DE102005046638C5

DE102005046638C5 - Scanmikroskop und Verfahren zur Probenmanipulation mit einem Manipulationslichtstrahl in einem Scanmikroskop

Info

Publication number: DE102005046638C5
Application number: DE102005046638.9A
Authority: DE
Inventors: Dr. Knebel Werner
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2005-09-29
Publication date: 2024-02-15
Anticipated expiration: 2025-09-30
Also published as: US8339703B2; DE102005046638A1; WO2007036531A1; DE102005046638B4; US20090073555A1

Abstract

Scanmikroskop (1) mit einer Lichtquelle (3), die einen Beleuchtungslichtstrahl (5) zum Beleuchten einer Probe (7) emittiert, der entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs (9) verläuft, und der mit einer Strahlablenkeinrichtung (11) über oder durch die Probe (7) führbar ist, und mit einer weiteren Lichtquelle (13), die einen Manipulationslichtstrahl (15), der entlang eines Manipulationsstrahlengangs (16) verläuft, erzeugt, wobei der Manipulationslichtstrahl (16) einen Manipulationsstrahlfokus (18) ausgebildet hat, der ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung (11) über oder durch die Probe (7) führbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blendenanordnung der weiteren Lichtquelle (13) außerhalb des Beleuchtungsstrahlengangs (9) und im Manipulationslichtstrahl (15) nachgeschaltet ist, mit dem die Größe des Manipulationsstrahlfokus (18) veränderbar ist, und dass die Blendenanordnung mit einer Steuereinheit (30) verbunden ist, die die Änderung der Größe des Manipulationsstrahlfokus (18) in Abhängigkeit von der Zeit erlaubt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Scanmikroskop. Im Besonderen betrifft die Erfindung ein Scanmikroskop mit einer Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten einer Probe emittiert, der entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs verläuft, und der mit einer Strahlenablenkeinrichtung über oder durch die Probe führbar ist. Ferner ist das Scanmikroskop mit einer weiteren Lichtquelle, die einen Manipulationslichtstrahl erzeugt, der entlang eines Manipulationsstrahlengangs verläuft, versehen. Der Manipulationslichtstrahl hat einen Manipulationsstrahlfokus ausgebildet, der ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe führbar ist.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Probenmanipulation mit einem Manipulationslichtstrahl in einem Scanmikroskop. Im Besonderen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Probenmanipulation mit einem Manipulationslichtstrahl in einem Scanmikroskop, wobei von einer Lichtquelle ein Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten einer Probe emittiert wird, der entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs verläuft, und der mit einer Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe geführt wird. Mit einer weiteren Lichtquelle wird ein Manipulationslichtstrahl erzeugt, der entlang eines Manipulationsstrahlengangs verläuft, und der einen Manipulationsstrahlfokus ausgebildet hat, der ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe geführt wird.
Die deutsche Patentanmeldung DE 102 33 549 A1 offenbart ein Scanmikroskop mit einer Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten einer Probe emittiert, der entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs verläuft, und der mit einer Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe führbar ist. Ein Detektor empfängt das von der Probe ausgehende Detektionslicht, das entlang eines Detektionsstrahlengangs verläuft. Eine weitere Lichtquelle erzeugt einen Manipulationslichtstrahl, der entlang eines Manipulationsstrahlengangs verläuft. Der Manipulationslichtstrahl ist ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe führbar.
Die Deutsche Offenlegungsschrift DE 199 54 933 A1 offenbart eine Anordnung zur Einkopplung mindestens eines Strahls einer optischen Pinzette zum Einfangen von Teilchen und/oder eines Bearbeitungsstrahls in einen mikroskopischen Strahlengang, vorzugsweise in einem Laser-Scanning-Mikroskop. Mittel zur frei einstellbaren Veränderung der Lage des Strahlfokus der optischen Pinzette und/oder des Bearbeitungsstrahls bezüglich der Veränderung der Fokusposition des Mikroskops sind vorgesehen.
Das U.S. Patent US 6,094,300 A offenbart ein Laser-Scanning-Mikroskop, das zwei Scan-Einrichtungen aufweist. Dabei wird über eine Scan-Einrichtung der Beleuchtungsstrahl geführt, über die andere Scan-Einrichtung wird z.B. ein weiterer Beleuchtungsstrahl bzw. ein Manipulationslichtstrahl geführt. Die von den beiden Scan-Einrichtungen kommenden Lichtstrahlen werden derart zusammengeführt, dass sie gemeinsam auf einen Punkt der Probe treffen. Diese Anordnung gestaltet sich jedoch als schwierig in der Handhabung.
Aus der DE 102 47 249 A1 und der DE 100 39 520 A1 sind jeweils Vorrichtungen bekannt, bei welchen eine Fokussierung des Manipulationslichtes bzw. eine Fokusposition entlang der optischen Achse veränderbar ist.
Der gesamte hier erwähnte Stand der Technik hat den Nachteil, dass wenn Bereiche einer Probe manipuliert werden sollen, die größer als der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls sind, muss man mit dem Manipulationsstrahl diese Bereiche abscannen. Dies ist umständlich und zeitaufwendig, und macht die Untersuchung schneller Prozesse unmöglich.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Scanmikroskop zu schaffen, mit dem es möglich ist, auf einfache Art und Weise die Größe und die Position des Manipulationslichtstrahls zu verändern. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Scanmikroskop, das die Merkmale des Anspruchs 1 umfasst und welches die erforderlichen Merkmale der Erfindung enthält.
Ferner ist es auch Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem auf einfache Weise die Größe und die Position des Fokus eines Manipulationslichtstrahls verändert werden kann.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Anspruchs 3 umfasst und welches die erforderlichen Merkmale der Erfindung enthält.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Es ist von Vorteil, wenn ein optisches Mittel der weiteren Lichtquelle im Manipulationslichtstrahl nachgeschaltet ist, mit dem die Größe des Manipulationsstrahlfokus veränderbar ist. Dabei kann das optische Mittel eine Zoomoptik oder eine Blendenanordnung sein.
Ferner ist von Vorteil, wenn das optische Mittel mit einer Steuereinheit verbunden ist, das die Änderung der Größe des Manipulationsstrahlfokus in Abhängigkeit von der Zeit erlaubt.
Ebenso ist es bei dem Verfahren zur Probenmanipulation mit einem Manipulationslichtstrahl in einem Scanmikroskop von Vorteil, wenn der weiteren Lichtquelle ein optisches Mittel im Manipulationslichtstrahl nachgeschaltet wird, mit dem die Größe des Manipulationsstrahlfokus verändert werden kann.
Es gibt mehrere Moden mit denen der Manipulationslichtstrahl verändert werden kann. Zum einen wird ausgehend von einer festen Position des Manipulationslichtstrahls die Größe des Manipulationslichtstrahls auf der Probe mindestens einmal vergrößert. Eine weitere Möglichkeit ist, dass ebenfalls ausgehend von einer festen Position des Manipulationslichtstrahls auf der Probe die Größe des Manipulationslichtstrahlfokus mindestens einmal verkleinert wird. Schließlich ist es möglich, dass die Position des Manipulationslichtstrahls auf der Probe derart verändert wird, dass die einzelnen Manipulationsstrahlfoki sich zumindest teilweise überlappen.
Mit der Steuereinheit, die mit dem optischen Mittel verbunden ist, kann dabei die Größe und die Position des Manipulationsstrahlfokus in Abhängigkeit von der Zeit beliebig gesteuert werden.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung können den Unteransprüchen entnommen werden.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt, und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:

1 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform des Scanmikroskops gemäß der gegenwärtigen Erfindung;
2 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des Scanmikroskops gemäß der gegenwärtigen Erfindung;
3a eine schematische Darstellung eines ersten Modus mit dem der Fokus des Manipulationslichtstrahls auf der Probe verändert wird; und
3b eine zweite nicht erfindungsgemäße Ausführungsform, mit der die Position des Fokus des Manipulationslichtstrahls auf der Probe verändert wird.

1 zeigt ein Scanmikroskop 1, das mit einer Lichtquelle 3 versehen ist. Die Lichtquelle 3 emittiert einen Beleuchtungslichtstrahl 5, der zum Beleuchten einer Probe 7 vorgesehen ist, die zumindest auf einem XY-Tisch 8 angebracht ist. Der Lichtquelle 3 ist ein Beleuchtungspinhole 10 nachgeschaltet. Der Beleuchtungsstrahlengang 9 ist mit einer Strahlablenkeinrichtung 11 über oder durch die Probe 7 führbar. Es ist eine weitere Lichtquelle 13 vorgesehen, die einen Manipulationslichtstrahl 15 emittiert, der entlang eines Manipulationsstrahlengangs 16 verläuft. Der Manipulationslichtstrahl 15 wird mittels eines Umlenkelements 17 auf die Strahlablenkeinrichtung 11 gerichtet. In der Strahlablenkeinrichtung 11 treffen der Manipulationslichtstrahl 15 und der Beleuchtungslichtstrahl 5 an einem Ort zusammen. Der Manipulationsstrahlengang 16 und der Beleuchtungsstrahlengang 9 verlaufen über eine Scanoptik 22 und eine Tubusoptik 24, und werden schließlich vom Objektiv 25 des Scanmikroskops 1 auf die Probe 7 abgebildet. Der Manipulationslichtstrahl 15 hat auf der Probe 7 einen Manipulationslichtstrahlfokus 18. Das von der Probe 7 ausgehende Detektionslicht 28 durchtritt einen dichroitischen Strahlteiler 26 und ein vor einem Detektor 23 angeordnetes Detektionspinhole 27. Das optische Mittel 20 ist mit einer Steuereinheit 30 verbunden, über die die Änderung der Größe des Manipulationsstrahlfokus 18 in Abhängigkeit von der Zeit erzielt wird. In der hier beschriebenen Ausführungsform ist das optische Mittel 20 als eine Zoomoptik dargestellt.
2 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Scanmikroskops 1. Der Aufbau des Scanmikroskops 1 ist mit dem in der 1 dargestellten Aufbau bis auf das optische Mittel 20 identisch. Das optische Mittel 20 ist in 2 eine Blende, mit der der Durchmesser des Manipulationslichtstrahls verändert werden kann. Wie bereits in der 1 beschrieben, kann die Veränderung des Durchmessers des Manipulationslichtstrahls manuell oder über eine Steuereinheit 30 erfolgen.
3a zeigt die Veränderung des Manipulationsstrahlfokus 18 bei fester Position. Zunächst startet man mit einem ersten Fokus 18₁, der einen bestimmten Durchmesser aufweist. Nach einer gewissen Zeit wird der Durchmesser des Fokus vergrößert, und man erhält einen zweiten Manipulationsstrahlfokus 18₂, der einen größeren Durchmesser aufweist, als der erste Manipulationsstrahlfokus 18₁. Nach einer weiteren Zeit stellt man auf einen dritten Manipulationsstrahlfokus 18₃, der abermals einen größeren Durchmesser aufweist, als der zweite Manipulationsstrahlfokus18₂. Obwohl bei der Darstellung in 3a drei Manipulationsstrahlfoki gezeigt werden, die sich hinsichtlich ihrer Größe, aber nicht hinsichtlich ihrer Position unterscheiden, sollte dies nicht als eine Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden. Es ist für jeden Fachmann selbstverständlich, dass man mit mindestens drei Manipulationsstrahlfoki, die sich hinsichtlich ihrer Größe unterscheiden, diesen Effekt erzielen kann. Durch die Änderung der Größe des Manipulationsstrahlfokus 18 in Abhängigkeit von der Zeit erzielt man den Effekt, dass sich die Intensität des Manipulationslichts auf der Probe ebenfalls in Abhängigkeit von der Zeit ändert. Bei dem in 3a beschriebenen Verfahren startet man zunächst in einem Bereich der Probe 7 mit einem erstem Manipulationsstrahlfokus 18₁. Mit dem Manipulationsstrahl kann man an der Position 18₁ der Probe 7 manipulieren (z.B. bleichen). Anschließend kann man - ohne die Position des Manipulationsstrahlfokus 18 zu verändern - mit einem etwas größeren Manipulationsstrahlfokus 18₂ manipulieren. Als nächstes würde dann ein weiterer, noch größerer Manipulationsstrahlfokus 18₃ folgen. Somit erreicht man, dass der beaufschlagte Probenbereich insgesamt von innen nach außen eine abnehmende Beaufschlagung von Manipulationslicht erfährt. Dies kann gleichgesetzt werden z.B. mit einer Abnahme der Bleichrate von innen nach außen. Selbstverständlich sind Abwandlungen, beispielsweise eine Umkehrung der Reihenfolge, das heißt von außen nach innen, möglich.
3b zeigt eine nicht zur Erfindung gehörende Ausführungsform der Änderung des Manipulationslichtstrahlfokus 18 auf der Probe 7. In der hier dargestellten Ausführungsform bleibt die Größe des Manipulationslichtstrahlfokus 18 konstant. Es wird lediglich die Position des Manipulationslichtstrahlfokus geändert. Dabei wird ein erster Manipulationslichtstrahlfokus 18₁ auf der Probe 7 gesetzt, anschließend wird die Position eines zweiten Manipulationsstrahlfokus 18₂ gesetzt, usw. Die mehreren Manipulationsstrahlfoki 18₁, 18₂, ... , 18_n werden dabei so aneinandergereiht gesetzt, dass sich die Bereiche der Probe, die mit einem Manipulationslichtstrahlfokus beaufschlagt sind, jeweils im Randbereich überlappen.

Claims

Scanmikroskop (1) mit einer Lichtquelle (3), die einen Beleuchtungslichtstrahl (5) zum Beleuchten einer Probe (7) emittiert, der entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs (9) verläuft, und der mit einer Strahlablenkeinrichtung (11) über oder durch die Probe (7) führbar ist, und mit einer weiteren Lichtquelle (13), die einen Manipulationslichtstrahl (15), der entlang eines Manipulationsstrahlengangs (16) verläuft, erzeugt, wobei der Manipulationslichtstrahl (16) einen Manipulationsstrahlfokus (18) ausgebildet hat, der ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung (11) über oder durch die Probe (7) führbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blendenanordnung der weiteren Lichtquelle (13) außerhalb des Beleuchtungsstrahlengangs (9) und im Manipulationslichtstrahl (15) nachgeschaltet ist, mit dem die Größe des Manipulationsstrahlfokus (18) veränderbar ist, und dass die Blendenanordnung mit einer Steuereinheit (30) verbunden ist, die die Änderung der Größe des Manipulationsstrahlfokus (18) in Abhängigkeit von der Zeit erlaubt.
Scanmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Blendenanordnung eine Irisblende ist.
Verfahren zur Probenmanipulation mit einem Manipulationslichtstrahl (15) in einem Scanmikroskop (1), wobei von einer Lichtquelle (3) ein Beleuchtungslichtstrahl (5) zum Beleuchten einer Probe (7) emittiert wird, der entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs (9) verläuft, und der mit einer Strahlablenkeinrichtung (11) über oder durch die Probe (7) geführt wird, und wobei mit einer weiteren Lichtquelle (13) ein Manipulationslichtstrahl (15) erzeugt wird, der entlang eines Manipulationsstrahlengangs (16) verläuft, und der einen Manipulationsstrahlfokus (18) ausgebildet hat, der ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung (11) über oder durch die Probe (7) geführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blendenanordnung der weiteren Lichtquelle (13) außerhalb des Beleuchtungsstrahlengangs (9) und im Manipulationslichtstrahl (15) nachgeschaltet wird, mit dem die Größe des Manipulationsstrahlfokus (18) verändert werden kann, und dass die Blendenanordnung mit einer Steuereinheit (30) verbunden ist, über die eine Änderung der Größe des Manipulationsstrahlfokus (18) in Abhängigkeit von der Zeit eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ausgehend von einer festen Position des Manipulationslichtstrahls (15) auf der Probe (7) die Größe des Manipulationsstrahlfokus (18) mindestens einmal vergrößert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ausgehend von einer festen Position des Manipulationslichtstrahls (15) auf der Probe (7) die Größe des Manipulationsstrahlfokus (18) mindestens einmal verkleinert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Position des Manipulationslichtstrahls (15) auf der Probe derart verändert wird, dass die einzelnen Manipulationsstrahlfoki sich zumindest teilweise überlappen.