerhalb des bioverträglichen Gerüsts in Oste oblasten zu differenzieren. Ein Verbundmaterial unter Verwendung der differenzierten Osteoblasten und von Hydroxyapatit wird subkutan in Ratten implantiert. Ein Verbundmaterial unter Verwendung eines bioverträglichen Gerüsts und mesenchymaler Stammzellen, die nicht das zweiwöchige Differenzierungsverfahren durchlaufen, werden ebenfalls zur Implantierung verwendet. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Ratten getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wird keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind, wenn Verbundmaterialien unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen und einem bioverträglichen Gerüst implantiert wird. Es wird eine geringe Knochenbildung in all jenen Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind, wenn Verbundmateriailen unter Verwendung von Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen diffierenziert wurden, und ein bioverträgliches Gerüst implantiert werden. Diese Knochenbildung wird mit jener verglichen, die durch Implantierung von Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/Rippenknorpel abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst (siehe Beispiel 1) und von dem Brustbein abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst (siehe Beispiel 2), induziert wurden. Diese Vergleiche zeigen, dass Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst überlegene Knochenbildungsfähigkeit gegenüber Materialien aufweisen, die mesenchymale Stammzellen oder Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenziert wurden, verwenden.

(Zusammenfassung der Vergleichsbeispiele 3 – 5)

Es wird keine Knochenbildung beobachtet, wenn Verbundmaterialien einschließlich der Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, abgeleitet vom Gehör knorpel, Gelenkknorpel oder Rippenknorpel, und ein bioverträgliches Gerüst subkutan in Ratten implantiert werden. Im Gegensatz dazu wird eine geringe Knochenbildung beobachtet, wenn Verbundmaterialien einschließlich Osteoblasten oder Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenziert wurden, und ein bioverträgliches Gerüst subkutan in Ratten implantiert werden. Die beobachtete Knochenbildung wird mit jener verglichen, die durch Implantierung von Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst induziert werden. Der Vergleich zeigte, dass Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst überlegene Knochenbildungsfähigkeit gegenüber Verbundmaterialien aufweisen, die Osteoblasten oder Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenziert wurden, verwenden.

(Beispiel 3: Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind und einem bioverträglichen Gerüst, in einen Bereich des Knochendefekts)

(Herstellung und Identifizierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus den Rippen/dem Rippenknorpel)

Ein Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst wurde durch ein Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.

(Herstellung eines Bereichs mit Knochendefekt)

Männliche Ratten (Wistar) wurden betäubt. Die Haut in dem Oberschenkel- oder Schienbeinbereich wurde abgehoben und weiches Gewebe auf eine Seite gelegt, um einen Oberschenkel- oder Schienbeinbereich freizulegen, oder die Kopfhaut wurde abgehoben, um aseptisch den Schädel freizulegen. Ein/eine Bohrstab oder -scheibe wurde mit einem Zahnbohrer verbunden und verwendet, um Knochendefekte an dem Oberschenkel- oder Schienbeinbereich oder in dem Schädel zu perforieren oder zu präparieren. Das wie oben hergestellte Verbundmaterial wurde in den neu hergestellten defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wurden die Ratten getötet, und der implantierte Bereich wurde entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wurde geschnitten und mit Hämatoxilin und Eosin (HE) gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde Knochenbildung in all jenen Verbundmaterialien beobachtet, die ein bioverträgliches Gerüst verwendeten, das jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt warf.

(Vergleichsbeispiel 6A: Wirkung von Implantierung eines Pellets aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, das von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet ist, in einen defekten Bereich eines Knochens)

(Herstellung eines Pellets aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind)

Ein Pellet aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie wird durch ein Verfahren hergestellt, das im Vergleichsbeispiel 1A beschrieben ist, und in einen defekten Bereich eines Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird der Zustand des implantierten Bereichs bewertet. Es wurde eine geringe Knochenbildung beobachtet, wenn das Pellet aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus den Rippen/dem Rippenknorpel in einen defekten Bereich des Knochens implantiert wurde, jedoch ist der Bereich signifikant kleiner im Vergleich dazu wenn Verbundmaterial unter Verwendung der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie aus den Rippen/dem Rippenknorpel und ein bioverträgliches Gerüst in einen defekten Bereich des Knochens implantiert werden (siehe Beispiel 3).

(Vergleichsbeispiel 6B: Wirkung der Implantierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind, alleine in einen defekten Bereich des Knochens)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die durch ein Verfahren das in Beispiel 1 beschrieben ist, erhalten wurden, werden alleine in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Es wurde keine Knochenbildung beobachtet, wenn die Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie alleine implantiert wurden.

(Vergleichsbeispiel 6C: Wirkung von Implantierung von Hydroxyapatit alleine in einen defekten Bereich eines Knochens)

Unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 3 beschrieben ist, wurden Hydroxyapatit Gerüste alleine in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Es wurde eine geringe Knochenbildung um das Implantat beobachtet, wenn Hydroxyapatit alleine implantiert wurde.

(Beispiel 4: Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Die Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein abgeleitet waren, und ein bioverträgliches Gerüst, erhalten durch ein Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben ist, werden in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt waren.

(Vergleichsbeispiel 7A: Wirkung von Implantierung eines Pellets aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein abgeleitet sind, in einen defekten Bereich eines Knochens)

Pellets aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie werden durch ein Verfahren, das im Vergleichsbeispiel 2A beschrieben ist, hergestellt, und in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird der Zustand des implantierten Bereichs bewertet. Es wird eine geringe Knochenbildung beobachtet, wenn ein Pellet aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus dem Brustbein in einen defekten Bereich eines Knochens implantiert wird, jedoch ist der Bereich signifikant kleiner im Vergleich dazu, wenn ein Verbundmaterial unter Verwendung der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie vom Brustbein und ein bioverträgliches Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens implantiert werden (siehe Beispiel 4).

(Vergleichsbeispiel 7B: Wirkung von Implantierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die vom Brustbein abgeleitet sind, alleine in einen defekten Bereich eines Knochens)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die durch ein Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben ist, erhalten wurden, werden alleine in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Es wurde keine Knochenbildung beobachtet, wenn Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie alleine implantiert werden.

(Vergleichsbeispiel 8A: Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörknorpel abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörknorpel abgeleitet sind, und ein bioverträgliches Ge rüst, erhalten im Vergleichsbeispiel 3A, werden in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird keine Knochenbildung auf den Verbundmaterialien unter Verwendung der Gerüste, die entweder aus Gelatine oder Collagen hergestellt sind, beobachtet, und sie wird nur geringfügig um die implantierten Verbundmaterialien unter Verwendung eines Gerüsts, das aus Hydroxyapatit hergestellt ist, beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 8B: Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörknorpel abgeleitet sind, und eines bioverträglichen Gerüsts in einen defekten Bereich eines Knochens)

Die Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörknorpel abgeleitet sind, und ein bioverträgliches Gerüst, erhalten im Vergleichsbeispiel 3B, werden in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird keine Knochenbildung in den Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die aus Gelatine oder Collagen hergestellt sind, und sie wird nur in geringem Umfang um die implantierten Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste, die aus Hydroxyapatit hergestellt sind, beobachtet.

(Vergieichsbeispiel 8C: Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen, die vom Rippenknorpel abgeleitet sind, und eines bioverträglichen Gerüsts in einen defekten Bereich eines Knochens)

Die Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Rippenknorpel abgeleitet sind, und das bioverträgliche Gerüst, erhalten im Vergleichsbeispiel 3C, werden in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird keine Knochenbildung in den Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste, die aus Gelatine oder Collagen hergestellt sind, beobach tet, und sie wird nur in geringem Umfang um die implantierten Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste, die aus Hydroxyapatit hergestellt sind, beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 9: Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten und eines bioverträglichen Gerüsts in einen defekten Bereich eines Knochens)

Die Verbumdmaterialien unter Verwendung von Osteoblasten und das bioverträgliche Gerüst, erhalten in Vergleichsbeispiel 4, werden in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird eine geringe Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind, beobachtet. Die beobachtete Knochenbildung wird mit jener verglichen, die durch Implantierung von Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippendem Rippenknorpel abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst (siehe Beispiel 3) und vom Brustbein abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst (siehe Beispiel 4) induziert wird. Diese Vergleiche zeigen, dass Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst überlegende Knorpelbildungsfähigkeit gegenüber Verbundmaterialien unter Verwendung von Osteoblasten aufweisen.

(Vergleichsbeispiel 10: Vergleich der Rate und der Menge von Knochenbildung bei Transplantation eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens.

Die Verbundmaterialien unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen und das bioverträgliche Gerüst, erhalten in Vergleichsbeispiel 5, oder Verbundmaterialien unter Verwendung von Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenzierten und ein bioverträgliches Gerüst, werden in einen defekten Bereich eines Knochens in Ratten implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen und einem bioverträglichen Gerüst wird eine geringe Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind. Wenn das Verbundmaterial unter Verwendung von Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenzierten und ein bioverträgliches Gerüst implantiert werden, wird eine geringe Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind. Diese Knochenbildung wird verglichen mit jener, die durch Implantierung von Verbundmaterialien unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind und einem bioverträglichen Gerüst (siehe Beispiel 3) und die vom Brustbein abgeleitet sind und einem bioverträglichen Gerüst (siehe Beispiel 4) induziert werden. Diese Vergleiche zeigen, dass Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit den Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst überlegene Knochenbildungsfähigkeit gegenüber Materialien aufweisen, die mesenchymale Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen differenziert sind, verwenden.

(Zusammenfassung der Beispiele 3 – 4 und der Vergleichsbeispiele 6A – 10)

Die Knochenbildung, die nach Implantierung des Verbundmaterials umfassend Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst in defekte Bereiche von Knochen in Ratten beobachtet wird, ist größer als jene, die nach Implantierung der pelletierten Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie beobachtet wird. Andererseits wird keine Knochenbildung beobachtet, wenn Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie alleine implantiert werden. Wenn Hydroxyapatit alleine implantiert wird, wird die Knochenbildung nur geringfügig um das Implantat induziert. Diese Ergebnisse spiegeln die Vergleichsbeispiele wieder, die aus subkutanen Versuchen des Verbundmaterials und ein zelnen Materialien (Beispiele 1 – 2 und Vergleichsbeispiele 1A – 2B) erhalten wurden. Zusätzlich wird eine geringe Knochenbildung in den defekten Bereichen des Knochens beobachtet, entweder bei Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Gehörknorpel, dem Gelenkknorpel oder ruhendem Knorpel abgeleitet sind, und bioverträglichen Gerüsten in defekte Bereiche des Knochens, oder bei einem Verbundmaterial unter Verwendung von Osteoblasten, Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind oder mesenchymalen Stammzellen und bioverträglichen Gerüsten in defekte Bereiche des Knochens.

(Beispiel 5: Die Rate und die Menge von Knochenbildung, die durch Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens induziert werden)

(Herstellung eines defizienten Bereichs eines Knochens und Messen der Rate und der Menge von Knochenbildung)

Die Rate und Menge von Knochenbildung wurde gemessen nachdem das Verbundmaterial aus Beispiel 1, in dem Knochenbildung beobachtet wurde, in einen defekten Bereich eines Knochens implantiert wurde. Die Rate und die Menge der Knochenbildung wurde unter Verwendung von Mikro CT(SkyScan 1172, Toyo Technica) gemessen. Hydroxyapatit wurde als ein bioverträgliches Gerüst verwendet. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und das Hydroxyapatit, erhalten durch ein Verfahren, das im Beispiel 1 beschrieben ist (unter Verwendung eines scheibenförmigen Hydroxyapatits von 4 mm im Durchmesser × 1 mm in der Stärke) wurde in den defekten Bereich des Knochens (eine gestanzte Läsion von 4 mm im Durchmesser) implantiert. Der defekte Bereich des Knochens wurde durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wurde der implantierte Bereich entfernt und mit Mikro CT (65 kV – 154 μA, 80 kV – 125 μA oder 100 kV – 100 μA; A1 oder Ti Filter; Rotationswinkel 0,4°) gemessen.

(Die Rate und die Menge von Knochenbildung)

Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden vier Wochen nach der Implantierung von Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in den defekten Bereich des Knochens, 5,78 mm³ Knochen gebildet. Der Prozentsatz von neu gebildeten Knochen gegenüber Gesamtknochen betrug 45,90 %.

(Vergleichsbeispiel 11: Die Rate und Menge von Knochenbildung, die durch Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens induziert wurde)

(Herstellung eines defekten Bereichs eines Knochens und Messen der Rate und Menge von Knochenbildung)

Hydroxyapatit wurde als ein bioverträgliches Gerüst verwendet. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit, erhalten durch ein Verfahren, das in Beispiel 3C beschrieben ist (unter Verwendung eines scheibenförmigen Hydroxyapatits von 4 mm im Durchmesser × 1 mm in der Stärke) wurde in einen defekten Bereich des Knochens implantiert (eine Läsion von 4 mm im Durchmesser). Der defekte Bereich des Knochens wurde durch ein Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, hergestellt.

(Die Rate und Menge der Knochenbildung)

Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden vier Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in den defekten Bereich des Knochens, 2,74 mm³ Knochen gebildet. Der Prozentsatz von neu gebildeten Knochen gegenüber Gesamt knochen betrug 24,16 %. Die Rate und die Menge von Knochenbildung war geringer als jene bei dem Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit, die in Beispiel 5 beschrieben ist.

(Vergleichsbeispiel 12: Die Rate und Menge von Knochenbildung, die durch Implantierung eines bioverträglichen Gerüsts alleine in einen defekten Bereich eines Knochens induziert wird)

(Herstellung eines defekten Bereichs eines Knochens und Messen der Rate und der Menge an Knochenbildung)

Hydroxyapatit wurde als ein bioverträgliches Gerüst verwendet. Das Hydroxyapatit (unter Verwendung eines scheibenförmigen Hydroxyapatits von 4 mm im Durchmesser × 1 mm in der Stärke) wurde in den defekten Bereich des Knochens implantiert (eine Läsion von 4 mm im Durchmesser). Der defekte Bereich des Knochens wurde durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Vier Wochen nach der Implantierung wurde der implantierte Bereich entfernt und mit Mikro CT gemessen (65 kV – 154 μA, 80 kV – 125 μA oder 100 kV – 100 μA; A1 oder Ti Filter; Rotationswinkel 0,4°).

(Die Rate und Menge an Knochenbildung)

Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden vier Wochen nach Implantierung von Hydroxyapatit alleine in den defekten Bereich des Knochens, 2,72 mm³ Knochen gebildet. Der Prozentsatz von neu gebildeten Knochen gegenüber Gesamtknochen betrug 29,48 %. Die Rate und die Menge von Knochenbildung war geringer als jene des Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit, die in Beispiel 5 beschrieben ist.

(Zusammenfassung von Beispiel 5 und Vergleichsbeispielen 11 und 12)

Die Rate und Menge von Knochenbildung, die nach Implantierung von Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in den defekten Bereich eines Knochens beobachtet wurde, war größer als jene von Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit (siehe 9 – 10 und Tabelle 2). Wenn das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in den defekten Bereich des Knochens implantiert wurden, war die Rate und die Menge der Knochenbildung größer als jene, die nach Implantierung von Hydroxyapatit alleine beobachtet wurde (siehe 9 – 10 und Tabelle 2). Es besteht kein Unterschied zwischen der Rate und der Menge von Knochenbildung nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit und jener nach Implantierung von Hydroxyapatit alleine in den defekten Bereich eines Knochens (siehe 9 – 10 und Tabelle 2). (Tabelle 2)

Leer:: Die Menge (Volumen) und Rate von Knochenbildung 4 Wochen nach Implantierung von Hydroxyapatit alleine in einen defekten Bereich eines Knochens in den Rattenschädel.
GC:: Die Menge (Volumen) und Rate von Knochenbildung 4 Wochen nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie (wachsende Knorpelzelle erhalten von den Rippen/dem Rippenknorpel) und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich eines Knochens in den Schädel von Ratten.
RC:: Die Menge (Volumen) und Rate von Knochenbildung 4 Wochen nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie (ruhende Knorpelzellen erhalten vom Rippenknorpel) und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich eines Knochens in den Rattenschädel.

(Vergleichsbeispiel 13: Die Rate und Menge von Knochenbildung nach Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

(Herstellung eines defekten Bereichs eines Knochens und Messen der Rate und der Menge von Knochenbildung)

Hydroxyapatit wird als ein bioverträgliches Gerüst verwendet. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Osteoblasten und Hydroxyapatit, erhalten nach einem Verfahren, das im Vergleichsbeispiel 4 beschrieben ist (unter Verwendung eines scheibenförmigen Hydroxyapatits von 4 mm im Durchmesser × 1 mm in der Stärke) wird in einen defekten Bereich eines Knochens implantiert (eine Läsion von 4 mm im Durchmesser). Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren erhalten, das in Beispiel beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird der implantierte Bereich entfernt und mit Mikro CT gemessen (65 kV – 154 μA, 80 kV – 125 μA oder 100 kV – 100 μA; A1 oder Ti Filter; Rotationswinkel 0,4°)

(Die Rate und Menge der Knochenbildung)

Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich eines Knochens wird geringfügig Knochen gebildet. Es wird beobachtet, dass der Prozentsatz des neu gebildeten Knochens gegenüber dem Gesamtknochen gering ist, und dass die Rate und Menge der Knochenbildung geringer ist als jene bei Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit, die in Beispiel 5 beschrieben ist.

(Vergleichsbeispiel 14: Die Rate und Menge der Knochenbildung, die durch Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten die aus mesenchymalen Stammzellen differenziert sind, und eines bioverträglichen Gerüsts in einen defekten Bereich eines Knochens induziert werden)

(Herstellung eines defekten Bereichs eines Knochens und Messen der Rate und Menge der Knochenbildung)

Hydroxyapatit wird als ein bioverträgliches Gerüst verwendet. Das Verbundmaterial unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder einem Osteoblasten, der aus mesenchymalen Stammzellen differenziert ist, und Hydroxyapatit, erhalten durch ein Verfahren, das im Vergleichsbeispiel 5 beschrieben ist (unter Verwendung von scheibenförmigem Hydroxyapatit von 4 mm im Durchmesser × 1 mm in der Stärke) wird in einen defekten Bereich eines Knochens implantiert (eine Läsion von 4 mm im Durchmesser). Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird der implantierte Bereich entfernt und mit Mikro CT gemessen (65 kV – 154 μA, 80 kV – 125 μA oder 100 kV – 100 μA; A1 oder Ti Filter; Rotationswinkel 0,4°)

(Die Rate und Menge der Knochenbildung)

Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenzierten, und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird geringfügig Knochen gebildet. Es wird beobachtet, dass der Prozentsatz des neu gebildeten Knochens gegenüber dem Gesamtknochen gering ist, und dass die Rate und Menge der Knochenbildung geringer ist als jene von Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit, die in Beispiel 5 beschrieben ist.

(Beispiel 6: Wirkung von Kulturmedium auf das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel abgeleitet sind)

Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst wurde unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel erhalten wurden, und einem bioverträglichen Gerüst)

MEM Wachstumsmedium wurde zu den Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die aus Beispiel 1 erhalten wurden, in einer Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml) hinzugefügt. Diese Zellsuspension wurde gleichmäßig in jeweils Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit Gerüste inokuliert und in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37°C für 1 Woche inkubiert.

Diese Kultur wurde in Ratten subkutan implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung wurden die Ratten getötet, und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Proben wurde geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Knochenbildung wurde in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurden.

(Beispiel 7: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von einem Menschen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus einem Menschen)

Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von menschlichem Gewebe, wie Polymeliac, Tumor oder Spenderknorpelgewebe abgeleitet sind, wird von Organisationen erhalten, die humane Gewebequellen verwenden (japanische Organisationen, wie die Health Science Research Resources Bank, RIKEN Bioresource Center, JCRB Cellbank of National Insitute of Biomedical Innovation, und Institute of Development, Aging and Cancer bei der Tohoku Universität; nicht japanische Organisationen, wie International Insitute for the Advancement of Medicine (IIAM) und American Type Cultur Collection (ATCC); und kommerzielle Quellen, wie Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, Sanko Junyaku, TOYOBO, Cambrex und Osiris). Erhaltene Zellen werden in HamF12 Wachstumsmedium inokuliert.

(Identifizierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie)

Unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wird bestimmt, dass die oben erhaltenen Zellen Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie sind.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von einem Menschen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Unter Verwendung der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, wird ein Verbundmaterial durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 beschrieben ist, und in immundefiziente Tiere, wie Nacktmäuse oder Nacktratten subkutan implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Tiere getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Knochenbildung wird in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind.

(Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich eines Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Bespiel erhalten wurden, und ein bioverträgliches Gerüst werden in einen defekten Bereich eines Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt ist.

(Messen der Rate und Menge der Knochenbildung in einem defekten Bereich eines Knochens)

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 5 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird Knochenneubildung beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 15A: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die von einem Menschen abgeleitet sind, und ein bioverträgliches Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung der Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie von einem Menschen)

Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die von menschlichem Gewebe abgeleitet sind, wie Polymeliac, Tumor oder Spenderknorpelgewebe wird von Organisationen erhalten, die menschliche Gewebequellen verwenden (japanische Organisationen, wie die Health Science Research Resources Bank, RIKEN Bioresource Center, JCRB Cellbank of National Insitute of Biomedical Innovation, und Institute of Development, Aging and Cancer bei der Tohoku Universität; nicht japanische Organisationen, wie IIAM und ATCC; und kommerzielle Quellen, wie Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, Sanko Junyaku, TOYOBO, Cambrex und Osiris). Die Zellen werden in HamF12 Wachstumsmedium inokuliert. Unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wird bestimmt, ob die hergestellten Zellen Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie sind.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie aus einem Menschen)

Unter Verwendung der Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, wird ein Verbundmaterial durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 beschrieben ist, und in immundefiziente Tiere, wie Nacktmäuse oder Nacktratten subkutan implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Tiere getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Proben werden geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wird keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind.

(Wirkung der Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich eines Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten werden, und ein bioverträgliches Gerüst werden in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird keine Knochenbildung in den Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die aus Gelatine und Collagen hergestellt sind, und nur eine geringfügige Knochenbildung wird um das implantierte Verbundmaterial unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts, das aus Hydroxyapatit hergestellt ist, beobachtet.

(Messen der Rate und Menge der Knochenbildung in einem defekten Bereich des Knochens)

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 5 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird eine geringfügige Neubildung des Knochens beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 15B: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten, die von einem Menschen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von Osteoblasten, die von einem Menschen abgeleitet sind)

Menschliche Osteoblasten werden von Organisationen erhalten, die menschliche Gewebequellen verwenden (japanische Organisationen, wie die Health Science Research Resources Bank, RIKEN Bioresource Center, JCRB Cellbank of National Insitute of Biomedical Innovation, und Institute of Development, Aging and Cancer bei der Tohoku Universität; nicht japanische Organisationen, wie IIAM und ATCC; und kommerzielle Quellen, wie Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, Sanko Junyaku, TOYOBO, Cambrex und Osiris). Die Zellen werden in HamF12 Wachstumsmedium inokuliert. Unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 4 beschrieben ist, werden die hergestellten Zellen als Osteoblasten bestimmt.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten aus einem Menschen und einem bioverträglichen Gerüst)

Unter Verwendung der Osteoblasten, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, wird ein Verbundmaterial durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 beschrieben ist, und subkutan in immundefiziente Tiere, wie Nacktmäuse oder Nacktratten implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Tiere getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Eine geringfügige Knochenbildung wird in jedem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind.

(Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter von Verwendung Osteoblasten und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Osteoblasten und einem bioverträglichen Gerüst, das in dem vorliegenden Vergleichs beispiel erhalten wird, wird in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird eine geringfügige Knochenbildung in allen Verbundmaterialien unter Verwendung von bioverträglichen Gerüsten beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind.

(Messen der Rate und Menge von Knochenbildung in einem defekten Bereich des Knochens)

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 5 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird geringfügige Neubildung des Knochens beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 15C: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, die von einem Menschen abgeleitet sind und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen, die von einem Menschen abgeleitet sind)

Menschliche mesenchymale Stammzellen werden von Organisationen erhalten, die menschliche Gewebequellen verwenden (japanische Organisationen, wie die Health Science Research Resources Bank, RIKEN Bioresource Center, JCRB Cellbank of National Insitute of Biomedical Innovation, und Institute of Development, Aging and Cancer bei der Tohoku Universität; nicht japanische Organisationen, wie IIAM und ATCC; und kommerzielle Quellen, wie Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, Sanko Junyaku, TOYOBO, Cambrex und Osiris). Die Zellen werden in HamF12 Wachstumsmedium inokuliert.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten von mesenchymalen Stammzellen, die von einem Menschen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt, mit der Ausnahme, dass mesenchymale Stammzellen in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden und MEM Wachstumsmedium verwendet wird. Das Verbundmaterial wird weiterhin in MEM Differenzierungsmedium in 5 % CO₂ bei 37°C für 2 Wochen inkubiert, und die mesenchymale Stammzelle auf oder innerhalb des bioverträglichen Gerüsts differenziert zu Osteoblasten. Das Verbundmaterial unter Verwendung der differenzierten Osteoblasten und Hydroxyapatit wird subkutan in immundefiziente Tiere, wie Nacktmäuse oder Nacktratten implantiert. Ein Verbundmaterial unter Verwendung eines bioverträglichen Gerüsts und mesenchymaler Stammzellen, die nicht das zweiwöchige Differenzierungsverfahren durchlaufen haben, wird ebenfalls zur Implantierung verwendet. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Tiere getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wird keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung von bioverträglichen Gerüsten beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind, wenn Verbundmaterialien unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen und einem bioverträglichen Gerüst subkutan implantiert werden. Es wird eine geringfügige Knochenbildung in allen Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind, wenn die Verbundmaterialien unter Verwendung von Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenzierten und ein bioverträgliches Gerüst implantiert werden.

(Wirkung der Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, die von einem Menschen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, hergestellt. Das Verbundmaterial unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, und ein bioverträgliches Gerüst, das in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wurde, wird in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird eine geringfügige Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind.

(Messen der Rate und der Menge der Knochenbildung in einem defekten Bereich des Knochens)

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 5 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird eine geringfügige Neubildung des Knochens beobachtet.

(Beispiel 8: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel der Maus abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung der Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel der Maus abgeleitet sind)

Mäuse werden als Subjekte verwendet. Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten werden, werden von den Rippen/dem Rippenknorpel der Maus unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt. Hergestellte Zellen werden als Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, identifiziert.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel der Maus abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten werden, durch ein Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt und subkutan in Mäuse implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Mäuse getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wurde eine Knochenbildung in allen Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurden.

(Wirkung der Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst, das in dem vorliegenden Beispiel erhalten wird, wird in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird eine Knochenbildung in allen Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind.

(Messen der Rate und der Menge der Knochenbildung in einem defekten Bereich eines Knochens)

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 5 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in den defekten Bereich des Knochens wird eine Neubildung des Knochens beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 16A: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel der Maus abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von ruhenden Knorpelzellen aus Rippenknorpel der Maus)

Mäuse werden als Subjekte verwendet. Ruhende Knorpelzellen werden unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 3C beschrieben ist, hergestellt. Hergestellte Zellen werden als ruhende Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 3C beschrieben ist, identifiziert.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die von dem Rippenknorpel der Maus abgeleitet sind, und ein bioverträgliches Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden, durch ein Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt und subkutan in Mäuse implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Mäuse getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bestimmen. Es wurde keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurde.

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, hergestellt. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst, das in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wird, wird in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird keine Knochenbildung in den Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die aus Gelatine oder Collagen hergestellt wurden, und es wird nur eine geringfügige Knochenbildung um die implantierten Verbundmaterialien unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das aus Hydroxyapatit hergestellt ist.

(Messen der Ratte und Menge der Knochenbildung in einem defekten Bereich des Knochens)

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 2 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird eine geringfügige Neubildung des Knochens beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 16B: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten, die von Mäusen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von Osteoblasten, die von Mäusen abgeleitet sind)

Mäuse werden als Subjekte verwendet. Osteoblasten werden von den Mäusen unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 4 beschrieben ist, hergestellt. Die hergestellten Zellen werden als Osteoblasten unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 4 beschrieben ist, identifiziert.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten, die von Mäusen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung von Osteoblasten, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden, durch ein Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und subkutan in Mäuse implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Mäuse getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Eine geringfügige Knochenbildung wird in allen Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind.

(Wirkung der Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten, die von Mäusen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Osteoblasten und einem bioverträglichen Gerüst, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden, werden in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird eine geringfügige Knochenbildung in den Verbundmaterialien unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurde.

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 5 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird eine geringfügige Neubildung des Knochens beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 16C: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, die von Mäusen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen, die von Mäusen abgeleitet sind)

Mäuse werden als Subjekte verwendet. Mesenchymale Stammzellen werden von Mäusen unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 5 beschrieben ist, hergestellt. Die hergestellten Zellen werden als mesenchymale Stammzellen unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 14 beschrieben ist, identifiziert.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von einer mesenchymalen Stammzelle abgeleitet sind, die von Mäusen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden, durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass mesenchymale Stammzellen, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden und MEM Wachstumsmedium verwendet werden. Das Verbundmaterial wird weiterhin in MEM Differenzierungsmedium in 5 % CO₂ bei 37°C für 2 Wochen inkubiert, um die mesenchymale Stammzellen auf oder innerhalb des bioverträglichen Gerüsts in Osteoblasten zu differenzieren. Das Verbundmaterial unter Verwendung der differenzierten Osteoblasten und Hydroxyapatit wird subkutan in Mäuse implantiert. Ein Verbundmaterial unter Verwendung eines bioverträglichen Gerüsts und mesenchymaler Stammzellen, welche das zweiwöchige Differenzierungsverfahren nicht durchlaufen haben, werden ebenfalls für die Implantierung verwendet. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Mäuse getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Nach subkutaner Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung der mesenchymalen Stammzelle und eines bioverträglichen Gerüsts wird keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt sind. Nach der subkutanen Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenzierten, und einem bioverträglichen Gerüst wurde eine geringfügige Knochenbildung in allen Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt waren.

(Wirkung der Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, hergestellt. Das Verbundmaterial unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind und ein bioverträgliches Gerüst, das in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wird, werden in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird eine geringfügige Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurde.

(Beispiel 9: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, die von den Rippen/dem Rippenknorpel des Kaninchens abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus Rippen/Rippenknorpel)

Kaninchen werden als Subjekte verwendet. Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie werden von dem Rippen/Rippenknorpel des Kaninchens unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt.

(Identifizierung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie)

Die hergestellten Zellen werden als Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie unter Verwendung eines Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie aus den Rippen/dem Rippenknorpel des Kaninchens und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie, das in dem vorliegenden Beispiel erhalten wird durch ein Verfahren, das in Beispiel beschrieben ist, hergestellt und subkutan in Kaninchen implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Kaninchen getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Knochenbildung wird in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurden.

(Wirkung der Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Ein defekter Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das im Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten werden, wird in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurde.

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 5 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird Neubildung des Knochens beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 17A: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Rippenknorpel des Kaninchens abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie aus dem Rippenknorpel des Kaninchens)

Kaninchen werden als Subjekte verwendet. Ruhende Knorpelzellen werden unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 3C beschrieben ist, hergestellt. Die hergestellten Zellen werden als ruhende Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 3C beschrieben ist, identifiziert.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die vom Rippenknorpel des Kaninchens abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung der ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten werden durch ein Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt und subkutan in Kaninchen implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Kaninchen getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wird keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurden.

(Wirkung der Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von ruhenden Knorpelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und ein bioverträgliches Gerüst, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden, wird in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das aus Gelatine und Collagen hergestellt wurde, und es wird nur eine geringfügige Knochenbildung um die implantierten Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die aus Hydroxyapatit hergestellt wurden.

Die Rate und Menge der Knochenbildung in dem implantierten Bereich wird durch ein Verfahren gemessen, das in Beispiel 5 beschrieben ist. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Knor pelzellen ohne das Potenzial für Hypertrophie und Hydroxyapatit in einen defekten Bereich des Knochens wird eine geringfügige Neubildung des Knochens beobachtet.

(Vergleichsbeispiel 17B: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten, die von einem Kaninchen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von Osteoblasten, die von einem Kaninchen abgeleitet sind)

Kaninchen werden als Subjekte verwendet. Osteoblasten werden aus Kaninchen unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 4 beschrieben ist, hergestellt. Die hergestellten Zellen werden als Osteoblasten unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 4 beschrieben ist, identifiziert.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten, die von einem Kaninchen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung von Osteoblasten, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel durch ein Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, erhalten werden, hergestellt und subkutan in Kaninchen implantiert. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Kaninchen getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Es wird eine geringfügige Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurden.

(Wirkung von Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung eines Osteoblasten und eines bioverträglichen Gerüsts in einen defekten Bereich eines Knochens)

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von Osteoblasten und einem bioverträgliches Gerüst, das in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wird, wird in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach Implantierung wird eine geringfügige Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung eines bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurde.

(Vergleichsbeispiel 17C: Wirkung von subkutaner Implantierung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, die einem Kaninchen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

(Herstellung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen, die von einem Kaninchen abgeleitet sind)

Kaninchen werden als Subjekte verwendet. Mesenchymale Stammzellen werden durch ein Verfahren, das im Vergleichsbeispiel 5 beschrieben ist, hergestellt. Die hergestellten Zellen werden als mesenchymale Stammzellen unter Verwendung eines Verfahrens, das im Vergleichsbeispiel 5 beschrieben ist, identifiziert.

(Herstellung eines Verbundmaterials unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind, die von Kaninchen abgeleitet sind, und einem bioverträglichen Gerüst)

Ein Verbundmaterial wird unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel durch ein Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, erhalten werden, hergestellt, mit der Ausnahme, dass mesenchymale Stammzellen, die in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten werden und MEM Wachstumsmedium verwendet werden. Das Verbundmaterial wird weiter in MEM Differenzierungsmedium in 5 % CO₂ bei 37°C für 2 Wochen inkubiert, um die mesenchymale Stammzelle auf oder innerhalb des bioverträglichen Gerüsts in Osteoblasten zu differenzieren. Das Verbundmaterial unter Verwendung der differenzierten Osteoblasten und Hydroxyapatit wird subkutan in Kaninchen implantiert. Ein Verbundmaterial unter Verwendung eines bioverträglichen Gerüsts und mesenchymaler Stammzellen, die das zweiwöchige Differenzierungsverfahren nicht durchlaufen haben, wird ebenfalls zur Implantierung verwendet. Vier Wochen nach der Implantierung werden die Kaninchen getötet und der implantierte Bereich entfernt, mit 10 % neutralem gepufterten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Probe wird geschnitten und mit HE gefärbt, um den Zustand des implantierten Bereichs zu bewerten. Nach subkutaner Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung mesenchymaler Stammzelle und eines bioverträglichen Gerüsts wird keine Knochenbildung in irgendeinem der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurden. Nach subkutaner Implantierung des Verbundmaterials unter Verwendung von Osteoblasten, die aus mesenchymalen Stammzellen differenzierten, und einem bioverträglichen Gerüst wird eine geringfügige Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung der bioverträglichen Gerüste beobachtet, die jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wuren.

Der defekte Bereich des Knochens wird durch ein Verfahren hergestellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Verbundmaterial unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen oder Osteoblasten, die von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind und ein bioverträgliches Gerüst, das in dem vorliegenden Vergleichsbeispiel erhalten wird, wird in einen defekten Bereich des Knochens implantiert. Vier oder zwölf Wochen nach der Implantierung wird eine geringfügige Knochenbildung in allen der Verbundmaterialien unter Verwendung des bioverträglichen Gerüsts beobachtet, das jeweils aus Gelatine, Collagen und Hydroxyapatit hergestellt wurde.

Wie oben diskutiert, wurde die vorliegende Erfindung durch bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dargestellt, jedoch sollte die vorliegende Erfindung nicht als auf solche Ausführungsformen beschränkt erachtet werden. Es wird verstanden, dass die vorliegende Erfindung nur durch den Schutzbereich der Patentansprüche beschränkt wird. Es wird verstanden, dass der Fachmann Äquivalente der Erfindung gemäß der Beschreibung der Erfindung oder dem allgemeinen technischen Wissen innerhalb des Standes der Technik durchführen kann. Es wird ebenfalls verstanden, dass der Inhalt von Patenten, Patentanmeldungen und zi tierter Literatur hier durch Bezugnahme eingeschlossen sein sollte, so als ob ihre Inhalte hier spezifisch beschrieben wurden.

Die 1B', 1C', 2A' – 2H', 3A' – 3C', 4', 5A', 5B', 6A', 6B', 7A' – 7H' und 8' sind schwarz weiß Darstellungen (Kopien) der farbigen 1B, 1C, 2A – 2H, 3A – 3C, 4, 5A, 5B, 6A, 6B, 7A – 7H und 8. Beide Sätze der jeweiligen obigen Figuren gehören zu der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung.

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verbundmaterial umfassend Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, bereit, mit einer Eigenschaft, welche das unerwartete Fortschreiten der Knochenbildung als eine Kombination von Zellen und Gerüsten bewirkt und es dadurch möglich macht, die Kombination aus Knorpelzellen mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein Gerüst zu verwenden, was herkömmlich nicht als praktikabel auf einer praktikablen Ebene erachtet wurde, und um Bereiche zu behandeln, die zuvor eine schlechte Prognose nach Implantierung von künstlichen Materialien des Standes der Technik aufwiesen.

Claims

Verbundmaterial zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus, umfassend: A) eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, und B) ein Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knochenbildung der Reparatur eines defekten Bereichs des Knochens dient.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 2, wobei das Verbundmaterial verwendet wird, um die Knochenbildung in dem defekten Bereich des Knochens zu verbessern, der eine Größe aufweist, die nicht durch Fixierung alleine repariert weiden kann, zu verbessern.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Bereich enthalten ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Oberfläche und einem Bereich innerhalb einer inneren Pore des Gerüsts, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie mindestens einen Marker exprimiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Typ X Collagen, alkalische Phosphatase, Osteonektin, Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan oder Bestandteile davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen und Chondromodulin.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie durch morphologische Hypertrophie gekennzeichnet ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 6, wobei das Potenzial für Hypertrophie der Knorpelzelle bestimmt wird durch Beobachten ihrer signifikanten Proliferation durch Herstellen eines Pellets der Zellen durch Zentrifugation von 5 × 10⁵ Zellen in Kulturmedium, Kultivieren des Pellets für einen vorbestimmten Zeitraum und Vergleichen einer Größe der Zellen unter einem Mikroskop vor der Kultur mit jener nach der Kultur.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie von einem Säugetier abgeleitet ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 8, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einem Hund, einer Katze oder einem Pferd abgeleitet ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie von einem allogenen Individuum abgeleitet ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie von einem heterologen Individuum abgeleitet ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie eine Zelle ist, die von einem Abschnitt abgeleitet ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Knorpel-Knochenübergang der Rippen, der epiphysialen Linie von Röhrenknochen, der epiphysialen Linie von Wirbeln, der Knorpel Proliferationszone von Knöchelchen, des Perichondriums, der Knochenorgananlage, die aus Knorpel des Fötus gebildet wird, dem Kallusbereich einer heilenden Knochenfraktur und dem knorpeligen Teil der Knochen Proliferationsphase.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 12, wobei die epiphysiale Linie des Röhrenknochens ein Bereich ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oberschenkelknochen, Schienbein, Wadenbein, Oberarmknochen, Elle und Speiche.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 12, wobei die Knorpel Proliferationszone von Knöchelchen ein Bereich ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Handknochen, Fußknochen und Brustbein.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie auf eine Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml bis 1 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie eine Zelle ist, die in einem Medium kultiviert wird, das eines umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ham's F12 (HamF12), Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM), minimales essenzielles Medium (MEM), minimales essenzielles Medium-Alpha (Alpha-MEM), Eagle's basales Medium (BME), Fitton-Jackson modifiziertes Medium (BGJb) und einer Zusammensetzung davon.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 16, wobei das Medium ein Material einschließt, das die Proliferation, Differenzierung oder beides von Zellen verstärkt.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 16, wobei das Medium mindestens einen Bestandteil einschließt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta), dem Knochen morphogenetischen Faktor (BMP), dem Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), dem Kolonie stimulierenden Faktor (CSF), Ascorbinsäure, Dexamethason, Glycerophosphorsäure, dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), dem Plättchen-reichen Plasma (PRP), dem Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).
Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, wobei das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, ein Material umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Tonerde, Zirkonerde, Apatit-Wollastonit abgelagertem Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, Seide, Cellulose, Dextran, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglykolsäure, Methylpolymethacrylat, Polycyanacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Ethylen-Vinylacetat Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 19, wobei das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, aus Calciumphosphat, Gelatine, Collagen oder einer Kombination davon aufgebaut ist.
Verbundmaterial gemäß Anspruch 20, wobei das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, aus Hydroxyapatit aufgebaut ist.
Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus, umfassend die Schritte: A) Bereitstellen einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, und B) Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie auf einem Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei Schritt A) das Bereitstellen der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie umfasst, wobei das Potenzial für Hypertrophie durch die Expression von mindestens einem, der ausgewählt ist, aber nicht beschränkt ist auf die Gruppe bestehend aus Typ X Collagen, alkalische Phosphatase, Osteonektin, Typ II Collagen, Knorpelproteoglykan oder Bestandteile davon, Hyaluronsäure, Typ IX Collagen, Typ XI Collagen und Chondromodulin, als ein Marker, identifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei Schritt A) die Schritte umfasst: Bereitstellen der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, wobei das Potenzial für Hypertrophie unter Verwendung ihrer Hypertrophie als ein Marker identifiziert wird; Herstellen eines Pellets aus den Zellen durch Zentrifugation von 5 × 10⁵ Zellen in Kulturmedium; Kultivieren des Pellets für einen vorbestimmten Zeitraum; Vergleichen der Größe der Zellen, die unter einem Mikroskop beobachtet werden, vor der Kultur mit jenen nach der Kultur; und Bestimmen der Knorpelzelle, dass sie das Potenzial für Hypertrophie aufweist, wenn eine signifikante Proliferation beobachtet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie von einem Säugetier abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einem Hund, einer Katze oder einem Pferd abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie eine Zelle ist, die von einem Abschnitt abgeleitet ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Knorpel-Knochenübergang der Rippen, der epiphysialen Linie von Röhrenknochen, der epiphysialen Linie von Wirbeln, der Knorpel Proliferationszone von Knöchelchen, des Perichondriums, der Knochenorgananlage, die aus Knorpel des Fötus gebildet wird, dem Kallusbereich einer heilenden Knochenfraktur und dem knorpeligen Teil der Knochen Proliferationsphase.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die epiphysiale Linie des Röhrenknochens ein Bereich ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oberschenkelknochen, Schienbein, Wadenbein, Oberarmknochen, Elle und Speiche.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die Knorpel Proliferationszone von Knöchelchen ein Bereich ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Handknochen, Fußknochen und Brustbein.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie auf eine Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml bis 1 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei Schritt B) das Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Medium umfasst, das eines umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ham's F12 (HamF12), Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM), minimales essenzielles Medium (MEM), minimales essenzielles Medium-Alpha (Alpha-MEM), Eagle's basales Medium (BME), Fitton-Jackson modifiziertes Medium (BGJb) und einer Zusammensetzung davon.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei Schritt B) das Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Medium umfasst, das eine Substanz, welche die Proliferation, Differenzierung oder beides von Zellen verstärkt, einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei Schritt B) das Kultivieren der Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie in einem Medium umfasst, das mindestens einen Bestandteil einschließt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta), dem Knochen morphogenetischen Faktor (BMP), dem Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), dem Kolonie stimulierenden Faktor (CSF), Ascorbinsäure, Dexamethason, Glycerophosphorsäure, dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), dem Plättchen-reichen Plasma (PRP), dem Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, ein Material umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Tonerde, Zirkonerde, Apatit-Wollastonit abgelagertem Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, Seide, Cellulose, Dextran, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglykolsäure, Methylpolymethacrylat, Polycyanacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Ethylen-Vinylacetat Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, Calciumphosphat, Gelatine oder Collagen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei das Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, Hydroxyapatit ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie eine Zelle ist, die in einem Bereich kultiviert wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Oberfläche und innerhalb einer inneren Pore des Gerüsts, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist, bei 37°C in der Anwesenheit von 5 – 10 % CO₂.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei der Schritt des Kultivierens für einen ausreichenden Zeitraum durchgeführt, so dass die Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie an dem Gerüst fixiert wird, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.
Verwendung eines Verbundmaterials, um ein Implantat oder ein Knochen Reparaturmaterial zum Verstärken oder Induzieren von Knochenbildung in einem biologischen Organismus herzustellen, wobei das Verbundmaterial umfasst: A) eine Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, und B) ein Gerüst, das mit dem biologischen Organismus bioverträglich ist.
Verfahren zum Reparieren eines defekten Bereichs eines Knochens, umfassend das Implantieren eines Verbundmaterials einschließlich einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und eines Gerüsts, das mit einem biologischen Organismus bioverträglich ist, in den defekten Bereich des Knochens.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei das Verbundmaterial verwendet wird, um Knochenbildung in dem defekten Bereich des Knochens zu verbessern, der eine Größe aufweist, die nicht durch Fixierung alleine repariert werden kann.
Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie, umfassend die Schritte des Erhaltens von Zellen aus dem Xiphoideusfortsatz Übergang, der an dem unteren Abschnitt des Brustbeins angeordnet ist.