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DE102006005827B3 - mRNA-Transfektion von adulten Progenitorzellen zur spezifischen Gewebsregeneration - Google Patents

mRNA-Transfektion von adulten Progenitorzellen zur spezifischen Gewebsregeneration Download PDF

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DE102006005827B3
DE102006005827B3 DE102006005827A DE102006005827A DE102006005827B3 DE 102006005827 B3 DE102006005827 B3 DE 102006005827B3 DE 102006005827 A DE102006005827 A DE 102006005827A DE 102006005827 A DE102006005827 A DE 102006005827A DE 102006005827 B3 DE102006005827 B3 DE 102006005827B3
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progenitor cells
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Jan Torzewski
Vinzenz Hombach
Juliane Ingeborg Marie Wiehe
Jochen Greiner
Michael Schmitt
Markus Wiesneth
Oliver Zimmermann
Hubert Schrezenmeier
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Universitaet Ulm
Original Assignee
Greiner Jochen Dr
Schrezenmeier Hubert Prof Dr med
Torzewski Jan Prof Dr med
Wiehe Juliane Ingeborg Marie Dr
Wiesneth Markus Dr med
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Progenitorzellen, Arzneimittel enthaltend Progenitorzellen sowie deren Verwendungen zur spezifischen Gewebsregeneration. Derartige Verfahren werden in sämtlichen medizinischen Bereichen benötigt, insbesondere bei der Behandlung kardiovaskulärer, hämatologischer, nephrologischer, neurologischer, dermatologischer, gastroenterologischer oder orthopädischer Erkrankungen. Die Progenitorzellen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie mit mRNA transfiziert sind, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen in einem Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Progenitorzellen, Arzneimittel enthaltend Progenitorzellen sowie deren Verwendungen zur spezifischen Gewebsregeneration. Derartige Verfahren werden in sämtlichen medizinischen Bereichen benötigt, insbesondere bei der Behandlung kardiovaskulärer, hämatologischer, nephrologischer, neurologischer, dermatologischer, gastroenterologischer oder orthopädischer Erkrankungen.
  • Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass Zellen mittels mRNA transfiziert werden können. Derartige transfizierte Zellen werden bisher dazu eingesetzt, um im Bereich der Tumortherapie geeignete transfizierte Zellen in das Tumorgewebe einzuschleusen. Damit ist es möglich, bestimmte Gewebetypen zu markieren und so einer gezielten Tumortherapie zugänglich zu machen.
  • Entsprechende mRNA-Transfektionsverfahren sind beispielsweise in Smits et al., Leukemia 2004, Seiten 1 bis 5, „RNA-based gene transfer for adult stem cells and T cells" beschrieben.
    •
  • Die vorliegende Erfindung geht von diesen bekannten Transfektionsverfahren aus und macht es sich zur Aufgabe, Verfahren und Stoffe sowie Arzneimittel sowie deren Herstellungsverfahren anzugeben, mit denen eine Geweberegenerierung möglich wird.
  • Diese Aufgabe wird durch die Progenitorzellen nach Anspruch 1, das Arzneimittel nach Anspruch 2, deren Verwendung nach den Ansprüchen 3 bis 4, sowie die in den Ansprüchen nachfolgenden erfindungsgemäßen Verfahren und Herstellungsverfahren gegeben. Vorteilhafte Weiterbildungen werden in den entsprechenden abhängigen Ansprüchen gegeben.
  • Die vorliegende Erfindung macht es sich zu Nutze, dass im Stand der Technik mRNA-Transfektionsverfahren bereits bekannt und für die Tumortherapie erfolgreich eingesetzt werden. Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung der grundlegende Gedanke und die Erkenntnis zugrunde, dass Progenitorzellen mit mRNA transfiziert werden können, die für ein Protein codieren, das die Ansiedlung der transfizierten Progenitorzellen in einem bestimmten Zielgewebe und/oder die Differenzierung der transfizierten Progenitorzellen in Zellen eines bestimmten Zielgewebetyps fördert. Hierdurch ist es erstmals möglich, die Progenitorzellen gezielt in ein bestimmtes Zielgewebe einzubringen und dort anzusiedeln (Homing) bzw. gezielt Zielzellen zu erzeugen, die dann anderweitig weiterverwendet werden können.
  • Im Gegensatz zu sonstigen herkömmlichen gentechnischen Verfahren unterliegt die mRNA-Transfektion nicht den strengen gesetzlichen Regulierungen, die für gentechnisch veränderte Zellen gelten. Denn durch eine mRNA-Transfektion wird die transfizierte Zelle nicht gentechnisch verändert, sondern sie stellt lediglich das durch die mRNA codierte Protein her. Die mRNA wird innerhalb der transfizierten Zelle rasch abgebaut, so dass nach kurzer Zeit die Zelle wieder in ihrem ursprünglichen Zustand vorliegt.
  • Diesen Mechanismus macht sich nun die vorliegende Erfindung zu Nutze, indem die Progenitorzellen entsprechend transfiziert werden, so dass sie während einer kurzen Phase einen Impuls bekommen, um in bestimmte Zielzellen auszudifferenzieren oder sich in einem bestimmten Zielgewebe anzusiedeln. Nach Abbau der eingebrachten mRNA und des Proteins, das durch diese mRNA codiert wurde, liegt eine unveränderte Zelle vor, die bei autologen Progenitorzellen sich nicht von den Zellen des Zielgewebes unterscheidet.
  • Als Progenitorzellen werden dabei sämtliche Zellen betrachtet, die noch nicht terminal ausdifferenziert sind, insbesondere hämatopoietische Progenitorzellen, neuronale Progenitorzellen, Progenitorzellen der Leber, des Skelettmuskels, der Haut und/oder Progenitorzellen aus Nabelschnurblut. Besonders vorteilhaft werden als Progenitorzellen Stammzellen, nicht jedoch menschliche Stammzellen embryonalen Ursprungs, also adulte Stammzellen, gewebespezifische adulte Stammzellen und andere noch nicht voll ausdifferenzierte Zellen verwendet.
  • Blau et al., Cell, Band 105, S. 829–841 (2001) „The envolving concept of a stem cell: Entity or Function" geben einen Überblick über in der vorliegenden Erfindung verwendbare Progenitorzellen.
  • Die vorliegende Erfindung eignet sich aufgrund der Möglichkeit zur Geweberegeneration bzw. zur Herstellung ausdifferenzierter Zielzellen eines bestimmtes Zielgewebes zur Behandlung von kardiovaskulären, hämotologischen, nephrologischen, neurologischen Erkrankungen, Hauterkrankungen, gastroenterologischen Erkrankungen und/oder orthopädischen Erkrankungen, bei denen Gewebe regeneriert werden soll. Auch weitere Krankheitsbilder sind nach der Erfindung bzw. den erfindungsgemäßen Zellen oder Arzneimitteln behandelbar.
  • Im Folgenden wird eine nicht abschließende, jedoch beispielhafte Liste von Erkrankungen gegeben, wobei der Behandlungsmechanismus bzw. die zu verwendende transfizierende mRNA mit angegeben wird:
  • 1. kardiovaskulären Erkrankungen
    • • z.B. Myokardinfarkt: intravasale oder intramyokardiale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen wie CD34-positiven Progenitorzellen oder mesenchymalen Stammzellen, s. 1 + 2 (z.B. Transfektion mit Adhäsionsmolekülen wie Selektinen oder Integrinen oder myokardialen Transkriptionsfaktoren wie GATA-4 oder Nkx2.5)
    • • z.B. chronisch degenerative Myokarderkrankungen wie Dilatative Kardiomyopathie oder chronisch ischämische Kardiomyopathie: intravasale oder intramyokardiale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen wie CD34-positiven Progenitorzellen oder mesenchymalen Stammzellen (z.B. Transfektion mit Adhäsionsmolekülen wie VCAM/ICAM oder myokardialen Transkriptionsfaktoren wie GATA-4 oder Nkx2.5)
  • 2. hämatologischen Systemerkrankungen
    • • z.B. Leukämien: Verbesserung des Knochenmarkhomings von hämatopoetischen Progenitorzellen durch mRNA-Transfektion von Adhäsionsmolekülen nach autologer oder allogener Stammzelltransplantation
    • • z.B. Leukämien: Induktion einer Zelldifferenzierung der malignen Zellen durch mRNA-Transfektion
    • • mRNA-Transfektion von Differenzierungsfaktoren hämatopoetischer Progenitorzellen zur Differenzierung bei reifungsgestörter Hämatopoese, z.B. bei Myelodysplastischem Syndrom (MDS)
    • • mRNA-Transfektion inhibitorischer RNA zur spezifischen Blockade von Translokationsprodukten von Leukämien zur Induktion einer Zelldifferenzierung
  • 3. nephrologischen Erkrankungen
    • • z.B. Nierenzellersatz: intravasale oder intrarenale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen der Niere wie mesenchymalen Stammzellen (z.B. Transfektion mit renalen Transkriptionsfaktoren) zur Behandlung chronisch degenerativer Nierenerkrankungen
  • 4. neurologischen Erkrankungen
    • • z.B. degenerative Erkrankungen des Nervensystems wie M. Parkinson oder M. Alzheimer: intravasale oder intracerebrale Applikation von mRNA-transfizierten neuronalen Progenitorzellen (z.B. Transfektion mit neuronalen Transkriptionsfaktoren) zur Behandlung chronisch degenerativer Erkrankungen des Gehirns
  • 5. Hauterkrankungen
    • • z.B. Hautzellersatz nach Verletzungen/Abschürfungen der Dermis durch intradermale oder intravasale Applikation von mRNA-transfizierten dermalen Progenitorzellen (z.B. Transfektion mit dermalen Transkriptionsfaktoren)
  • 6. Gastroenterologischen Erkrankungen
    • • z.B. Ersatz von Inselzellen des Pankreas durch parenchymale oder intravasale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen bei Diabetes mellitus
  • 7. Orthopädischen Erkrankungen
    • • z.B. Knorpelersatz durch durch parenchymale oder intravasale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen des Knorpels/Knochens
  • Im Folgenden werden einige Proteine angegeben, deren für sie codierende mRNA vorteilhafterweise bei der vorliegenden Erfindung als zu transfizierende mRNA eingesetzt werden können. Es handelt sich dabei um Adhäsionsmoleküle, d.h. um Moleküle, die die Ansiedlung der transfizierten Progenitorzelle im Zielgewebe ermöglichen, bzw. um kardiale, hämatopoietische, neuronale, renale oder dermale Transfektionsfaktoren, die die Ausdifferenzierung der transfizierten Progenitorzellen in Zielzellen eines entsprechenden Zielgewebes fördern:
  • Adhäsionsmoleküle:
    • • „Rolling Factors": insbesondere L-selectin, PSGL-1, Sialyl Lewis X auf Leukozyten, P- bzw. E- Selectin, Glycam-1, CD34, MadCAM-1 auf Endothelzellen sowie
    • • „Adhesion molecules": insbesondere Integrine wie αLβ2 (LFA-1) sowie αMβ2 (MAC-1) αxβ2 (p150.95), α4β1, (VLA-4), α5β1, (VLA-5) und „Cellular adhesions molecules" (CAMs) wie ICAM-1,-2, VCAM-1, Fibronectin auf Endothelzellen
  • Kardiale, hämatopoetische, neuronale, renale, dermale Transkriptionsfaktoren:
    • • Kardiale Transkriptionsfaktoren: insbesondere Nkx2.5, GATA-4
    • • Hämatopoetische Transkriptionsfaktoren: insbesondere PU-1, CEBPα, GATA-1, CD44, CD168, p16, p15, p21, p27
    • • Neuronale Transkriptionsfaktoren
    • • Renale Transkriptionsfaktoren: insbesondere Sall-1, Wnt-Familie
    • • Dermale Transkriptionsfaktoren: insbesondere Egr-1
  • Im Folgenden werden nun einige Beispiele erfindungsgemäßer Verfahren gegeben.
  • Es zeigen
  • 1 FACS-Analysen der mRNA versus Plasmidnukleofektion von hämatopoietischen CD34 positiven humanen Progenitorzellen (HPC);
  • 2 die Ergebnisse einer mRNA-Nukleofektion von CD34 positiven HPC mit dem kardialen Transkriptionsfaktor Nkx2.5; und
  • 3 die Ergebnisse einer mRNA-Nukleofektion von mesenchymalen HPC mit EGFP-mRNA und LNGFR-mRNA.
  • 1 zeigt die Ergebnisse einer mRNA-Nukleofektion bzw. einer Plasmidnukleofektion von hämatopoietischen CD34 positiven humanen Progenitorzellen (HPC) mit den Oberflächenmarkern EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) und LNGFR (Low-Finity Nerve Growth Factor Receptor). Für diese Versuche wurden die folgenden Methoden und Protokolle verwendet:
  • Zellkultur
  • Humane CD34-positive hämatopoetische Progenitorzellen (HPC): Humane CD34-positive HPC wurden nach G-CSF Stimulation mittels Leukapherese isoliert. Die immunomagnetische Selektion CD34-positiver Zellen wurde mittels CliniMACSTM System (Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) durchgeführt. Die Zellen wurden in RPMI-Medium (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), ergänzt mit 10 % FCS und den Wachstumsfaktoren IL-3 (10 ng/ml), IL-6 (20 ng/ml), und SCF (100 ng/ml) bei 37 °C, 5 % CO2 kultiviert. Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Die Viabilität der Zellen wurde mittels Trypanblau-Färbung resp. Flow Zytometrie (scatter exclusion) im Standardassay bestimmt.
  • Humane mesenchymale Stammzellen (MSC):
  • Spongiosa aus humanem Femur oder Tibia wurde nach Aufklärung und Einwilligung von Probanden im Alter zwischen 40 und 66 Lebensjahren gewonnen. MSC wurde aus dem Trabekelwerk nach Adhaesion an positiv gela dene Plastikoberflächen (NUNC, Wiesbaden, Germany) für 24 Stunden in „complete αMEM (Cambrex, Verviers, Belgium)", ergänzt mit 20 % Hitze-inaktiviertem FBS (Gibco, Karlsruhe, Germany), isoliert. Frühe Passagen (Passage 2 – Passage 4) wurden für die Experimente verwendet. Die Zellen wurden nach 10 bis 14 Tagen mit Trypsin (Gibco) von den Zellkulturplatten gelöst und in einer Zelldichte von 100 bis 500 Zellen/cm2 neu ausgesät. Das Medium wurde 2·/Woche gewechselt. Die Viabilität wurde mittels Trypan-Blau-Aufnahme resp. Flow Zytrometrie (scatter exclusion) bestimmt.
  • Charakterisierung von MSC:
  • (a) Differenzierungsassay: Für die Differenzierungsassays wurde eine initiale Zellzahl von 25.000 bis 100.000 Zellen in Zellkulturflaschen (NUNC) ausgesät, und die Differenzierung wurde mit Medien von Cambrex (osteogene und adipogene Differenzierung) oder Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany (chondrogene und osteogene Differenzierung) induziert. Zur Detektion differenzierter Zellen wurden die Ansätze in 7 % Paraformaldehyd fixiert. (i) Osteoblasten wurden auf Alkalische Phosphatase Aktivität, (ii) adipogene Differenzierung wurde über eine Anfärbung mit saturierter „Oil RedO" Lösung und (iii) Chondrogene Differenzierung über „Alcian Blue-Färbung" getestet. Die Materialien für die Färbung wurden ausnahmslos von SIGMA (Taufkirchen, Germany) gekauft, nur das „Alcian Blue staining kit" stammt von Dako, Hamburg, Germany. (b) Marker panel: Antikörper zur Charakterisierung von MSC: IgG (MOPC-21), CD3 (HIT3a), CD14 (M5E2), CD16 (3G8), CD29 (HUTS-21), CD34 (581), CD44 (G44-26), CD45 (HI30), CD73 (AD2), CD90 (5E10), CD146 (P1H12), CD166 (3A6) und CD253 (GA-R2). Alle Antikörper stammten von BD Pharmingen (Heidelberg, Germany), ausgenommen CD48 (J4.57, Beckman Coulter, Krefeld, Germany) und CD66b (60H3, Beckman Coulter) sowie CD105 (Sn6, Biozol-Serotec, Eching, Germany) und CD133 (29303, Miltenyi).
  • Plasmidkonstruktion
  • Der ΔLNGFR Vektor wurde durch Klonierung des humanen trunkierten LNGFR Gens in den eukaryoten pVAX1 Expressionvektor (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) generiert. Das ΔLNGFR 834 bp Fragment wurde mittels polymerase chain reaction amplifiziert.
  • In vitro-Transkription
  • Das pGEM4Z/EGFP/A64 Plasmid wurde mit Spe I, das pVAX/deltaLNGFR plasmid (Greiner et al. 2004, Hemother. Transf. Med.) mit Xho I (New England Biolabs, Frankfurt, Germany) linearisiert. Die linearisierten Plasmide wurden mittels „nucleotid removal kit" (Qiagen, Hilden, Germany) aufgereinigt und als DNA templates für die in vitro Transkriptionsreaktion verwendet. Die Transkription wurde in einem finalen 20 μl Reaktionsmix bei 37 °C mittels T7 Opti-mRNA Transkriptionskit (Cure Vac GmbH, Tübingen, Germany) angesetzt, um „5'-capped" in vitro-transkribierte mRNA zu generieren. Die Aufreinigung der mRNA wurde mittels DNase I Verdauung durchgeführt. Um einen Poly A Schwanz an die mRNA von deltaLNGFR zu hängen, wurde ein Poly(A) Tailing Kit (Ambion) benutzt. Die mRNAs von EGFP und delta LNGFR wurden abschließend mittels „LiCl precipitation" präzipitiert. Die mRNA-Konzentration wurde durch spektrophotometrische Analyse bei einer OD260 bestimmt. Die RNA wurde in Aliquots bei –80 °C gelagert.
  • Nukleofektion
  • CD34-positive HPC und MSC wurden pelletiert und in humanen CD34 Cell NucleofectorTM Solutions (Amaxa GmbH, Köln, Germany) in einer Zelldichte von 2–3 × 106 oder 5 × 105 Zellen pro 100 μl resuspendiert. Die Zellen wurden mit 5 μg mRNA oder 2 μg plasmid DNA nukleofiziert, die Programme U-08 (für HPC) oder C-17 (für MSC) des Nukleofektors wurden verwendet. Nach der Nukleofektion wurden die Zellen sofort mit 500 μl vorgewärmtem Kulturmedium gemischt und in Wellplatten mit vorgewärmtem Medium transferiert. Die Zellen wurden bei 37 °C über 10 Tage kultiviert.
  • Evaluation der Genexpression mittels Flow-Zytometrie Die deltaLNGFR- und EGFP-Expression nukleofizierter und nicht-transfizierter CD34-positiver HPC und MSC wurde mittels Flowzytometrie 1, 3, 6, 8 und 10 Tage nach Transfektion bestimmt. Zur Detektion von deltaLNGFR wurden die Zellen mit „non-conjugated purified mouse monoclonal anti-human NGF antibody (Santa Cruz)" und einem PE-markierten „anti mouse lgG1 secondary antibody (Becton Dickinson)" inkubiert. Die Daten wurden mittels Cellquest Version 3.1 Software (Becton Dickinson) analysiert.
  • In 1A ist in der linken Spalte die Nukleofektion mit mRNA von EGFP (oberes Bild) bzw. LNGFR (unteres Bild) dargestellt. Es ist zu erkennen, dass der Nachweis von EGFP und von LNGFR in den jeweiligen mRNA-transfizierten Zellen innerhalb weniger Tage abklingt. Anfänglich zeigt die mRNA-Transfektion jedoch eine sehr hohe Effizienz von über 90 % (EGFP/LNGFR-positive Zellen/Gesamtzahl der Zellen). Bei der Plasmidnukleofektion wird lediglich eine Nukleofektions effizienz von 60 bis 70 % erreicht (1A, rechte Spalte), wobei jedoch der Nachweis der Proteine langsamer abklingt als bei der mRNA-Nukleofektion.
  • 1B zeigt die Viabilitäten der nukleofizierten Zellen wiederum für die mRNA-Nukleofektion in der linken Spalte und für die Plasmidnukleofektion in der rechten Spalte. Es ist zu erkennen, dass die mRNA-Transfektion zu sehr hohen Viabilitäten mit wenigstens 50 % viablen Zellen führt (sowohl für EGFP als auch für LNGFR), während die Viabilität der transfizierten Zellen bei der Plasmidnukleofektion insbesondere anfänglich sehr niedrig liegt.
  • Dies zeigt, dass mit dem vorliegenden Verfahren geeignete Faktoren in die Zellen eingebracht werden können, ohne die Nachteile der Plasmidnukleofektion (gentechnische Veränderung, geringe Viabilität der veränderten Zellen, Risiko der Tumorgenerierung) in Kauf zu nehmen.
  • In 1B wurden die jeweiligen Werte mit einer sog. „mock-Nukleofektion" verglichen, d.h. einer Kontrolle, bei der keinerlei mRNA oder Plasmide in die Zelle eingebracht wurden.
  • 2 zeigt die Ergebnisse einer mRNA-Nukleofektion von CD34-positiven HPC mit dem kardialen Transkriptionsfaktor Nkx 2.5. Für diese Versuche wurde zusätzlich das folgende Protokoll für die mRNA-Transfektion von Nkx2.5 mittels Nukleofektion verwendet: 5 × 106 CD34-positive hämatopoetische Progenitor Zellen wurden pelletiert, in 100 μl „human CD34 Cell NucleofectorTM Solution" (Amaxa GmbH, Köln, Germany) resuspendiert und mit 5 μg in vitro transkribierter (CureVac, Tübingen, Deutschland) mRNA, welche für das Nkx-2.5 Protein kodiert, gemischt. Die Zellsuspension wurde mit dem Programm U-08 nukleofiziert, anschließend mit 500 μl vorgewärmten Kultur-Medium versetzt und in 6-Well Platten mit vorgewärmtem Kultur-Medium transferiert. Die Zellen wurden für vier Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert, bevor Protein-Volllysate extrahiert wurden.
  • In 2 zeigt sich die Expression von Nkx2.5 als eine Bande, die zwischen den beiden Markern mit 37.1 kD und 48,8 kD liegt. Durch diese Westernblot-Analyse konnte die Expression von Nkx2.5 aus der transfizierten mRNA sowohl 4 Stunden als auch 24 Stunden nach der Nukleofektion nachgewiesen werden.
  • 3 zeigt eine FACS-Analyse der mRNA-Nukleofektion mit EGFP-mRNA bzw. LNGFR-mRNA von mesenchymalen HPC. Es ist zu erkennen, dass die Effizienz der mRNA-Nukleofektion zwischen 95,8 % (für LNGFR) und 98,8 % (für EGFP) liegt.

Claims (16)

  1. Progenitorzellen, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen dadurch gekennzeichnet, dass sie mit mRNA transfiziert sind, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen in einem Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert.
  2. Arzneimittel enthaltend Progenitorzellen nach Anspruch 1.
  3. Verwendung von Progenitorzellen, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei die Progenitorzellen mit mRNA transfiziert sind, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert.
  4. Verwendung nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen, hämatologischen Systemerkrankungen, nephrologischen Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen, Hauterkrankungen, Gastroenterologischen Erkrankungen und/oder orthopädischen Erkrankungen.
  5. Verfahren zur gezielten Regenerierung von Zielzellen bzw. Zielgewebe in vitro dadurch gekennzeichnet, dass Progenitorzellen, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen mit mRNA transfiziert werden, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung Überarbeiteter Patentanspruch 6
  6. Verfahren zur gezielten Regenerierung von Zielzellen bzw. Zielgewebe, dadurch gekennzeichnet, dass Progenitorzelle, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen mit mRNA transfiziert werden, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert, und die transfizierten Zellen appliziert werden.
  7. Verwendung von Progenitorzellen, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen die mit mRNA transfiziert werden, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert, in der Medizin.
  8. Verwendung von Progenitorzellen, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen die mit mRNA transfiziert sind, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert, zur Behandlung eines Säugetieres.
  9. Zellen, Arzneimittel oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Säugetier ein Mensch ist.
  10. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen peripher, insbe sondere intravenös, intramuskulär, intrakutan, subkutan und/oder parenchymal appliziert werden.
  11. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mRNA für mindestens eines der folgenden Proteine kodiert: Rollingfactors insbesondere L-Selectin, PSGL-1, Sialyl Lewis X auf Leukozyten, P-Selectin, E-Selectin, Glycam-1, CD34, MadCAM-1, Integrine, insbesondere αLβ2(LFA-1) sowie αMβ2 (MAC-1) αxβ2, α4β1 (p150.95), VLA-4, α5β1 (VLR-5), CAMs (Cellular Adhesion Molecules), insbesondere ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 und Fibronectin, Kardiale Transkriptionsfaktoren, insbesondere Nkx2.5 und GATA-4, Hämatopoietische Transkriptionsfaktoren, insbesondere PU-1, CEBPα, GATA-1, CD44, CD168, p16, p15, p21 und p27, neuronale Transkriptionsfaktoren, renale Transkriptionsfaktoren, insbesondere Sall-1, Wnt-Proteine, und/oder dermale Transkriptionsfaktoren, insbesondere Egr-1.
  12. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung mindestens einer der folgenden Indika tionen kardiovaskulären Erkrankungen, hämatologischen Systemerkrankungen, nephrologischen Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen, Hauterkrankungen, Gastroenterologischen Erkrankungen und/oder orthopädischen Erkrankungen.
  13. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass autologe oder allogene Progenitorzellen verwendet werden.
  14. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektion der Progenitorzellen mit mRNA mittels Elektroporation, insbesondere Nukleotransfektionsverfahren erfolgt.
  15. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Progenitorzellen Stammzellen, embryonale, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen und/oder nichtembryonal Stammzellen, adulte Stammzellen, gewebespezifische adulte Stammzellen, die spezifisch für das Zielgewebe oder ein anderes Gewebe sind, oder andere nicht voll ausdifferenzierte Zellen verwendet werden.
  16. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Progenitorzellen hematopoietische Progenitorzellen, neuronale Progenitorzelle und/oder Progenitorzellen der Leber, des Skelettmuskels und/oder der Haut und/oder Zellen aus Nabelschnurblut verwendet werden.
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