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Die
Erfindung bezieht sich auf eine Testvorrichtung zum Nachweis eines
in einer Probenflüssigkeit
enthaltenen Analyten (A), umfassend einen trockenen porösen Träger (10),
auf dem in einer Reaktionszone angeordnet sind:
ein selektiver
Binder (12), der in der Lage ist, nach Befeuchtung des
Trägers
(10) mit der Probenflüssigkeit
den Analyten (A) selektiv zu binden,
ein Komplex, gebildet
aus einem Biomarker (B) und dem ersten, komplexierten Reporterpartner
eines zur Erzeugung eines optisch detektierbaren Signals wechselwirkenden
Reporterpaares aus Reporterenzym (E) und Reportersubstrat (S),
sowie
der zweite, freie Reporterpartner des Reporterpaares,
wobei
der Biomarker (B) hinsichtlich der Selektivität der Bindungsfähigkeit
des selektiven Binders (12) dem Analyten (A) äquivalent
und zu diesem kompetitiv ist.
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Die
Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zum Herstellen einer
Testvorrichtung sowie ein Verfahren zum Durchführen eines Nachweises eines
Analyten in einer flüssigen
Probe.
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Eine
häufig
eingesetzte Testvorrichtung ist allgemein unter der Bezeichnung "Lateral-Flow"-Test bekannt und
insbesondere beschrieben in der
EP 0 291 194 B2 . Bei dem Lateral-Flow-Test
handelt es sich um einen trockenen, porösen Träger, auf dem in einer so genannten
Startzone ein spezifisches Bindungsreagenz, z.B. ein spezifischer,
monoklonaler Antikörper
gegen den Analyten, aufgetrocknet ist. Der Antikörper ist mit einem Markierungspartikel,
z.B. einem Gold- oder
Latexpartikel markiert. Er ist so auf den Träger aufgetrocknet, dass er
im trockenen Zustand des Trägers
an dessen Oberfläche
fixiert ist und sich im feuchten Zustand des Trägers frei in diesem bewegen
kann. Zur Anwendung des Tests wird eine mutmaßlich den Analyten enthaltende
Probenflüssigkeit
in der Startzone appliziert. In der Probenflüssigkeit enthaltener Analyt
bindet mit dem markierten Antikörper
und wird zusammen mit diesem aufgrund von Kapillarkräften aus
der Startzone entlang der Längserstreckung
des Trägers
transportiert. In einer stromabwärts
der Startzone gelegenen Detektionszone ist ein ebenfalls für den Analyten
spezifisches Bindungsreagenz dauerhaft immobilisiert. Hierbei handelt
es sich beispielsweise um einen weiteren Antikörper, der spezifisch gegen
ein anderes Epitop des Analyten als der markierte Antikörper gerichtet
ist. Der Detektionsantikörper
ist so an die Oberfläche
des Trägers
gebunden, dass er auch im feuchten Zustand des Trägers in
der Detektionszone fixiert bleibt. Gelangt der mit dem markierten
Antikörper
gekoppelte Analyt in die Detektionszone, bindet er in einer so genannten
Sandwich-Reaktion mit dem immobilisierten Antikörper, was zu einer dauerhaften Anfärbung der
Detektionszone aufgrund der Partikelmarkierung führt. Ist kein Analyt in der
Probenflüssigkeit
enthalten, erfolgt keine Bindung zwischen den beiden beteiligten
Antikörpern,
so dass der markierte Antikörper
durch die Detektionszone hindurchläuft und sich keine Anfärbung der
Detektionszone einstellt.
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Der
Test ist für
eine Vielzahl von Analyten einsetzbar. Von besonderer Bedeutung
ist seine Verwendung als Schwangerschaftstest zum Nachweis von hCG.
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Ein
weiterer Lateral-Flow-Test ist aus der
US 6,177,281 B1 bekannt.
In einer ersten von dem Analyten passierten Zone ist ein spezifisch
bindender Antikörper
immobilisiert. Stromabwärts
ist ein zweiter, markierter Antikörper beweglich positioniert.
Analytmoleküle,
die die Immobilisierungszone passieren können, werden von den zweiten
Antikörpern
gebunden und laufen mit diesen in eine Detektionszone, in der sie
zusammen mit den markierten Antikörpern von einer immobilisierten
Detektionssubstanz festgehalten werden. Um eine quantitative Analyse
zu ermöglichen,
sind mehrere solcher Laufwege parallel zueinander angeordnet, wobei
unterschiedliche Mengen erster, immobilisierter Antikörper verwendet
werden.
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Nachteilig
bei diesen bekannten Testvorrichtungen ist ihre geringe Sensitivität gegenüber geringen
Analytkonzentrationen. Jedes Analyt-Molekül trägt nämlich nur durch Bindung genau
eines Markierungspartikels zur Anfärbung der Detektionszone bei. Für Tests,
bei denen Analyten nachgewiesen werden müssen, die nur in geringen Konzentrationen
vorliegen, ist die bekannte Testvorrichtung daher ungeeignet.
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Aus
der
US 3,817,837 ist
ein enzymatisch verstärktes
Nachweisverfahren für
einen Analyten in einer Probenflüssigkeit
bekannt. Dieses Verfahren umfasst zunächst die Schritte des Bereitstellens
der folgenden Reaktionselemente:
- – Ein selektiver
Binder, der in der Lage ist, den Analyten selektiv zu binden.
- – Ein
Komplex, gebildet aus einem Biomarker und dem ersten, komplexierten
Reporterpartner eines zur Erzeugung eines optisch detektierbaren
Signals wechselwirkenden Reporterpaares aus Reporterenzym und Reportersubstrat.
Der Biomarker ist dabei eine Substanz, die hinsichtlich der Selektivität der Bindungsfähigkeit
des selektiven Binders dem Analyten äquivalent ist. Dies schließt die Möglichkeit
ein, Analytmoleküle
selbst als Biomarker zu verwenden.
- – Der
zweite, freie Reporterpartner des Reporterpaares.
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Als
Reporterpaar wird eine Paarung von Enzym und zugeordnetem Substrat
bezeichnet, wobei eine enzymatische Umsetzung des Reportersubstrats
durch das Reporterenzym zu einem optisch detektierbaren Signal,
z.B. zu einer Anfärbung,
führt. Der
Komplex aus Biomarker und erstem Reporterpartner ist so beschaffen,
dass eine Bindung des selektiven Binders mit dem Biomarker die enzymatische
Umsetzung des Reportersubstrats durch das komplexierte Reporterenzym
behindert, d.h. in ihrer Effizienz reduziert oder vollständig unterbindet.
Bei dem bekannten Verfahren werden sämtliche Reaktionselemente zusammen
mit der zu analysierenden Probenflüssigkeit in vorgegebener Reihenfolge
und in vorgegebenen Mengen in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Ist in der Probenflüssigkeit
Analyt enthalten, konkurrieren die Analyt-Moleküle mit den Biomarker-Molekülen um Bindungsstellen
des selektiven Binders. Je mehr Analyt in der Probenflüssigkeit
enthalten ist, desto kleiner wird die Anzahl der Biomarker/Reporterpartner-Komplexe,
die mit einem selektiven Binder-Molekül gekoppelt sind; umso geringer fällt also
die Beeinträchtigung
der Wechselwirkung zwischen Reporterenzym und Reportersubstrat aus, was
zu einem entsprechend stärkeren
optisch detektierbaren Signal führt.
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Dieses
bekannte Verfahren ist zwar sehr sensitiv, da es zum einen einen
kompetitiven Ansatz wählt
und zum anderen einen Verstärkungseffekt zeigt,
da jedes Analyt-Molekül
zu einer Vielzahl von Substratumsetzungen beiträgt; seine Anwendung ist jedoch
kompliziert und hängt
von der korrekten Einhaltung der vorgegebenen Pipettier-Reihenfolge
und den vorgegebenen Pipettier-Mengen ab. Ein solcher Test kann
nur von geschultem Personal unter Laborbedingungen ausgeführt werden.
Für den
Hausgebrauch durch Laien oder in Notfallsituationen unter Zeitdruck
und ohne optimale technische Ausrüstung ist das bekannte Verfahren
nicht einsetzbar.
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Aus
der gattungsbildenden
DE
698 28 642 T2 ist eine Testvorrichtung bekannt, die in
der Reaktionszone eines festen Trägers zwei räumlich getrennte Oberflächen aufweist.
Auf einer ersten Oberfläche
ist ein für
den Analyten spezifischer Antikörper immobilisiert,
an den ein Komplex aus einem zu dem Analyten äquivalenten Biomarker und einem
ersten Partner eines Reporterpaares gebunden ist. Der zweite Partner
des Reporterpaares ist auf der zweiten Oberfläche immobilisiert. Nach Zugabe
von den Analyten enthaltender Flüssigkeit
verdrängt
der Analyt den Komplex kompetitiv von seiner Bindungsstelle an dem
Antikörper.
Der Komplex wird dann von dem an der zweiten Oberfläche immobilisierten
zweiten Partners des Reporterpaares abgefangen, wobei eine Wechselwirkung
zuwischen den Reporterpartnern zu einem detektierbaren Signal führt. Obgleich die
genannte Druckschrift als Reporterpaar u.a. ein Enzym/Substrat-System vorschlägt, werden
nicht die oben erläuterten
Vorteile der enzymatischen Verstärkung
genutzt, da die Immobilisierung des Komplexes durch den abfangenden,
zweiten Partner an der zweiten Oberfläche eine mehrfache Signalgebung verhindert.
Zudem ist der Aufbau der Vorrichtung, die zwei getrennte aber nah
beieinander liegende Oberflächen
verlangt, aufwendig und daher teuer.
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Eine ähnliche
Testvorrichtung ist auch aus der WO 91/05262 bekannt. Auch hier
umfasst die Vorrichtung einen in einer ersten Zone immobilisierten
Binder, an den ein dem Analyten äquivalenter
Biomarker, der mit einem signalgebenden Molekül komplexiert ist, gebunden
ist. Nach kompetitiver Verdrängung
des Komplexes durch Zugabe von Analyt wird der Komplex in einer
zweiten Zone an einem dort immobilisierten zweiten Binder gebunden.
Die Bindung des Komplexes in der ersten und der zweiten Zone wirken
unterschiedlich auf das Signalgebungsvemögen des Komplexes, sodass das
Vorliegen von Analyt in der Probe durch Entstehung oder Vernichtung
des Signals nachgewiesen werden kann.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine gattungsgemäße Testvorrichtung
derart weiterzubilden, dass sensitivere Messungen durchführbar werden.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein kostengünstiges
Herstellungsverfahren für
eine derartige Testvorrichtung anzugeben.
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Es
ist schließlich
eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Testverfahren
anzugeben, das einfach anwendbar und gleichzeitig hoch sensitiv
ist.
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Die
erstgenannte Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs
von Anspruch 1 dadurch gelöst,
dass eine Bindung des selektiven Binders mit dem komplexierten Biomarker die
Wechselwirkung zwischen dem komplexierten und dem freien Reporterpartner
sterisch oder allosterisch behindert.
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Die
zweitgenannte Aufgabe wird mit den Merkmalen des Oberbegriffs von
Anspruch 30 gelöst.
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Die
drittgenannte Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 50 gelöst.
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Grundidee
der vorliegenden Erfindung ist es, ein dem bekannten Nachweisverfahren
vergleichbares, hochsensitives Testverfahren mit den Handhabungsvorteilen
des Lateral-Flow- Tests
zu kombinieren. Darüber
hinaus stellt die vorliegende Erfindung noch eine Vereinfachung
gegenüber
der Handhabung und der Herstellung des Lateral-Flow-Tests dar, indem
sämtliche
Reaktionselemente in einer einzigen Reaktionszone angeordnet sind.
Dem Anwender bleibt zum einen Wartezeit erspart, zum anderen fällt auch
die Unsicherheit weg, ob ein scheinbar negatives Testergebnis eventuell
auf eine Unterbrechung von Kapillarströmungen zurückzuführen ist. Bei dem bekannten
Lateral-Flow-Test wird zu diesem Zweck eine eigene Kontrollzone
vorgeschlagen, die die Herstellung des Tests erheblich verkompliziert
und damit verteuert. Außerdem
wird die Handhabung deutlich erleichtert, so dass das Fehlerpotential
insbesondere im Hinblick auf falsch-negative Ergebnisse, die bei dem
bekannten Lateral-Flow-Test z.B. bei versehentlicher Benetzung der
Detektionszone mit Probenflüssigkeit
auftreten, wesentlich reduziert wird.
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Wie
erwähnt,
kann der Biomarker der Analyt selber sein. Dies stellt die größtmögliche Äquivalenz bezüglich der
Bindung des selektiven Binders mit dem in der Probenflüssigkeit
vorliegenden Analyten sicher, kann jedoch im Hinblick auf die Synthese
des Komplexes schwierig und teuer sein. Häufig ist es daher günstiger,
statt des Analyten ein Fragment des Analyten als Biomarker zu verwenden.
Dabei handelt es sich vorzugsweise um dasjenige Fragment, mit welchem
der selektive Binder bei seiner Bindung mit dem Analyten in Wechselwirkung
tritt. Als weitere Alternative können
Substanzen verwendet werden, die Abschnitte aufweisen, welche der
Bindungsstelle des Analyten für
den selektiven Binder entsprechen oder ihr ähnlich sind. Wichtig ist, dass
der komplexierte Biomarker und der freie Analyt für den selektiven
Binder im Wesentlichen ununterscheidbar sind, so dass eine echte Kompetitivität zwischen
komplexiertem Biomarker und Analyt besteht.
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Entsprechend
der Vielzahl möglicher
Analyten sind auch die Möglichkeiten
der Gestaltung des Biomarkers weit gefächert. Es kann sich dabei insbesondere
um eine Nukleinsäure,
ein Protein, ein Peptid, eine niedermolekulare organische Verbindung, ein
Kohlenhydrat oder eine Kombination hieraus handeln.
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Die
Kopplung des Biomarkers zu einem Komplex kann alternativ mit dem
Reporterenzym oder Reportersubstrat erfolgen. Als besonders günstig hat
sich die Kopplung des Biomarkers mit dem Reporterenzym zu dem Komplex
erwiesen, da hierbei zur Behinderung der enzymatischen Umsetzung
des Substrates sowohl sterische als auch allosterische Effekte genutzt
werden können.
Als geeignete Reporterenzyme sind beispielsweise alkalische Phosphatase,
Peroxidase, Glucose-Oxidase, β-Galactosidase, Maltatdehydrogenase,
Glucose-6-Phosphatdehydrogenase
oder Lysozym geeignet. Je nach konkreter Wahl des Reporterenzyms
hat der Fachmann als Reportersubstrat das für das jeweilige Enzym "passende" Substrat zu wählen.
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Bei
einer besonderen Variante des erfindungsgemäßen Tests ist das Reporterenzym
aus wenigstens zwei Untereinheiten aufgebaut, die einzeln enzymatisch
nicht aktiv sind, und die auf dem trockenen, porösen Träger getrennt vorliegen. Wenigstens eine
Untereinheit ist dabei nicht mit dem Biomarker komplexiert. Eine
Bindung des selektiven Binders mit dem komplexierten Biomarker behindert
bei dieser Ausführungsform
die enzymatische Umsetzungsreaktion indirekt, indem ein Binden der
Enzym-Untereinheiten zu einem aktiven Reporterenzym behindert wird.
Diese Ausführungsform
ist insbesondere im Hinblick auf eine einfache Herstellung des erfindungsgemäßen Tests
vorteilhaft, wie weiter unten detailliert erläutert werden soll.
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Günstigerweise
wird die Kopplung der komplexierten Reaktionskomponenten untereinander, d.h.
des Biomarkers mit dem komplexierten Reporterpartner, durch eine
kovalente Bindung realisiert. Die kovalente Bindung hat zum einen
den Vorteil großer
Stabilität,
insbesondere auch während
des Kontaktes des Komplexes mit der Probenflüssigkeit; zum anderen stellt
eine kovalente Bindung eine enge Nachbarschaft der komplexierten
Komponenten sicher, was insbesondere eine sterische Inhibition der enzymatischen
Reaktion durch den selektiven Binder begünstigt. Alternativ können jedoch
auch andere Komplexbildungsmechanismen angewandt werden.
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Als
selektiver Binder sind insbesondere ein monoklonaler oder polyklonaler
Antikörper,
ein proteinogener Binder oder ein auf Nukleinsäuren basierender Binder, insbesondere
ein so genanntes Aptamer, geeignet. Die Größe des selektiven Binders ist dabei
nicht auf die zum Eingehen der selektiven Bindung mit dem Biomarker
bzw. dem Analyten erforderliche Struktur beschränkt; vielmehr kann der selektive
Binder ein großvolumiges
Molekül
sein oder mit einem großvolumigen
Molekül
gekoppelt sein, welches mit dem Biomarker/Reporterpartner-Komplex
in einer die enzymatische Reaktion behindernder Weise wechselwirkt.
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Günstigerweise
liegt der selektive Binder auf dem trockenen, porösen Träger in mit
dem Biomarker gebundener Form vor. Dies ist, wie weiter unten erläutert werden
soll, für
die Herstellung der erfindungsgemäßen Testvorrichtung besonders vorteilhaft.
Aus biochemischer Sicht kann dies jedoch nachteilig sein, da sich
die Einstellung eines Gleichgewichts zwischen dem Analyten und dem
komplexierten Biomarker in Bezug auf die Bindung mit selektiven
Binder verzögern
kann, was die Testdauer nachteilig verlängern würde. In dieser Hinsicht günstiger kann
es daher sein, wenn der selektive Binder auf dem trockenen, porösen Träger separat
von dem komplexierten Biomarker vorliegt. Bei dieser Variante starten
der Biomarker und der Analyt ihre Konkurrenz um Bindungsstellen
des selektiven Binders aus der gleichen Ausgangssituation. Ein Gleichgewicht
kann sich daher schneller einstellen. Dies trifft insbesondere zu,
wenn zwischen dem selektiven Binder und dem Analyten bzw. dem Biomarker
eine stabile oder gar irreversible Bindung etabliert wird.
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Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass ein Reaktionselement
der Gruppe aus selektivem Binder, Komplex und zweitem Reporterpartner
auf dem porösen
Träger
oder einem auf dem porösen
Träger
festgelegten Zwischenträger
immobilisiert ist, so dass es auch im feuchten Zustand des porösen Trägers in
der Reaktionszone räumlich
fixiert ist. Diese Variante der erfindungsgemäßen Testvorrichtung bietet
zwei Vorteile. Zum einen wird ein "Ausbluten" der Komponenten aus der Reaktionszone
vermieden. Zum anderen hat sich herausgestellt, dass, insbesondere
wenn der selektive Binder das immobilisierte Reaktionselement ist,
die Behinderung der enzymatischen Umsetzung des Reportersubstrates
deutlich effizienter erfolgt als in dem Fall, in dem sämtliche
Reaktionselemente im porösen
Träger
frei beweglich sind. Als Grund hierfür wird die Einschränkung der
räumlichen
Freiheitsgrade durch die Immobilisierung angenommen durch welche
die Reporterpartner in ihren Möglichkeiten
einer z.B. sterischen Inhibition auszuweichen, eingeschränkt werden.
Es hat sich erwiesen, dass eine Immobilisierung, insbesondere des
selektiven Binders auf einem Zwischenträger, z.B. einem Glas-, Latex-
oder Kunststoff-Bead, zu einem ähnlichen
Effekt führt,
wie die Immobilisierung auf der Oberfläche des porösen Trägers selbst. Die Verwendung
eines Zwischenträgers
kann in Bezug auf das Herstellungsverfahren günstig sein, da die Herstellung
z.B. von Antikörpern
auf Beads allgemein bekannt ist und eine mechanische Fixierung der
Beads auf dem porösen
Träger
keine technischen Schwierigkeiten darstellt.
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Vorzugsweise
ist das immobilisierte Reaktionselement durch eine kovalente Bindung
auf dem porösen
Träger
oder dem Zwischenträger
fixiert. Dies führt
zu einer besonders stabilen Immobilisierung. Dabei kann die kovalente
Bindung zwischen dem Reaktionselement und einer reaktiven Gruppe
auf der Oberfläche
des porösen
Trägers
oder des Zwischenträgers
ausgebildet sein. Als reaktive Gruppen sind insbesondere ein Säureester,
ein Säureanhydrid,
ein Säurehalogenid,
ein Imid, ein Imidylester, ein Carboxyl, ein Halogencarbonamid,
ein Sulfonylhalogenid, ein Isothiocyanat, ein Thiol, ein Pyrimidylsulfid,
ein Halogenacetyl, ein Hydroxyl, ein Halogenalkyl, ein Phosphoramidit,
ein Amin, ein Hydrazid, ein Azid, ein Aryldiazo, ein Nitren, ein
Aldehyd und/oder ein Keton geeignet.
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Dabei
können
zwischen dem immobilisierten Reaktionselement und der reaktiven
Gruppe eine oder mehrere Linkerverbindungen geschaltet sein. Als
Linkerverbindungen sind u.a. insbesondere eine Polyoxyalkyleinheit,
eine aliphatische, eine cykloaliphatische und/oder eine aromatische
Einheit, jeweils substituiert oder nicht substituiert, geeignet.
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Alternativ
zur kovalenten Bindung kann vorgesehen sein, dass das immobilisierte
Reaktionselement durch eine nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen Paaren
von Brücksubstanzen
auf dem porösen
Träger
oder einem auf dem porösen
Träger festgelegten
Zwischenträger
fixiert ist. Als Brückensubstanzen
sind beispielsweise komplementäre
Nukleinsäurestränge, Streptavidin/Biotin,
Avidin/Biotin, Streptavidin/Streptag, MBP/Maltose, ProteinA-IgG/Antikörper, Hexa-His-Tag/NTA,
Hexa-His-Tag/Anti-His-Antikörper, Digoxigenin/Anti-Digoxogenin-Antikörper und/oder
GST/Glutathion geeignet.
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Auch
bei dieser Variante kann die Verwendung einer oder mehrerer Linkerverbindungen
vorgesehen sein, die vorzugsweise zwischen dem porösen Träger oder
dem Zwischenträger
und den mit ihm gekoppelten Partner des Paares von Brückensubstanzen
geschaltet sind. Als Linkerverbindungen sind u.a. die bereits oben
im Zusammenhang mit der kovalenten Bindung des immobilisierten Reaktionselementes genannten
geeignet.
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Vorzugsweise
besteht der poröse
Träger
aus Kunststoff wie etwa Polystyrol oder Polyester, Papier oder einem
anderen Zellulosederivat, Glas, Metall, Silizium, Keramik oder einem
Verbundmaterial hieraus.
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Der
poröse
Träger
ist vorzugsweise flächig ausgebildet,
kann jedoch auch als dreidimensionaler, insbesondere sphärischer
Träger
ausgebildet sein. Bei beiden Varianten kann der Träger in einer
vorteilhaften Ausführungsform
an einer stabförmigen
Haltevorrichtung angebracht sein. Mit einer solchen Vorrichtung
ist es möglich,
zur Applikation der Probenflüssigkeit
in der Reaktionszone den Träger
selbst in die Probenflüssigkeit
zu tauchen.
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Wie
nachfolgend im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren
eingehender erläutert
werden soll, kann die Gefahr bestehen, dass einige Reaktionselemente
vorzeitig miteinander reagieren. Bei einer vorteilhaften Weiterbildung
der Erfindung ist daher vorgesehen, dass wenigstens ein Reaktionselement
der Gruppe aus selektivem Binder, Komplex und zweitem Reporterpartner
gekapselt auf dem porösen
Träger
vorliegt. Das gekapselte Reaktionselement kann beispielsweise in Kapseln
aus Dextran oder aus Gelatine und/oder in Liposom-Vesikeln eingeschlossen
sein. Kapseln aus Dextran oder Gelatine bieten sich insbesondere
bei Einrichtungen des erfindungsgemäßen Tests zur Untersuchung
wässriger
Probenflüssigkeiten
an. Bei Kontakt mit der wässrigen
Probenflüssigkeit
lösen sich
solche Kapseln nämlich
auf und geben das gekapselte Reaktionselement frei. Analoges gilt
für Kapselung
in Liposom-Vesikeln, wenn die Probenflüssigkeit auf organischen Lösungsmitteln
basiert.
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Als
zu kapselndes Reaktionselement kommen insbesondere der selektive
Binder und/oder der Komplex in Frage. In einem solchen Fall wird
eine vorzeitige Bindung zwischen selektivem Binder und komplexiertem
Biomarker zuverlässig
verhindert.
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Bei
einer vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung ist die gemeinsame Reaktionszone in eine Mehrzahl
benachbarter Subzonen aufgeteilt, von denen jede ein oder mehrere
Reaktionselemente der Gruppe aus selektivem Binder, Komplex und
zweitem Reporterpartner trägt.
Eine einzelne Subzone kann dabei als eine das zugeordnete Reaktionselement
bzw. mehrere zugeordnete Reaktionselemente einschließende Gelatineschicht ausgebildet
sein. Die Gelatineschichten können über- oder
nebeneinander in der gemeinsamen Reaktionszone angeordnet sein.
Der dieser Ausführungsform
zugrunde liegende Gedanke ist wiederum eine Verhinderung einer vorzeitigen
Reaktion mehrerer Reaktionselemente untereinander. Dabei wird es
als besonders günstig
angesehen, den selektiven Binder und den Komplex in unterschiedlichen
Subzonen anzuordnen. Alternativ zur Verwendung einer wasserlöslichen
Gelatineschicht können
Subzonen auch als das zugeordnete Reaktionselement bzw. die zugeordneten
Reaktionselemente einschließende,
flüssigkeitspermeable
Filme ausgebildet sein. Solche Filme lösen sich bei Kontakt mit der
Probenflüssigkeit
nicht auf; die erlauben jedoch ein Ausschwemmen der in ihnen enthaltenen
Reaktionselemente, so dass diese gemeinsam reagieren können. Alternativ
können
die Subzonen auch als Papierschichten ausgebildet sein, die mit dem
bzw. den zugeordneten Reaktionselement(en) imprägniert sind.
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Zur
Herstellung einer erfindungsgemäßen Testvorrichtung
ist vorgesehen, zunächst,
wie aus dem eingangs erläuterten
Nachweisverfahen nach dem Stand der Technik bekannt, alle Reaktionselemente,
d.h. den selektiven Binder, den Komplex aus Biomarker und erstem
Reporterpartner sowie den zweiten Reporterpartner bereitzustellen.
Anstatt diese Reaktionselemente jedoch in Lösung vorzuhalten und bei Bedarf
in vorgeschriebenen Mengen und vorgeschriebener Reihenfolge zu pipettieren,
ist erfindungsgemäß vorgesehen,
diese auf einem trockenen, porösen
Träger
in einer gemeinsamen Reaktionszone auszubringen, so dass sie im
trockenen Zustand des Trägers
auf diesem fixiert und wenigstens zwei der Reaktionselemente im
durch Aufbringen der flüssigen
Probe feuchten Zustand des porösen
Trägers
in diesem frei beweglich sind. Eine Aufbringung von Reaktionselementen
auf einem porösen
Träger, so
dass sie dort entweder dauerhaft immobilisiert oder lediglich im
trockenen Zustand fixiert und im feuchten Zustand des Trägers frei
beweglich sind, ist technisch auf verschiedene, dem Fachmann teils
bekannte, teils jedoch auch neuartige Weise machbar. Allerdings
wurde eine entsprechende Aufbringung bislang nicht realisiert, weil
Vorurteile der Fachwelt in Bezug auf eine unvermeidbare, vorzeitige
Reaktion einzelner Komponenten miteinander dem entgegenstanden.
Insbesondere muss eine vorzeitige Umsetzung des Reportersubstrates
durch das Reporterenzym verhindert werden. Auch ist es bei manchen
Anwendungen erforderlich, den selektiven Binder und den komplexierten
Biomarker getrennt zu halten, um bei Anwendung des Tests eine gleichberechtigte Konkurrenzsituation
zwischen dem Analyten und dem komplexierten Biomarker zu schaffen,
was im Hinblick auf die Testdauer vorteilhaft sein kann.
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Bei
einer günstigen
Variante des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens
ist vorgesehen, dass der Schritt des Aufbringens mehrere Teilschritte des
Benetzens des porösen
Trägers
mit Lösungen, die
jeweils ein oder mehrere in Lösungsmittel
gelöste Reaktionselemente
enthalten, sowie wenigstens einen nachfolgenden Teilschritt des
Trocknens umfasst. Dabei ist vorgesehen, dass in einem zeitlich früheren Teilschritt
eine das Reporterenzym enthaltende, stärker polare Lösung und
in einem zeitlich späteren
Teilschritt eine das Reportersubstrat enthaltende, schwächer polare
Lösung
verwendet wird. Die Benetzung des porösen Trägers kann beispielsweise durch
Tränken,
Aufsprühen
oder Aufdrucken erfolgen. Die Benetzungsschritte erfolgen somit
sukzessive und mit absteigender Polarität. Dies hat zur Folge, dass
zunächst
das in wässriger
Umgebung aktive und gut lösliche
Enzym auf den porösen
Träger
aufgebracht wird.
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Vorzugsweise
erfolgt unmittelbar nach der Aufbringung ein Trockenschritt, so
dass das Enzym z.B. durch Adhäsionskräfte an den
porösen
Träger gekoppelt
wird.
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Wird
in einem nachfolgenden Schritt das Reportersubstrat in wenig oder
unpolarer Lösung,
z.B. Toluol, aufgebracht, kann das nur in wässriger Lösung aktive Reporterenzym das
Reportersubstrat nicht umsetzen. In einem anschließenden Trocknungsschritt
wird dann auch das Reportersubstrat beispielsweise durch Adhäsionskräfte am porösen Träger fixiert.
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In ähnlicher
Weise kann mit dem selektiven Binder verfahren werden, sofern dieser
nicht zusammen mit dem Komplex, ggf. bereits an diesen gebunden,
aufgebracht wird.
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Bei
einer besonders vorteilhaften Wahl der Reaktionselemente, bei der
die enzymatische Umsetzung des Reportersubstrats durch die Bindung des
selektiven Binders mit dem Komplex aus Biomarker und erstem Reporterpartner
vollständig
oder nahezu vollständig
unterbunden wird, ist auch ein einstufiges Herstellungsverfahren
möglich,
bei dem eine alle Reaktionselemente enthaltende Lösung in
der Reaktionszone, z.B. durch Tränken,
Aufsprühen
oder Aufdrucken aufgetragen wird.
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Die
Fixierung der Reaktionselemente durch reine Trocknung wird in der
Regel dazu führen,
dass die so fixierten Reaktionselemente im feuchten Zustand des
porösen
Trägers
in diesem frei beweglich sind. Da es sich jedoch, wie zuvor bereits
erläutert, als
vorteilhaft erwiesen hat, insbesondere den selektiven Binder fest
an einer Matrix zu immobilisieren, so dass er auch im feuchten Zustand
des porösen
Trägers räumlich fixiert
bleibt, ist bei einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens
vorgesehen, dass die Immobilisierung durch Ausbildung einer kovalenten
Bindung zwischen dem immobilisierten Reaktionselement und dem porösen Träger oder
einem Zwischenträger
erfolgt. Dies kann direkt oder indirekt über reaktive Gruppen auf der
Oberfläche
des porösen
Trägers
sowie mit oder ohne Schaltung einer oder mehrerer Linkerverbindungen
zwischen dem immobilisierten Reaktionselement und der reaktiven
Gruppe erfolgen. Zur günstigen
Wahl reaktiver Gruppen bzw. Linkerverbindungen wird auf die obige
Erläuterung
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
verwiesen.
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Alternativ
zur Immobilisierung durch kovalente Bindung kann vorgesehen sein,
dass die Immobilisierung durch eine nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen Paaren
von Brückensubstanzen
erfolgt, wobei jeweils ein Partner des Paares von Brückensubstanzen
mit dem Reaktionselement und der andere Partner mit dem porösen Träger oder
Zwischenträger
gekoppelt wird. Auch hier kann die Schaltung einer oder mehrerer
Linkerverbindungen, insbesondere zwischen dem porösen Träger oder dem
Zwischenträger
und dem mit ihm gekoppelten Partner des Paares von Brückensubstanzen
vorgesehen sein. Bezüglich
der günstigen
Wahl von Brückensubstanzen
bzw. Linkerverbindungen wird auf die obige Erläuterung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
verwiesen.
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Alternativ
oder zusätzlich
zu der Aufbringung durch Benetzungsschritte mit Lösungen abnehmender
Polarität
kann bei einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens
vorgesehen sein, dass vor dem Schritt des Aufbringens wenigstens
eines der Reaktionselemente gekapselt wird. Hierzu kann das bzw.
die zu kapselnden Reaktionselemente in Kapseln aus Dextran oder
Gelatine und/oder in Liposom-Vesikeln eingeschlossen werden. Hierdurch
kann ebenfalls eine vorzeitige, unerwünschte Reaktion einzelner Reaktionselemente miteinander
verhindert werden. Je nach Wahl des Kapselmaterials wird der Fachmann
selbstverständlich
darauf zu achten haben, dass bei der Aufbringung der Reaktionselemente
auf den porösen
Träger das
verwendete Lösungsmittel
die Verkapselung nicht angreift.
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Alternativ
oder zusätzlich
zu der Verkapselung einzelner Reaktionselemente kann vorgesehen sein,
dass der Schritt des Aufbringens das Auftragen einer Mehrzahl von
Schichten in der gemeinsamen Reaktionszone umfasst, wobei jede Schicht
ein oder mehrere Reaktionselemente enthält. Insbesondere die Einschließung des
Reportersubstrates und des Reporterenzyms in unterschiedlichen Schichten
ist günstig,
um eine vorzeitige enzymatische Umsetzung und damit eine Signalerzeugung
bereits bei der Herstellung zu verhindern. Auch die Aufbringung
des selektiven Binders in einer eigenen Schicht kann im Hinblick
auf die Schaffung einer gleichwertigen Ausgangssituation für die Konkurrenz
zwischen Analyt und komplexiertem Biomarker um Bindungen mit dem
selektiven Binder wünschenswert
sein. Die Schichten können über und/oder
nebeneinander in der Reaktionszone angeordnet sein.
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Beispielsweise
können
die Schichten als Gelatineschichten aufgetragen werden, die jeweils
das bzw. die zugeordneten Reaktionselemente einschließen. Diese
Variante ist besonders günstig,
da dabei während
des gesamten Herstellungsverfahrens auf wässriger Basis gearbeitet werden
kann.
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Alternativ
können
die Schichten auch als flüssigkeitspermeable
Filme aufgetragen werden. Solche Filme lösen sich bei Kontakt mit der
Probenflüssigkeit
nicht notwendig auf, gestatten jedoch die Durchmischung der Reaktionselemente
bei Benetzung mit der Probenflüssigkeit.
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Zur
Aufbringung solcher Filme, aber auch von Schichten aus Gelatine
oder anderen Matrixmaterialien können
aus der Fotoindustrie zur Herstellung von Colorfilmen bekannte Kaskadengussmaschinen
verwendet werden. Solche Maschinen erzeugen in einem einstufigen
Arbeitsschritt mehrschichtige Strukturen, wobei die einzelnen Schichten als
hochviskose Gele aufgetragen werden, die unterschiedliche Füllstoffe – hier die
unterschiedlichen Reaktionselemente – enthalten, wobei eine Durchmischung
der Schichten aufgrund ihrer Viskosität unterbleibt. Optional kann
die Schichtenstruktur einem nachfolgenden Trocknungsschritt unterworfen
werden.
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Alternativ
können
auch unterschiedliche Papierschichten in der Reaktionszone aufgetragen
werden, die jeweils einzeln mit einem oder mehreren zugeordneten
Reaktionselementen imprägniert
sind. Bei dieser Variante des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens
ist zwar eine größere Anzahl
von Arbeitsschritten erforderlich; diese sind jedoch jeweils besonders
einfach gestaltet, so dass insgesamt ein sehr kostengünstiges
und technisch wenig aufwendiges Herstellungsverfahren realisiert
wird.
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Außer dem
gleichen Aufbau aller Subzonen ist auch eine Kombination von Subzonen
unterschiedlicher Natur möglich.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
die zu einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
führt geht
aus von einer Papierschicht, die mit einem ersten Reaktionselement
imprägniert
ist. Die Imprägnierung
kann z.B. durch Tränken,
Aufsprühen
oder Aufdrucken einer das erste Reaktionselement enthaltenden Lösung erfolgen.
Vorzugsweise nach Trocknung der Papierschicht wird auf deren Oberseite
eine ein zweites Reaktionselement enthaltende Schicht, z.B. eine
Gelatineschicht oder ein flüssigkeitspermeabler Film,
aufgetragen. Anschließend
kann auf der Unterseite der Papierschicht eine weitere Schicht aufgetragen
werden, die ein drittes Reaktionselement enthält. In besonderen Fällen kann
das dritte Reaktionselement auch mit dem zweiten Reaktionselement
identisch sein. Natürlich
ist es auch möglich,
die Oberseite und die Unterseite der Papierschicht simultan zu beschichten.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
ein neues und besonders vorteilhaftes Testverfahren zum Nachweis
eines Analyten in einer flüssigen
Probe. Dieses Testverfahren umfasst das Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Testvorrichtung,
das Befeuchten der Reaktionszone mit der flüssigen Probe und, nach Ablauf
einer vorgegebenen Reaktionszeit, das Detektieren des Vorliegens
oder Nichtvorliegens einer durch die Umsetzungsreaktion der Reporterpartner
erzeugten optischen Signals in der Reaktionszone. Dabei kann das
Verfahren sowohl quantitativ als auch nicht-quantitativ angewendet
werden, wobei zur quantitativen Bestimmung einer Analytkonzentration
in der Probe ein gemessenes optisches Signal mit geeigneten Kalibrierwerten
verglichen wird.
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Die
technische Realisierung der Signaldetektion hängt von der Natur des erzeugten
Signals ab. Viele Enzym/Substrat-Paare, die zum Nachweis von Reaktionen
verwendet werden, führen
zu einer Anfärbung
im Sinne einer Erhöhung
der Absorption für
Licht eines bestimmten Wellenlängenbereichs.
Alternativ kann die enzymatische Umsetzung des Substrats auch zu
einer Erzeugung bzw. Verstärkung oder
zu einer Abschwächung
eines Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzsignals führen. Je
nach Art des optischen Signals sind dem Fachmann geeignete Detektionsmittel
und -verfahren bekannt.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus
der nachfolgenden, speziellen Beschreibung und den Zeichnungen.
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Es
zeigen
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1:
eine schematische Darstellung einer ersten biochemischen Variante
der erfindungsgemäßen Testvorrichtung.
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2:
eine schematische Darstellung einer zweiten biochemischen Variante
der erfindungsgemäßen Testvorrichtung.
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3:
eine schematische Darstellung einer dritten biochemischen Variante
der erfindungsgemäßen Testvorrichtung.
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4:
eine schematische Darstellung einer vierten biochemischen Variante
der erfindungsgemäßen Testvorrichtung.
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5:
eine erste Variante eines erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens.
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6:
eine zweite Variante eines erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens.
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7:
eine dritte Variante eines erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens.
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8:
eine schematische Schnittdarstellung einer ersten Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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9:
eine schematische Schnittdarstellung einer zweiten Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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10:
eine schematische Schnittdarstellung einer dritten Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Die 1-4 zeigen
unterschiedliche Varianten eines mit der erfindungsgemäßen Testvorrichtung
durchführbaren
biochemischen Testverfahrens. Der Aufbau der Darstellung ist in
allen vier Figuren derselbe. Teilbild I zeigt jeweils eine Ausgangssituation
von Reaktionskomponenten, die auf einem trockenen, porösen Träger 10 fixiert
sind. Teilbild IIa zeigt jeweils die Situation nach Zugabe einer
analythaltigen Probenflüssigkeit.
Teilbild IIb zeigt jeweils die Situation nach Zugabe einer analytfreien
Probenflüssigkeit.
Die Reaktionskomponenten sind ein Reporterenzym E, welches unter
Erzeugung eines optisch detektierbaren Signals ein Reportersubstrat
S enzymatisch umsetzen kann. Eine weitere Reaktionskomponente ist
ein selektiver Binder 12, der beispielsweise als polyklonaler
oder monoklonaler Antikörper,
insbesondere als Fab-, Fab2-Fragment oder als ein anderer rekombinanter
Antikörper,
wie etwa ein "single
chain"-Antikörper scFv
ausgebildet sein kann. Die Verwendung anderer selektiver Binder,
wie etwa ein Aptamer ist ebenfalls möglich. Auch kann der selektive
Binder 12 mit einem voluminösen Molekül derivatisiert sein, wobei
das voluminöse
Molekül gegen
die enzymatische Wirkung des Enzyms E inert ist, jedoch für die erwünschte Behinderung
der enzymatischen Umsetzung des Substrates S hilfreich ist. Das
voluminöse
Molekül
kann beispielsweise ein synthetisches Polymer, ein Dendrimer, ein
Naturstoff, eine Nukleinsäure,
eine Peptidnukleinsäure
(PNA), ein Peptid, ein Protein, ein Lipid oder ein Kohlenhydrat
sein.
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Alternativ
oder zusätzlich
kann auch das Reportersubstrat mit einem solchen voluminösen Molekül gekoppelt
sein.
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Schließlich ist
als weitere Reaktionskomponente ein Biomarker B vorgesehen, der
bezüglich seiner
Bindungsfähigkeit
mit dem selektiven Binder 12 dem Analyten A äquivalent
ist. Insbesondere kann der Biomarker B selbst dem Analyten A entsprechen.
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Die 1 bis 4 stellen
jeweils einen typischen Testablauf dar, wobei in die Reaktionszone des
in Teilbild I gezeigten porösen
Trägers 10 eine Probenflüssigkeit,
die mutmaßlich
den Analyten A enthält,
appliziert wird. Dies ist in den Zeichnungen durch "A?" angedeutet.
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1 zeigt
eine Ausführungsform,
bei der der Biomarker B mit dem Substrat S komplexiert ist. Das
heißt,
es ist eine stabile und enge Bindung zwischen dem Biomarker B und
dem Substrat S etabliert. Eine weitere Besonderheit der Ausführungsform von 1 ist,
dass der selektive Binder 12 im trockenen Zustand des porösen Trägers bereits
mit dem komplexierten Biomarker B gebunden ist.
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Bei
Vorliegen von Analyt A in der applizierten Probenflüssigkeit
konkurrieren Analyt-Moleküle
mit Komplex-Molekülen um Bindungsstellen
des selektiven Binders 12. Dabei ist es erforderlich, dass
die anfängliche
Bindung des Binders mit dem Biomarker B reversibel ist. Bei Überschuss
von Analyt A bindet der Binder 12 den Analyten A in großem Umfang,
während
er den komplexierten Biomarker B freigibt. Durch den Flüssigkeitseintrag
werden das Enzym E und/oder der Komplex aus Biomarker B und Substrat S
aufgeschwemmt, so dass wenigstens eines dieser Reaktionselemente
im porösen
Träger
freibeweglich ist. Dadurch kommt es zu einer enzymatischen Umsetzung
des Substrates S und in der Folge zu einem optisch detektierbaren
Signal.
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Der
Fall, dass in der Probenflüssigkeit
kein Analyt vorliegt, ist in Teilbild IIb von 1 dargestellt. Hier
werden zwar das Enzym E und/oder der Komplex durch den Flüssigkeitseintrag
aufgeschwemmt, so dass wenigstens eines dieser Elemente im porösen Träger freibeweglich
ist; gleichwohl kommt es nicht zu einer enzymatischen Umsetzung
des Substrates S, da eine Wechselwirkung zwischen dem Enzym E und
dem komplexierten Substrat S durch den an den Biomarker gebundenen
Binder 12 behindert wird. Im schematisch dargestellten
Fall ist diese Behinderung eine vollständige Unterdrückung der
enzymatischen Wirkung aufgrund einer sterischen Inhibition. Bei
anderen Ausgestaltungen können
auch allosterische Effekte benutzt werden. Insbesondere bei der
sterischen Inhibition ist die zuvor erwähnte Derivatisierung des Binders 12 mit
einem voluminösen Molekül hilfreich.
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2 zeigt
eine ähnliche
Ausgangssituation wie 1, jedoch mit dem Unterschied,
dass der Binder 12 im trockenen Zustand des porösen Trägers separat
von dem Biomarker B vorliegt. Dies hat den Vorteil, dass die kompetitive
Reaktion von Analyt A und komplexiertem Biomarker B um die Bindungsstellen
des selektiven Binders 12 von einer einheitlichen Ausgangssituation
starten. Dies kann zu einer Beschleunigung der Einstellung des Gleichgewichtes und
damit zu einer Verkürzung
der Testdauer führen. Außerdem ist
diese Variante auch geeignet, wenn die Bindung zwischen dem Binder 12 und
dem Analyten bzw. dem Biomarker nicht oder nur wenig reversibel ist.
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Die 3 und 4 zeigen
eine andere grundlegende Variante der vorliegenden Erfindung, wobei
der Biomarker B nicht mit dem Substrat S sondern mit dem Enzym E
komplexiert ist. In 2 ist der Binder 12 bereits
im trockenen Zustand des porösen
Trägers
mit diesem Komplex gekoppelt, während er
bei der Variante von 4 im trockenen Zustand des porösen Trägers separat
vorliegt. Im Übrigen
erfolgt die Reaktion analog zu den oben im Zusammenhang mit den 1 und 2 erläuterten
Reaktionen.
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5 zeigt
eine erste Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens
für eine
erfindungsgemäße Testvorrichtung.
Hierzu wird in einem ersten Schritt ein poröser Träger 10 in einer wässrigen
Lösung
getränkt,
in der das Enzym E vorliegt. Anstelle einer Tränkung kann die Lösung auch aufgesprüht oder
aufgedruckt werden. In einem anschließenden, nicht eigens dargestellten
Trockenschritt wird das Enzym E an der Oberfläche des porösen Trägers durch Adhäsionskräfte fixiert.
Dies kann durch geeignete Oberflächenbeschichtung
des porösen
Trägers
unterstützt
werden. In einem nachfolgenden Schritt, der in 5b dargestellt
ist, wird der poröse
Träger 10 erneut
getränkt,
wobei hierzu eine Toluol-Lösung
eines mit dem Biomarker B komplexierten Substrates S verwendet wird.
In der unpolaren Toluol-Lösung
ist das Enzym nicht aktiv, so dass bei diesem zweiten Verfahrensschritt
keine enzymatische Umsetzung des Substrates erfolgen kann. Ein anschließender Trocknungsschritt
fixiert den Komplex auf dem porösen
Träger.
In einem weiteren, nicht dargestellten Schritt ist noch der selektive Binder
auf dem porösen
Träger
zu fixieren. Dies kann vor, zwischen oder nach den in 5 dargestellten Schritten
erfolgen, wobei vorzugsweise eine weitere Polaritätsabstufung
des verwendeten Lösungsmittels erfolgt,
so dass eine vorzeitige Bindung des Binders mit dem Biomarker B
verhindert wird.
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6 zeigt
eine weitere Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens. Hierbei
wird der poröse
Träger 10 in
einer Flüssigkeit getränkt, in
der sämtliche
Reaktionselemente, d.h. im dargestellten Fall das Enzym E, den Binder 12 und einen
Komplex aus Substrat S und Biomarker B enthält. Zur Verhinderung einer
vorzeitigen Reaktion der einzelnen Elemente untereinander sind bei
der dargestellten Ausführungsform
das Enzym E und der Binder 12 gekapselt. Beispielhaft für derartige
Kapselungen ist bei dem Binder 12 eine Kapselung in Liposom-Vesikeln
und bei dem Enzym E in einer Gelatine- oder Dextrankapsel dargestellt.
Bei der praktischen Anwendung werden vorzugsweise für beide gekapselten
Elemente gleichartige Kapselungen verwendet. Anderenfalls sollte
die Auftragung in mehreren Schritten, jeweils mit geeigneten Lösungsmitteln erfolgen.
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7 stellt
eine weitere Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens
dar. Dabei werden mit Hilfe einer Kaskadengussmaschine von der lediglich
Extruderelemente 14, 16, 18 dargestellt
sind, mehrere hoch viskose Schichten 24, 26, 28 aufgetragen,
die jeweils eines der Reaktionselemente (selektiver Binder, Komplex
aus Biomarker und erstem Reporterpartner, zweiter Reporterpartner)
einschließen.
Durch die hohe Viskosität
ist ein Austausch zwischen den Schichten und somit eine vorzeitige
Reaktion der Reaktionselemente ausgeschlossen. Die Schichten 24, 26, 28 können so
ausgestaltet sein, dass sie sich bei Eintrag der Probenflüssigkeit
auflösen;
alternativ können
sie auch als flüssigkeitspermable
Filme ausgebildet sein.
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8 zeigt
einen schematischen Querschnitt durch eine erfindungsgemäße Testvorrichtung,
wie sie beispielsweise mittels eines Herstellungsverfahrens gemäß 7 erzeugt
wird. Auf einem porösen
Träger 10 sind übereinander
mehrere Schichten 24, 26, 28 aufgetragen,
die jeweils ein Reaktionselement enthalten. 9 zeigt
eine weitere Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Testvorrichtung,
wobei eine Reaktionszone 20 auf einem porösen Träger 10 in
mehrere Subzonen 20a, 20b und 20c unterteilt
ist, die jeweils ein Reaktionselement enthalten. Bei der Ausführungsform
von 9 sind die Grenzen zwischen den Subzonen gestrichelt
dargestellt, um anzudeuten, dass eine derartige Unterteilung der
Reaktionszone nicht zwingend erforderlich ist. Bei geeigneter Aufbringung
der einzelnen Reaktionselemente, etwa in gekapselter Form, kann
die Reaktionszone 20 auch einheitlich gestaltet sein.
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Schließlich zeigt 10 eine
weitere Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Testvorrichtung,
wobei der poröse
Träger
als dreidimensionales sphärisches
Gebilde ausgestaltet ist, welches mit einer stabförmigen Haltevorrichtung 22 verbunden
ist. Die Reaktionszone 20 umschließt die gesamt Oberfläche des
sphärischen
Trägers 10,
wobei die gestrichelte Linie wiederum andeutet, dass eine Unterteilung
in Subzonen (hier zwei Subzonen 20a und 20b) optional
ist.
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Natürlich stellen
die in der speziellen Beschreibung und in den Figuren gezeigten
Ausführungsformen
nur illustrative Beispiele der vorliegenden Erfindung dar. Insbesondere
hinsichtlich der räumlichen
Gestaltung des porösen
Trägers,
der Wahl der Materialien für
den Träger
sowie die Wahl und Gestaltung der Reagenzien ist dem Fachmann ein
breites Spektrum an Möglichkeiten
an Hand gegeben. Insbesondere die im Einzelnen zugrunde gelegte
Biochemie ist an die konkreten Erfordernisse beim Nachweis eines
speziellen Analyten anzupassen.