DE102005047271A1

DE102005047271A1 - Measurement system for the light intensity of a light source in a bio analysis process uses charge measurement over a time period

Info

Publication number: DE102005047271A1
Application number: DE102005047271A
Authority: DE
Inventors: Lothar Nofer
Original assignee: Berthold Detection Systems GmbH
Current assignee: Berthold Detection Systems GmbH
Priority date: 2005-08-15
Filing date: 2005-10-01
Publication date: 2007-02-22

Abstract

The output of a photo electron multiplier, PMT, [1] is connected to a capacitor [5],pulse amplitude discriminator [6] and counter [7]. A microprocessor [8] use the count to determine time for a set number of pulses. The PMT output is also fed to a charge measuring circuit [9,11,12,13]. A control stage [10] controls the start of the measuring cycle.

Description

Die Erfindung geht aus von einem Verfahren mit den im Oberbegriff des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Ein solches Verfahren ist aus der DE 196 18 601 A1 bekannt.The invention is based on a method having the features specified in the preamble of claim 1. Such a method is from the DE 196 18 601 A1 known.

Bei den Lichtquellen handelt es sich in der Bioanalytik um Proben, in welchen in Folge von chemischen oder biologischen Reaktionen Licht erzeugt und ausgesandt, durch eingestrahltes Licht angeregt oder in welchen eingestrahltes Licht mehr oder weniger stark absorbiert wird. Die von den Proben kommenden Lichtsignale sind meistens schwach, weshalb man sie mit einen Photoelektronenvervielfacher, nachfolgend abgekürzt PMT genannt, auffängt und verstärkt. Sind die Lichtsignale so schwach, dass das PMT die auf seiner Photokathode auftreffenden Photonen einzeln nachweisen kann, dann kann man die Lichtintensität der die Photonen aussendenden Lichtquelle einfach dadurch bestimmen, dass man die vom PMT während eines bestimmten Zeitintervalls aufgefangenen Photonen zählt.at The light sources are bioanalytical samples, in which light as a result of chemical or biological reactions generated and emitted, excited by incident light or in which incident light absorbs more or less strongly becomes. The light signals coming from the samples are usually weak, which is why you use a photomultiplier tube, below abbreviated Called PMT fields and reinforced. Are the light signals so weak that the PMT's on its photocathode can detect individually incident photons, then you can see the light intensity of the Photon emitting light source simply determine that one of the PMT during of a given time interval intercepts photons.

Die DE 196 18 601 A1 offenbart zu diesem Zweck folgende Vorgehensweise: Die vom PMT gelieferten elektrischen Impulse werden zunächst verstärkt. Dem Ausgang des Verstärkers ist ist Impulshöhendiskriminator nachgeschaltet, weicher nur solche Impulse durchläßt, die eine bestimmte, einstellbare Schwellenhöhe überschreiten. Das Ausgangssignal des Impulshöhendiskriminators wird einem Zähler eingespeist, welcher mit einem Mikroprozessor verbunden ist, der das Zeitintervall vorgibt, in welchem die Impulse gezählt werden, der das Zählergebnis auswertet und den Zähler zurückstellt und startet.The DE 196 18 601 A1 discloses for this purpose the following procedure: The electrical pulses delivered by the PMT are first amplified. The output of the amplifier is followed by pulse height discriminator, which transmits only those pulses which exceed a certain, adjustable threshold height. The output of the pulse height discriminator is fed to a counter which is connected to a microprocessor which determines the time interval in which the pulses are counted, which evaluates the count and resets and starts the counter.

Die zu bestimmende Lichtintensität ist proportional der Anzahl der gezählten Photonenimpulse pro Zeiteinheit.The to be determined light intensity is proportional to the number of counted photon pulses per unit time.

Dieses Einzelphotonenzählverfahren hat eine Reihe von Vorteilen:

• Die Photonimpulse werden in Echtzeit registriert. Das erlaubt ein Zählen der eingetroffenen Photonimpulse in sehr kurzen Zeitintervallen, so dass auch schnellen Änderungen der Lichtintensität gefolgt werden kann. Das ist für die Messung von schnell ablaufenden Reaktionen sowie zur Beobachtung der Reaktionskinetik in der Probe von Bedeutung.
• Das Einzelphotonenzählverfahren ist verhältnismäßig unempfindlich gegen Schwankungen der Verstärkung des PMT, des nachgeschalteten Verstärkers und der am PMT anliegenden Hochspannung.
• Das Einzelphotonenzählverfahren ist verhältnismäßig unempfindlich gegen Störsignale, da diese in einem hohen Maße durch den Impulshöhendiskriminator unterdrückt werden.

This single photon counting method has a number of advantages:

• The photon pulses are registered in real time. This allows counting of the incoming photon pulses in very short time intervals, so that even rapid changes in light intensity can be followed. This is important for the measurement of fast reactions as well as for the observation of the reaction kinetics in the sample.
• The single-photon counting method is relatively insensitive to variations in the gain of the PMT, the post-amplifier, and the high voltage applied to the PMT.
The single-photon counting method is relatively insensitive to spurious signals since they are largely suppressed by the pulse height discriminator.

Der wesentliche Nachteil des Einzelphotonenzählverfahrens ergibt sich aus der Tatsache, dass die Impulse, die der PMT als Antwort auf ein Auftreffen eines Photons liefert, eine endliche Dauer haben. Eine Impulsdauer von 5 ns bis 10 ns ist typisch. Die Impulse treten nicht in gleichen Zeitabständen, sondern statistisch verteilt auf. Mit zunehmender Impulsrate steigt die Anzahl der Impulse, die einander mehr oder weniger überlagert sind, bis die Impulsraten schließlich so hoch sind, dass die einzelnen Impulse nicht mehr voneinander trennbar sind. Das hat zur Folge, dass im Einzelphotonenzählverfahren bei höherer Lichtintensität die Zählrate wieder abnimmt und im Extremfall keine Impulse mehr gezählt werden.Of the Significant disadvantage of Einzelphotonenzählverfahrens results the fact that the impulses that the PMT in response to a Impact of a photon delivers, have a finite duration. A Pulse duration from 5 ns to 10 ns is typical. The pulses do not occur at equal intervals, but statistically distributed. With increasing pulse rate increases the number of pulses that more or less overlap each other are until the pulse rates are finally so high that the individual impulses are no longer separable from each other. That has As a result, in the single-photon counting method at higher light intensity, the count rate again decreases and in extreme cases no impulses are counted.

Um diesem Nachteil zu begegnen lehrt die DE 19618 601 A1 , dem PMT für den Fall hoher Lichtintensitäten einen weiteren Auswertekanal nachzuschalten, mit welchem vom PMT ein durch die Photonen ausgelöstes Stromsignal abgeleitet wird. Für höhere Lichtintensitäten, bei welchen das Einzelphotonenzählverfahren keine zuverlässige Aussage mehr über die Intensität der Lichtquelle liefert, wird dieses Stromsignal als Maß für die Lichtintensität ausgewertet. Die Stromstärke ist proportional der Lichtintensität. Der durch das PMT fließende Strom unterliegt jedoch statistischen Schwankungen, die vom statistisch variierenden Eintreffen der Photonen herrühren. Um dennoch einen aussagekräftigen, stabilen Mittelwert der Stromstärke zu erreichen, wird der durch das PMT fließende Strom geglättet, indem mittels eines Integriergliedes ein Stromintegral gebildet wird. Mittels eines Analogverstärkers wird das Stromsignal verstärkt und in einem Analog-Digital-Wandler digitalisiert, z. B. in eine Frequenz gewandelt, deren Impulse während eines vorgegebenen Zeitintervalls in einem Zähler als Stromintegralwert addiert werden.To counter this disadvantage teaches the DE 19618 601 A1 to connect the PMT for the case of high light intensities another evaluation channel, with which the PMT a current-triggered by the photons current signal is derived. For higher light intensities, in which the single-photon counting method no longer provides reliable information about the intensity of the light source, this current signal is evaluated as a measure of the light intensity. The current is proportional to the light intensity. However, the current flowing through the PMT is subject to statistical fluctuations resulting from the statistically varying arrival of the photons. Nevertheless, to achieve a meaningful, stable mean value of the current, the current flowing through the PMT is smoothed by forming a current integral by means of an integrator. By means of an analog amplifier, the current signal is amplified and digitized in an analog-to-digital converter, for. B. converted into a frequency whose pulses are added during a predetermined time interval in a counter as current integral value.

Die Bestimmung der Lichtintensität mittels einer Strommessung, wie es in der DE 196 18 601 A1 offenbart ist, hat Nachteile:

• Das Verfahren ist, wie die DE 196 18 601 A1 bestätigt, anfällig gegen Veränderungen der Verstärkung des PMT und der nachgeschalteten Verstärker sowie gegen Veränderungen der am PMT anliegenden Hochspannung, z. B. aufgrund von Temperaturschwankungen.
• Da der Strom durch das PMT entsprechend dem statistischen Einfall der Photonen eine statistisch schwankende, sich impulsförmig verändernde Stromstärke hat, ist vor allem im unteren Bereich des Strommeßverfahrens eine Glättung des Stromsignales mit großer Zeitkonstante erforderlich. Das hat zur Folge, dass das Stromsignal einer Veränderung der Lichtintensität erst mit entsprechender zeitlicher Verzögerung folgt und rasche Änderungen im Intensitätsverlauf, z. B. kurzzeitige auftretende Maximas, nicht oder nur eingeschränkt beobachtet werden können, so dass es schwer ist, mittels einer Strommessung Aussagen über die Reaktionskinetik in der Probe zu gewinnen oder schnell ablaufende Reaktionen (flash Lumineszenz) überhaupt zu messen.
• Ein eindeutiger zeitlicher Bezug zwischen dem Lichtsignal und dem Stromsignal ist nicht gegeben.
• Das Stromsignal steht bei der in der DE 196 18 601 A1 gewählten Art der Auskopplung des Signals nicht in einem linearen Zusammenhang mit dem Photonenstrom.

The determination of the light intensity by means of a current measurement, as in the DE 196 18 601 A1 disclosed has disadvantages:

• The procedure is like the DE 196 18 601 A1 confirmed, susceptible to changes in the gain of the PMT and the downstream amplifier as well as changes in the voltage applied to the PMT, z. B. due to temperature fluctuations.
• Since the current through the PMT has a statistically fluctuating, pulsed current intensity in accordance with the statistical incidence of the photons, smoothing of the current signal with a large time constant is required, especially at the lower end of the current measuring process. This has the consequence that the current signal of a change in the light intensity only with ent speaking delay follows and rapid changes in the intensity course, z. B. short-term occurring Maximas, can not or only partially be observed, so that it is difficult to gain by means of a current measurement statements about the reaction kinetics in the sample or fast running reactions (flash luminescence) to measure.
• A clear temporal relation between the light signal and the current signal is not given.
• The current signal is in the DE 196 18 601 A1 selected type of coupling of the signal is not in a linear relationship with the photon current.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Messen der Lichtintensität einer Lichtquelle in der Bioanalytik anzugeben welches bei niedriger intensität der Lichtquelle Einzelphotonen zählt und bei höherer Intensität der Lichtquelle mehr und/oder genauere Informationen über den Intensitätsverlauf der Lichtquelle zu gewinnen erlaubt.Of the The present invention is based on the object, a method for measuring the light intensity indicate a light source in bioanalytics which at lower intensity the light source counts single photons and at higher intensity the light source more and / or more accurate information about the intensity curve allowed to win the light source.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den im Anspruch 1 angegebenen Merkmalen. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.These Task is solved by a method having the features specified in claim 1. advantageous Further developments of the invention are the subject of the dependent claims.

Erfindungsgemäß wird beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität die am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellte elektrische Ladung in einem Speicher gesammelt, nach einer bestimmten Zeitspanne gemessen und daraus die Anzahl der in dieser Zeitspanne empfangenen Photonen bestimmt. Um das zu ermöglichen, wird die im Speicher gesammelte Ladung mit der Ladung verglichen, die jedes empfangene Photon zu der im Speicher gesammelten Ladung im Mittel beiträgt. Die mittlere Ladung je Photon wird erfindungsgemäß gewonnen, indem beim Beobachten der Lichtquelle mit so niedriger Intensität, dass die aufgefangenen Photonen zu einzelnen, unterscheidbaren elektrischen Impulsen am Ausgang des Photoelektronenvervielfacher führen, die Photonen nicht nur gezählt werden, sondern zusätzlich auch die elektrische Ladung gesammelt und bestimmt wird, welche von den gezählten Photonen am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellt wird. Teilt man die bei niedriger Intensität gesammelte Ladung durch die Anzahl der während des Sammelns der Ladung gezählten Photonen, dann ergibt sich daraus die mittlere elektrische Ladungsmenge pro Photon. Diese mittlere Ladungsmenge pro Photon ist ein Eichfaktor, der bei der Apparatur, mit welcher man die mittlere Ladung pro Photon nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt hat, benutzt wird, um beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität aus der gesammelten Ladung auf die Anzahl der Photonen zurückzuschließen, welche die angesammelte Ladungsmenge bewirkt haben. Die während eines Zeitintervalls gesammelte Ladung ist proportional zu der Anzahl der in diesem Zeitintervall im Photoelektronenvervielfacher eingetroffenen Photonen. Das gilt auch beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität, bei weicher sich die von den Photonen im Photoelektronenvervielfacher erzeugten elektrischen Impulse sämtlich oder teilweise nicht mehr voneinander trennen lassen.According to the invention Watching light sources with higher intensity at the Output of the photomultiplier provided Electric charge collected in a store, according to a specific Time span measured and from this the number in this time span received photons determined. In order to make that possible, the memory will be stored collected charge compared with the charge that each received Photon contributes to the accumulated charge in the store on average. The average charge per photon is obtained according to the invention by observing the light source with such low intensity that the captured photons to individual, distinguishable electrical pulses at the output of the Lead photomultiplier, not only counted the photons but also in addition the electric charge is collected and determined which of the counted Photons provided at the output of the photomultiplier becomes. Divide the charge accumulated at low intensity through the Number of during of collecting the cargo counted Photons, this results in the average amount of electrical charge per photon. This average charge per photon is a calibration factor that at the apparatus, with which the mean charge per photon according to the inventive method has been determined to be used when observing light sources with higher intensity from the accumulated charge to deduce the number of photons, which have caused the accumulated charge amount. The during a Time interval collected charge is proportional to the number the arrived in this time interval in the photomultiplier Photons. This also applies when observing light sources with higher intensity, with softer those generated by the photons in the photomultiplier electrical impulses all or partially no longer separate from each other.

Bei niedriger Intensität der Lichtquelle, bei welcher die aufgefangenen Photonen zu einzelnen, unterscheidbaren elektrischen Impulsen am Ausgang des PMT führen, hat das erfindungsgemäße Verfahren alle Vorteile des Einzelphotonenzählverfahrens, welche einleitend dargestellt worden sind.at low intensity the light source, in which the collected photons to individual, distinguishable carry electrical pulses at the output of the PMT, has the inventive method all the advantages of single photon counting, which are preliminary have been shown.

Beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität, bei welcher die von den empfangenen Photonen im PMT erzeugten elektrischen Signale nicht mehr oder nur noch zum Teil einzeln unterscheidbar sind, hat die Erfindung den Vorteil, dass – wie beim bekannten Strommeßverfahren – das zeitliche Auflösungsvermögen des PMT, welches die Anwendbarkeit des Einzelphotonenzählverfahrens beschränkt, keine Rolle spielt. Weiterhin ist das Verfahren unempfindlich gegenüber Veränderungen der Verstärkung des PMT, der ihm nachgeschalteten Verstärker sowie der an das PMT angelegten Hochspannung, z. B. aufgrund von Temperaturschwankungen, aber auch aufgrund von Alterung, denn der Eichfaktor "Ladung je Photon" ist einer fortlaufenden Aktualisierung zugänglich. Zugleich werden eine Reihe von weiteren Vorteilen erreicht, die das bekannte Strommeßverfahren nicht hat:

• Die Zeitintervalle, in welchen die am Ausgang des PMT auftretende Ladung gesammelt wird, können ebenso kurz oder – wegen der höheren Lichtintensität -kürzer sein als beim Einzelelektronenzählverfahren. Deshalb kann der zeitliche Intensitätsverlauf sehr viel besser beobachtet werden als beim bekannten Strommeßverfahren, unter Umständen sogar noch besser als beim Einzelphotonenzählverfahren.
• Die Zunahme der Ladung im Speicher bzw. die daraus ableitbare Zählrate hat einen engen, eindeutigen, zeitlichen Bezug zur Intensität des Lichtsignals. Der für das bekannte Strommeßverfahren charakteristische Nachlauf des Stromsignals gegenüber dem Lichtsignal wird vermieden.
• Die Zunahme der Ladung im Speicher bzw. die daraus ableitbare Zählrate steht in einem linearen Zusammenhang mit dem vom PMT aufgefangenen Photonenstrom.
• Es können Spitzen im Intensitätsverlauf der Lichtquelle beobachtet und gemessen werden. Das ist z. B. vorteilhaft bei der Beobachtung des Reaktionsverlaufs bei von schnell verlaufenden Reaktionen (Flash Lumineszenz).
• Hat die Intensität der Lichtquelle einen solchen Verlauf, dass sowohl niedrigere Intensitäten auftreten, welche das Anwenden des Einzelphotonenzählverfahrens erlauben, als auch höhere Intensitäten, bei denen die einzelnen Photonen im Ausgangssignal des PMT nicht mehr unterscheidbar sind, dann lassen sich die gewonnenen Messergebnisse aus dem Einzelphotonenzählverfahren und aus dem erfindungsgemäßen, mit der Ladungssammlung arbeitenden Verfahren einander zeitlich eindeutig zuordnen und die jeweiligen Meßsignale der beiden Verfahrensvarianten lassen sich einfach ineinander überführen. Auf diese Weise läßt sich ein Intensitätsverlauf, der sich von einem Bereich hoher Intensität bis in einen Bereich mit niedriger Intensität erstreckt, in welcher eine Zählung einzelner Photonen möglich ist, optimal beobachten.

When observing light sources of higher intensity, in which the electrical signals generated by the photons received in the PMT are no longer or only partially distinguishable, the invention has the advantage that - as in the known current measuring method - the temporal resolution of the PMT, which limits the applicability of the single photon counting method is irrelevant. Furthermore, the method is insensitive to changes in the gain of the PMT, its downstream amplifier and the high voltage applied to the PMT, z. B. due to temperature fluctuations, but also due to aging, because the calibration factor "charge per photon" is a continuous update accessible. At the same time a number of other advantages are achieved, which does not have the known Strommeßverfahren:

• The time intervals in which the charge occurring at the output of the PMT is collected may be as short or - because of the higher light intensity - shorter than in the single electron counting method. Therefore, the temporal intensity curve can be observed much better than in the known current measuring method, possibly even better than the single-photon counting method.
• The increase in charge in the memory or the count rate derived from it has a narrow, unambiguous, temporal relation to the intensity of the light signal. The characteristic of the known current measuring process lag of the current signal relative to the light signal is avoided.
• The increase in the charge in the memory or the count rate derived from it is linearly related to the photon current absorbed by the PMT.
• It is possible to observe and measure peaks in the intensity course of the light source. This is z. B. advantageous in the observation of the course of reaction in fast-running reactions (flash luminescence).
• If the intensity of the light source has such a course that both lower intensities occur, which allow the use of the Einzelphotonenzählverfahrens, as well as higher intensities, in which the individual photons in the output signal of the PMT are no longer distinguishable, then the results obtained from the Einzelphotonenzählverfahren and from the novel, working with the charge collection method time each other unique and the respective measurement signals of the two variants of the method can be easily converted into each other. In this way, an intensity profile extending from a high-intensity region to a low-intensity region in which a count of individual photons is possible can be optimally observed.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann so durchgeführt werden, dass die Zeitspanne, über welche die einzelnen Photonen am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers gezählt werden, vorgewählt wird. Die Vorwahl kann so vor sich gehen, dass unter einer Anzahl vorgegebener Zeitspannen eine unter den gegebenen Versuchsbedingungen besonders geeignete Zeitspanne ausgewählt wird. Es besteht aber auch die Möglichkeit, den Zähler, der dem Ausgang des PMT nachgeschaltet ist, auf eine vorgewählte Anzahl von Photonen voreinzustellen und die Zeitspanne zu messen, die benötigt wird, um die vorgewählte Anzahl von Photonen zu erreichen.The inventive method can be done that way be that time, about which the individual photons at the output of the photomultiplier counted be selected. The area code can be such that under a number of predefined Time periods a particularly suitable under the given experimental conditions Time span selected becomes. But there is also the possibility the counter, which is downstream of the output of the PMT, to a preselected number preset by photons and measure the amount of time it takes around the selected one Reach number of photons.

In entsprechender Weise kann beim Beobachten einer Lichtquelle mit höherer Intensität die Zeitspanne vorgewählt werden, während der die am Ausgang des PMT auftretende Ladung gesammelt wird. Alternativ ist es möglich, die beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellte elektrische Ladung zu sammeln, bis eine vorgewählte Ladungsmenge erreicht ist und die dafür benötigte Zeitspanne zu messen.In in the same way, when observing a light source with higher intensity the time span is selected be while the charge occurring at the output of the PMT is collected. alternative Is it possible, when observing higher intensity light sources at the output of the Photoelectric multiplier provided electrical Collect charge until a preselected amount of charge is reached is and the time required for it to eat.

Die Person, die das erfindungsgemäße Verfahren durchführt, hat die Möglichkeit, unter den genannten Möglichkeiten jene auszuwählen, die den Versuchsbedingungen, der Lichtquelle und der durch die Untersuchung zu beantwortenden Frage am besten gerecht wird. So kann man, wenn es darum geht, den zeitlichen Verlauf der Lichtintensität mit möglichst großer zeitlicher Auflösung zu verfolgen, mit entsprechend kurz gewählten Zeitintervallen arbeiten. Kommt es eher darauf an, den Eichfaktor (Ladung pro Photon) möglichst genau zu bestimmen, wird es sich empfehlen, am Photonenzähler eine entsprechend hohe Photonenzahl vorzugeben, die beim Zählvorgang erreicht werden soll. Soll in erster Linie das gesamte Ausmaß einer Reaktion in einer Probe ermittelt werden, ist es angemessen, eine Zeitspanne vorzuwählen, die so lang ist, dass sie die mutmaßliche Dauer der Reaktion umfaßt. Wird eine besonders genaue Messung der Lichtintensität angestrebt, ist es angemessen, am Zähler eine entsprechend hohe Anzahl von gezählten Photonen vorzugeben bzw. am Ladungssammler das Erreichen einer entsprechend hohen Ladungsmenge vorzugeben. Die unterschiedlichen Vorgaben können bei der Untersuchung einer Serie gleichartiger Proben auch alternativ zur Anwendung kommen, um ein möglichst vollständiges Bild über Umfang, Dauer und Ablauf der in gleichartigen Proben ablaufenden Reaktion zu erhalten.The Person using the method according to the invention performs, has the possibility, under the mentioned possibilities select those the experimental conditions, the light source and the examination best answer to the question to be answered. So you can, if it is about the temporal course of the light intensity with as possible greater temporal resolution to work with correspondingly short time intervals. It depends more on the calibration factor (charge per photon) as possible to determine exactly, it will be recommended, at the photon counter one to specify a correspondingly high number of photons during the counting process should be achieved. Primarily the whole extent of a Reaction can be determined in a sample, it is appropriate to a To select time span which is so long that it covers the presumed duration of the reaction. Becomes a particularly accurate measurement of light intensity, it is appropriate at the counter to specify a correspondingly high number of counted photons or at the charge collector reaching a correspondingly high amount of charge pretend. The different specifications can be used in the investigation of a Series of similar samples can also be used as an alternative to one as possible complete Picture over Scope, duration and course of the running in similar samples To get reaction.

Die beigefügte einzige Zeichnung ist ein Blockschaltbild einer Apparatur, die zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann. Die Apparatur hat einen Photoelektronenvervielfacher (PMT) 1 mit einer Kaskade von Dynoden, die über einen Spannungsteiler mit einer Hochspannungsquelle 2 verbunden sind, die durch einen Schalter 3 vom PMT 1 getrennt werden kann.The accompanying single drawing is a block diagram of an apparatus which may be used to carry out the method of the invention. The apparatus has a photomultiplier tube (PMT) 1 with a cascade of dynodes that have a voltage divider with a high voltage source 2 connected by a switch 3 from the PMT 1 can be separated.

Der Ausgang des PMT 1 ist zum einen über einen Kondensator 4 in Reihe mit einem breitbandigen Impulsverstärker 5, mit einem Impulshöhendiskriminator 6 und einem Zähler 7 verbunden, der mit einem Mikroprozessor 8 verbunden ist. Im Einzelphotonenzählverfahren werden die am Ausgang des PMT 1 auftretenden Spannungsimpulse über dem Kondensator 4 abgegriffen und durch den Verstärker 5 verstärkt. Störsignale, die unterhalb einer einstellbaren Schwelle liegen, sowie in dem Ausgangssignal des Verstärkers 5 enthaltenes Rauschen werden durch den Impulshöhendiskriminator 6 unterdrückt. Impulse, die der Impulshöhendiskriminator durchläßt, werden vorzugsweise so umgeformt, dass sie gleiche Höhe und Breite haben. So werden sie zum Zähler 7 weitergeleitet und gezählt. Das Zählergebnis wird im Mikroprozessor 8 ausgewertet. Über den Mikroprozessor 8 können entweder das Zeitintervall, in welchem der Zähler 7 zählt, oder eine vom Zähler 7 zu erreichende Anzahl von Zählimpulsen vorgegeben werden. Im zuletzt genannten Fall ermittelt der Mikroprozessor 8 die Zeit, die benötigt wird, um die vorgegebene Anzahl von Zählimpulsen zu erreichen.The output of the PMT 1 is on the one hand via a capacitor 4 in series with a broadband pulse amplifier 5 , with a pulse height discriminator 6 and a counter 7 connected to a microprocessor 8th connected is. In the single photon counting process, those at the output of the PMT 1 occurring voltage pulses across the capacitor 4 tapped and through the amplifier 5 strengthened. Noise signals that are below an adjustable threshold, as well as in the output signal of the amplifier 5 Noise contained by the pulse height discriminator 6 suppressed. Pulses transmitted by the pulse height discriminator are preferably reshaped to have the same height and width. This is how they become a counter 7 forwarded and counted. The counting result is in the microprocessor 8th evaluated. About the microprocessor 8th can either the time interval in which the counter 7 counts, or one from the counter 7 to be reached number of counts are specified. In the latter case, the microprocessor determines 8th the time it takes to reach the predetermined number of counts.

Zusätzlich ist der Ausgang des PMT 1 mit einem Speicher 9 verbunden, welcher die am Ausgang des PMT 1 auftretende elektrische Ladung speichert, im einfachsten Fall in ein Kondensator oder eine Schaltungsabordnung mit einem Kondensator als Speicher. Ein mit dem Mikroprozessor 8 verbundenes Steuermodul 10 bestimmt den Startzeitpunkt für den Speicher 9 und setzt diesen wieder zurück, wenn entweder eine vom Mikroprozessor 8 vorgegebene Zeitspanne erreicht ist oder wenn die gesammelte Ladung einen Schwellenwert erreicht hat, der durch einen Schwellenwertdetektor 11 überwacht wird. Die Höhe des Schwellenwertes kann durch den Mikroprozessor 8 vorgegeben werden und wird in jedem Fall so gewählt, dass sie unterhalb der Kapazität des Speichers 9 liegt. Der Ausgang des Schwellenwertschalters 11 ist mit dem Steuermodul 10 verbunden und meldet das Erreichen des vorgegebenen Schwellenwertes an das Steuermodul 10, woraufhin dieses den Speicher 9 zurückstellt.In addition, the output of the PMT 1 with a memory 9 connected to the output of the PMT 1 occurring electric charge stores, in the simplest case in a capacitor or a Schaltabordordnung with a capacitor as a memory. One with the microprocessor 8th connected control module 10 determines the starting time for the memory 9 and put this back, if either one from the microprocessor 8th predetermined period of time is reached or when the accumulated charge has reached a threshold which is exceeded by a threshold detector 11 is monitored. The height of the threshold can be determined by the microprocessor 8th be specified and will in any case be chosen so that they are below the capacity of the memory 9 lies. The output of the threshold switch 11 is with the control module 10 connected and reports the achievement of the predetermined threshold value to the control module 10 , whereupon this the memory 9 resets.

Der Ausgang des Speichers 9 ist nicht nur mit dem Schwellwertdetektor 11 verbunden, sondern über einen steuerbaren Schalter 12 auch mit einem Analog-Digital-Wandler 13, welcher die über den geschlossenen steuerbaren Schalter 12 abfließende Ladung in ein digitales Signal, z. B. in eine der Ladungsmenge proportionale Frequenz wandelt, welche der Mikroprozessor 8 misst und als Maß für die gespeicherte Ladungsmenge nimmt.The output of the memory 9 is not just with the threshold detector 11 but via a controllable switch 12 also with an analog-to-digital converter 13 which is above the closed controllable switch 12 outgoing charge into a digital signal, z. B. in one of the charge quantity proportional frequency converts which the microprocessor 8th measures and takes as a measure of the stored charge.

Aus der bei niedriger Lichtintensität im Einzelphotonenzählverfahren gewonnenen und vom Zähler 7 registrierten Photonenzahl und der gleichzeitig im parallelen Zweig ermittelten Ladungsmenge im Speicher 9 berechnet der Mikroprozessor 8 laufend die Ladung pro Photon als Eichfaktor. Bei höheren Lichtintensitäten, die dazu führen, dass nicht mehr alle vom PMT 1 aufgefangenen Photonen als einzelne Ereignisse gezählt werden können, errechnet der Mikroprozessor aus der in einer bestimmten Zeitspanne gesammelten Ladung mit Hilfe des Eichfaktors die der gespeicherte Ladungsmenge entsprechende Anzahl der Photonen, die der Lichtintensität im gewählten Zeitintervall proportional ist.From the low light intensity obtained in the single photon counting method and from the counter 7 registered number of photons and simultaneously determined in the parallel branch amount of charge in the memory 9 calculates the microprocessor 8th running the charge per photon as a calibration factor. At higher light intensities, that will no longer cause all of the PMT 1 When the collected photons can be counted as individual events, the microprocessor uses the calibration factor to calculate the number of photons corresponding to the stored charge quantity, which is proportional to the light intensity in the selected time interval, from the charge collected in a certain period of time.

Ist die Lichtintensität so groß, dass der Schwellwertdetektor 11 anspricht, bevor die vorgegebene Zeitspanne abgelaufen ist, wird der Zeitpunkt des Ansprechens des Schwellwertdetektors 11 an den Mikroprozessor 8 gemeldet, welcher aus der bis zum Ansprechen des Schwellwertdetektors 11 benötigten Zeitspanne und aus der am Schwellwertdetektor 11 voreingestellten Ladungsmenge die Ladungsmenge pro Zeiteinheit errechnet und daraus mit Hilfe des Eichfaktors die Photonenzahl pro Zeiteinheit errechnet. Gleichzeitig mit dem Ansprechen des Schwellwertdetektors 11 stellt das Steuermodul 10 den Speicher 9 zurück und startet einen neuen Meßzyklus.Is the light intensity so high that the threshold detector 11 Before the predetermined period of time has elapsed, the time of the response of the threshold detector is addressed 11 to the microprocessor 8th which is from the until the response of the threshold detector 11 required period of time and from the threshold detector 11 preset amount of charge calculates the amount of charge per unit of time and calculates therefrom with the aid of the calibration factor the number of photons per unit of time. Simultaneously with the response of the threshold detector 11 puts the control module 10 the memory 9 back and starts a new measurement cycle.

Alternativ ist es möglich, dem Steuermodul 10 keine bestimmte Zeitspanne vorzugeben, die vom Beginn des Meßvorgangs bis zum Öffnen des steuerbaren Schalters 10 abläuft, sondern lediglich eine Schwelle am Schwellenwertdetektor 11 vorzugeben und die Zeit bis zum Erreichen des Schwellenwertes mit Hilfe des Mikroprozessors 8 zu messen.Alternatively, it is possible for the control module 10 do not specify a certain period of time from the beginning of the measuring process to the opening of the controllable switch 10 expires, but only a threshold on the threshold detector 11 specify and the time to reach the threshold with the help of the microprocessor 8th to eat.

Um den Eichfaktor auch in Meßpausen aktualisieren zu können, kann das PMT 1 im Meßpausen von einer Standard-Liehtquelle, z. B. von einer Leuchtdiode, beaufschlagt werden.In order to be able to update the calibration factor during measurement pauses, the PMT 1 in measurement breaks from a standard Liehtquelle, z. B. from a light emitting diode, are acted upon.

Der Schwellenwertdetektor 11 kann weiterhin dazu herangezogen werden, eine Überlastung des PMT 1 im Falle zu hoher Lichtintensitäten zu verhindern, indem die Hochspannungsquelle 2 beim Erreichen eines vorgegebenen Schwellenwertes vom PMT 1 getrennt wird.The threshold detector 11 can still be used to overload the PMT 1 in the case of preventing too high light intensities by the high voltage source 2 upon reaching a predetermined threshold from the PMT 1 is disconnected.

Claims

Method for measuring the light intensity of a light source in bioanalytics, in particular from samples in which luminescence or fluorescence reactions take place by collecting photons of the light source with a photomultiplier, which provides a certain amount of electrical charge for each photon collected at an output of the photomultiplier wherein in a region of a low intensity of the light source, in which the collected photons lead to individual, distinct electrical pulses at the output of the photo-electron multiplier, the photons are counted by counting caused by them at the output of the photo-electron multiplier electrical pulses over a period of time, characterized in that the electric charge is determined by observing the light source with the lower intensity in addition, which of a photon at the output of the photo-electron multiplier in the with tel, and that, when observing higher intensity light sources, the electrical charge provided at the output of the photomultiplier tube is collected in a memory, measured after a period of time, compared with the mean charge per photon and therefrom the number of times in the time period received photons is determined.

Method according to claim 1, characterized in that that the time span over which the individual photons at the output of the photomultiplier counted be selected becomes.

Method according to claim 1, characterized in that that the photons at the output of the photomultiplier to to reach a preselected Number counted and the one for that required time span is measured.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the time over which the charge occurring in the observation of a light source of higher intensity at the output of the photomultiplier in the store is selected.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized that when watching light sources with higher intensity at the output of the Photoelectric multiplier provided electrical Charge is accumulated in the store until a preselected charge amount is reached, and that's for it needed Time span is measured.