DE102005032055A1

DE102005032055A1 - Producing cell-membrane protein useful as universal anchor for extracellular proteins, by genetic manipulation of cell membrane protein of human erythrocytes

Info

Publication number: DE102005032055A1
Application number: DE200510032055
Authority: DE
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2007-01-25

Abstract

Producing a cell-membrane protein (A) that serves as neutral anchor for extracellular proteins that can exert a specific interaction effect outside the cell comprising (a) genetic manipulation of a cell-membrane protein (X) from human erythrocytes and (b) recombinant integration and co-expression of (X) together with a functional protein (Y) in eukaryotic cell membranes, is new.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung eines Zellmembran-Proteins, dass als ein neutraler Anker für extrazelluläre Proteine dient, die eine bestimmte Wechselwirkung außerhalb der Zelle ausüben können. Hierfür wurde ein Zellmembran-Protein aus menschlichen Erythrozyten gentechnisch verändert und kann zusammen mit einem Funktions-Protein rekombinant in eukaryontischen Zellmembranen integriert werden.The The present invention describes a method for producing a Cell membrane protein that acts as a neutral anchor for extracellular proteins serves, which can exert a certain interaction outside the cell. For this was a cell membrane protein from human erythrocytes genetically engineered changed and may together with a functional protein recombinant in eukaryotic Cell membranes are integrated.

Bei der Forschung an lebendem Gewebe bzw. den dazugehörigen Zellen und in zunehmendem Maße auch an Stammzellen rückt die Kommunikation unter den Zellen immer mehr in den Fokus. Wechselwirkung zwischen gleichartigen und unterschiedlich geprägten Zellen und Zell-Zell-Kontakte spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Um in-vitro und in-vivo Manipulationen an Zellen vornehmen zu können müssen diese vielfach an bestimmten Orten fixiert werden. Das können bestimmte Bereiche auf Oberflächen sein oder auch ein erzwungener Kontakt mit anderen Zellen (bsw. die Prägung hämopoetischer Stammzellen an Thymusgewebe). Eine Manipulation von Zellen basiert stets auf zellspezifischen, zelleigenen Molekülen, wie beispielsweise ein spezifischer Antigen-Antikörper-Kontakt. Hierbei ist man in den Methoden eingeschränkt, da man keine beliebige Auswahl an Werkzeugen hat. Auch ist man bei der Lokalisation oder dem Sortieren und Steuern von Zellen auf begrenzte physikalische Hilfsmittel angewiesen, wie z.B auf hoch viskose Medien oder aufwendige und teure Apparaturen.at the research on living tissue or the associated cells and, increasingly, too on stem cells moves the communication among the cells is becoming more and more the focus. Interaction between similar and differently shaped cells and cell-cell contacts play a crucial role here. To in vitro and in vivo Manipulation of cells to be able to do this often at certain Places are fixed. The skill certain areas on surfaces or even a forced contact with other cells (eg. the imprint hematopoietic Stem cells to thymic tissue). A manipulation of cells is based always on cell-specific, cell-own molecules, such as a specific antigen-antibody contact. Here one is limited in the methods, since one does not have any Has a selection of tools. Also, one is at the localization or sorting and controlling cells for limited physical resources instructed, such as on highly viscous media or consuming and expensive equipment.

Eine beliebige Funktion (bsw. atypische Antikörper, Avidin, spezielle Antigene) auf der Oberfläche entsprechender Zellen würde die Freiheit schaffen mit beliebigen Molekülen außerhalb der Zellen in Wechselwirkung zu treten, die Zellen zu dirigieren oder an bestimmten Orten zu fixieren. So könnte beispielsweise eine simple Biotin-Funktionalität das Steuern von Zellen auf strukturierten Avidin-Oberflächen ermöglichen. Auf ähnliche Weise könnten biologisch oder spontan inkompatible Zelltypen in Kontakt gebracht werden, um Kommunikation oder Wechselwirkungen dieser Zellen zu erzwingen. Idealerweise wäre diese artifizielle Funktionalität in einer Weise physiologisch integriert, um eine unerwünschte interne Wirkung gering zu halten oder auszuschließen. Membranproteine, die eine an sie gekoppelte extazelluläre Funktionalität besitzen, kämen hierfür in Frage. Nachteilig an Membranproteinen ist, dass diese gewöhnlich eine Rezeptorfunktion haben, welche eine enorme intrazelluläre Wirkungsweise besitzt.A any function (eg atypical antibodies, avidin, special antigens) on the surface corresponding cells would to create the freedom to interact with any molecules outside the cells to step, to direct the cells or in certain places fix. So could For example, a simple biotin functionality controlling cells structured avidin surfaces enable. On similar Way could biologically or spontaneously contacted incompatible cell types to communicate or interact with these cells force. Ideally would be this artificial functionality physiologically integrated in a way to an unwanted internal To minimize or exclude the effect. Membrane proteins containing a coupled to them extacellular functionality own, would come for this in Question. A disadvantage of membrane proteins is that they usually have a Receptor function, which has a tremendous intracellular mode of action has.

Ein solches Membranprotein müsste sich aber gegenüber zellinternen Stoffwechselvorgängen neutral verhalten und dürfte an keinerlei Signalwegen (Transduktion) teilhaben.One such membrane protein would have to but opposite cell-internal metabolic processes behave neutral and likely participate in no signaling pathways (transduction).

Das hier vorliegende Verfahren beschreibt die rekombinant modifizierende Konstruktion eines universellen Zellmembranankers aus einem ursprünglich natürlicherweise vorkommenden Chemokinrezeptor (DARC oder DUFFY) des humanen FY-Gens in den Zellmembranen von Erythrozyten. Hierfür wird die gentechnisch veränderte Sequenz des FY-Gens in einen für die eukayontische Expression geeigneten Vektor kloniert, um damit transfizierte Zellen zu erzeugen, die das modifizierte rekombinante DUFFY-Protein in ihrer Zellmembran tragen. Die extrazelluläre Funk tionalität (bsw. genetische Information für Digoxygenin) wird als DNA-Fragment vor das 5'-Ende der DUFFY-Gensequenz im Expressionsvektor kloniert, um das resultierende Protein am Aminoterminus des Membranankers zu exprimieren, das wiederum nach der Verankerung von Duffy in der Zellmembrane mit dem Aminoterminus des Proteins im extrazellulären Raum präsentiert wird.The The present method describes the recombinantly modifying Construction of a universal cell membrane anchor from an originally natural occurring chemokine receptor (DARC or DUFFY) of the human FY gene in the cell membranes of erythrocytes. This is the genetically modified sequence of the FY gene into a for the eukaryotic expression is cloned into a vector suitable for use with to generate transfected cells containing the modified recombinant DUFFY protein in carry their cell membrane. The extracellular funcionality (bsw. genetic information for Digoxygenin) is inserted as a DNA fragment in front of the 5 'end of the DUFFY gene sequence in the expression vector cloned to the resulting protein at the amino-terminus of the membrane anchor to express that, in turn, after anchoring Duffy in the Cell membrane with the amino terminus of the protein in the extracellular space presents becomes.

FY ist ein proteinkodierendes Single-copy-Gen, dessen Locus auf eine Region im langen Arm des menschlichen Chromosoms 1 kartiert wurde. FY besteht aus zwei Exons, die von einem Intron unterbrochen werden.FY is a protein-encoding single-copy gene whose locus is on a Region in the long arm of human chromosome 1 was mapped. FY consists of two exons interrupted by an intron.

Es sind jedoch auch FY-Transkripte belegt, in denen Exon 1 vollständig fehlt. Bisher wurden keine Studien zur Ursache dieser Beobachtungen veröffentlicht. Es bleibt daher unklar, welche Mechanismen ihnen zugrunde liegen. Die ungespleißte Form des Exon 2 umfasst 339 Codons und korrespondiert mit der kompletten 7-Transmembran-Region des DUFFY-Proteins. Es gibt bislang keine experimentellen Daten zur Kettenkonformation von DARC. Allerdings wurden wiederholt Sekundärstrukturvorhersagen unternommen. Diese legen einen modularen Aufbau des Proteins nahe: Danach besteht DARC aus sieben hydrophoben, helikalen Transmembran-Domänen, die durch abwechselnd endo- und exoplasmatische Abschnitte miteinander verbunden sind. Die Exposition des N-Terminus auf der E-Seite ist bereits verifiziert. Der C-Terminus wird auf der P-Seite vermutet (1). Mit dieser Topologie wäre DARC ein Typ III-Membranprotein.However, FY transcripts are also occupied in which exon 1 is completely absent. So far no studies on the cause of these observations have been published. It therefore remains unclear which mechanisms underlie them. The unspliced form of exon 2 comprises 339 codons and corresponds to the complete 7 transmembrane region of the DUFFY protein. There are no experimental data on the chain conformation of DARC. However, secondary structure predictions were repeatedly made. These suggest a modular structure of the protein: Thereafter, DARC consists of seven hydrophobic, helical transmembrane domains, which are interconnected by alternating endo- and exoplasmic sections. Exposure of the N-terminus on the E-side is already verified. The C-terminus is suspected on the P-side ( 1 ). With this topology, DARC would be a type III membrane protein.

DUFFY ist ein Polypeptid, das zuerst als Bestandteil der Erythrozytenmembran beschrieben wurde. Im Laufe der Untersuchungen stellte sich heraus, daß das Molekül sowohl Antigenizität als auch Rezeptoreigenschaften in sich vereint. Diese Identität führte zu seinem zusammengesetzten Namen: Duffy-Antigen/Chemokin-Rezeptor (englisches Akronym DARC). DARC ist stark hydrophob und besitzt einen N-terminalen Bereich, der überdurchschnittlich viele Aminosäuren mit sauren und hydrophilen Seitenketten enthält. Die aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz errechnete Molekularmasse beträgt etwa 36 kDa.DUFFY is a polypeptide, first as a component of the erythrocyte membrane has been described. In the course of the investigations, it turned out that this molecule both antigenicity as well as receptor properties combined. This identity led to its compound name: Duffy Antigen / Chemokine Receptor (English Acronym DARC). DARC is highly hydrophobic and has an N-terminal Range, the above average many amino acids containing acidic and hydrophilic side chains. The derived from the amino acid sequence calculated molecular mass is about 36 kDa.

Unabhängig von allen Ansätzen zur Aufklärung der molekularen Funktion von DARC erhob sich bereits von Anfang an die Frage nach seinem physiologischen Stellenwert. Aufschluß gaben hier die verschiedenen Polymorphismen von FY.Independent of all approaches to the enlightenment The molecular function of DARC has been established from the beginning to the question of its physiological significance. Gave information here the different polymorphisms of FY.

Das Allel FY·B^null, mit dem im homozygoten Genotyp die völlige Abwesenheit von DARC auf Erythrocyten einhergeht, ist in bestimmten Populationen weit verbreitet. Anhand dieses Phänotyps wurde ursprünglich der Zusammenhang von DARC mit Malaria hergestellt. Die betreffenden Individuen sind gesund, sie zeigen keinerlei physiologische Besonderheiten, die auf die veränderte Expression von FY zurückführbar wären. Gleiches gilt für FY·X. Dessen Produkte werden wahrscheinlich mehrheitlich nicht korrekt in die Zellmembran eingebettet. Obwohl sich dieser Effekt im Unterschied zu FY·B^null auf alle FY-exprimierenden Gewebe erstreckt, sind die Träger des Allels ebenfalls pathologisch unauffällig. Darüber hinaus weiß man von mindestens drei Personen, deren FY-Gen eine 14 Basenpaare lange Deletion im codierenden Bereich aufweist. Die damit verbundene Verschiebung des Leserasters zieht ein verstümmeltes Protein aus vermutlich 118 Aminosäuren nach sich, dem die extrazellulären Schleifen 2 und 3 fehlen und das keine Chemokine bindet. Auch für diese Fälle sind keine messbaren Veränderungen der Körperfunktionen, geschweige denn gesundheitliche Probleme dokumentiert. Eingehende Untersuchungen von Dfy-Knockout-Mäusen (homologes Gen von FY in Mäusen) bestätigen die Befunde. Der physiologische Beitrag von DARC ist unklar. Andere Strukturen scheinen ihn zu übernehmen, wenn FY nur schwach exprimiert wird, stark verändert ist oder völlig fehlt. Trotz der artübergreifenden Konservierung dieses Gens muß daher nach aktuellem Kenntnisstand das von ihm codierte Protein mindestens als funktionell redundant gelten. Ob es sogar völlig funktionslos ist, muss sich noch zu zeigen.The allele FY · B ^null , which is associated with the complete absence of DARC on erythrocytes in the homozygous genotype, is widely distributed in certain populations. Based on this phenotype, the relationship between DARC and malaria was originally established. The individuals in question are healthy, they show no physiological peculiarities that would be traceable to the altered expression of FY. The same applies to FY · X. Its products will probably not be correctly embedded in the cell membrane by the majority. Although this effect extends to all FY-expressing tissues in contrast to FY * B ^null , the carriers of the allele are also pathologically inconspicuous. In addition, at least three individuals are known whose FY gene has a 14 base pair deletion in the coding region. The associated shift of the reading frame results in a mutilated protein of presumably 118 amino acids, which lacks extracellular loops 2 and 3 and does not bind chemokines. Also for these cases no measurable changes of the body functions, let alone health problems are documented. In-depth studies of Dfy knockout mice (homologous gene of FY in mice) confirm the findings. The physiological contribution of DARC is unclear. Other structures seem to take over when FY is poorly expressed, strongly altered, or completely absent. Despite the cross-species preservation of this gene, therefore, according to current knowledge, the protein encoded by it must be considered at least to be functionally redundant. Whether it is even completely non-functional, has yet to show.

Diese Erkenntnisse machen DUFFY zu einem idealen Kandidaten für einen Membrananker für extrazelluläre Funktionalitäten (s. o.) These Findings make DUFFY an ideal candidate for one Membrane anchor for extracellular functionalities (see above)

DARC erscheint als ein untypisches Mitglied der Chemokin-Rezeptoren. Obwohl die Untersuchung des von FY codierten Membranproteins bisher keine Hinweise auf eine Beteiligung an Signaltransduktions-Prozessen ergeben hat, kann seine Kopplung an G-Proteine nicht völlig ausgeschlossen werden. Interaktionen dieser Art sind jedoch bei der späteren Expression in eukaryontischen Zellen unerwünscht.DARC appears as an atypical member of chemokine receptors. Even though the investigation of the FY coded membrane protein so far none Evidence of involvement in signal transduction processes has its coupling to G proteins can not be completely excluded. However, interactions of this type are eukaryotic in subsequent expression Cells unwanted.

Um die eventuelle, für eine Wechselwirkung mit G-Proteinen entscheidende Bildung von Strukturen in der dritten zytosolischen Schleife von DARC zu unterbinden, war eine definierte Veränderung dieses Proteinbereichs vorgenommen worden. Die an den Positionen 237 und 238 auftretenden Aminosäuren Leucin und Glycin wurde durch Alanin und Cystein ersetzt. Zu diesem Zweck wurde eine ortspezifische in-vitro-Mutagenese des entsprechenden FY-Abschnitts durchgeführt, in der die ursprüngliche, auf TTGGGT lautende Sequenz der Nucleotide 709 bis 714 durch die Abfolge GCATGC, die gleichzeitig eine Erkennungssequenz der Restriktionsnuklease Sph I ist, ersetzt wurde. Wegen der strukturellen Besonderheiten von FY konnte eine expressionsfähige Form dieses Gens direkt aus der genomischen DNA-Sequenz über PCR erhalten werden. Alle verwendeten PCR-Primer richteten sich ausschließlich auf den codierenden Bereich des Exons 2 (s. o.). Für die in-vitro-Mutagenese von FY wurde die DNA des Gens in zwei Teilstücken vervielfältigt. Dazu wurden zwei getrennte PCRs durchgeführt. Alle verwendeten Primer wiesen neben den zur jeweiligen Zielsequenz komplementären Bereichen auch solche Abschnitte auf, die nicht mit FY hybridisieren würden. Bei den Primern 1 und 4 (Tab.: 1) enthielten diese die Erkennungssequenz und Hydrolyseposition der Restriktionsnuclease BamH I bzw. Xho I. In die Primer 2 und 3 (Tab.: 1) waren die zwei auszutauschenden Aminosäure-Codons eingebettet, deren Sequenz gleichzeitig eine Restriktionsstelle für Sph I darstellte. Tabelle 1: verwendete Oligonucleotidprimer

In order to prevent the possible formation of structures in the third cytosolic loop of DARC, which is crucial for an interaction with G proteins, a defined change of this protein region had been made. The amino acids leucine and glycine occurring at positions 237 and 238 were replaced by alanine and cysteine. For this purpose, a site-specific in vitro mutagenesis of the corresponding FY section was carried out, in which the original TTGGGT sequence of nucleotides 709 to 714 was replaced by the sequence GCATGC, which is also a recognition sequence of the restriction nuclease Sph I. Because of the structural peculiarities of FY, an expressible form of this gene could be obtained directly from the genomic DNA sequence via PCR. All PCR primers used were directed exclusively to the coding region of exon 2 (see above). For in vitro mutagenesis of FY, the DNA of the gene was amplified in two sections. For this two separate PCRs were performed. All primers used had, in addition to the areas complementary to the respective target sequence, also those sections which would not hybridize with FY. For primers 1 and 4 (Table 1), these contained the recognition sequence and the hydrolysis position of the restriction nuclease BamH I or Xho I. The primers 2 and 3 (Table 1) embedded the two amino acid codons to be exchanged, their sequence simultaneously represented a restriction site for Sph I. Table 1: used oligonucleotide primers

Um die beiden Fragmente des FY-Gens zusammenzufügen und damit die beabsichtigte Mutagenese zu vollziehen, wurden die kompatiblen Sequenzen in ihren Primeranteilen freigelegt. Dazu wurden die gereinigten PCR-Produkte mit der Restriktionsendonuclease Sph I behandelt. Um die Verbindung der Fragmente mit der Vektor-DNA zu ermöglichen, war außerdem der Zugang zu den dafür vorgesehenen, ebenfalls in ursprüngliche Primerbereiche eingebetteten Restriktionsstellen herzustellen. Daher wurde die DNA von Fragment 1 im Folgenden mit der Restriktionsendonuclease BamH I inkubiert, die von Fragment 2 mit dem Enzym Xho I. Gleichzeitig wurde eukaryontische Expressions-Vektor-DNA (Bsp. hier: pCMV-Script, Stratagene) mit BamH I und Xho I linearisiert.Around to join the two fragments of the FY gene and thus the intended one To perform mutagenesis, the compatible sequences in their Primer shares exposed. These were the purified PCR products treated with the restriction endonuclease Sph I. To the connection to allow the fragments with the vector DNA was also the Access to it provided, also in original form Primer areas to create embedded restriction sites. Therefore was the DNA of fragment 1 below with the restriction endonuclease BamH I incubated that of fragment 2 with the enzyme Xho I. simultaneously was eukaryotic expression vector DNA (ex. here: pCMV-Script, Stratagene) linearized with BamH I and Xho I.

Anschließend wurden die drei Moleküle ligiert (2).Subsequently, the three molecules were ligated ( 2 ).

Die erfolgreiche Klonierung des veränderten rekombinante DUFFY-Gens (rFY) wurde durch eine Sequenzierung der Gensequenz verifiziert (siehe Anhang). Im Anschluss daran wird die gewünschte Funktionalität (Bsp. Digoxygenin) upstream zu Duffy kloniert, um sie im fertig translatierten Protein am Aminoterminus lokalisiert zu haben, d. h. letztendlich in den extrazellulären Raum zu päsentieren.The successful cloning of the modified recombinant DUFFY gene (rFY) was obtained by sequencing the Gene sequence verified (see Appendix). Following this, the desired functionality (Ex. Digoxygenin) is cloned upstream to Duffy to get it ready Having localized translated protein at the amino terminus, d. H. ultimately to place in the extracellular space.

Die vorliegende Erfindung ist gekennzeichnet durch die Auswahl eines geeigneten eukaryontischen und physiologisch neutralen Membranproteins (rFY), das als weiteres Kennzeichen durch in-vitro-Mutagenese gentechnisch verändert wurde, um eine ohnehin kaum mögliche Rezeptorfunktion auszuschließen. Das Hauptalleinstellungsmerkmal dieser vorliegenden Erfindung ist die eukaryontische Koexpression in transient transfizierten Zellen mit einem funktionellen Protein am Aminoterminus von rFY, die als Komplex eine physiologisch in der Zellmembran verankerte extrazelluläre Funktionalität der transfizierten Zellen präsentiert.The The present invention is characterized by the selection of a suitable eukaryotic and physiologically neutral membrane protein (rFY), which has been genetically engineered as a further hallmark by in vitro mutagenesis, an almost impossible anyway Exclude receptor function. The main all-purpose feature of this invention is eukaryotic coexpression in transiently transfected cells with a functional protein at the amino terminus of rFY, known as Complex a physiologically anchored in the cell membrane extracellular functionality of the transfected Cells presented.

In dem hier vorliegenden Verfahren wird die gentechnische Herstellung eines natürlich vorkommenden eukaryontischen Membranrezeptors und dessen Modifizierung in die Erfindung eines physiologisch neutralen Zellmembranankers für die fixierte Bereitstellung von extrazellulären Funktionalitäten in Form von koexprimierten funktionalen Proteinen (Bsp. Digoxygenin) beschrieben. Hiermit ist man in die Lage versetzt Zellen auf multiple Weise gezielt an Oberflächen ortsaufgelöst zu immobilisieren, Zellen auf Oberflächen strukturiert zu sortieren und Zellen an determinierenden Strukturen zu steuern. Ferner kann der rFY-Membrananker als Carrier für beliebige zu präsentierende Antigene dienen, es können über entsprechend gewählte Funktionalitäten Zell-Zell-Kontakte unterschiedlichster Prägung und Funktion herbeigeführt werden, um interzelluläre Wirkungsweisen zu erzeugen bzw. aufzuzeigen und multizelluläre Aggregate oder heterogener Gewebe zu bilden.In The present process is the genetic engineering one of course occurring eukaryotic membrane receptor and its modification in the invention of a physiologically neutral cell membrane anchor for the fixed delivery of extracellular functionalities in the form of coexpressed functional proteins (eg digoxygenin). This enables one to target cells in multiple ways on surfaces spatially resolved to immobilize cells on structured surfaces to sort and control cells at deterministic structures. Furthermore, can the rFY membrane anchor as a carrier for any to be presented Antigens serve, it can be over appropriately elected Functionalities Cell-cell contacts different imprint and function brought about become intercellular To produce or show effects and multicellular aggregates or heterogeneous tissue.

Anhang (die modifizierten Tripletts sowie die zugehörigen Aminosäuren sind doppelt unterstrichen)

SEQUENCE LISTING

Annex (the modified triplets and their amino acids are underlined twice)

SEQUENCE LISTING

Claims

A method for producing a cell membrane protein, the as a neutral anchor for extracellular Proteins serving a specific interaction outside exercise the cell can; comprising the following steps: (i) Genetic modification a cell membrane protein from human erythrocytes; (Ii) Recombinant integration and coexpression of the cell membrane protein together with a functional protein in eukaryotic cell membranes.