DE102006008030A1

DE102006008030A1 - Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren

Info

Publication number: DE102006008030A1
Application number: DE102006008030A
Authority: DE
Inventors: Petra Dr. Cirpus; Jörg Dr. Bauer; Xiao Dr. Qiu; Guohai Dr. Wu; Bifang Dr. Chen; Martin Dr. Truksa
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2006-02-21
Filing date: 2006-02-21
Publication date: 2007-08-23
Also published as: ZA200807982B; CN101400798A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in transgenen Pflanzen, indem in der Pflanze bereitgestellt werden mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Delta6-Desaturase-Aktivität kodiert; mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Delta6-Elongase-Aktivität kodiert; mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Delta5-Desaturase-Aktivität kodiert; und mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Delta5-Elongase-Aktivität kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Delta5-Elongase-Aktivität kodiert, gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in transgenen Pflanzen, indem in der Pflanze bereitgestellt werden mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität kodiert; mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ6-Elongase-Aktivität kodiert; mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Desaturase-Aktivität kodiert; und mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zusätzlich weitere Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit der Aktivität einer ω3-Desaturase und/oder einer Δ4-Desaturase kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden weitere Nukleinsäuresequenzen, die für Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Nukleinsäuremoleküle, umfassend mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität kodiert; mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ5-Desaturase-Aktivität kodiert; mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ6-Elongase-Aktivität kodiert; und mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert und die gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist.
Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Öle, Lipide und/oder Fettsäuren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, und deren Verwendung.
Schließlich betrifft die Erfindung auch transgene Pflanzen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden oder die ein erfindungsgemäßes rekombinantes Nukleinsäuremolekül enthalten, und deren Verwendung als Nahrungs- oder Futtermittel.
Die Lipidsynthese lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase oder in Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle zusammen Acetoacetyl-ACP, das über eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen siehe F. C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D. C., S. 612–636 und darin enthaltene Literaturstellen; Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57: 522–542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide gebundenen Fettsäuren müssen anschließend für die weiteren Elongationen aus den Phospholipiden wieder in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden. Dies ermöglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen. Weiterhin können diese Enzyme die elongierten Fettsäuren wieder von den CoA-Estern auf die Phospholipide übertragen. Diese Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4–5): 161–166).
Eine Übersicht über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und -Assemblierung geben einschließlich der Literaturstellen die folgenden Artikel: Kinney (1997) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19: 149–166; Ohlrogge und Browse (1995) Plant Cell 7: 957–970; Shanklin und Cahoon (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 611–641; Voelker (1996) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18: 111–13; Gerhardt (1992) Prog. Lipid R. 31: 397–417; Gühnemann-Schäfer & Kindl (1995) Biochim. Biophys Acta 1256: 181–186; Kunau et al. (1995) Prog. Lipid Res. 34: 267–342; Stymne et al. (1993) in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150–158; Murphy & Ross (1998) Plant Journal. 13(1): 1–16.
Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren können entsprechend ihrem Desaturierungsmuster in zwei große Klassen, die ω-6- und die ω-3-Fettsäuren, eingeteilt werden, die metabolisch und funktionell unterschiedliche Aktivitäten haben.
Im Folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs bezeichnet (poly unsaturated fatty acids, PUFA, mehrfach ungesättigte Fettsäuren; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren).

Als Ausgangsstoff für den ω-6-Stoffwechselweg fungiert die Fettsäure Linolsäure (18:2^Δ9,12), während der ω-3-Weg über Linolensäure (18:3^Δ9,12) abläuft. Linolensäure wird dabei durch die Aktivität einer ω-3-Desaturase aus Linolsäure gebildet (Tocher et al. (1998) Prog. Lipid Res. 37: 73–117; Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 4105–4113).

Säugetiere und damit auch der Mensch verfügen über keine entsprechende Desaturaseaktivität (Δ-12- und ω-3-Desaturase) zur Bildung dieser Ausgangsstoffe und müssen daher diese Fettsäuren (essentielle Fettsäuren) über die Nahrung aufnehmen. Über eine Abfolge von Desaturase- und Elongase-Reaktionen werden dann aus diesen Vorstufen die physiologisch eine ω-wichtigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren Arachidonsäure (= ARA, 20:4^Δ5,8,11,14) 6-Fettsäure und die beiden ω-3-Fettsäuren Eicosapentaen- (= EPA, 20:5^Δ5,8,11,17) und Docosahexaensäure (DHA, 22:6^{Δ4,7,10,13,17,19}) synthetisiert.

Die Verlängerung von Fettsäuren durch Elongasen um 2 bzw. 4 C-Atome ist für die Produktion von C₂₀- bzw. C₂₂-PUFAs von entscheidender Bedeutung. Dieser Prozess verläuft über 4 Stufen. Den ersten Schritt stellt die Kondensation von Malonyl-CoA an das Fettsäure-Acyl-CoA durch die Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS, im weiteren Text als Elongase bezeichnet) dar. Es folgt dann ein Reduktionsschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase, KCR), ein Dehydratationsschritt (Dehydratase) und ein abschließender Reduktionsschritt (Enoyl-CoA-Reduktase). Es wurde postuliert, dass die Aktivität der Elongase die Spezifität und Geschwindigkeit des gesamten Prozesses beeinflusst (Millar and Kunst (1997) Plant Journal 12: 121–131).

Für Fettsäuren und Triacylglyceride besteht eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, ob es sich um freie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren oder um Triacylglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. So werden z. B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten, speziell mehrfach ungesättigten, Fettsäuren bevorzugt. Den mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren wird dabei ein positiver Effekt auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Prävention einer Herzerkrankung zugeschrieben. Durch Zugabe dieser ω-3-Fettsäuren zur Nahrung kann das Risiko einer Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert werden (Shimikawa (2001) World Rev. Nutr. Diet. 88: 100–108).

Auch entzündliche, speziell chronisch entzündliche, Prozesse im Rahmen immunologischer Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis lassen sich durch ω-3-Fettsäuren positiv beeinflussen (Calder (2002) Proc. Nutr. Soc. 61: 345–358; Cleland und James (2000) J. Rheumatol. 27: 2305–2307). Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell diätetischen Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung. ω-6-Fettsäuren wie Arachidonsäure üben bei diesen rheumatischen Erkrankungen eher einen negativen Effekt aus.

ω-3- und ω-6-Fettsäuren sind Vorläufer von Gewebshormonen, den sogenannten Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-γ-linolensäure, der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten, und den Thromboxanen und Leukotrienen, die sich von der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten. Eicosanoide (sog. PG₂-Serie), die aus ω-6-Fettsäuren gebildet werden, fördern in der Regel Entzündungsreaktionen, während Eicosanoide (sog. PG₃-Serie) aus ω-3-Fettsäuren geringe oder keine entzündungsfördernde Wirkung haben.

Mehrfach ungesättigte langkettige ω-3-Fettsäuren wie Eicosapentaensäure (= EPA, C20:5^{Δ5,8,11,14,17}) oder Docosahexaensäure (= DHA, C22:6^{Δ4,7,10,13,16,19}) sind wichtige Komponenten der menschlichen Ernährung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in der Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen Gehirns, die Funktionalität des Auges, die Synthese von Hormonen und anderer Signalstoffe, sowie die Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Poulos, A (1995) Lipids 30: 1–14; Horrocks, LA und Yeo YK (1999) Pharmacol Res 40: 211–225).

Aufgrund der heute üblichen Zusammensetzung der menschlichen Nahrung ist ein Zusatz von mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren, die bevorzugt in Fischölen vorkommen, zur Nahrung besonders wichtig. So werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Docosahexaensäure (= DHA, C22:6^{Δ4,7,10,13,16,19}) oder Eisosapentaensäure (= EPA, C20:5^{Δ5,8,11,14,17}) der Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Es besteht aus diesem Grund ein Bedarf an der Produktion mehrfach ungesättigter langkettiger Fettsäuren.

Hauptsächlich werden die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps und Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Triglycerole) anfallen. Sie können aber auch aus Tieren wie z. B. Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch Verseifung der Triacylglyceride hergestellt. Sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie DHA, EPA, Arachidonsäure (ARA, C20:4^Δ5,8,11,14), Dihomo-γ-linolensäure (DHGL, C20:3^Δ8,11,14) oder Docosapentaensäure (DPA, C22:5^{Δ7,10,13,16,19}) werden in Ölfruchtpflanzen wie Raps, Soja, Sonnenblume, Färbersaflor jedoch nicht synthetisiert. Übliche natürliche Quellen für diese Fettsäuren sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch oder Algen.

Aufgrund der positiven Eigenschaften der mehrfach ungesättigten Fettsäuren hat es in der Vergangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese dieser Fettsäuren bzw. Triglyceride beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ-15-Desaturase und in WO 94/11516 eine Δ-12-Desaturase beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 20144–20149, Wada et al. (1990) Nature 347: 200–203 oder Huang et al. (1999) Lipids 34: 649–659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und zu charakterisieren sind (McKeon et al. (1981) Methods in Enzymol. 71: 12141–12147, Wang et al. (1988) Plant Physiol. Biochem., 26: 777–792).

In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen durch Einbringung in einen geeigneten Organismus, der anschließend auf Enzymaktivität mittels Edukt- und Produktanalyse untersucht wird. Δ-6-Desaturasen werden in WO 93/06712, US 5,614,393 , WO 96/21022, WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben. Die Anwendung dieses Enzyms zur Produktion von Fettsäuren in transgenen Organismen wird in WO 98/46763, WO 98/46764 und WO 98/46765 beschrieben. Die Expression verschiedener Desaturasen und die Bildung mehrfach ungesättigter Fettsäuren wird auch in WO 99/64616 oder WO 98/46776 beschrieben und beansprucht. Bzgl. der Effektivität der Expression von Desaturasen und ihrem Einfluss auf die Bildung mehrfach ungesättigter Fettsäuren ist anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase wie bisher beschrieben lediglich geringe Gehalte an ungesättigten Fettsäuren/Lipiden wie z. B. γ-Linolensäure und Stearidonsäure erreicht wurden.

In der Vergangenheit wurden zahlreiche Versuche unternommen, Elongase-Gene zu erhalten. Millar and Kunst (1997) Plant Journal 12: 121–131 und Millar et al. (1999) Plant Cell 11: 825–838 beschreiben die Charakterisierung von pflanzlichen Elongasen zur Synthese von einfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren (C22:1) bzw. zur Synthese von sehr langkettigen Fettsäuren für die Wachsbildung in Pflanzen (C₂₈-C₃₂). Beschreibungen zur Synthese von Arachidonsäure und EPA finden sich beispielsweise in WO 01/59128, WO 00/12720, WO 02/077213 und WO 02/08401. Die Synthese von mehrfach ungesättigter C24-Fettsäuren ist beispielsweise in Tvrdik et al. (2000) J. Cell Biol. 149: 707–718 oder in WO 02/44320 beschrieben.

Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAs sind Mikroalgen wie Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-Arten, Thraustochytrien-Arten, Schizochytrien-Arten oder Crypthecodinium-Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie Mortierella, Entomophthora oder Mucor und/oder Moose wie Physcomitrella, Ceratodon und Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553–558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060–1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: 269–278). Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutantenstämmen der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe wünschenswerter Verbindungen, einschließlich PUFAs, produzieren. Die Mutation und Selektion von Stämmen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls wie den mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Mit Hilfe der vorgenannten Mikroorganismen lassen sich zudem nur begrenzte Mengen der gewünschten mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie DPA, EPA oder ARA herstellen, die noch dazu in der Regel als Fettsäuregemische anfallen. Deshalb werden, wann immer möglich, gentechnologische Verfahren bevorzugt.

Höhere Pflanzen enthalten mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Linolsäure (C18:2) und Linolensäure (C18:3). ARA, EPA und DHA kommen im Samenöl höherer Pflanzen gar nicht oder nur in Spuren vor (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Vegetales. Technique & Documentation – Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Es wäre jedoch vorteilhaft, in höheren Pflanzen, bevorzugt in Ölsaaten wie Raps, Lein, Sonnenblume und Soja, LCPUFAs herzustellen, da auf diese Weise große Mengen qualitativ hochwertiger LCPUFAs für die Lebensmittelindustrie, die Tierernährung und für pharmazeutische Zwecke kostengünstig gewonnen werden können. Hierzu werden vorteilhafterweise über gentechnische Methoden Gene, die für Enzyme der Biosynthese von LCPUFAs kodieren, in Ölsaaten eingeführt und exprimiert. Dies sind Gene, die beispielsweise für Δ-6-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen oder Δ-4-Desaturasen kodieren. Diese Gene können vorteilhaft aus Mikroorganismen und niederen Pflanzen isoliert werden, die LCPUFAs herstellen und in den Membranen oder Triacylglyceriden einbauen. So konnten bereits Δ-6-Desaturase-Gene aus dem Moos Physcomitrella patens und Δ-6-Elongase-Gene aus P. patens und dem Nematoden C. elegans isoliert werden.

Transgene Pflanzen, die für Enzyme der LCPUFA-Biosynthese kodierende Gene enthalten und exprimieren und als Folge dessen LCPUFAs produzieren, wurden beispielsweise in DE-A-102 19 203 (Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen) beschrieben. Diese Pflanzen produzieren allerdings LCPUFAs in Mengen, die für eine Aufarbeitung der in den Pflanzen enthaltenen Öle noch weiter optimiert werden müssen. So beträgt der Gehalt von ARA in den in DE-A-102 19 203 beschriebenen Pflanzen lediglich 0,4 bis 2% und der Gehalt von EPA lediglich 0,5 bis 1%, jeweils bezogen auf den Gesamtlipidgehalt der Pflanze.

Um eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit mehrfach ungesättigten, langkettigen Fettsäuren zu ermöglichen, besteht daher ein großer Bedarf an einem einfachen, kostengünstigen Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten, langkettigen Fettsäuren speziell in pflanzlichen Systemen.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren, insbesondere Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure, in transgenen Pflanzen in großer Menge preiswert hergestellt werden können.

Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden, dass durch die Expression einer optimierten Δ5-Elongase-Sequenz in transgenen Pflanzen die Ausbeute an langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure, gesteigert werden kann.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten PUFAs umfassen eine Gruppe von Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr synthetisieren können und somit aufnehmen müssen oder die höhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich aufnehmen müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden können.

Entsprechend wird die Aufgabe der Erfindung gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in einer transgenen Pflanze, umfassend das Bereitstellen in der Pflanze von mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität kodiert;
mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ6-Elongase-Aktivität kodiert; mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Desaturase-Aktivität kodiert; und mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert,
wobei die Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist.

Das "Bereitstellen in der Pflanze" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass Maßnahmen getroffen werden, so dass die Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität, ein Polypeptid mit einer Δ6-Elongase-Aktivität, ein Polypeptid mit einer Δ5-Desaturase-Aktivität und ein Polypeptid mit einer Δ5- Elongase-Aktivität zusammen in einer Pflanze vorliegen. Das "Bereitstellen in der Pflanze" umfasst somit das Einbringen der Nukleinsäuresequenzen in die Pflanze sowohl durch Transformation einer Pflanze mit einem oder mehreren rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die die genannten Nukleinsäuresequenzen enthalten, als auch durch Verkreuzung von geeigneten Elternpflanzen, die eine oder mehrere der genannten Nukleinsäuresequenzen enthalten.

Die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, ist erfindungsgemäß gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist. Dies bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenz gezielt für die Zwecke der Erfindung optimiert wurde, ohne dass dadurch die von der Nukleinsäuresequenz kodierte Aminosäuresequenz verändert wurde.

Der genetische Code ist redundant, da er 61 Kodons verwendet, um 20 Aminosäuren zu spezifizieren. Daher werden die meisten der 20 proteinogenen Aminosäuren von mehreren Tripletts (Kodons) kodiert. Die synonymen Kodons, die eine einzelne Aminosäure spezifizieren, werden in einem bestimmten Organismus jedoch nicht mit gleicher Häufigkeit verwendet, sondern es gibt bevorzugte Kodons, die häufig verwendet werden und Kodons, die seltener verwendet werden. Diese Unterschiede in der Kodonverwendung werden zurückgeführt auf selektive evolutionäre Drücke und vor allem die Effizienz der Translation. Ein Grund für die geringere Translationseffizienz von selten auftretenden Kodons könnte darin liegen, dass die entsprechenden Aminoacyl-tRNA-Pools erschöpft werden und damit nicht mehr zur Proteinsynthese zur Verfügung stehen.

Außerdem bevorzugen unterschiedliche Organismen unterschiedliche Kodons. Daher läuft beispielsweise die Expression einer rekombinanten DNA, die aus einer Säugerzelle stammt, in E. coli-Zellen häufig nur suboptimal ab. Deshalb kann der Austausch selten verwendeter Kodons gegen häufig verwendete Kodons in manchen Fällen die Expression erhöhen. Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die kodonoptimierten DNA-Sequenzen eine effizientere Translation ermöglichen und die daraus gebildeten mRNAs möglicherweise eine höhere Halbwertszeit in der Zelle besitzen und daher häufiger für die Translation zur Verfügung stehen. Aus dem vorstehend gesagten folgt, dass eine Kodonoptimierung nur dann nötig ist, wenn der Organismus, in dem die Nukleinsäuresequenz exprimiert werden soll, ein anderer ist als der Organismus, aus dem die Nukleinsäuresequenz ursprünglich stammt.

Für viele Organismen, von denen die DNA-Sequenz einer größeren Zahl von Genen bekannt ist, gibt es Tabellen, denen man die Häufigkeit der Verwendung bestimmter Kodons in dem jeweiligen Organismus entnehmen kann. Mit Hilfe dieser Tabellen lassen sich Proteinsequenzen mit relativ großer Genauigkeit in eine DNA-Sequenz zurückübersetzen, die die im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodons für die verschiedenen Aminosäuren des Proteins enthält. Tabellen zur Kodonverwendung können u.a. unter der folgenden Internet-Adresse aufgefunden werden:
http://www.kazusa.or.jp/Kodon/E.html. Darüber hinaus bieten mehrere Firmen Software für die Genoptimierung an, wie z. B. die Firma Entelechon (Software Leto) oder die Firma Geneart (Software GeneOptimizer).

Die Anpassung der Sequenzen an die Kodonverwendung in einem bestimmten Organismus kann unter Zuhilfenahme verschiedener Kriterien erfolgen. Zum einen kann für eine bestimmte Aminosäure immer das am häufigsten im ausgewählten Organismus vorkommende Kodon verwendet werden, zum anderen kann aber auch die natürliche Frequenz der verschiedenen Kodons berücksichtigt werden, so dass alle Kodons für eine bestimmte Aminosäure entsprechend ihrer natürlichen Häufigkeit in die optimierte Sequenz eingebaut werden. Dabei kann die Auswahl, an welcher Position welches Basen-Triplett verwendet wird, zufällig stattfinden. Erfindungsgemäß wurde die DNA-Sequenz unter Berücksichtigung der natürlichen Häufigkeit einzelner Kodons angepasst, wobei die Verwendung des am häufigsten im ausgewählten Organismus vorkommenden Kodons ebenfalls geeignet ist.

Besonders bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz aus Ostreococcus tauri, die für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, zumindest an die Kodonverwendung in Raps, Soja und/oder Lein angepasst. Bei der ursprünglich aus Ostreococcus tauri stammenden Nukleinsäuresequenz handelt es sich bevorzugt um die in SEQ ID No. 13 dargestellte Sequenz. Die für die Δ5-Elongase kodierende DNA-Sequenz ist an mindestens 20% der Positionen, bevorzugt an mindestens 30% der Positionen, besonders bevorzugt an mindestens 40% Positionen und am meisten bevorzugt an mindestens 50% der Positionen an die Kodonverwendung in Raps, Soja und/oder Lein angepasst.

Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der verwendeten Nukleinsäuresequenz um die in SEQ ID No. 1 angegebene Sequenz.

Es versteht sich, dass auch solche kodonoptimierten DNA-Sequenzen von der Erfindung erfasst sind, die für ein Polypeptid mit der Aktivität einer Δ5-Elongase kodieren, dessen Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Positionen gegenüber der Wildtyp-Sequenz verändert ist, das aber noch im wesentlichen die gleiche Aktivität aufweist wie das Wildtyp-Protein.

Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID No. 3 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die für die in SEQ ID No. 4 angegebene Aminosäuresequenz kodieren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem komplementären Strang der in SEQ ID No. 3 angegebenen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und
d) Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 3 angegebenen Sequenz zu mindestens 60% identisch sind.

Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ6-Elongase-Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID No. 5 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die für die in SEQ ID No. 6 angegebene Aminosäuresequenz kodieren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem komplementären Strang der in SEQ ID No. 5 angegebenen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und
d) Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 5 angegebenen Sequenz zu mindestens 60% identisch sind.

Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ5-Desaturase-Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID No. 7 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die für die in SEQ ID No. 8 angegebene Aminosäuresequenz kodieren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem komplementären Strang der in SEQ ID No. 7 angegebenen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und
d) Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 7 angegebenen Sequenz zu mindestens 60% identisch sind.

Weitere geeignete Nukleinsäuresequenzen kann der Fachmann der Literatur bzw. den bekannten Genbanken wie z. B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov entnehmen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden zusätzlich eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit der Aktivität einer ω-3-Desaturase und/oder einer Δ4-Desaturase kodieren, in die Pflanze eingebracht.

Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer ω-3-Desaturase-Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID No. 9 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die für die in SEQ ID No. 10 angegebene Aminosäuresequenz kodieren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem komplementären Strang der in SEQ ID No. 9 angegebenen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und
d) Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 9 angegebenen Sequenz zu mindestens 60% identisch sind.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendete ω-3-Desaturase ermöglicht eine Verschiebung vom ω-6-Biosyntheseweg zum ω-3-Biosyntheseweg, was zu einer Verschiebung von C_18:2- zu C_18:3-Fettsäuren führt. Weiterhin ist vorteilhaft, dass die ω-3-Desaturase eine breite Palette von Phospholipiden wie Phosphatidylcholin (= PC), Phosphatidylinositol (= PIS) oder Phosphatidylethanolamin (= PE) umsetzt. Schließlich lassen sich auch Desaturierungsprodukte in den Neutrallipiden (= NL), das heißt in den Triglyceriden finden.

Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ4-Desaturase-Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID No. 11 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die für die in SEQ ID No. 12 angegebene Aminosäuresequenz kodieren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem komplementären Strang der in SEQ ID No. 11 angegebenen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und
d) Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 11 angegebenen Sequenz zu mindestens 60% identisch sind.

Die Δ4-Desaturase, die im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendet wird, katalysiert die Einführung einer Doppelbindung in die Fettsäure Docosapentaensäure, was zur Bildung von Docosahexaensäure führt.

Für das erfindungsgemäße beschriebene Verfahren ist es vorteilhaft, in die Pflanzen zusätzlich zu den Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität, einer Δ6-Elongase-Aktivität, einer Δ5-Desaturase-Aktivität und einer Δ5-Elongase-Aktivität kodieren, sowie den ggf. eingebrachten Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit einer ω-3-Desaturase-Aktivität und/oder einer Δ4-Desaturase-Aktivität kodieren, zusätzlich weitere Nukleinsäuren einzubringen, die für Enzyme des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels kodieren.

Im Prinzip können alle Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels in Kombination mit den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden; bevorzugt werden Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen, Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) in Kombination mit der Δ-6-Elongase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase und der Δ-5-Elongase sowie ggf. der ω-3-Desaturase und/oder der Δ-4-Desaturase verwendet, wobei einzelne Gene oder mehrere Gene in Kombination verwendet werden können.

Vorteilhaft werden die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren im vegetativen Gewebe (= somatischem Gewebe) exprimiert. Unter vegetativem Gewebe ist im Sinne dieser Erfindung ein Gewebe zu verstehen, das sich durch mitotische Teilungen vermehrt. Derartiges Gewebe entsteht auch durch asexuelle Fortpflanzung (= Apomixis) und Vermehrung. Von Vermehrung spricht man dann, wenn sich die Zahl der Individuen in aufeinander folgenden Generationen erhöht. Diese durch asexuelle Vermehrung entstandenen Individuen sind mit ihren Eltern weitestgehend identisch. Beispiele für derartige Gewebe sind Blatt, Blüte, Wurzel, Stengel, oberirdische oder unterirdische Ausläufer (Seitensprosse, Stolonen), Rhizome, Knospen, Knollen wie Wurzelknollen oder Ausläuferknollen, Zwiebel, Brutkörper, Brutknospen, Bulbillen oder Turione. Derartige Gewebe können auch durch unechte, echte oder durch den Mensch verursachte Viviparie entstehen. Aber auch Samen, die durch Agamospermie, wie sie für Asteraceae, Poaceae oder Rosaceae typisch sind, entstanden sind, gehören zu den vegetativen Geweben, in denen vorteilhaft die Expression stattfindet. Zu einem geringeren Teil oder gar nicht werden die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren im generativen Gewebe (Keimbahngewebe) exprimiert. Beispiele für derartige Gewebe sind Gewebe, die durch geschlechtliche Fortpflanzung, d. h. meiotische Zellteilungen entstehen, wie z. B. Samen, die durch geschlechtliche Prozesse entstanden sind. Unter zu einem geringen Teil ist zu verstehen, dass im Vergleich zum vegetativen Gewebe die Expression gemessen auf RNA- und/oder Proteinebene weniger als 5%, vorteilhaft weniger als 3%, besonders vorteilhaft weniger als 2%, am meisten bevorzugt weniger als 1; 0,5; 0,25 oder 0,125% beträgt.

Besonders bevorzugt werden die Nukleinsäuresequenzen in den Blättern der transgenen Pflanzen exprimiert. Dies hat den Vorteil, dass die erfindungsgemäß hergestellten LCPUFAs von Tieren und Menschen direkt durch den Verzehr der Blätter aufgenommen werden können und keine vorherige Aufarbeitung des Pflanzenmaterials erforderlich ist.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen im Blatt kann durch die Verwendung von konstitutiven oder blattspezifischen Promotoren erreicht werden.

"Konstitutive Promotoren" sind Promotoren, die die Expression in einer Vielzahl, vorzugsweise in allen, Geweben über einen wesentlichen Zeitraum während der pflanzlichen Entwicklung, bevorzugt während der gesamten pflanzlichen Entwicklung, ermöglichen. Bevorzugt wird ein Promotor aus einer Pflanze oder aus einem Pflanzenvirus verwendet. Bevorzugt sind der Promotor des CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S-Transkripts (Franck et al. (1980) Cell 21: 285–294), der 19S CaMV-Promotor ( US 5,352,605 ), der Aktinpromotor aus Reis (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163–171), der Legumin B-Promotor (GenBank Acc. No. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR duale Promotor, der Octopinsynthase-Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin-Promotor (Holtorf et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29: 637–649), der Smas-Promotor, der Cinnamoylalkoholdehydrogenase-Promotor ( US 5,683,439 ), die Promotoren der vacuolaren ATPase-Untereinheiten, der pEMU-Promotor (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581–588), der MAS-Promotor (Velten et al. (1984) EMBO J. 3(12): 2723–2730), der Histon-H3-Promotor aus Mais (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276–285), der Promotor des Nitrilase 1-Gens aus Arabidopsis (GenBank Acc. No. U38846, Nukleotide 3862–5325) und der Promotor eines Prolin-reichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) und weitere Promotoren, die konstitutive Genexpression vermitteln. Besonders bevorzugt ist der Promotor des CaMV 35S-Transkripts.

Es ist im Prinzip möglich, alle natürlich auftretenden konstitutiven Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist aber ebenfalls möglich, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden.

"Blattspezifische Promotoren" sind Promotoren, die eine hohe Aktivität im Blatt und keine oder nur eine geringe Aktivität in anderen Geweben zeigen. Unter "geringer Aktivität" wird im Rahmen der Erfindung verstanden, dass die Aktivität in anderen Geweben weniger als 20%, bevorzugt weniger als 10%, besonders bevorzugt weniger als 5% und am meisten bevorzugt weniger als 3, 2 oder 1% der Aktivität im Blatt beträgt. Geeignete blattspezifische Promotoren sind z. B. die Promotoren der kleinen Untereinheit von Rubisco (Timko et al. (1985) Nature 318: 579–582) und des Chlorophyll a/b-bindenden Proteins (Simpson et al. (1985) EMBO J. 4: 2723–2729).

Dem Fachmann sind weitere blattspezifische Promotoren bekannt bzw. er kann mit bekannten Methoden weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z. B. Hybridisierungsexperimenten oder DNA-Protein-Bindungsstudien, Blatt-spezifische regulatorische Nukleinsäurelemente identifizieren. Dabei wird z. B. in einem ersten Schritt aus Blattgewebe des gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, die gesamte poly(A)⁺-RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)⁺-RNA-Molekülen aus einem Nicht-Blattgewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)⁺-RNA-Moleküle lediglich im Blattgewebe akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Blatt-spezifische regulatorische Elemente verfügen. Dem Fachmann stehen darüber hinaus weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter Blatt-spezifischer Promotoren zur Verfügung.

Selbstverständlich können die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung auch in den Samen der transgenen Pflanzen exprimiert werden, indem samen-spezifische Promotoren verwendet werden, die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samen-spezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotyledonen als auch aus monokotyledonen Pflanzen isoliert werden. Im Folgenden sind bevorzugte Promotoren aufgeführt: USP (= unknown seed protein) und Vicilin (Vicia faba) (Bäumlein et al. (1991) Mol. Gen Genet. 225(3): 459–467), Napin (Raps) ( US 5,608,152 ), Conlinin (Lein) (WO 02/102970), Acyl-Carrier Protein (Raps) ( US 5,315,001 und WO 92/18634), Oleosin (Arabidopsis thaliana) (WO 98/45461 und WO 93/20216), Phaseolin (Phaseolus vulgaris) ( US 5,504,200 ), Bce4 (WO 91/13980), Leguminosen B4 (LegB4-Promotor) (Bäumlein et al. (1992) Plant J. 2(2): 233–239), Lpt2 und lpt1(Gerste) (WO 95/15389 und WO 95/23230), Samen-spezifische Promotoren aus Reis, Mais und Weizen (WO 99/16890), Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain ( US 5,677,474 ), Bce4 (Raps) ( US 5,530,149 ), Glycinin (Soja) ( EP 571 741 ), Phosphoenol-Pyruvatcarboxylase (Soja) (JP 06/62870), ADR12-2 (Soja) (WO 98/08962), Isocitratlyase (Raps) ( US 5,689,040 ) oder α-Amylase (Gerste) ( EP 781 849 ).

Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89–108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.

Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, wie beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 22: 361–366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinII-Promotor (EP-A-0 375 091).

Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394.

Es versteht sich, dass die erfindungsgemäß hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren nicht nur in intakten transgenen Pflanzen produziert werden können, sondern auch in pflanzlichen Zellkulturen oder in Kalluskulturen.

Die im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind vorteilhaft in Phospholipiden und/oder Triacylglyceriden gebunden, können aber auch als freie Fettsäuren oder aber gebunden in Form anderer Fettsäureester in den Organismen vorkommen. Dabei können sie als "Reinprodukte" oder aber vorteilhaft in Form von Mischungen verschiedener Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher Phospholipide wie Phosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und/oder Phosphatidylserin und/oder Triacylglyceriden, Monoacylglyceriden und/oder Diacylglyceriden vorliegen. Vorteilhaft liegen die im Verfahren hergestellten LCPUFAS EPA, DPA und DHA im Phosphatidylcholin und/oder Phosphatidylethanolamin und/oder in den Triacylglyceriden vor. Die Triacylglyceride können außerdem noch weitere Fettsäuren enthalten wie kurzkettige Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, mittelkettige Fettsäuren mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettige Fettsäuren mit 14 bis 24 C-Atomen. Bevorzugt enthalten sie langkettige Fettsäuren, besonders bevorzugt C₂₀- oder C₂₂-Fettsäuren.

Unter dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein, zwei oder drei Carbonsäureresten verestertes Glycerin verstanden (Mono-, Di- oder Triglycerid). Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch aus verschiedenen Glyceriden verstanden. Vorteilhaft handelt es sich bei dem Glycerid um ein Triglycerid. Das Glycerid oder das Glyceridgemisch kann weitere Zusätze, z. B. freie Fettsäuren, Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere Substanzen enthalten.

Unter einem "Glycerid" im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu zählen neben den oben beschriebenen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide und Glyceroglycolipide. Bevorzugt seien hier die Glycerophospholipide wie Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide beispielhaft genannt.

Unter Phospholipiden im Sinne der Erfindung sind zu verstehen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin und/oder Phosphatidylinositol.

Die Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C₁₈-, C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuremolekülen können aus den Nutzpflanzen, die für die Herstellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipiden, Phosphoglyceriden, Lipiden, Glycolipiden wie Glycosphingolipiden, Phospholipiden wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidylglycerol, Monoacylglyceriden, Diacylglyceriden, Triacylglyceriden oder sonstigen Fettsäureestern wie den Acetyl-CoenzymA-Estern, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei, drei oder vier, bevorzugt vier, fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten, isoliert werden, vorteilhaft werden sie in der Form ihrer Diacylglyceride, Triacylglyceride und/oder in Form des Phosphatidylesters isoliert, besonders bevorzugt in der Form der Triacylglyceride, Phosphatidylcholin und/oder Phosphatidylethanolamin. Neben diesen Estern sind die mehrfach ungesättigten Fettsäuren auch als freie Fettsäuren oder gebunden in anderen Verbindungen in den Pflanzen enthalten. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und freie Fettsäuren) in den Organismen in einer ungefähren Verteilung von 80 bis 90 Gew.-% Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospholipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens 4 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 11, 12, 13, 14 oder 15 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 16, 17, 18, 19, oder 20 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 25, 30, 35 oder 40 Gew.-% bezogen auf die gesamten Fettsäuren in der transgenen Pflanze hergestellt. Dabei sind die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäuren EPA, DPA und/oder DHA mit einem Gehalt von jeweils mindestens 5 Gew.-%, bevorzugt von jeweils mindestens 6, 7, 8 oder 9 Gew.-%, besonders bevorzugt von jeweils mindestens 10, 11 oder 12 Gew.-%, am meisten bevorzugt von jeweils mindestens 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Gew.-%, bezogen auf die gesamten Fettsäuren in der transgenen Pflanze enthalten.

Vorteilhaft werden die Fettsäuren in gebundener Form hergestellt. Mit Hilfe der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren lassen sich diese ungesättigten Fettsäuren an sn1-, sn2- und/oder sn3-Position der vorteilhaft hergestellten Triacylglyceride bringen. Vorteilhaft sind mindestens 11% der Triacylglyceride doppelt (das heißt an sn1- und sn2- oder sn2- und sn3-Position) substituiert. Auch dreifach substituierte Triacylglyceride sind nachweisbar. Da im erfindungsgemäßen Verfahren von den Ausgangsverbindungen Linolsäure (C18:2) bzw. Linolensäure (C18:3) mehrere Reaktionsschritte durchlaufen werden, fallen die Endprodukte des Verfahrens wie beispielsweise Arachidonsäure (ARA) oder Eicosapentaensäure (EPA) nicht als absolute Reinprodukte an, es sind immer auch Spuren oder größere Mengen der Vorstufen im Endprodukt enthalten. Sind in der Ausgangspflanze beispielsweise sowohl Linolsäure als auch Linolensäure vorhanden, so liegen die Endprodukte wie ARA oder EPA und/oder DPA und/oder DHA als Mischungen vor. Die Vorstufen sollten vorteilhaft nicht mehr als 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht als 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 Gew.-% bezogen auf die Menge des jeweiligen Endprodukts betragen. Vorteilhaft werden in einer transgenen Pflanze als Endprodukte nur ARA oder EPA und/oder DPA und/oder DHA im erfindungsgemäßen Verfahren gebunden oder als freie Säuren hergestellt.

Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, enthalten vorteilhaft 6 bis 15% Palmitinsäure, 1 bis 6% Stearinsäure; 7–85% Ölsäure; 0,5 bis 8% Vaccensäure, 0,1 bis 1% Arachinsäure, 7 bis 25% gesättigte Fettsäuren, 8 bis 85% einfach ungesättigte Fettsäuren und 60 bis 85% mehrfach ungesättigte Fettsäuren, jeweils bezogen auf 100% und auf den Gesamtfettsäuregehalt der Organismen. Als vorteilhafte mehrfach ungesättigte Fettsäure sind in den Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische bevorzugt mindestens 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 oder 1% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt an Arachidonsäure enthalten. Weiterhin enthalten die Fettsäureestern bzw. Fettsäuregemischen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopentendodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,11-dienonsäure), Vernonsäure (9,10-Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10-Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14-Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6-Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c-Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t11t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c11t13t-Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c-Octadecatriensäure), Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12-Hydroxyölsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy-9c,11t-Octadecadienonsäure). Die vorgenannten Fettsäuren kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemischen in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt sie kommen bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt zu weniger als 30%, bevorzugt zu weniger als 25%, 24%, 23%, 22% oder 21%, besonders bevorzugt zu weniger als 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% oder 5%, ganz besonders bevorzugt zu weniger als 4%, 3%, 2% oder 1% vor. In einer weiteren bevorzugten Form der Erfindung kommen diese vorgenannten Fettsäuren bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6%; oder 0,5%, besonders bevorzugt zu weniger als 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1% vor. Vorteilhaft enthalten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1% bezogen auf die Gesamtfettsäuren und/oder keine Buttersäure, kein Cholesterin sowie keine Nisinsäure (Tetracosahexaensäure, C23:6^{Δ3,8,12,18,21}).

Durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen kann in den transgenen Pflanzen eine Steigerung der Ausbeute an LCPUFAs von mindestens 50%, vorteilhaft von mindestens 80%, besonders vorteilhaft von mindestens 100%, ganz besonders vorteilhaft von mindestens 150% gegenüber den nicht transgenen Pflanzen erreicht werden.

Auch chemisch reine mehrfach ungesättigte Fettsäuren oder Fettsäurezusammensetzungen sind nach den vorbeschriebenen Verfahren darstellbar. Dazu werden die Fettsäuren oder die Fettsäurezusammensetzungen aus den Pflanzen in bekannter Weise beispielsweise über Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Methoden isoliert. Diese chemisch reinen Fettsäuren oder Fettsäurezusammensetzungen sind für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelindustrie, der Kosmetikindustrie und besonders der Pharmaindustrie vorteilhaft.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind prinzipiell alle dicotylen oder monokotylen Nutzpflanzen geeignet. Unter Nutzpflanzen sind Pflanzen zu verstehen, die der Nahrungsproduktion für Mensch und Tier, der Produktion von Genussmitteln, Fasern und Pharmazeutika dienen, wie Getreide, z. B. Mais, Reis, Weizen, Gerste, Hirse, Hafer, Roggen, Buchweizen; wie Knollen, z. B. Kartoffel, Maniok, Batate, Yams etc.; wie Zuckerpflanzen, z. B. Zuckerrohr oder Zuckerrübe; wie Hülsenfrüchte, z. B. Bohnen, Erbsen, Saubohne etc.; wie Öl- und Fettfrüchte, z. B. Sojabohne, Raps, Sonnenblume, Färberdiestel, Lein, Camelina etc., um nur einige zu nennen. Vorteilhafte Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzenfamilien bestehend aus den Familien der Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Arecaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Cannaceae, Caprifoliaceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Fagaceae, Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Moraceae, Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Poaceae, Polygonaceae, Punicaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae und Valerianaceae.

Beispielhaft seien die folgenden Pflanzen genannt: Anacardiaceae wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium z. B. die Gattung und Arten Pistacia vera (Pistazie), Mangifer indica (Mango) oder Anacardium occidentale (Cashew), Asteraceae wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana z. B. die Gattung und Arten Calendula officinalis (Garten-Ringelblume), Carthamus tinctorius (Färberdistel, safflower), Centaurea cyanus (Kornblume), Cichorium intybus (Wegwarte), Cynara scolymus (Artischocke), Helianthus annus (Sonnenblume), Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta (Salat), Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia (Studentenblume), Apiaceae wie die Gattung Daucus z. B. die Gattung und Art Daucus carota (Karotte), Betulaceae wie die Gattung Corylus z. B. die Gattungen und Arten Corylus avellana oder Corylus colurna (Haselnuss), Boraginaceae wie die Gattung Borago z. B. die Gattung und Art Borago officinalis (Borretsch), Brassicaceae wie die Gattungen Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis z. B. die Gattungen und Arten Brassica napus, Brassica rapa ssp. (Raps), Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis (Senf), Brassica oleracea (Futterrübe) oder Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae wie die Gattungen Anana, Bromelia (Ananas) z. B. die Gattungen und Arten Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa (Ananas), Caricaceae wie die Gattung Carica wie die Gattung und Art Carica papaya (Papaya), Cannabaceae wie die Gattung Cannabis wie die Gattung und Art Cannabis sative (Hanf), Convolvulaceae wie die Gattungen Ipomoea, Convolvulus z. B. die Gattungen und Arten Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus (Süßkartoffel, Batate), Chenopodiaceae wie die Gattung Beta wie die Gattungen und Arten Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta (Zuckerrübe), Cucurbitaceae wie die Gattung Cucubita z. B. die Gattungen und Arten Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata (Kürbis), Elaeagnaceae wie die Gattung Elaeagnus z. B. die Gattung und Art Olea europaea (Olive), Ericaceae wie die Gattung Kalmia z. B. die Gattungen und Arten Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida (Berglorbeer), Euphorbiaceae wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus z. B. die Gattungen und Arten Manihot utilissima, Janipha manihot,, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta (Manihot) oder Ricinus communis (Rizinus), Fabaceae wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja z. B. die Gattungen und Arten Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile (Erbse), Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck Acacia macrophylla, Albizia lebbek Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck Mimosa speciosa (Seidenbaum), Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia (Alfalfa) Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max (Sojabohne), Geraniaceae wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum z. B. die Gattungen und Arten Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois (Kokusnuss), Gramineae wie die Gattung Saccharum z. B. die Gattung und Art Saccharum officinarum, Juglandaceae wie die Gattungen Juglans, Wallia z. B. die Gattungen und Arten Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra (Walnuss), Lauraceae wie die Gattungen Persea, Laurus z. B. die Gattungen und Arten Laurus nobilis (Lorbeer), Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea (Avocado), Leguminosae wie die Gattung Arachis z. B. die Gattung und Art Arachis hypogaea (Erdnuss), Linaceae wie die Gattungen Linum, Adenolinum z. B. die Gattungen und Arten Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum (Lein), Lythrarieae wie die Gattung Punica z. B. die Gattung und Art Punica granatum (Granatapfel), Malvaceae wie die Gattung Gossypium z. B. die Gattungen und Arten Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi (Baumwolle), Musaceae wie die Gattung Musa z. B. die Gattungen und Arten Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. (Banane), Onagraceae wie die Gattungen Camissonia, Oenothera z. B. die Gattungen und Arten Oenothera biennis oder Camissonia brevipes (Nachtkerze), Palmae wie die Gattung Elaeis z. B. die Gattung und Art Elaeis guineensis (Ölpalme), Papaveraceae wie die Gattung Papaver z. B. die Gattungen und Arten Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium (Mohn), Pedaliaceae wie die Gattung Sesamum z. B. die Gattung und Art Sesamum indicum (Sesam), Piperaceae wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia z. B. die Gattungen und Arten Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata (Cayennepfeffer), Poaceae wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum, z. B. die Gattungen und Arten Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum (Gerste), Secale cereale (Roggen), Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida (Hafer), Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum (Hirse), Oryza sativa, Oryza latifolia (Reis), Zea mays (Mais) Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare (Weizen), Porphyridiaceae wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia z. B. die Gattung und Art Porphyridium cruentum, Proteaceae wie die Gattung Macadamia z. B. die Gattung und Art Macadamia intergrifolia (Macadamia), Rubiaceae wie die Gattung Coffea z. B. die Gattungen und Arten Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica (Kaffee), Scrophulariaceae wie die Gattung Verbascum z. B. die Gattungen und Arten Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus (Königskerze), Solanaceae wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon z. B. die Gattungen und Arten Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens (Pfeffer), Capsicum annuum (Paprika), Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris (Tabak), Solanum tuberosum (Kartoffel), Solanum melongena (Aubergine) Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum (Tomate), Sterculiaceae wie die Gattung Theobroma z. B. die Gattung und Art Theobroma cacao (Kakao) oder Theaceae wie die Gattung Camellia z. B. die Gattung und Art Camellia sinensis (Tee).

In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahren werden als Nutzpflanzen Ölfruchtpflanzen verwendet, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Saflor (Carthamus tinctoria), Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss oder Walnuss) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Vorteilhafte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Lein, Soja, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Besonders bevorzugt sind Pflanzen, die reich an C18:2- und/oder C18:3-Fettsäuren sind, wie Sonnenblume, Färberdistel, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein, Hanf oder Distel. Ganz besonders bevorzugt sind Pflanzen wie Färberdistel, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein oder Hanf.

Es ist auch vorteilhaft, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in den Blättern von Futter- oder Nahrungspflanzen zu exprimieren und dadurch den Gehalt der Blätter an Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure zu steigern. Bevorzugte Futterpflanzen sind z. B. Kleearten wie Rotklee (Trifolium pratense), Weißklee (Trifolium repens), Bastardklee (Trifolium hybridum), Esparsette (Onobrychis viciifolia), Alexandrinerklee (Trifolium alexandrinum) und Perserklee (Trifolium resupinatum). Bevorzugte Nahrungspflanzen sind etwa Salatarten wie Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis und Valeriana locusta.

Durch die enzymatische Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-6-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase- und/oder Δ-5-Elongase-Aktivität kodieren, vorteilhaft in Kombination mit Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase- und/oder Δ-4-Desaturase-Aktivität kodieren, sowie weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie weiteren Polypeptiden mit Δ-5-, Δ-6-, Δ-8-, Δ-12-Desaturase- oder Δ-5-, Δ-6-oder Δ-9-Elongaseaktivität kodieren, können unterschiedlichste mehrfach ungesättigte Fettsäuren im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Je nach Auswahl der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Nutzpflanzen lassen sich Mischungen der verschiedenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren oder einzelne mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie EPA, DPA oder DHA in freier oder gebundener Form herstellen. Je nachdem welche Fettsäurezusammensetzung in der Ausgangspflanze vorherrscht (C18:2- oder C18:3-Fettsäuren) entstehen so Fettsäuren, die sich von C18:2-Fettsäuren ableiten, wie GLA, DGLA oder ARA oder Fettsäuren, die sich von C18:3-Fettsäuren ableiten, wie EPA, DPA oder DHA. Liegt in der für das Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur Linolsäure (= LA, C18:2^Δ9,12) vor, so können als Produkte des Verfahrens nur GLA, DGLA und ARA entstehen, die als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können.

Ist in der im Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur α-Linolensäure (= ALA, C18:3^Δ9,12,15)vorhanden, beispielsweise wie in Lein, so können als Produkte des Verfahrens nur SDA, ETA, EPA, DPA und/oder DHA entstehen, die wie oben beschrieben als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Durch Modifikation der Aktivität der im Verfahren verwendeten und an der Synthese beteiligten Enzyme Δ-6-Elongase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase vorteilhaft in Kombination mit weiteren Genen des Lipid- oder Fettsäurestoffwechsels lassen sich gezielt in den Pflanzen nur einzelne Produkte herstellen. Vorteilhaft werden nur EPA, DPA oder DHA oder deren Mischungen synthetisiert. Da die Fettsäuren in Biosyntheseketten synthetisiert werden, liegen die jeweiligen Endprodukte nicht als Reinsubstanzen in den Organismen vor. Es sind immer auch geringe Mengen der Vorläuferverbindungen im Endprodukt enthalten. Diese geringen Mengen betragen weniger als 20 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 15 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 10 Gew.-%, ganz besonders vorteilhaft weniger als 5, 4, 3, 2 oder 1 Gew.-% bezogen auf die Endprodukte EPA, DPA oder DHA oder deren Mischungen.

Zur Steigerung der Ausbeute im beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem vorteilhaft erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist es vorteilhaft, die Menge an Ausgangsprodukt für die Fettsäuresynthese zu steigern. Dies kann beispielsweise durch das Einbringen einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit Δ-12-Desaturase kodiert, in den Organismus erreicht werden. Dies ist besonders vorteilhaft in Nutzpflanzen, wie Öl-produzierenden Pflanzen wie Pflanzen der Familie der Brassicaceae wie der Gattung Brassica z. B. Raps; der Familie der Elaeagnaceae wie die Gattung Elaeagnus z. B. die Gattung und Art Olea europaea oder der Familie Fabaceae wie der Gattung Glycine z. B. die Gattung und Art Glycine max, die einen hohen Ölsäuregehalt aufweisen. Da diese Organismen nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen (Mikoklajczak et al. (1961) Journal of the American Oil Chemical Society 38: 678–681) ist die Verwendung der genannten Δ-12-Desaturasen zur Herstellung des Ausgangsprodukts Linolsäure aus Ölsäure vorteilhaft. Daneben können die Ausgangsfettsäuren auch von außen zugefüttert werden, was aber aus Kostengründen weniger bevorzugt ist.

Moose und Algen sind die einzigen bekannten Pflanzensysteme, die erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie Arachidonsäure (ARA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaensäure (DHA) herstellen. Moose enthalten PUFAs in Membranlipiden, während Algen, algenverwandte Organismen und einige Pilze auch nennenswerte Mengen an PUFAs in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen sich Nukleinsäuremoleküle, die aus solchen Stämmen isoliert werden, die PUFAs auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren, besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren und damit zur Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems in einer Pflanze, wie einer Nutzpflanze wie einer Ölfruchtpflanze, beispielsweise Raps, Canola, Lein, Hanf, Soja, Sonnenblumen, Borretsch. Sie sind deshalb vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar.

Im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuren stammen vorteilhaft aus Pflanzen wie Algen, beispielsweise Algen der Familie der Prasinophyceae wie aus den Gattungen Heteromastix, Mammella, Mantoniella, Micromonas, Nephroselmis, Ostreococcus, Prasinocladus, Prasinococcus, Pseudoscourfielda, Pycnococcus, Pyramimonas, Scherffelia oder Tetraselmis wie den Gattungen und Arten Heteromastix longifillis, Mamiella gilva, Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis olivacea, Nephroselmis pyriformis, Nephroselmis rotunda, Ostreococcus tauri, Ostreococcus sp. Prasinocladus ascus, Prasinocladus lubricus, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas amylifera, Pyramimonas disomata, Pyramimonas obovata, Pyramimonas orientalis, Pyramimonas parkeae, Pyramimonas spinifera, Pyramimonas sp., Tetraselmis apiculata, Tetraselmis carteriaformis, Tetraselmis chui, Tetraselmis convolutae, Tetraselmis desikacharyi, Tetraselmis gracilis, Tetraselmis hazeni, Tetraselmis impellucida, Tetraselmis inconspicua, Tetraselmis levis, Tetraselmis maculata, Tetraselmis marina, Tetraselmis striata, Tetraselmis subcordiformis, Tetraselmis suecica, Tetraselmis tetrabrachia, Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Tetraselmis verrucosa fo. rubens oder Tetraselmis sp. oder aus Algen der Familie Euglenaceae wie aus den Gattungen Ascoglena, Astasia, Colacium, Cyclidiopsis, Euglena, Euglenopsis, Hyalophacus, Khawkinea, Lepocinclis, Phacus, Strombomonas oder Trachelomonas wie die Gattungen und Art Euglena acus, Euglena geniculata, Euglena gracilis, Euglena mixocylindracea, Euglena rostrifera, Euglena viridis, Colacium stentorium, Trachelomonas cylindrica oder Trachelomonas volvocina.

Weitere vorteilhafte Pflanzen sind Algen wie Isochrysis oder Crypthecodinium, Algen/Diatomeen wie Thalassiosira oder Phaeodactylum, Moose wie Physcomitrella oder Ceratodon oder höheren Pflanzen wie den Primulaceae wie Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Mikroorganismen wie Pilzen wie Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor oder Mortierella, Bakterien wie Shewanella, Hefen oder Tiere wie Nematoden wie Caenorhabditis, Insekten, Frösche, Seegurken oder Fische. Vorteilhaft stammen die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenzen aus einem Tier aus der Ordnung der Vertebraten. Bevorzugt stammen die Nukleinsäuresequenzen aus der Klasse der Vertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae bzw. Oncorhynchus oder Vertebrata, Amphibia, Anura, Pipidae, Xenopus oder Evertebrata wie Protochordata, Tunicata, Holothuroidea, Cionidae wie Amaroucium constellatum, Botryllus schlosseri, Ciona intestinalis, Molgula citrina, Molgula manhattensis, Perophora viridis oder Styela partita. Besonders vorteilhaft stammen die Nukleinsäuren aus Pilzen, Tieren oder aus Pflanzen wie Algen oder Moosen, bevorzugt aus der Ordnung der Salmoniformes wie der Familie der Salmonidae wie der Gattung Salmo beispielsweise aus den Gattungen und Arten Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta oder Salmo trutta fario, aus Algen wie den Gattungen Mantoniella oder Ostreococcus oder aus den Diatomeen wie den Gattungen Thalassiosira oder Phaeodactylum oder aus Algen wie Crypthecodinium.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Zelle oder einer ganzen Pflanze, die die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase, Δ-5-Desaturase und/oder Δ-5-Elongase sowie ggf. Nukleinsäuresequenzen, die für eine ω-3-Desaturase und/oder eine Δ-4-Desaturase kodieren, enthält, wobei die Zelle und/oder die Nutzpflanze noch weitere Nukleinsäuresequenzen des Lipid- oder Fettsäurestoffwechsels enthalten kann. Die im Verfahren bevorzugt verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden zur Expression vorteilhaft in mindestens ein Genkonstrukt und/oder einen Vektor wie nachfolgend beschrieben, allein oder in Kombination mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels kodieren, eingebaut und schließlich in die Zelle oder Pflanze transformiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus den Nutzpflanzen. Die so hergestellte Zelle oder die so hergestellte Nutzpflanze ist vorteilhaft eine Zelle einer Öl-produzierenden Pflanze, Gemüse-, Salat-, oder Zierpflanze oder die Pflanze selbst wie oben ausgeführt.

Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung im Falle von Pflanzenzellen, -gewebe oder -organe auf oder in einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Ackerboden zu verstehen.

"Transgen" bzw. "rekombinant" im Sinne der Erfindung bedeutet bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette (= Genkonstrukt) oder einem Vektor enthaltend die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen oder einer mit den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassette oder Vektor transformierten Pflanze alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder

a) die Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine mit der Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
c) (a) und (b)

nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen genomischen bzw. chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette -beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz mit der Nukleinsäuresequenz, die für Proteine mit entsprechender Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase- und Δ-5-Elongase-Aktivität kodiert, vorteilhaft in Kombination mit Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine mit ω-3-Desaturase- und/oder Δ-4-Desaturase-Aktivität kodieren – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise beschrieben in US 5,565,350 oder WO 00/15815.

Unter "transgener Pflanze" im Sinne der Erfindung ist wie vorgenannt zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom der Pflanze sind. Dabei können die Nukleinsäuresequenzen homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom der Pflanze sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an nicht-natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuresequenzen liegt vor.

Bevorzugte transgene Organismen sind Nutzpflanzen wie Öl-produzierende Pflanzen, Gemüse-, Salat- oder Zierpflanzen, die vorteilhaft ausgewählt sind aus der Gruppe der Pflanzenfamilien bestehend aus den Familien der Aseraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Arecaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Cannaceae, Caprifoliaceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Fagaceae, Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Moraceae, Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Poaceae, Polygonaceae, Punicaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae und Valerianaceae.

Als Wirtspflanzen für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die Expressionskassette oder den Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Nutzpflanzen, die in der Lage sind Fettsäuren, speziell ungesättigte Fettsäuren, zu synthetisieren bzw. die für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien an dieser Stelle Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Nutzpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, FärberSaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne genannt. Weitere vorteilhafte Pflanzen sind an anderer Stelle dieser Anmeldung aufgeführt.

Für die Herstellung der transgenen Nutzpflanze werden in der Regel als Zwischenwirte Mikroorganismen verwendet. Derartige nutzbare Zwischenwirtszellen werden in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) genannt.

Vorteilhaft verwendbare Expressionsstämme für diesen Zweck sind z. B. solche, die eine geringe Proteaseaktivität aufweisen. Sie werden z. B. in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119–128 beschrieben.

Transgene Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten mehrfach ungesättigten, langekettigen Fettsäuren enthalten, können vorteilhaft direkt vermarktet werden, ohne dass die synthetisierten Öle, Lipide oder Fettsäuren isoliert werden müssen. Diese Form der Vermarktung ist besonders vorteilhaft.

Bei den "Pflanzen" im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ganze Pflanzen sowie alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze ableiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Pflanzen in Form ihrer Öle, Fett, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte mehrfach ungesättigte Fettsäuren lassen sich durch Ernten der Pflanzen oder Pflanzenzellen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld gewinnen. Dies kann über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile, bevorzugt der Pflanzensamen, erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch so genanntes Kaltschlagen oder Kaltpressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile, speziell die Samen, leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst oder mit Lösungsmittel wie warmem Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Auf diese Weise können mehr als 96% der im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen, werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf desodoriert.

Vorzugsweise sind die durch dieses Verfahren produzierten PUFAs bzw. LCPUFAs C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuremoleküle mit mindestens vier Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise fünf oder sechs Doppelbindungen. Diese C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuremoleküle lassen sich aus der Pflanze in Form eines Öls, Lipids oder einer freien Fettsäure isolieren. Geeignete transgene Pflanzen sind beispielsweise die vorstehend erwähnten.

Diese erfindungsgemäßen Öle, Lipide oder Fettsäuren enthalten wie oben beschrieben vorteilhaft 6 bis 15% Palmitinsäure, 1 bis 6% Stearinsäure; 7–85% Ölsäure; 0,5 bis 8% Vaccensäure, 0,1 bis 1% Arachinsäure, 7 bis 25% gesättigte Fettsäuren, 8 bis 85% einfach ungesättigte Fettsäuren und 60 bis 85% mehrfach ungesättigte Fettsäuren jeweils bezogen auf 100% und auf den Gesamtfettsäuregehalt der Pflanzen.

Als vorteilhafte mehrfach ungesättigte, langkettige Fettsäuren sind in den Fettsäureestern bzw. Fettsäuregemischen wie Phosphatidylfettsäureestern oder Triacylglyceridestern bevorzugt mindestens 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19 oder 20 Gew.-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt an Eicosapentaensäure und/oder mindestens 1; 2; 3; 4; 5 oder 6 Gew.-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt an Docosapentaensäure und/oder mindestens 1; 2; 3; bevorzugt mindestens 4; 5; 6; besonders bevorzugt mindestens 7 oder 8 und am meisten bevorzugt mindestens 9 oder 10 Gew.-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt an Docosahexaensäure enthalten.

Weiterhin enthalten die Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopentendodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,11-dienonsäure), Vernonsäure (9,10-Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10-Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14-Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6-Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c-Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t11t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c11t13t-Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c-Octadecatriensäure), Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12-Hydroxyölsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy-9c,11t-Octadecadienonsäure). Die vorgenannten Fettsäuren kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemischen in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt sie kommen bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 30%, bevorzugt zu weniger als 25%, 24%, 23%, 22% oder 21%, besonders bevorzugt zu weniger als 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% oder 5%, ganz besonders bevorzugt zu weniger als 4%, 3%, 2% oder 1% vor. In einer weiteren bevorzugten Form der Erfindung kommen diese vorgenannten Fettsäuren bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6%; oder 0,5%, besonders bevorzugt zu weniger als 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1% vor. Vorteilhaft enthalten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1% bezogen auf die Gesamtfettsäuren und/oder keine Buttersäure, kein Cholesterin sowie keine Nisinsäure.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung der Öle, Lipide, der Fettsäuren und/oder der Fettsäurezusammensetzung, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika. Die im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen tierischen Ursprungs wie z. B. Fischölen verwendet werden. Auch diese so hergestellten Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische, die aus pflanzlichen und tierischen Bestandteilen bestehen, können zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika verwendet werden.

Unter dem Begriff "Öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte und/oder gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl, Lipid oder Fett einen hohen Anteil an mehrfach ungesättigten freien oder vorteilhaft veresterten Fettsäure(n), insbesondere Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30%, besonders bevorzugt ist ein Anteil von 50%, am meisten bevorzugt ist ein Anteil von 60%, 70%, 80% oder mehr. Der Anteil an Fettsäure kann nach Überführung der Fettsäuren in die Methylester durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl, Lipid oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z. B. Calendulasäure, Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, Ölsäure etc., enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.

Bei den im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens drei, vier, fünf oder sechs, besonders vorteilhaft mit fünf oder sechs Doppelbindungen, handelt es sich wie oben beschrieben vorteilhaft um Fettsäureester beispielsweise um Sphingolipidester, Phosphoglyceridester, Lipidester, Glycolipidester, Phospholipidester, Monoacylglycerinester, Diacylglycerinester, Triacylglycerinester oder sonstige Fettsäureester, bevorzugt handelt es sich um Phospholipidester und/oder Triacylglycerinester.

Aus den so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigte Fettsäureestern mit vorteilhaft mindestens drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen lassen sich die enthaltenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung, beispielsweise mit wäßriger KOH oder NaOH, oder durch saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließende Ansäuerung mit z. B. H₂SO₄. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.

Als Substrate der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase- und/oder Δ-5-Elongase-Aktivität sowie ggf. Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase- und/oder Δ-4-Desaturase-Aktivität kodieren, und/oder den weiteren verwendeten Nukleinsäuren wie den Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenase(n), Lipoxygenase(n), Triacylglycerol-Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n) oder Fettsäure-Elongase(n) kodieren, eignen sich vorteilhaft C₁₆-, C₁₈- oder C₂₀-Fettsäuren. Bevorzugt werden die im Verfahren als Substrate umgesetzten Fettsäuren in Form ihrer Acyl-CoA-Ester und/oder ihrer Phospholipid-Ester umgesetzt.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen langkettigen PUFAs müssen die gesättigten, einfach ungesättigten C₁₆-Fettsäuren und/oder mehrfach ungesättigten C₁₈-Fettsäuren zunächst je nach Substrat durch die enzymatische Aktivität einer Desaturase und/oder Elongase desaturiert und/oder elongiert oder nur desaturiert und anschließend über eine Elongase um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängert werden. Nach einer Elongationsrunde führt diese Enzymaktivität entweder ausgehend von C₁₆-Fettsäuren zu C₁₈-Fettsäuren oder ausgehend von C₁₈-Fettsäuren zu C₂₀-Fettsäuren, und nach zwei Elongationsrunden ausgehend von C₁₆-Fettsäuren zu C₂₀-Fettsäuren. Die Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Desaturasen und Elongasen führt vorzugsweise zu C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren vorteilhaft mit mindestens zwei oder drei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt zu C₂₂-Fettsäuren mit mindestens fünf Doppelbindungen im Fettsäuremolekül. Besonders bevorzugt als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure. Die C₁₈-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure können durch die erfindungsgemäße enzymatische Aktivität in Form der freien Fettsäure oder in Form der Ester, wie Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide, Phosphoglyceride, Monoacylglycerin, Diacylglycerin oder Triacylglycerin, verlängert werden.

Der bevorzugte Biosyntheseort von Fettsäuren, Ölen, Lipiden oder Fette in den vorteilhaft verwendeten Pflanzen ist beispielsweise im allgemeinen der Samen oder Zellschichten des Samens, so dass eine samenspezifische Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, dass die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden nicht auf das Samengewebe beschränkt sein muss, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze – beispielsweise in Epidermiszellen oder in den Knollen – gewebespezifisch erfolgen kann. Vorteilhaft findet die Synthese gemäß des erfinderischen Verfahrens im vegetativen (somatischen) Gewebe statt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den im Verfahren verwendeten Pflanzen prinzipiell auf zwei Arten erhöht werden. Es kann vorteilhaft der Pool an freien mehrfach ungesättigten Fettsäuren und/oder der Anteil der über das Verfahren hergestellten veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren erhöht werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den transgenen Pflanzen erhöht, vorteilhaft in Form der Phosphatidylester und/oder Triacylester.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sequenzen werden einzeln in Expressionskonstrukte kloniert oder auf einem gemeinsamen rekombinanten Nukleinsäuremolekül bereitgestellt und zum Einbringen und zur Expression in Organismen verwendet. Diese Expressionskonstrukte ermöglichen eine optimale Synthese der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren.

Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren können nach Einbringung in eine Pflanze oder Pflanzenzelle entweder auf einem separaten Plasmid liegen oder vorteilhaft in das Genom der Wirtszelle integriert sein. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funktionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuresequenzen über Multiexpressionskassetten oder Konstrukte zur multiparallelen Expression in die Pflanzen gebracht, d. h. die Nukleinsäuresequenzen liegen in einer gemeinsamen Expressionseinheit vor.

Es kann im Nukleinsäurekonstrukt mehr als eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Δ-12-Desaturase, Δ-4-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase und/oder ω-3-Desaturase enthalten sein. Es können auch mehrere Kopien einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Δ-12-Desaturase, Δ-4-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase und/oder ω-3-Desaturase enthalten sein.

Zum Einbringen werden die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren vorteilhaft einer Amplifikation und Ligation in bekannter Weise unterworfen. Vorzugsweise geht man in Anlehnung an das Protokoll der Pfu-DNA-Polymerase oder eines Pfu/Taq-DNA-Polymerasegemisches vor. Die Primer werden in Anlehnung an die zu amplifizierende Sequenz gewählt. Zweckmäßigerweise sollten die Primer so gewählt werden, dass das Amplifikat die gesamte kodogene Sequenz vom Start- bis zum Stop-Kodon umfasst. Im Anschluss an die Amplifikation wird das Amplifikat zweckmäßigerweise analysiert. Beispielsweise kann die Analyse nach gelelektrophoretischer Auftrennung hinsichtlich Qualität und Quantität erfolgen. Im Anschluss kann das Amplifikat nach einem Standardprotokoll gereinigt werden (z. B. Qiagen). Ein Aliquot des gereinigten Amplifikats steht dann für die nachfolgende Klonierung zur Verfügung. Geeignete Klonierungsvektoren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Hierzu gehören insbesondere Vektoren, die in mikrobiellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierung in Hefen oder Pilze gewährleisten, und die die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen. Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignete, binäre und co-integrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakteriumvermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzende Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al. (2000) Trends in Plant Science 5: 446–451. Für die Vektorpräparation können die Vektoren zunächst mit Restriktionsendonuklease(n) linearisiert und dann in geeigneter Weise enzymatisch modifiziert werden. Im Anschluss wird der Vektor gereinigt und ein Aliquot für die Klonierung eingesetzt. Bei der Klonierung wird das enzymatisch geschnittene und erforderlichenfalls gereinigte Amplifikat mit ähnlich präparierten Vektorfragmenten unter Einsatz von Ligase kloniert. Dabei kann ein bestimmtes Nukleinsäurekonstrukt bzw. Vektor- oder Plasmidkonstrukt einen oder auch mehrere kodogene Genabschnitte aufweisen. Vorzugsweise sind die kodogenen Genabschnitte in diesen Konstrukten mit regulatorischen Sequenzen funktional verknüpft. Zu den regulatorischen Sequenzen gehören insbesondere pflanzliche Sequenzen wie die oben beschriebenen Promotoren und Terminatoren. Die Konstrukte lassen sich vorteilhafterweise in Mikroorganismen, insbesondere Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens, unter selektiven Bedingungen stabil propagieren und ermöglichen so einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen.

Unter der vorteilhaften Verwendung von Klonierungsvektoren können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen und Nukleinsäurekonstrukte in Mikroorganismen und danach in Pflanzen eingebracht werden und damit bei der Pflanzentransformation verwendet werden, wie denjenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. (1991) 42: 205–225. Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren lassen sich damit zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese bessere und/oder effizientere Produzenten von LCPUFAs werden.

Durch das Einbringen eines Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase- und Δ-5-Elongase-Genes in eine Pflanze allein oder in Kombination mit anderen Genen kann nicht nur der Biosynthesefluss zum Endprodukt erhöht, sondern auch die entsprechende Triacylglycerin- und/oder Phosphatidylester-Zusammensetzung erhöht oder de novo geschaffen werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import von Nährstoffen, die zur Biosynthese einer oder mehrerer Fettsäuren, Ölen, polaren und/oder neutralen Lipiden nötig sind, erhöht sein, so dass die Konzentration dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen innerhalb der Zellen oder innerhalb des Speicherkompartiments erhöht ist, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von PUFAs, wie im Folgenden beschrieben, weiter gesteigert wird. Durch Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl eines oder mehrerer der Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase- und/oder Δ-5-Elongase-Gene, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Zerstören der Aktivität einer oder mehrerer Gene, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Organismen und vorteilhaft aus Pflanzen zu steigern.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle kodieren für Proteine oder Teile von diesen, wobei die Proteine oder das einzelne Protein oder Teile davon eine Aminosäuresequenz enthält, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz ist, die in den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 und ggf. SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 12 dargestellt ist, so dass die Proteine oder Teile davon noch eine Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase- und/oder Δ-5-Elongase-Aktivität sowie ggf. eine Δ-4-Desaturase- und/oder ω-3-Desaturase-Aktivität aufweisen. Vorzugsweise haben die Proteine oder Teile davon, die von dem Nukleinsäuremolekül/den Nukleinsäuremolekülen kodiert wird/werden, noch seine/ihre wesentliche enzymatische Aktivität und die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen oder Lipidkörperchen in Organismen vorteilhaft in Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen. Vorteilhaft sind die von den Nukleinsäuremolekülen kodierten Proteine zu mindestens etwa 60% und bevorzugt mindestens etwa 70%, 80% oder 90% und besonders bevorzugt mindestens etwa 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr identisch zu den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen. Im Sinne der Erfindung ist unter Homologie oder homolog, Identität oder identisch zu verstehen.

Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Für den Vergleich verschiedener Sequenzen stehen dem Fachmann eine Reihe von Programmen zur Verfügung, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution (1987) 25: 351–360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151–153) oder die Programme Gap und BestFit (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453 und Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482–489), die im GCG Software-Packet (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)) enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 und Average Mismatch: 0.000. Diese Einstellungen wurden, falls nicht anders angegeben, immer als Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet.

Unter wesentlicher enzymatischer Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten ω-3-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase, Δ-5-Elongase, Δ-4-Desaturase und/oder Δ-5-Desaturase ist zu verstehen, dass sie im Vergleich zu den durch die Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 kodierten Proteinen/Enzymen noch eine enzymatische Aktivität von mindestens 10%, bevorzugt von mindestens 20%, besonders bevorzugt von mindestens 30% und am meisten bevorzugt von mindestens 40, 50 oder 60% aufweisen und damit am Stoffwechsel von zum Aufbau von Fettsäuren, vorteilhaft Fettsäureestern wie Phosphatidylestern und/oder Triacylglyceridestern, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über Membranen teilnehmen können.

Vorteilhaft im Verfahren verwendbare Nukleinsäuren stammen aus Bakterien, Pilzen, Diatomeen, Tieren wie Caenorhabditis oder Oncorhynchus oder Pflanzen wie Algen oder Moosen wie den Gattungen Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Pytium irregulare, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, speziell aus den Gattungen und Arten Pytium irregulare, Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis, Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans oder besonders vorteilhaft aus Pytium irregulare, Thraustochytrium sp. und/oder Ostreococcus tauri.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können zusätzlich Nukleotidsequenzen verwendet werden, die für eine Δ-12-Desaturase, Δ-9-Elongase oder Δ-8-Desaturase kodieren. Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden vorteilhaft in einer Expressionskassette, die die Expression der Nukleinsäuren in Pflanzen ermöglicht, eingebracht.

Die Nukleinsäuresequenzen, die für die Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase, Δ-9-Elongase, Δ-6-Desaturase, Δ-8-Desaturase, Δ-6-Elongase, Δ-5-Desaturase, Δ-5-Elongase oder Δ-4-Desaturase kodieren, werden mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Pflanze bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Vorteilhaft werden Sequenzen für die Expression verwendet, die eine konstitutive Expression ermöglichen, wie der CaMV35S-, CaMV36S-, CaMV35Smas-, nos-, mas-, ubi-, stpt-, lea- oder Super-Promotor. Bevorzugt erfolgt die Expression im vegetativen Gewebe wie oben beschrieben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Expression im Samen.

Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu den Regulationssequenzen, die in ihrem natürlichen Locus nicht mit den Nukleinsäuresequenzen verknüpft sind, oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht ist. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "Enhancer-Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Vorteilhafte Terminatoren sind beispielweise virale Terminatoren wie der 35S-Terminator oder andere. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene in der Expressionskassette vor. Dieses Genkonstrukt oder die Genkonstrukte können gleichzeitig oder nacheinander in die Pflanze eingebracht werden und zusammen im Wirtsorganismus exprimiert werden. Dabei kann das Genkonstrukt oder die Genkonstrukte in einem oder mehreren Vektoren inseriert sein und frei in der Zelle vorliegen oder aber im Genom inseriert sein. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene in die Pflanze, wenn die zu exprimierenden Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen. Es ist aber auch möglich, jeweils ein Genkonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze einzuführen und die so erhaltenen Pflanzen miteinander zu verkreuzen, um Nachkommen zu erhalten, die alle Genkonstrukte gemeinsam enthalten.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Um eine stabile Integration der Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase, Δ-5-Desaturase oder Δ-5-Elongase und ggf. für die ω-3-Desaturase oder Δ-4-Desaturase kodieren, unter der Kontrolle eines eigenen Promotors exprimiert werden. Dieser kann für jede der Sequenzen gleich oder unterschiedlich sein. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt, die vorteilhaft in einem Polylinker liegt. Hinter dem Polylinker kann ggf. ein Terminator liegen. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach, bevorzugt drei-, vier-, fünf- oder sechsmal, so dass bis zu sechs Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Die Nukleinsäuresequenzen werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäuresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator. Es ist aber auch möglich, mehrere Nukleinsäuresequenzen hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Nukleinsäuresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass durch die die Position die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette in einer vorteilhaften Ausführungsform unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, LegB4 oder DC3-Promotor und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können auch identische Promotoren wie der CaMV35S-Promotor verwendet werden.

Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeignete Terminatoren am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesegene (hinter dem Stopcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann hier z. B. der OCS1- oder der 35SCaMV-Terminator. Wie auch für die Promotoren, sollten hier für jedes Gen unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.

Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtspflanzen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthalten sein oder aber diese Gene können auf einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenase(n), Lipoxygenase(n), Triacylglycerol-Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n) oder Fettsäure-Elongase(n) oder Kombinationen davon verwendet. Besonders vorteilhafte Nukleinsäuresequenzen sind Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe der Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase, Δ-8-Desaturase, Δ-9-Desaturase, Δ-12-Desaturase und/oder Δ-9-Elongase. Dabei können die vorgenannten Nukleinsäuren bzw. Gene in Kombination mit anderen Elongasen und Desaturasen in Expressionskassetten, wie den vorgenannten, kloniert werden und zur Transformation von Pflanzen mit Hilfe von Agrobakterium eingesetzt werden.

Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff "Vektor" steht für ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z. B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung). Andere Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch auch andere Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.

Die im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren umfassen die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen oder das oben beschriebene Genkonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der verwendeten Nukleinsäuren in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, die auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt ist und die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfasst. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz ermöglicht wird und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z. B. in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird). Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, einschließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Ausmaß der Expression des Proteins, usw. abhängen kann.

Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen so gestaltet sein, dass sie in prokaryotische Zwischenwirte transformiert werden können und schließlich nach Einbringung in die Pflanzen die Expression der Gene in diesen ermöglichen. Dies ist vorteilhaft, da häufig Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheit halber in Mikroorganismen durchgeführt werden. Beispielsweise können die Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase- und/oder Δ-5-Elongase-Gene in bakteriellen Zellen, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M. A., et al. (1992) Yeast 8: 423–488; van den Hondel, C. A. M. J. J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsgb., S. 396–428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F., et al., Hrsgb., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology.1: (3): 239–251), Ciliaten, mit Vektoren nach einem Transformationsverfahren, wie beschrieben in WO 98/01572, sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.: 583–586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–43; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225 (und darin zitierte Literaturstellen)) exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-Regulationssequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.

Die Expression von Proteinen in Prokaryonten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression von Fusions- oder nicht-Fusionsproteinen steuern. Typische Fusions-Expressionsvektoren sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B., und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.

Beispiele für geeignete induzierbare nicht-Fusions-E. coli-Expressionsvektoren sind u.a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusions-Promotor, die von einer koexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.

Andere in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, diese Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 or pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667.

Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturasec 1 (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113–123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsgb., S. 396–428: Academic Press: San Diego). Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23.

Alternativ können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z. B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39).

Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Auch können die im Verfahren verwendeten Gen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1 (3): 239–251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z. B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele fü Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38.

Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3. 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet.

Da die Regulation der Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf die Transkriptionsebene beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbundene Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Research 15: 8693–8711).

Die Pflanzengenexpression muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression steuert. Vorteilhaft nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. (1989) 8: 2195–2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al. (1980) Cell 21: 285–294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.

Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen; notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode (1996) Crit. Rev. Plant Sci. 15 (4): 285–423 und darin zitierte Literaturstellen).

Vektor-DNA lässt sich in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", Konjugation und Transduktion, wie hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäuren (z. B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Kopräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.

Der Begriff "Nukleinsäure(molekül)", wie hier verwendet, umfasst in einer vorteilhaften Ausführungsform zudem die am 3'- und am 5'-Ende des kodierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens 500, bevorzugt 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes des kodierenden Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes des kodierenden Genbereichs. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (z. B. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden). Bei verschiedenen Ausführungsformen kann das im Verfahren vewendete isolierte Δ-6- Desaturase-, Δ-6-Elongase- oder Δ-5-Desaturase- sowie ggf. das ω-3-Desaturase- oder Δ-4-Desaturase-Molekül zum Beispiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt, flankieren.

Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle können unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch kann mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA- oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese können als Hybridisierungssonde in Standard-Hybridisierungstechniken (wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zur Isolierung weiterer im Verfahren nützlicher Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Überdies lassen sich die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle oder Teile von diesen durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon verwendet werden (z. B. kann ein Nukleinsäuremolekül umfassend die vollständige Sequenz oder einen Teil davon durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind). Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (z. B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294–5299) und cDNA mittels Reverser Transkriptase (z. B. Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 gezeigten Sequenzen oder mit Hilfe der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern nach Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide können durch Standard-Syntheseverfahren, beispielsweise mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.

Homologe der verwendeten Δ-5-Elongase-, ω-3-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-Δ-4-Desaturase- oder Δ-5-Desaturase-Nukleinsäuresequenzen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 bedeutet beispielsweise allelische Varianten mit mindestens etwa 40, 50 oder 60%, vorzugsweise mindestens etwa 60 oder 70%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 oder 80%, 90% oder 95% und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Identität bzw. Homologie zu einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 gezeigten Nukleotidsequenzen oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga oder Teilen davon. Weiterhin sind isolierte Nukleinsäuremoleküle einer Nukleotidsequenz umfasst, die an eine der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 gezeigten Nukleotidsequenzen oder einen Teil davon, z. B. unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Unter einem Teil gemäß der Erfindung ist dabei zu verstehen, dass mindestens 25 Basenpaare (= bp), 50 bp, 75 bp, 100 bp, 125 bp oder 150 bp, bevorzugt mindestens 175 bp, 200 bp, 225 bp, 250 bp, 275 bp oder 300 bp, besonders bevorzugt 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp oder mehr Basenpaare für die Hybridisierung verwendet werden. Es kann auch vorteilhaft die Gesamtsequenz verwendet werden. Allelische Varianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz erhalten lassen, wobei aber die Enzymaktivität der davon kodierten Proteine für die Insertion im wesentlichen beibehalten wird.

Für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafte Nukleinsäuremoleküle können auf der Grundlage ihrer Homologie zu den hier offenbarten ω-3-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-4-Desaturase- und/oder Δ-6-Elongase-Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Dabei können beispielsweise isolierte Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die mindestens 15 Nukleotide lang sind und unter stringenten Bedingungen mit den Nukleinsäuremolekülen, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID No. 11 umfassen, hybridisieren. Es können auch Nukleinsäuremoleküle mit mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden verwendet werden.

Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60% homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65%, bevorzugt mindestens etwa 70% und besonders bevorzugt mindestens etwa 75% oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6. finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium chloride/sodium citrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Temperatur liegt beispielsweise unter "Standard-Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel, zum Beispiel 50% Formamid, im oben genannten Puffer vorliegt, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise 30°C bis 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise 45°C bis 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den folgenden Lehrbüchern Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.

Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei Aminosäuresequenzen (z. B. einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 12) oder von zwei Nukleinsäuren (z. B. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11) werden die Sequenzen untereinander geschrieben, um sie optimal vergleichen zu können (z. B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie", wie hier verwendet, entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität"). Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d. h. % Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen × 100). Die zur Bestimmung der Homologie verwendeten Programme bzw. Algorithmen sind oben beschrieben.

Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für eine im Verfahren verwendete ω-3-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-4-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase kodiert, die zu einer Proteinsequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 12 homolog ist, kann durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingebracht werden. Mutationen können in eine der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 11 durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten, (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einer ω-3-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-4-Desaturase oder Δ-6-Elongase wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der ω-3-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-4-Desaturase oder Δ-6-Elongase kodierenden Sequenz eingebracht werden, z. B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können nach der hier beschriebenen ω-3-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-4-Desaturase- oder Δ-6-Elongase-Aktivität durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, die die ω-3-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-4-Desaturase- oder Δ-6-Elongase-Aktivität beibehalten haben. Nach der Mutagenese kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann z. B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests bestimmt werden.

Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.

Beispiele
Beispiel 1: Allgemeine Klonierungsverfahren
Die Klonierungsverfahren wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose- und Nylon-Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli-Zellen, Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Beispiel 2: Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase-Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
Beispiel 3: Klonierung von Genen aus Ostreococcus tauri
In einer Ostreococcus tauri Sequenzdatenbank (genomische Sequenzen) konnte durch Suche nach konservierten Bereichen jeweils eine Sequenz kodierend für ein Protein mit Δ-5-Elongaseaktivität oder Δ-6-Elongase-Aktivität identifiziert werden. Es handelt sich dabei um die folgenden Sequenzen:
OtElo1.2 weist die höchste Ähnlichkeit zu einer Elongase aus Danio rerio auf (GenBank AAN77156; ca. 26% Identität), während OtElo2.1 die größte Ähnlichkeit zur Elongase aus Physcomitrella (PSE) (ca. 36% Identität) aufweist (Alignments wurden mit dem tBLASTn-Aalgorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410) durchgeführt).
Die Klonierung der Elongasen wurde wie folgt durchgeführt:
40 ml einer Ostreococcus tauri Kultur in der stationären Phase wurden abzentrifugiert und in 100 μl Aqua bidest resuspendiert und bei –20°C gelagert. Mit Hilfe des PCR-Verfahrens wurden die entsprechenden genomischen DNAs amplifiziert. Die entsprechenden Primerpaare wurden so ausgewählt, dass sie die Hefe-Konsensus-Sequenz für hocheffiziente Translation (Kozak (1986) Cell 44: 283–292) neben dem Startcodon trugen. Die Amplifizierung der OtElo-DNAs wurde jeweils mit 1 μl aufgetauten Zellen, 200 μM dNTPs, 2,5 U Taq-Polymerase und 100 pmol eines jeden Primers in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: Erste Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten sowie ein letzter Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten.
Beispiel 4: Optimierung von Elongase-Genen aus Ostreococcus tauri
Elongasen aus dem Organismus Ostreococcus tauri wurden isoliert wie in Beispiel 3 beschrieben. Um eine Steigerung des Gehalts an C22-Fettsäuren zu erreichen, wurden die Sequenzen SEQ ID No. 15 (Δ6-Elongase) und SEQ ID No. 13 (Δ5-Elongase) an die Kodonverwendung in Raps, Lein und Soja angepasst. Dazu wurde die Aminosäuresequenz der Δ6-Elongase und der Δ5-Elongase (SEQ ID NO: 16 für die Δ6-Elongase; SEQ ID NO: 2 für die Δ5-Elongase) revers translatiert, wodurch degenerierte DNA-Sequenzen erhalten wurden. Diese DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe des Programms GeneOptimizer (Fa. Geneart, Regensburg) an die Kodonverwendung in Raps, Soja und Lein angepasst, wobei die natürliche Häufigkeit einzelner Kodons berücksichtigt wurde. Die so erhaltenen optimierten Sequenzen, die in SEQ ID NO: 1 (Δ5-Elongase) und SEQ ID NO: 14 (Δ6-Elongase) angegeben sind, wurden in vitro synthetisiert.
Beispiel 5: Klonierung von Expressionsplasmiden zur heterologen Expression in Hefen
Zur Charakterisierung der Funktion der optimierten Nukleinsäuresequenzen wurden die offenen Leserahmen der jeweiligen DNAs stromabwärts des Galactose-induzierbaren GAL1-Promotors von pYES2.1/V5-His-TOPO (Invitrogen) kloniert, wodurch die Plasmide pOTE1.2 (enthaltend die Δ6-Elongase-Sequenz) und pOTE2.2 (enthaltend die Δ5-Elongase-Sequenz) erhalten wurden.
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm 334 wurde durch Elektroporation (1500 V) mit den Vektoren pOTE1.2 bzw. pOTE2.2 sowie den Vergleichskonstrukten pOTE1.1 und pOTE2.1, die die natürliche, für die Δ5-Elongase bzw. Δ6-Elongase kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten, transformiert. Als Kontrolle wurde eine Hefe verwendet, die mit dem leeren Vektor pYES2 transformiert wurde. Die Selektion der transformierten Hefen erfolgte auf Komplett-Minimalmedium (CMdum)-Agarplatten mit 2% Glucose, aber ohne Uracil. Nach der Selektion wurden je drei Transformanten zur weiteren funktionellen Expression ausgewählt.
Für die Expression der Ot-Elongasen wurden zunächst Vorkulturen aus jeweils 5 ml CMdum-Flüssigmedium mit 2% (w/v) Raffinose aber ohne Uracil mit den ausgewählten Transformanten angeimpft und 2 Tage bei 30°C, 200 rpm inkubiert. 5 ml CMdum-Flüssigmedium (ohne Uracil) mit 2% Raffinose wurden dann mit den Vorkulturen auf eine OD₆₀₀ von 0,05 angeimpft. Dabei wurde der Hefekultur, die mit pOTE1.1 und pOTE1.2 transformiert worden war, jeweils 0,2 mM γ-Linolensäure (GLA) zugegeben. Ausgehend von der Aktivität von Otelo1.1 bzw. Otelo1.2 ist eine Elongation der γ-Linolensäure zur Fettsäure 20:3 zu erwarten. Der Hefekultur, die mit pOTE2.1 und pOTE2.2 transformiert worden war, wurden jeweils 0,2 mM Arachidonsäure bzw. Eicosapentaensäure zugegeben. Entsprechend der Aktivität von Otelo2.1 bzw. Otelo2.2 ist eine Elongation der Fettsäuren ARA bzw. EPA zu den Fettsäuren 22:4 bzw. 22:5 zu erwarten. Die Expression wurde durch die Zugabe von 2% (w/v) Galaktose induziert. Die Kulturen wurden für weitere 96 h bei 20°C inkubiert.
Beispiel 6: Expression von OtELO1.2 und OtELO2.2 in Hefen
Hefen, die wie in Beispiel 5 mit den Plasmiden pYES2, pYES-OtELO1.1, pYES-OtELO1.2, pYES-OtELO2.1 und pYES-OtELO2.2 transformiert wurden, wurden folgendermaßen analysiert:
Die Hefezellen aus den Hauptkulturen wurden durch Zentrifugation (100 × g, 5 min, 20°C) geerntet und mit 100 mM NaHCO₃, pH 8,0 gewaschen, um restliches Medium und Fettsäuren zu entfernen. Aus den Hefe-Zellsedimenten wurden Fettsäuremethylester (FAMEs) durch saure Methanolyse hergestellt. Hierzu wurden die Zellsedimente mit 2 ml 1 N methanolischer Schwefelsäure und 2% (v/v) Dimethoxypropan für 1 h bei 80°C inkubiert. Die Extraktion der FAMES erfolgte durch zweimalige Extraktion mit Petrolether (PE). Zur Entfernung nicht derivatisierter Fettsäuren wurden die organischen Phasen je einmal mit 2 ml 100 mM NaHCO₃, pH 8,0 und mit 2 ml Aqua dest. gewaschen. Anschließend wurden die PE-Phasen mit Na₂SO₄ getrocknet, unter Argon eingedampft und in 100 μl PE aufgenommen. Die Proben wurden auf einer DB-23-Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm, Agilent) in einem Hewlett-Packard 6850-Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor getrennt. Die Bedingungen für die GLC-Analyse waren wie folgt: Die Ofentemperatur wurde von 50°C bis 250°C mit einer Rate von 5°C/min und schließlich 10 min bei 250°C (Halten) programmiert.
Die Identifikation der Signale erfolgte durch Vergleiche der Retentionszeiten mit entsprechenden Fettsäurestandards (Sigma). Die Methodik ist beschrieben zum Beispiel in Napier and Michaelson (2001) Lipids 36(8): 761–766; Sayanova et al. (2001) Journal of Experimental Botany 52(360): 1581–1585, Sperling et al. (2001) Arch. Biochem. Biophys. 388(2): 293–298 und Michaelson et al. (1998) FEBS Letters 439(3): 215–218. Die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Sowohl für pOTE1.1/pOTE1.2 als auch für pOTE2.1/2.2 konnten die entsprechenden Aktivitäten bestätigt werden. In beiden Fällen zeigte die optimierte Sequenz (pOTE1.2 bzw. pOTE2.2) Aktivität. Dabei konnte die Synthese der γ-Linolensäure durch pOTE1.2 gegenüber der Wildtyp-Sequenz nur geringfügig gesteigert werden. Dagegen konnte für pOTE2.2 überraschenderweise sowohl eine Erhöhung der Aktivität als auch eine Veränderung der Spezifität beobachtet werden (Tabelle 1). Dabei hat sich die Aktivität zur Verlängerung von EPA nahezu verdoppelt, während die Verlängerung von ARA sich mehr als vervierfacht hat. Mit der Optimierung der Sequenz der Δ5-Elongase von Ostreococcus tauri konnte somit in Hefe bei gleicher Substratmenge die Ausbeute an den Vorstufen von DHA 6fach erhöht werden.
Beispiel 7: Klonierung von Expressionsplasmiden zur Samen-spezifischen Expression in Pflanzen
Die folgenden beschriebenen allgemeinen Bedingungen gelten für alle nachfolgenden Versuche, wenn nicht anders beschrieben.
Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden für die folgenden Beispiele Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5: 446–451. Verwendet wurde ein pGPTV-Derivat wie in DE 10205607 beschrieben. Dieser Vektor unterscheidet sich von pGPTV durch eine zusätzlich eingefügte AscI-Restriktionsschnittstelle.
Ausgangspunkt der Klonierung war der Klonierungsvektor pUC19 (Maniatis et al.). Im ersten Schritt wurde das Conlinin-Promotor-Fragment mit folgenden Primern amplifiziert:
Cnl1 C5': gaattcggcgcgccgagctcctcgagcaacggttccggcggtatagagttgggtaattcga
Cnl1 C3': cccgggatcgatgccggcagatctccaccattttttggtggtgat
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

5,00 μl Template cDNA
5,00 μl 10 × Puffer (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl₂
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl je Primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)

Reaktionsbedingungen der PCR:

Anlagerungstemperatur: 1 min 55°C
Denaturierungstemperatur: 1 min 94°C
Elongationstemperatur: 2 min 72°C
Anzahl der Zyklen: 35

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym EcoRI und dann für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Der Klonierungsvektor pUC19 wurde in gleicher Weise inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der 2668 bp große, geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1-C wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Im nächsten Schritt wurde der OCS-Terminator (Genbank Accession V00088; De Greve, H. et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 (6): 499–511) aus dem Vektor pGPVT-USP/OCS ( DE 102 05 607 ) mit den folgenden Primern amplifiziert:
OCS_C 5': aggcctccatggcctgctttaatgagatatgcgagacgcc
OCS_C 3': cccgggccggacaatcagtaaattgaacggag
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und dann für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1-C wurde 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1C_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Im nächsten Schritt wurde der Cnl1-B Promotor durch PCR mittels folgender Primer amplifiziert:
Cnl1-B 5': aggcctcaacggttccggcggtatag
Cnl1-B 3': cccggggttaacgctagcgggcccgatatcggatcccattttttggtggtgattggttct
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und dann für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1-C wurde 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1B_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert.
In einem weiteren Schritt wurde der OCS-Terminator für Cnl1B eingefügt. Dazu wurde die PCR mit folgenden Primer durchgeführt:
OCS2 5': aggcctcctgctttaatgagatatgcgagac
OCS2 3': cccgggcggacaatcagtaaattgaacggag
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und dann für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1C_Cnl1B_OCS wurde für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1B_OCS2 wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Im nächsten Schritt wurde der Cnl1-A Promotor durch PCR mittels folgender Primer amplifiziert:
Cnl1-B 5': aggcctcaacggttccggcggtatagag
Cnl1-B 3': aggccttctagactgcaggcggccgcccgcattttttggtggtgattggt
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1-C wurde für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1B_Cnl1A_OCS2 wurde durch Sequenzierung verifiziert.
In einem weiteren Schritt wurde der OCS-Terminator für Cnl1A eingefügt. Dazu wurde die PCR mit folgenden Primer durchgeführt:
OCS2 5': ggcctcctgctttaatgagatatgcga
OCS2 3': aagcttggcgcgccgagctcgtcgacggacaatcagtaaattgaacggaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und dann für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym HindIII inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1C_Cnl1B_Cnl1A_OCS2 wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym HindIII inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1B_Cnl1A_OCS3 wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Das Plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1B_Cnl1A_OCS3 wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ6-, Δ5-Desaturase und Δ6-Elongase verwendet. Dazu wurde die Δ6-Desaturase aus Phytium irregulare (WO02/26946) mit folgenden PCR-Primern amplifiziert:
D6Des(Pir) 5': agatctatggtggacctcaagcctggagtg
D6Des(Pir) 3': ccatggcccgggttacatcgctgggaactcggtgat
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BglII und dann für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym NcoI inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1C_Cnl1B_Cnl1A_OCS3 wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BglII und für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym NcoI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Das Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir) wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ5-Desaturase aus Thraustochytrium ssp. (WO02/26946) verwendet. Dazu wurde die Δ5-Desaturase aus Thraustochytrium ssp. mit folgenden PCR-Primern amplifiziert:
D5Des(Tc) 5': gggatccatgggcaagggcagcgagggccg
D5Des(Tc) 3': ggcgccgacaccaagaagcaggactgagatatc
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BamHI und dann für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym EcoRV inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1_d6Des(Pir) wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BamHI und für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym EcoRV inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Das Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (WO01/59128) verwendet, wozu diese mit folgenden PCR-Primern amplifiziert wurde:
D6Elo(Pp) 5': gcggccgcatggaggtcgtggagagattctacggtg
D6Elo(Pp) 3': gcaaaagggagctaaaactgagtgatctaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym NotI und dann für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym XbaI inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym NotI und für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym XbaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Ausgehend von pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde der binäre Vektor für die Pflanzentransformation hergestellt. Dazu wurde pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym AscI inkubiert. Der Vektor pGPTV wurde in gleicher Weise behandelt. Anschließend wurden das Fragment aus pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) und der geschnittene pGPTV-Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pGPTV-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Ein weiteres Konstrukt, pGPTV-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co), fand Verwendung. Dazu wurde ausgehend von pUC19-Cnl1C_OCS mit folgenden Primern amplifiziert:
Cnl1_OCS 5': gtcgatcaacggttccggcggtatagagttg
Cnl1_OCS 3': gtcgatcggacaatcagtaaattgaacggaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym SalI inkubiert. Der Vektor pUC19 wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym SalI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert.
In einem weiteren Schritt wurde das Δ12-Desaturase-Gen aus Calendula officinalis (WO01/85968) in pUC19-Cnl1_OCS kloniert. Dazu wurde d12Des(Co) mit folgenden Primern amplifiziert:
D12Des(Co) 5': agatctatgggtgcaggcggtcgaatgc
D12Des(Co) 3': ccatggttaaatcttattacgatacc
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BglII und anschließend für 2 h bei gleicher Temperatur mit NcoI inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1_OCS wurde in gleicher Weise inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Fragment und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Das Plasmid pUC19-Cnl1_D12Des(Co), sowie das Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurden für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym SalI inkubiert. Anschließend wurde das Vektor-Fragment sowie der Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und Vektor-Fragment ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Ausgehend von pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde der binäre Vektor für die Pflanzentransformation hergestellt. Dazu wurde pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym AscI inkubiert. Der Vektor pGPTV wurde in gleicher Weise behandelt. Anschließend wurden das Fragment aus pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) und der geschnittene pGPTV-Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pGPTV-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Ein weiterer für die Pflanzentransformation geeigneter Vektor ist pSUN2. Um die Zahl der im Vektor enthaltenen Expressionskassetten auf mehr als vier zu erhöhen wurde dieser Vektor in Kombination mit dem Gateway-System (Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Dazu wurde in den Vektor pSUN2 gemäß Herstellerangaben die Gateway-Kassette A wie folgendermaßen beschrieben, eingefügt:
Der pSUN2 Vektor (1 μg) wurde 1 h mit dem Restriktionsenzym EcoRV bei 37° inkubiert. Anschließend wurde die Gateway-Kassette A (Invitrogen, Karlsruhe) in den geschnittene Vektor ligiert mittels des Rapid Ligation Kits von Roche, Mannheim. Das entstandene Plasmid wurde in E. coli DB3.1 Zellen (Invitrogen) transformiert. Das isolierte Plasmid pSUN-GW wurde anschließend durch Sequenzierung verifiziert.
Im zweiten Schritt wurde die Expressionskassette aus pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) mittels AscI ausgeschnitten und in den in gleicherweise behandelten Vektor pSUN-GW ligiert. Das so entstandene Plasmid pSUN-4G wurde für weitere Genkonstrukte verwendet.
Dazu wurde zuerst gemäß Herstellerangaben (Invitrogen) ein pENTR-Klon modifiziert. Das Plasmid pENTR1A (Invitrogen) wurde 1 h bei 37° mit dem Restriktionsenzym EcoRI inkubiert, anschließend für 30 min mit Klenow-Enzym, sowie einem 1 μM dNTP-Mix behandelt und dann der AscI-Adapter (5'-ggcgcgcc; am 5'-Ende phosphoryliert, doppelsträngig) in den pENTR1A-Vektor liegiert. In diesen modifizierten wurde wie oben beschrieben schrittweise Gene in die Cnl-Kassette eingefügt und über AscI in den pENTR-Vektor übertragen, wodurch der pENTR-Cnl-Vektor entstand.
In einem weiteren Schritt wurde das Konstrukt pSUN-8G hergestellt. Dazu wurden 5'- und 3'-Primer für die Gene mit den SEQ ID NOs: 1, 3, 5 und 7 mit den oben beschriebenen Restriktionsschnittstellen sowie den ersten und jeweils letzten 20 Nukleotiden des offenen Leserahmens erstellt und mit den Standardbedingungen (siehe oben) amplifiziert und in den pENTR-Cnl-Vektor ligiert, der anschließend einer Rekombinationsreaktion nach Herstellerangaben mit dem Vektor pSUN-4G unterworfen wurde.
Dadurch wurde das Konstrukt pSUN-8G hergestellt, das in Brassica juncea bzw. Brassica napus transformiert wurde. Die Samen der transgenen Pflanzen wurden durch Gaschromatographie analysiert.
Beispiel 8: Lipidextraktion aus Pflanzenmaterial
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet wird und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d. h. der Lipide oder einer Fettsäure) untersucht werden. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89–90 und S. 443–613, VCH: Weinheim (1985); Fallon A. et al. (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935–12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141–145 beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide-Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952)–16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z. B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P. M. Rhodes und P. F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103–129; 131–163 und 165–192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee, 119–169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33: 343–353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2% Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d. h. Sigma), definiert werden.
Pflanzenmaterial wird zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen.
Dann wird 10 min auf 100°C erhitzt und nach dem Abkühlen auf Eis erneut sedimentiert. Das Zellsediment wird mit 1 M methanolischer Schwefelsäure und 2% Dimethoxypropan für 1 h bei 90°C hydrolysiert und die Lipide transmethyliert. Die resultierenden Fettsäuremethylester (FAME) werden in Petrolether extrahiert. Die extrahierten FAME werden durch Gasflüssigkeitschromatographie mit einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) und einem Temperaturgradienten von 170°C auf 240°C in 20 min und 5 min bei 240°C analysiert. Die Identität der Fettsäuremethylester wird durch Vergleich mit entsprechenden FAME-Standards (Sigma) bestätigt. Die Identität und die Position der Doppelbindung kann durch geeignete chemische Derivatisierung der FAME-Gemische z. B. zu 4,4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1998) mittels GC-MS weiter analysiert werden.
Beispiel 9: Verwendung der optimierten Δ5-Elongase aus Ostreococcus tauri für Konstrukte zur konstitutiven Expression
Für die Transformation von Pflanzen wurden Transformationsvektoren auf Basis von pGPTV-355, eines Plasmids basierend auf pBIN19-35S (Bevan M. (1984) Nucl. Acids Res. 18:203) erzeugt. Dazu wurde zunächst in einem pUC-Vektor eine Expressionskassette bestehend aus dem Promotor-Element CaMV35S (SEQ ID No. 17) sowie dem 35S-Terminator (SEQ ID NO: 18; Franck, A. et al. (1980) Cell 21(1): 285–294) zusammengesetzt. Dabei wurde der Promotor über die Restriktionsschnittstellen SalI/XbaI und der Terminator über die Restriktionsschnittstellen BamHI/SmaI eingesetzt. An den Terminator wurde außerdem ein Polylinker mit der XhoI Schnittstelle angehängt (,triple ligation'). Das entstandene Plasmid pUC19-35S wurde dann für die Klonierung von PUFA Genen eingesetzt. Es wurden parallel die offenen Leserahmen der Δ6-Desaturase- (SEQ ID NO: 3), der Δ5-Desaturase- (SEQ ID NO: 7) und Δ6-Elongase- (SEQ ID NO: 5) Sequenzen über die EcoRV-Schnittstelle in pUC19-35S Vektoren eingefügt. Die entstandenen Plasmide pUC-D6, pUC-D5, pUC-E6(Tc) wurden für die Erstellung des binären Vektors pGPTV-35S_D6D5E6(Tc) verwendet. Dazu wurde der Vektor pGPTV mit dem Enzym SalI, das Plasmid pUC-D6 mit SalI/XhoI verdaut und die korrekten Fragmente ligiert. Das entstandene Plasmid pGPTV-D6 wurde anschließend mit SalI, das Plasmid pUC-D5 mit SalI/XhoI verdaut und die korrekten Fragmente ligiert. Das entstandene Plasmid pGPTV-D6-D5 wurde dann ein weiteres Mal mit SalI verdaut, das Plasmid pUC-E6(Tc) mit SalI/XhoI und die korrekten Fragmente ligiert. Aus diesen sequentiellen Klonierungsschritten entstand der binäre Vektor pGPTV-D6D5E6(Tc), der für die Transformation eingesetzt wurde.
In einer weiteren Ausführung wurde an Stelle der Sequenz d6Elo(Tc) die Sequenz von d6Elo(Tp)(SEQ ID NO: 19) in den Vektor pUC19-35S eingesetzt. Das entstandene Plasmid pUC-E6(Tp) wurde zur Herstellung des binären Vektors pGPTV-35S_D6D5E6(Tp) verwendet.
In einer weiteren Ausführung wurde der offene Leserahmen der ω3Des(SEQ ID NO: 9) in pUC19-35S kloniert. Das entstandene Plasmid pUC-ω3Pi wurde über SalI/XhoI in die binären Vektoren pGPTV-D6D5E6(Tc) und pGPTV-D6D5E6(Tp) übertragen. Die entstandenen Vektoren pGPTV-D6D5E6(Tc)ω3Pi und pGPTV-D6D5E6(Tp)ω3Pi wurden für die Pflanzentransformation eingesetzt.
In einer weiteren Ausführung wurde der offene Leserahmen der optimierten Δ5-Elongase aus Ostreococcus tauri (SEQ ID No. 1), sowie der offene Leserahmen der Δ4-Desaturase aus Thraustochytrium sp. (SEQ ID No. 11) in pUC19-35S kloniert. Die entstandenen Plasmide pUC-E5 und pUC-D4 wurden dann über SalI/XhoI entsprechend obiger Angaben in den Vektor pGPTV-D6D5E6(Tp)ω3Pi übertragen. Der entstandene Vektor pGPTV-D6D5E6(Tp)ω3PiE5D4 wurde für die Pflanzentransformation eingesetzt.
Alle binären Vektoren wurden in E. coli DH5α-Zellen (Invitrogen) nach Herstellerangaben transformiert. Positive Klone wurden durch PCR identifiziert und Plasmid-DNA isoliert (Qiagen Dneasy).
Beispiel 10: Transformation der konstitutiven binären Vektoren in Pflanzen
a) Erzeugung transgener Orychophragmus violaceus Pflanzen
Es wurde das Protokoll zur Transformation von Rapspflanzen verwendet (verändert nach Moloney et al. (1992) Plant Cell Reports 8: 238–242).
Zur Erzeugung transgener Pflanzen wurde der binäre Vektor pGPTV-D6D5E6(Tp)ω3PiE5D4 in Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 transformiert (Deblaere et al. (1984) Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788). Zur Transformation von Orychophragmus violaceus wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473) mit 3% Saccharose (3MS-Medium) verwendet. Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter steriler Pflanzen (zu je ca. 1 cm²) wurden in einer Petrischale mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung für 5–10 Minuten inkubiert. Es folgt eine 3-tägige Koinkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde anschließend mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 15 mg/l Kanamycin, 20 μM Benzylaminopurin (BAP) und 1,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt. Bildeten sich nach drei Wochen keine Wurzeln, wurde dem Medium als Wachstumshormon 2-Indolbuttersäure zum Bewurzeln zugegeben.
Regenerierte Sprosse wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und mittels Lipidanalysen auf Elongase-Expression wie Δ-6-Elongaseaktivität oder Δ-5- oder Δ-6-Desaturaseaktivität untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren wurden so identifiziert.
b) Transformation von Arabidopsis thaliana Pflanzen
Es wurde das Protokoll von Bechthold et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie. 316: 1194–1199 angewendet.
Zur Erzeugung transgener Pflanzen wurde der erzeugte binäre Vektor pGPTV-D6D5E6(Tp)ω3PiE5D4 in Agrobacterium tumefaciens C58C1:pMP90 transformiert (Deblaere et al. (1984) Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788) und gemäß des Protokolls von Bechthold et al. (1993) Blüten von Arabidopsis thaliana cv. Columbia 0 in eine Agrobakterien-Lösung mit OD600 = 1,0 getaucht. Der Vorgang wurde zwei Tage später nochmals wiederholt. Samen aus diesen Blüten wurden dann auf Agar-Platten mit 1/2 MS, 2% Saccharose und 50 mg/L Kanamycin ausgelegt. Grüne Keimlinge wurden dann auf Erde transferiert.
Beispiel 11: Analyse von Pflanzenmaterial transgener Orychophragmus- bzw. Arabidopsis-Pflanzen
Die Extraktion von Blattmaterial transgener Orychophragmus violaceus und Arabidopsis thaliana Pflanzen tranformiert mit pGPTV-D6D5E6(Tp)ω3PiE5D4 sowie die gaschromatographische Analyse wurde wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Analysen. Die verschiedenen Fettsäuren sind in Flächenprozent angegeben. Für beide unterschiedliche Pflanzenarten konnte die Synthese von langkettigen, mehrfach ungesättigte Fettsäuren gezeigt werden. Überraschenderweise konnte mit der optimierten Sequenz der Δ5-Elongase aus Ostreococcus tauri eine deutlich höhere Ausbeute an DHA erhalten werden wie dies zum Beispiel von Robert et al. (2005) Functional Plant Biology 32: 473–479 für Arabidopsis thaliana mit 1,5% DHA berichtet wird. Für Orychophragmus violaceus konnte zum ersten Mal eine Synthese von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren erzielt werden.
Beispiel 12: Detaillierte Analyse der Lipidklassen und Positionsanalyse von Blattmaterial von O. violaceus
Etwa 1 g Blattgewebe wurde für 10 Minuten bei 95°C in in 4 ml of Isopropanol erhitzt, durch Polytron homogenisiert und nach der Zugabe von 1,5 ml Chloroform geschüttelt. Die Proben wurden zentrifugiert, der Überstand gesammelt und das Pellet mit Isopropanol:Chloroform 1:1 (v/v) nochmals extrahiert. Die beiden Extrakte wurden vereinigt, getrocknet und in Chloroform gelöst. Der Lipidextrakt wurde an einer Silica PrepSep-Säule (Fisher Scientific, Nepean, Canada) in neutrale Lipide, Glykolipide und Phospholipide vorfraktioniert, wobei mit Chloroform:Essigsäure 100:1 (v/v), Aceton:Essigsäure 100:1 (v/v) bzw. Methanol:Chloroform:Wasser 100:50:40 (v/v/v) eluiert wurde. Diese Fraktionen wurden auf Silica G-25 Dünnschichtchromatographieplatten (TLC; Macherey-Nagel, Düren, Germany) weiter aufgetrennt. Neutrale Lipide wurden mit Hexan:Diethylether:Essigsäure (70:30:1), Glykolipide mit Chloroform:Methanol:Ammoniak (65:25:4 v/v/v) und Phospholipide mit Chloroform:Methanol:Ammoniak:Wasser (70:30:4:1 v/v/v/v) entwickelt. Die einzelnen Lipidklassen wurden nach dem Besprühen mit Primulin unter UV-Licht identifiziert, durch Abkratzen von den Platten entfernt, und entweder für die direkte Transmethylierung verwendet oder durch ein geeignetes Lösungsmittel für die weitere Analyse extrahiert.
Entsprechend der beschriebenen Methoden konnten die verschiedenen Lipidklassen (Neutral-, Phospho- und Galaktolipide) aufgetrennt und separat analysiert werden. Desweiteren wurden die Glycolipide auf die Position der einzelnen Fettsäuren untersucht.
a) Regiospezifische Analyse der Triacylglyceride (TAG)
Drei bis fünf mg der TLC-gereinigten TAG wurden unter Stickstoff in Glasröhrchen getrocknet, in wässrigem Puffer durch kurze Ultraschallbehandlung resuspendiert (1 M Tris pH 8; 2.2% CaCl₂ (w/v); 0.05% Gallensalze (w/v)) und für 4 Minuten bei 40°C inkubiert. Nach der Zugabe von 0.1 ml einer Lösung von Pankreaslipase (10 mg/ml in Wasser) wurden die Proben für 3 Minuten kräftig gevortext und der Verdau durch Zugabe von 1 ml Ethanol und 1,5 ml 4 M HCl abgebrochen. Die teilweise verdauten TAG wurden zweimal mit Diethylether extrahiert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst. Monoacylglycerole (MAG) wurden von den freien Fettsäuren und unverdauten TAGs auf einer TLC-Platte getrennt wie oben für neutrale Lipide beschrieben. Der Punkt, der den MAGs entsprach, wurde durch GC analyert und stellte die sn-2-Position der TAG dar. Die Verteilung der Fettsäuren an den verbleibenden sn-1- and sn-3-Positionen wurde nach der folgenden Formel berechnet: sn-1 + sn-3 = (TAG × 3 – MAG)/2.
Diese Positionsanalyse der Triacylglyceride ergab dabei, dass EPA und DHA in den Positionen sn-2 und sn-1/3 in ähnlichen Konzentrationen vorhanden sind, während ARA insgesamt nur in geringen Mengen in den Triacylglyceriden zu finden ist und hier hauptsächlich in der Position sn-2 (Tab. 3).
b) Stereospezifische Analyse von Phospholipiden
Aufgetrenntes und extrahiertes Phosphatidylglykol (PG), Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylcholin (PC) wurden unter N₂ getrocknet und in 0.5 ml Boratpuffer (0.5M, pH 7.5, enthaltend 0.4 mM CaCl₂) resuspendiert. Nach einer kurzen Ultraschallbehandlung wurden 5U der Phospholipase A2 aus dem Gift von Naja mossambica (Sigma P-7778) und 2 ml Diethylether zugegeben und die Proben wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur gevortext. Die Etherphase wurde getrocknet, der Verdau mit 0,3 ml 1M HCl abgebrochen, und das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform:Methanol (2:1 v/v) extrahiert. Die verdauten Phospholipide wurden durch TLC in Chloroform:Methanol:Ammoniak:Wasser (70:30:4:2 v/v/v/v) getrennt und Punkte, die den freigesetzten freien Fettsäuren und Lysophospholipiden entsprachen, wurden durch Kratzen entfernt und direkt transmethyliert.
Die Positionsanalyse der Phospholipide zeigte eine Akkumulation von EPA und DHA in der sn-2 Position von Phosphatidylcholin (PC), während DHA in Phosphatidylethanolamin (PE) in sn-1 und sn-2 Position ähnlich verteilt war. In beiden Phospholipiden war kein oder nur Spuren von ARA zu finden (Tab. 4). In Phosphatidylglycerol fanden sich geringere Konzentrationen an EPA und DHA als in den anderen untersuchten Phospholipiden, wobei auch in dieser Lipidklasse eine Akkumulation in der sn-2 Position zu beobachten war (Tab. 4, PG).
c) Stereospezifische Analyse von Glykolipiden
Als weitere polare Lipidklasse wurden die Galaktolipide untersucht. Galaktolipide finden sich in den Membranen von Plastiden und bilden dort die Hauptkomponenten.
TLC-gereinigtes Monogalaktosyldiacylglycerol (MGDG) und Digalaktosyldiacylglycerol (DGDG) wurden unter Stickstoff getrocknet und in 0.5 ml Diethylether gelöst. Dann wurden 25 Einheiten der Lipase aus Rhizopus arrhizus (Sigma 62305), resuspendiert in 2 ml Boratepuffer (50 mM, pH 7.5 enthaltend 2 mM CaCl₂), zugegeben und die Proben für 2 Stunden bei Raumtemperatur gevortext. Die Etherphase wurde getrocknet und der Verdau durch die Zugabe von 0,3 ml 1M HCl abgebrochen und die Lipide wurden mit 4 ml Chloroform:Methanol (2:1 v/v) extrahiert. Nach dem Trocknen wurden die verdauten Galaktolipide in einem kleinen Volumen Chloroform:Methanol (2:1 v/v) und zweimal auf einer vorgefertigten Silica TLC-Platte entwickelt, zuerst mit Chloroform:Methanol:Ammoniak:Wasser (70:30:4:1 v/v/v/v) bis etwa zwei Drittel der Plattenhöhe, gefolgt von der vollständigen Entwicklung in Hexan:Diethylether:Essigsäure (70:30:1). Die Punkte, die den freigesetzten freien Fettsäuren und den Lysogalaktolipiden entsprachen, wurden nach dem Besprühen mit Primulin identifiziert, abgekratzt und direkt für die GC-Analyse transmethyliert.
Auch in diesen Lipiden konnten VLCPUFA gefunden werden, wobei eine Akkumulation von EPA in der sn-2 Position zu beobachten war. DHA war nur in den Digalakto-Diacylglycerolen (DGDG) zu finden und konnte nicht in den Monogalakto-Diacylglycerolen (MGDG) nachgewiesen werden (Tabelle 5). Die Verteilung von VLCPUFA in Galaktolipiden, einem Kompartiment, in dem diese Fettsäuren nicht erwartet wurden, zeigt die Dynamik der Synthese und den späteren Umbau. Ernährungstechnisch sind VLCPUFA in Polarlipiden besonders wertvoll, da diese im Darm von Säugetieren besser aufgenommen werden können als die Neutrallipide.
Tabelle 1: Test der optimierten Sequenzen von pOTE1.1 und pOTE2.1 in Hefe. Entsprechend der Substratumsetzungen wurden die Konversionsraten bestimmt. Mit der optimierten Sequenz in Plasmid pOTE2.2 konnte ein deutlicher Anstieg der Aktivität erreicht werden.
Tabelle 2: Gaschromatographische Analyse von Blattmaterial von Orychophragmus violaceus und Arabidopsis thaliana. Die einzelnen Fettsäuren sind in Flächenprozent angegeben.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in einer transgenen Pflanze, umfassend das Bereitstellen in der Pflanze von mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität kodiert; mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ6-Elongase-Aktivität kodiert; mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Desaturase-Aktivität kodiert; und mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz zumindest an die Kodonverwendung in Raps, Soja und/oder Lein angepasst ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Nukleinsäuresequenz unter Berücksichtigung der natürlichen Häufigkeit einzelner Kodons angepasst ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die veränderte Nukleinsäuresequenz der in SEQ ID No. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotors exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Promotor um den CaMV35S-Promotor handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle eines blattspezifischen Promotors exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Promotor um den Promotor der kleinen Untereinheit von Rubisco oder des Chlorophyll a/b-bindenden Proteins handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Promotor um den USP-, Vicilin-, Napin-, Conlinin- oder Oleosin-Promotor handelt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zusätzlich eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der Aktivität einer ω3-Desaturase und/oder einer Δ4-Desaturase in der Pflanze bereitgestellt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei alle verwendeten Nukleinsäuresequenzen auf einem gemeinsamen rekombinanten Nukleinsäuremolekül in der Pflanze bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei jede Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines eigenen Promotors steht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in der Pflanze vorwiegend als Ester in Phospholipiden oder Triacylglyceriden gebunden vorliegt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pflanze eine Öl-produzierende Pflanze, eine Gemüse-, Salat-, Futter- oder Zierpflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe der Pflanzenfamilien bestehend aus den Familien der Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Arecaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Cannaceae, Caprifoliaceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Fagaceae, Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Moraceae, Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Poaceae, Polygonaceae, Punicaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae und Valerianaceae.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zusätzliche weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) in der Pflanze bereitgestellt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiter umfassend das Gewinnen der Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in Form ihrer Öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus der Pflanze.
Öl, Lipide oder freie Fettsäuren oder eine Fraktion davon, erhalten durch ein Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit der Aktivität einer Δ5-Elongase kodiert und die gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist, zur Herstellung von Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in transgenen Pflanzen.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend: a) eine oder mehrere Kopien von mindestens einem in Pflanzenzellen aktiven Promotor, b) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität kodiert, c) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ5-Desaturase-Aktivität kodiert, d) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ6-Elongase-Aktivität kodiert, e) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert und die gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist, und f) eine oder mehrere Kopien von mindestens einer Terminatorsequenz.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 22, wobei die veränderte Nukleinsäuresequenz der in SEQ ID No. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz entspricht.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 22 oder 23, zusätzlich umfassend eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der Aktivität einer ω3-Desaturase und/oder einer Δ4-Desaturase.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 22 bis 24, zusätzlich umfassend Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen und Fettsäure-Elongase(n).
Transgene Pflanze enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 22 bis 25 oder enthaltend die in SEQ ID No. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz.
Verwendung von Ölen, Lipiden oder freien Fettsäuren gemäß Anspruch 19 oder gewonnen durch ein Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit einem gegenüber Wildtyp-Pflanzen erhöhten Gehalt an Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure umfassend das Bereitstellen in der Pflanze von mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ6-Desaturase-Aktivität kodiert; mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ6-Elongase-Aktivität kodiert; mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Desaturase-Aktivität kodiert; und mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer Δ5-Elongase-Aktivität kodiert, gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist.
Verwendung der Pflanze nach Anspruch 26 oder einer nach einem Verfahren nach Anspruch 28 erhaltenen Pflanze als Nahrungs- oder Futtermittel.