DE102005051406A1

DE102005051406A1 - Optical coupling element for a flow cell

Info

Publication number: DE102005051406A1
Application number: DE102005051406A
Authority: DE
Inventors: Thuro Dr. Arnold; Kay Grossmann; Evelyn Dr. Krawczyk-Bärsch
Original assignee: Helmholtz Zentrum Dresden Rossendorf eV
Current assignee: Helmholtz Zentrum Dresden Rossendorf eV
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2007-05-03
Also published as: WO2007048379A1

Abstract

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein optisches Koppelelement zur mikroskopsichen Charakterisierung von Proben in Durchflusszellen zu entwickeln, um einen direkten Kontakt des Objektivs mit der Durchflusslösung zu vermeiden und dabei die Verluste in der numerischen Apertur des Objektivs so gering als möglich zu halten. Die Erfindung baut auf einer Zelle (1), einem oder mehreren Probenträgern (2), welche sich innerhalb der Zelle (1) befinden, Zu- und Abläufen (4) zur Gewährleistung eines kontinuierlichen Flusses von verschiedenen Lösungen durch die Zelle (1) hindurch und Öffnungen (12) für das Einbringen einer Inertgasatmosphäre. Die Erfindung beinhaltet, dass DOLLAR A eine Aussparung im Deckelteil (5) zur mikroskopischen Untersuchung der Proben (3) in situ vorgesehen ist, DOLLAR A in die Aussparung des Deckelteils (5) ein zusätzliches optisches Koppelelement (7, 8) eingebracht ist und DOLLAR A das optische System aus zwei optisch aktiven Medien besteht, die optisch entgegengesetzt angeordnet sind.The object of the invention is to develop an optical coupling element for microscopic characterization of samples in flow cells in order to avoid direct contact of the objective with the flow solution and to keep the losses in the numerical aperture of the objective as low as possible. The invention is based on a cell (1), one or more sample carriers (2) located inside the cell (1), inlets and outlets (4) to ensure a continuous flow of different solutions through the cell (1) and openings (12) for the introduction of an inert gas atmosphere. The invention includes that DOLLAR A is provided a recess in the cover part (5) for microscopic examination of the samples (3) in situ, DOLLAR A an additional optical coupling element (7, 8) is introduced into the recess of the cover part (5) and DOLLAR A the optical system consists of two optically active media which are arranged optically opposite one another.

Description

Die Erfindung betrifft ein optisches Koppelelement, welches als Verbindungsstück zwischen einer Durchflusszelle und einer mikroskopischen Auswerteeinrichtung dient. Ein wesentliches Einsatzgebiet dieses optischen Koppelelements ist die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von Proben.The The invention relates to an optical coupling element, which serves as a connecting piece between a flow cell and a microscopic evaluation device serves. An essential field of application of this optical coupling element is the light and fluorescence microscopy for the examination of samples.

Es ist bekannt, dass Mikroorganismen und mikrobielle Aggregate im Labor in speziellen Reaktoren, so genannten Durchflussreaktoren oder Durchflusszellen kultiviert werden (Lawrence, J.R., Swerhone, G.D.W., Neu, T.R., A simple rotating annular reactor for replicated biofilm studies. Journal of Microbiological Methods 42, 215–224, 2000; Beyenal, H., Sani, R.K., Peyton, B.M., Dohnalkova, A.C., Amonette, J.E., Lewandowski, Z., Uranium Immobilization by Sulfate-Reducing Biofilms. Environ. Sci. Technol. 38, 2067–2074, 2004). Mit Hilfe von fluoreszierenden Markerfarbstoffen werden diese Mikroorganismen oder mikrobielle Aggregate in situ mikroskopisch charakterisiert (Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H.-C., Application of fluorescently labelled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in Biofilms of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods 50, 237–248, 2002).It It is known that microorganisms and microbial aggregates in the laboratory in special reactors, so-called flow reactors or flow cells cultivated (Lawrence, J.R., Swerhone, G.D.W., Neu, T.R. A simple rotating reactor for replicated biofilm studies. Journal of Microbiological Methods 42, 215-224, 2000; Beyenal, H., Sani, R.K., Peyton, B.M., Dohnalkova, A.C., Amonette, J.E., Lewandowski, Z., Uranium Immobilization by Sulfate Reducing Biofilms. Environ. Sci. Technol. 38, 2067-2074, 2004). With the help of fluorescent marker dyes these become Microorganisms or microbial aggregates characterized in situ microscopically (Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H. -C., Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods 50, 237-248, 2002).

Die Probenbestandteile werden dabei spezifisch mit den Fluoreszenzfarbstoffen markiert und emittieren bei optimaler Anregung Fluoreszenzlicht. Die Untersuchung dieser Proben ist mit kommerziellen Fluoreszenzmikroskopen durchführbar. Eine besondere Schwierigkeit des Messverfahrens in einer Durchflusszelle besteht darin, dass nacheinander verschiedene Flüssigkeiten in den Raum zwischen Objektiv des Mikroskops und dem Träger der Mikroorganismen eingebracht werden. Dabei kommt es, vor allem bei Eintauchobjektiven zwangsläufig zu einer Benetzung des Objektivs. Diese Benetzung ist insbesondere bei Flüssigkeiten mit gelösten radioaktiven Metallen durch deren schnelle Adsorption und schlechte Desorption am Objektiv unerwünscht.The Sample components become specific with the fluorescent dyes marked and emit fluorescent light at optimal excitation. The Examination of these samples is with commercial fluorescence microscopes feasible. A particular difficulty of the measurement process in a flow cell is that successively different liquids in the space between lens of the microscope and the carrier the microorganisms are introduced. That's what happens, above all with immersion lenses inevitably to a wetting of the lens. This wetting is particular for liquids with solved radioactive metals due to their rapid adsorption and bad Desorption on the lens undesirable.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein optisches Koppelelement zur mikroskopischen Charakterisierung von Proben in Durchflusszellen zu entwickeln, um einen direkten Kontakt des Objektivs mit der Durchflusslösung zu vermeiden und dabei die Verluste in der numerischen Apertur des Objektivs so gering als möglich zu halten.The The object of the invention is an optical coupling element for the microscopic characterization of samples in flow cells to develop a direct contact of the lens with the flow solution too avoid the losses in the numerical aperture of the Lens as low as possible to keep.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit den in den Patentansprüchen dargelegten Merkmalen gelöst.According to the invention Problem solved by the features set out in the claims.

Das erfindungsgemäß austauschbare optische Koppelelement führt zu einer Schonung des Objektivs. Durch das optische Koppelelement wird an der Stelle der ursprünglichen Objektebene eine zusätzliche Bildebene gelegt, um damit keine Aperturverschlechterung hinnehmen zu müssen. Eine weitere Einsatzmöglichkeit dieses Koppelelementes ist bei der Einkopplung von Kryozellen in den mikroskopischen Strahlengang gegeben.The interchangeable according to the invention optical coupling element leads to a protection of the lens. Through the optical coupling element will be in the place of the original Object level an additional Image plane so as not to tolerate aperture deterioration to have to. Another application This coupling element is in the coupling of cryogenic cells in given the microscopic beam path.

Bei der Auslegung dieser Koppelelemente ist besonders darauf zu achten, dass in der optischen Koppeleinheit bereits Möglichkeiten eingearbeitet werden um auftretende Fehler, wie z.B. achromatische Fehler korrigieren zu können. Sowohl die Durchflusszelle an sich, als auch der Einkoppelbereich für das optische Koppelelement ist zur Umgebung hin gasdicht (isoliert) zu gestalten, so dass auch Messungen unter Inertgasatmosphäre möglich sind. Über die Linsen im optischen System erfolgt in bekannter Weise die Korrektur von Abbildungsfehlern, wie z.B. achromatische Fehler.at the design of these coupling elements is particularly important to that already possibilities are incorporated in the optical coupling unit to avoid errors such as Correct achromatic errors to be able to. Both the flow cell itself, as well as the coupling region for the optical coupling element is gastight to the environment (isolated) be designed so that measurements under an inert gas atmosphere are possible. About the Lenses in the optical system is carried out in a known manner, the correction aberrations, e.g. achromatic errors.

Kommerzielle Durchflusszellen, welche in den mikroskopischen Strahlengang eingekoppelt werden können sind im Allgemeinen dadurch charakterisiert, dass sie nach oben hin offen oder vom Fassungsvolumen so minimal dimensioniert sind, dass durch den Durchfluss von Nährflüssigkeiten oder Markerflüssigkeiten keine kritischen Drücke für Deckgläschen entstehen. Das Pumpvolumen muss bei diesen Durchflusszellen an die Bruchstabilität des Deckgläschens angepasst werden. Eine In-situ-Messung der Proben im Durchfluss, bei höheren Pump- und Druckverhältnissen ist somit nicht oder nur in sehr geringen Grenzen gewährleistet. Bei hochaperturigen Objektiven beispielsweise ist der Arbeitsabstand zur Probe sehr gering. Somit darf das Deckglas auf der Probe nur eine geringe Schichtdicke aufweisen, welche wiederum eine geringe Pumpleistung oder geringe Drücke bedingt. Für Objektive mit größerem Arbeitsabstand, können zwar Deckgläser mit größerer Schichtdicke eingesetzt werden, es ist aber mit einer erheblichen Verschlechterung der numerischen Apertur zu rechnen. Ein einfaches Eintauchen der Objektive in die Durchflusslösung führt nur bei nicht aggressiven, schlecht sorbierenden Lösungen mehrfach zum Ziel. Aggressive gut sorbierende Lösungen führen zu einer Beschädigung des Objektivs, welche bei mehreren Anwendungen das Objektiv unbrauchbar werden lassen.commercial Flow cells, which are coupled into the microscopic beam path can are generally characterized by being upwards open or dimensioned so minimally, that by the flow of nutrient fluids or marker fluids no critical pressures arise for coverslips. The pump volume must be adapted to the breakage stability of the coverslip in these flow cells become. An in-situ measurement of the samples in the flow, at higher pumping and pressures is therefore not guaranteed or only within very small limits. For example, with high-aperture lenses, the working distance is very small for the sample. Thus, the coverslip on the sample may only have a small layer thickness, which in turn a small Pump power or low pressures conditionally. For Lenses with longer working distance, can though coverslips with larger layer thickness but it is with a significant deterioration to calculate the numerical aperture. A simple dipping the Lenses in the flow solution only leads in non-aggressive, poorly sorbing solutions multiple goals. aggressive good sorbing solutions to lead to damage of the lens, which in several applications, the lens useless let be.

Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. In den zugehörigen Zeichnungen zeigenThe Invention will be explained in more detail using an exemplary embodiment. In the associated Drawings show

1 den Gesamtaufbau der Messzelle mit optischem Koppelelement, 1 the overall structure of the measuring cell with optical coupling element,

2 den Strahlengang der Messzelle und 2 the beam path of the measuring cell and

3 den Meniskus der Transmitterflüssigkeit. 3 the meniscus of the transmitter fluid.

In einer geschlossenen Zelle 1 befinden sich der Probenträger 2 mit den darauf immobilisierten Mikroorganismen, Zellen bzw. Gewebeproben 3. Die Proben 3 werden in der Zelle 1 über Zu – und Abläufe 4 wahlweise durch Nährsuspensionen zur Förderung des Wachstums und der Vermehrung durch Markerflüssigkeiten mit gelösten Fluoreszenzfarbstoffen oder mit umweltrelevanten fluoreszierenden Schwermetallen 15 benetzt. Im Deckelteil 5 der Zelle 1 befindet sich eine Öffnung 6, in welche zwei zueinander entgegengesetzt liegende Sammellinsen 7, 8 eingepasst werden. Das optische Koppelelement (Sammellinsen) 7, 8 stellt ein Bauteil für sich dar und kann in der Gesamtzelle 1 jederzeit gegen ein anderes Linsensystem ausgetauscht werden. Das gewünschte Dichtekriterium der Zelle 1 gegenüber der Umgebung wird beim Austausch des optischen Koppelelements 7, 8 über mehrere Gummidichtungen 17 erfüllt. Um die gewünschte Objektebene während der Messung zu fokusieren, ist der Probenträger 2 mit einer Mikrometerschraube 10 versehen, über welche der Tisch in Z-Richtung frei bewegt werden kann. In einer weiteren Ausführungsvariante mit Inertgasatmosphäre wird das optische Koppelelement nicht austauschbar gestaltet. Für diese Messungen ist eine zusätzliche Öffnung 12 in der Zelle 1 vorgesehen, über welche die gewünschte Gasatmosphäre in die Zelle 1 eingebracht wird. Das Gas wird dabei über einen Filter 13 in die Zelle 1 gepresst. Eine vorteilhafte Ausführung der Erfindung besteht darin, die zweite Sammellinse 8 durch eine Transmitterflüssigkeit 14 von der Nährflüssigkeit oder den Markierungsstoffen 15 zu trennen, um eine Verunreinigung der Oberfläche der zweiten Sammellinse 8 zu vermeiden. Diese Transmitterflüssigkeit 14 wird bei Bedarf über einen Kanal 9 im Deckel 5 eingeleitet. Als Transmitterflüssigkeit 14 eignen sich polare Flüssigkeiten, die sich in Wasser nicht lösen und durch die entstehende Oberflächenspannung einen Meniskus 16 mit wasserähnlichen Lösungen bilden.In a closed cell 1 are the sample carrier 2 with the microorganisms, cells or tissue samples immobilized thereon 3 , Samples 3 be in the cell 1 about inflows and outflows 4 optionally by nutrient suspensions to promote growth and proliferation by marker fluids with dissolved fluorescent dyes or with environmentally relevant fluorescent heavy metals 15 wetted. In the lid part 5 the cell 1 there is an opening 6 , in which two mutually opposite converging lenses 7 . 8th be fitted. The optical coupling element (converging lenses) 7 . 8th represents a component in itself and can in the total cell 1 be replaced at any time against another lens system. The desired density criterion of the cell 1 to the environment when replacing the optical coupling element 7 . 8th over several rubber seals 17 Fulfills. To focus the desired object plane during the measurement, the sample carrier is 2 with a micrometer screw 10 provided over which the table in the Z direction can be moved freely. In a further embodiment variant with an inert gas atmosphere, the optical coupling element is not designed to be interchangeable. For these measurements is an additional opening 12 in the cell 1 provided, via which the desired gas atmosphere in the cell 1 is introduced. The gas is thereby over a filter 13 into the cell 1 pressed. An advantageous embodiment of the invention is the second convergent lens 8th through a transmitter liquid 14 from the nutrient fluid or the markers 15 to separate, to contamination of the surface of the second condenser lens 8th to avoid. This transmitter fluid 14 if necessary via a channel 9 in the lid 5 initiated. As a transmitter fluid 14 Polar liquids that do not dissolve in water and a meniscus due to the resulting surface tension are suitable 16 form with water-like solutions.

2 zeigt den Strahlengang zwischen Objektiv 11 und Probe 3. Es werden insgesamt 3 (bzw. 4 bei Verwendung einer Transmitterflüssigkeit 14, [s. 3]) zusätzliche optisch aktive Flächen eingefügt, um das Objekt (die Probe 3) in die Bildebene 18 des Mikroskopes abzubilden. Dabei handelt es sich um die beiden Linsen und die Zwischenräume. Zwischen Linse 7 und dem Objektiv 11 wird durch das optische Koppelelement 7, 8 eine zusätzliche Bildebene 19 erzeugt. Weitere optisch aktive Flächen können eingeführt werden, wenn eine Farbkorrektur notwendig ist. 2 shows the beam path between lens 11 and sample 3 , There will be a total of 3 (respectively. 4 when using a transmitter liquid 14 , [s. 3 ]) added additional optically active surfaces to the object (the sample 3 ) in the picture plane 18 of the microscope. These are the two lenses and the spaces between them. Between lens 7 and the lens 11 is through the optical coupling element 7 . 8th an additional image plane 19 generated. Other optically active surfaces can be introduced if color correction is necessary.

3 zeigt die Ausbildung eines Meniskus 16 zwischen der polaren Transmitterflüssigkeit 14 und der bipolaren Nährflüssigkeit 15. 3 shows the formation of a meniscus 16 between the polar transmitter liquid 14 and the bipolar nutrient fluid 15 ,

Claims

Optical coupling element for a flow cell consisting essentially of: - a cell ( 1 ), - one or more sample carriers ( 2 ), which are within the cell ( 1 ), - processes and procedures ( 4 ) to ensure a continuous flow of different solutions through the cell ( 1 ), - openings ( 12 ) for the introduction of an inert gas atmosphere, characterized in that - a recess in the cover part ( 5 ) for the microscopic examination of the samples ( 3 ) is provided in situ, - in the recess of the cover part ( 5 ) an additional optical coupling element ( 7 . 8th ) is introduced and - the optical system consists of two optically active media, which are arranged optically opposite.

Optical coupling element according to claim 1, characterized in that in the case of aggressive samples ( 3 ) and solutions ( 15 ) to the sample ( 3 ) facing lens ( 8th ) with a film of a transmitter liquid ( 14 ) is coated.

Optical coupling element according to claim 1, characterized in that the optical coupling element ( 7 . 8th ) and in the flow cell system ( 1 ) is interchangeable.