DE102005031429A1

DE102005031429A1 - Verfahren zur selektiven Bestimmung pathologischer Proteinablagerungen

Info

Publication number: DE102005031429A1
Application number: DE102005031429A
Authority: DE
Inventors: Eva Birkmann; Detlev Riesner; Nicole Weinmann; Oliver SCHÄFER
Original assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Current assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Priority date: 2005-07-04
Filing date: 2005-07-04
Publication date: 2007-01-11
Also published as: EP1902317A1; CA2656417A1; EP1902317B1; CA2656417C; US20090042211A1; WO2007003415A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Bestimmung der Gegenwart und/oder der Menge pathologischer Proteinablagerungen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Bestimmung der Gegenwart und/oder der Menge pathologischer Proteinablagerungen, insbesondere von solchen Proteinablagerungen, die mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert sind. Das Verfahren umfasst: (a) Immobilisieren eines Fängermoleküls, das spezifische Bindungsaffinität für Teilstrukturen der Proteinablagerungen aufweist, auf einer Oberfläche, (b) In-Kontakt-bringen des immobilisierten Fängermoleküls mit einer Messprobe, von der vermutet wird, dass sie pathologische Proteinablagerungen oder Teilstrukturen davon enthält, (c) Inkubieren des Ansatzes, sodass die Bildung eines Komplexes aus dem immobilisierten Fängermolekül und den Teilstrukturen der Proteinablagerungen ermöglicht wird, (d) In-Kontakt-bringen dieses Komplexes mit mindestens einer detektierbaren Einheit, die spezifische Bindungsaffinität für die Teilstrukturen der Proteinablagerungen aufweist, und die ein optisch detektierbares Signal erzeugt, wobei mindestens eine der mindestens einen detektierbaren Einheit ein mittels spektroskopischer Verfahren detektierbares Signal erzeugt, und (e) Detektieren der Komplexbildung durch Messung des von der mindestens einen detektierbaren Einheit insgesamt erzeugten Signals.

Eine Reihe von Erkrankungen ist mit dem Auftreten von Proteinablagerungen assoziiert. Bislang ist allerdings weitestgehend unklar, ob diese Proteinablagerungen nur eine Manifestation des jeweiligen Krankheitsbildes darstellen oder in der Tat kausal für die Ätiologie und/oder Progression dieser Erkrankungen verantwortlich sind. So sind beispielsweise neurodegenerativen Erkrankungen bekannt, bei denen im Gehirn der Betroffenen als amyloide Plaques bezeichnete Proteinablagerungen auftreten. Zu diesen Erkrankungen zählen unter anderem Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Chorea Huntington, vererbbare cerebrale amyloide Angiopathie sowie die transmissiblen spongiformen Encephalopathien. Zur letzteren zählen zum Beispiel die Creutzfeld-Jakob-Erkrankung (CJD) beim Menschen, Scrapie bei Schafen oder die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern sowie weitere, früher als "Slow Virus"-Erkrankungen bezeichnete Syndrome, wie die Kuru-Erkrankung. Heute werden diese Krankheiten unter dem Begriff Prionenerkrankungen zusammengefasst (Übersichten in Prusiner, S.B. (1982) Science 216, 136–144; Weissmann, C. (1996) FEBS Lett. 389, 3–11; Riesner, D. (1996) Chemie in unserer Zeit, S. 66–74; Prusiner, S.B. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13363–13383).

Pathologische Proteinablagerungen treten jedoch nicht nur bei Erkrankungen des neuronalen Systems in Erscheinung, sondern werden auch in anderen Organen beobachtet. Beispielsweise wird bei Typ II Diabetes mellitus bei einigen Patienten eine diabetische Nephropathie beobachtet, als deren Grund eine Matrixstörung durch Proteinablagerungen diskutiert wird. Eine Übersicht nicht neuronaler Erkrankungen, die mit der Bildung von pathologischen Proteinablagerungen einhergehen, findet sich in Sipe, W. (1992) Annu. Rev. Biochem. 61, 947–975.

Bei den transmissiblen spongiformen Encephalopathien werden Ablagerungen der infektiösen Form des Prionenproteins (PrP^Sc) kausal mit der Krankheitsentstehung in Verbindung gebracht. Dieses modifizierte Prionenprotein ist in der Lage, mit der normalen zellulären Form PrP derart in Wechselwirkung zu treten, dass die infektiöse Form PrP^Sc eine Konformationsänderung der Wildtyp-Form PrP zur infektiösen Form bedingt. Die infektiöse Formen PrP^Sc aggregieren und bilden die für die Indikation charakteristischen pathologischen Proteinablagerungen aus.

In den letzten Jahren ist vor allem die bovine spongiforme Encephalopathie (BSE) ins Bewusstsein der Öffentlichkeit gerückt, insbesondere auch deshalb weil BSE mit der humanen Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung in Verbindung gebracht wird. Der Etablierung von Nachweisverfahren zur Diagnose von Prionenerkrankungen kommt daher besondere Bedeutung zu. Zum Beispiel besteht aus veterinärmedizinischer Sicht die Notwendigkeit sicherzustellen, dass kein kontaminiertes Fleisch mit BSE infizierter Rinder oder mit Scrapie infizierter Schafe in Umlauf gerät. Wünschenswert ist neben einer sicheren und schnellen Diagnose eine hohe Sensitivität des Nachweises, sodass infizierte Tiere frühzeitig erkannt werden können. Weiterhin sollte die Vorbereitung des biologischen Probenmaterials einen möglichst geringen Arbeitsaufwand erfordern, um auch eine effiziente Durchführung von Reihenuntersuchungen zu ermöglichen. Für eine sichere Früherkennung von Prionenerkrankungen ergibt sich weiterhin die Notwendigkeit, Verluste an pathogenem Material bei der Vorbereitung des Probenmaterials zu vermeiden. Gängige BSE-Testverfahren (siehe u.a. Pitschke, M. et al. (1998) Nat. Med. 4, 832–834; Safar, J.G. et al. (1998) Nat. Med. 4, 1157–1165; Bieschke, J. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5468–5473; Safar, J.G. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20, 1147–1150; Thomzig, A. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 33847–33854) nutzen als wesentliches Kriterium die Proteinase K (PK)-Resistenz von infektiösem PrP^Sc. Der Anteil an PK-resistentem PrP^Sc schwankt allerdings sowohl zwischen Individuen als auch zwischen verschiedenen Arealen eines Organs desselben Individuums mitunter sehr stark. Zudem ist der Anteil von PK-resistentem PrP^Sc in BSE-infizierten Rindern höher als in Scrapie-infizierten Schafen. Das bedeutet aber, dass eine Behandlung des Probenmaterials mit Proteinase K zu einer nicht unerheblichen Verzerrung der Messergebnisse führen kann, da Teile des pathogenen Materials nicht erfasst werden. Daher ist es für ein sensitives Nachweisverfahren wünschenswert, die infektiösen Prionenproteine bzw. deren gegenseitige Assoziation direkt zu messen.

Eine weitere Herausforderung im Zusammenhang mit der Infektionskontrolle von Prionerkrankungen liegt darin, dass zumindest hypothetisch das Risiko besteht, dass zum Beispiel BSE-infiziertes Material über kontaminiertes Futter (u.a. Fleisch, Knochen- oder Tiermehl) in andere Spezies, etwa Schafe, übertragen werden kann. Die klinischen Symptome von Scrapie können jedoch nicht mit hinreichender Genauigkeit von denen experimentell in Schafen erzeugter BSE unterschieden werden (Bradley, R. (2004) Prions: A Challenge for Science, Medicine, and the Public Health System. (Rabenau, H.F., Cinatl, J., and Doerr, H.W., Hrsg.) S. Karger AG, Basel, Schweiz, S. 146–185). Bislang ist dazu eine zeitaufwendige und kostenintensive Typisierung in Mausmodellen notwendig.

Daher besteht ein Bedarf an Verfahren, mit denen selektiv ein Prionenprotein einer bestimmten Spezies nachgewiesen werden kann.

Die entsprechenden Anforderungen an ein Nachweisverfahren für pathologische Proteinablagerungen sind nicht auf den Nachweis von Prionen beschränkt und auf den Nachweis weiterer Erkrankungen übertragbar, die mit Proteinablagerungen in Verbindung stehen.

Das Europäische Patent EP1015888 offenbart ein Verfahren, das die Assoziation von Teilstrukturen der Proteinablagerungen als Target (Zielstruktur) an eine Sonde, die zur Assoziation mit dem Target befähigt ist, direkt misst. Unter einer Teilstruktur ist dabei ein pathologisches Protein per se oder eine Aggregation mehrerer Proteine zu verstehen, welche pathologische Proteine beinhaltet. Die Wechselwirkung einer solchen Teilstruktur an eine Sonde wird bevorzugt spektroskopisch erfasst, wobei als Sonde verschiedene Strukturen eingesetzt werden können, die zur Wechselwirkung mit der Teilstruktur befähigt sind. Folglich kann daher aufgrund der Selbstaggregation von Prionenproteinen in diesem Fall auch das pathologische Protein selbst als Sonde dienen. Die Proteinaggregate können auf Grund intrinsischer Eigenschaften der betreffenden Moleküle direkt detektiert werden oder werden durch Anlagerung von beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörpern und/oder fluoreszierenden, synthetisch hergestellten Sondenmolekülen und Anregung dieser fluoreszierenden Verbindungen durch Laserlicht indirekt nachgewiesen.

Das in EP1015888 offenbarte Verfahren weist jedoch analog zu den oben zitierten anderen gängigen Nachweisverfahren den Nachteil auf, dass die markierten Targets (Zielstrukturen), also etwa infektiöse Prionenaggregate, frei beweglich in Lösung gemessen werden. Die Aggregate liegen dabei in aller Regel nicht gleich verteilt in der Messprobe vor. Größere Aggregate sinken zum Beispiel schneller ab und verschwinden so aus dem messbaren Volumen. Dieser Sachverhalt bedingt somit zum Teil erhebliche Messungenauigkeiten.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von pathologischen Proteinablagerungen bereitzustellen, das im Vergleich mit den bekannten Nachweisverfahren nicht nur eine höhere Messgenauigkeit in Verbindung mit einer gesteigerten Sensitivität aufweist, sondern auch die selektive Bestimmung einer spezifischen Proteinablagerung erlaubt.

Dieses Ziel wird durch ein Verfahren zur selektiven Bestimmung der Gegenwart und/oder der Menge pathologischer Proteinablagerungen gemäß dem unabhängigen Anspruch 1 erreicht, das umfasst:

(a) Immobilisieren eines Fängermoleküls, das spezifische Bindungsaffinität für Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen aufweist, auf einer Oberfläche;
(b) In-Kontakt-bringen des immobilisierten Fängermoleküls mit einer Messprobe, von der vermutet wird, dass sie pathologische Proteinablagerungen oder Teilstrukturen davon enthält;
(c) Inkubieren des Ansatzes, sodass die Bildung eines Komplexes aus dem immobilisierten Fängermolekül und den Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen ermöglicht wird;
(d) In-Kontakt-bringen des Komplexes mit mindestens einer detektierbaren Einheit, die spezifische Bindungsaffinität für die Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen aufweist, und die ein optisch detektierbares Signal erzeugt, wobei mindestens eine der mindestens einen detektierbaren Einheit ein mittels spektroskopischer Verfahren detektierbares Signal erzeugt; und
(e) Detektieren der Komplexbildung durch Messung des von der mindestens einen detektierbaren Einheit insgesamt erzeugten Signals.

Die Erfindung basiert dabei auf der überraschenden Entdeckung, dass durch eine Immobilisierung der zu bestimmenden Proteinablagerung auf einer Oberfläche in Kombination mit der Verwendung spezieller Fängermoleküle und Detektionseinheiten ein selektives und effizientes Nachweisverfahren für Proteinablagerungen mit hoher Sensitivität etabliert werden konnte, das sämtliche oben erwähnte Nachteile der bislang bekannten Verfahren überwindet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist gekennzeichnet durch die Immobilisierung der zu bestimmenden Proteinablagerungen auf einer Oberfläche. Dadurch erfolgt eine Konzentration der Proteinaggregate in der Fläche, die eine erhebliche Steigerung der Testsensitivität bedingt. Gleichzeitig ist es möglich, die gesamte Fläche abzurastern (zu scannen) und somit sämtliche immobilisierten Proteinaggregate zu detektieren, während bei einer dreidimensionalen Messung in Lösung häufig nur ein Teilvolumen analysiert und somit ein erheblicher Anteil der vorhandenen Proteinaggregate nicht erfasst wird. Zudem wird ein Absinken von größeren Proteinaggregaten aus dem Messbereich verhindert. Beide Aspekte bedingen eine signifikante Verbesserung der Messgenauigkeit.

Die Proteinablagerungen können auf einer beliebigen Oberfläche immobilisiert werden, beispielsweise einer Glasoberfläche, einer Kunststoffoberfläche oder einer Metalloberfläche. Vorzugsweise werden die Proteinaggregate auf einem Analyse- oder Assay-Chip immobilisiert. Derartige Chips sind von zahlreichen Anbietern kommerziell verfügbar.

Die Immobilisierung an die Oberfläche erfolgt über ein Fängermoleküle ("Capture-Molekül"), das spezifische Bindungsaffinität für Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen aufweist, d.h. das diese Teilstrukturen auch im Vergleich zu ähnlichen oder homologen Teilstrukturen mit deutlich besserer Affinität bindet. In anderen Worten, das Fängermolekül unterscheidet ähnliche Strukturen, wodurch die Spezifität bzw. Selektivität des Nachweises weiter erhöht wird.

Die Fängermoleküle sind kovalent oder nicht-kovalent an die Oberfläche gebunden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Oberfläche vor der Immobilisierung der Proteinaggregate aktiviert. Eine solche Aktivierung kann zum Beispiel durch Abflammen und durch Beschichten der Oberfläche mit verschiedenen Polymeren, zum Beispiel mit poly-D-Lysin, erreicht werden.

Unter Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen, für welche die Fängermoleküle spezifische Bindungsaktivität besitzen, werden monomere oder oligomere Einheiten der Proteinablagerungen verstanden, zum Beispiel monomere Prionenproteine oder oligomere Proteinaggregate. Bei einer erfindungsgemäßen Teilstruktur kann es sich aber auch um einen Teil eines Monomers, z.B. ein Peptid, handeln.

Bevorzugt werden Fängermoleküle, die aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten besteht, wobei monoklonale Antikörper besonders bevorzugt sind.

Durch Verwendung spezifischer monoklonaler Antikörpers können zum Beispiel Scrapie- bzw. BSE-spezifische Prionenproteine in derselben Messprobe jeweils selektiv an einer Oberfläche immobilisiert und nachgewiesen werden.

In anderen Ausführungsformen besteht das Fängermolekül selbst ebenfalls aus Teilstrukturen pathologischer Proteinablagerungen oder aus Fragmenten davon, wobei diese Teilstrukturen natürlichen Ursprungs oder rekombinant hergestellt sein können. Aufgrund der Selbstaggregation, etwa von Prionenproteinen, werden so die zu detektierenden Proteinablagerungen ebenfalls an der Oberfläche immobilisiert. Dabei können als Fängermolekül sowohl Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerung verwendet werden (homologes System) als auch Teilstrukturen anderer Proteinablagerungen (heterologes System). Beispielsweise kann eine Teilstruktur, die aus amyloiden Plaques einer BSE stammt, als Fängermolekül zur Detektion von Teilstrukturen aus an Alzheimer erkranktem Gewebe verwendet werden.

Optional können nach Immobilisierung des Fängermoleküls noch verbliebene freie Bindungsstellen auf der Oberfläche durch Inkubation mit einem Blockierungsreagenz blockiert werden, um die unspezifische Bindung der zu bestimmenden Proteinaggregate zu reduzieren. Als Blockierungsreagenzien können zum Beispiel Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung oder fettfreie Magermilch verwendet werde.

Obwohl nicht darauf beschränkt, sind die qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmenden die Proteinablagerungen vorzugsweise mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert sind. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden die neurodegenerativen Erkrankungen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus transmissiblen spongiformen Encephalopathien, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und vererbbarer cerebraler amyloider Amyloidose besteht.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die zu detektierenden Proteinablagerungen mit transmissiblen spongiformen Encephalopathien assoziiert, wobei die Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung, Scrapie und die bovine spongiforme Encephalopathie besonders bevorzugt sind.

Die zu bestimmenden Proteinablagerungen können in einer beliebigen biologischen Messprobe nachgewiesen werden, die zum Beispiel aus einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe stammt. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Körperflüssigkeit aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Cerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Blut, Urin und Sputum besteht, wobei Cerebrospinalflüssigkeit und Blut besonders bevorzugt werden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen stammt die Messprobe aus Hirngewebe.

In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die Messprobe vor dem In-Kontakt-bringen mit dem Fängermolekül einem Reinigungsverfahren unterworfen, um die zu bestimmenden Proteinablagerungen von etwaig vorhandenen Kontaminanten zu isolieren. In Abhängigkeit von der Art der Probe, der vermuteten Konzentration der zu bestimmenden Proteinablagerungen, der verwendeten Detektionsmethode und dergleichen kann eine partielle oder eine (nahezu) vollständige Reinigung/Isolation durchgeführt werden. Die Proben können dabei mit physikalischen und/oder chemischen Standardmethoden (z.B. Ultraschall, Temperaturänderungen, Inkubation mit Lösungen unterschiedlicher Ionenstärke, chaotropen Salzen Detergenzien und Enzymen) behandelt werden. Dabei können die Methoden einzeln oder in beliebiger Kombination angewendet werden.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die Messproben durch Natriumphosphorwolframat (NaPTA)-Fällung gereinigt (Safar, J.D. et al. (1998) Nat. Med. 4, 1157–1165), wobei auf eine Zugabe von Proteasen, insbesondere von Proteinase K, verzichtet wird.

Die Messprobe wird anschließend erfindungsgemäß mit dem immobilisierten Fängermolekül inkubiert, um die Bildung eines Komplexes aus dem immobilisierten Fängermolekül und den Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen zu ermöglichen.

Der Nachweis der Komplexbildung zwischen Fängermolekül und zu detektierenden Teilstruktur erfolgt durch In-Kontaktbringen des Komplexes mit mindestens einer detektierbaren Einheit. Unter einer detektierbaren Einheit ist ein Sondenmolekül zu verstehen, das eine spezifische Bindungsaffinität für die Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen aufweist, und die ein optisch detektierbares Signal erzeugt, wobei das optisch detektierbare Signal durch das Sondenmolekül selbst erzeugt werden kann oder durch einen Bindungspartner, der an das Sondenmolekül gekoppelt ist. Beispiele für solche Bindungspartner sind radioaktive fluoreszierende, chemilumineszente oder biolumineszente Markierungen sowie Metallpartikel (z.B. kolloidales Gold). Mindestens eine der mindestens einen detektierbaren Einheit erzeugt ein mittels spektroskopischer Verfahren detektierbares Signal.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden zwei detektierbare Einheiten simultan mit dem Komplex in Kontakt gebracht. Werden zwei oder mehr detektierbare Einheiten verwendet, kann das In-Kontakt-bringen mit dem Komplex simultan oder seriell erfolgen.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die mindestens eine detektierbare Einheit ein Protein oder ein Polypeptid, wobei diese Protein oder Polypeptid natürlichen Ursprungs oder rekombinant hergestellt sein kann. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das Protein oder Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten besteht, wobei monoklonale Antikörper bevorzugt sind. Die detektierbaren Einheiten können jedoch zum Beispiel auch kleine organische Moleküle, Nukleinsäuren (einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA) oder Polysaccharide umfassen.

Ebenfalls bevorzugt sind Ausführungsformen der Erfindung, bei denen das von der mindestens einen detektierbaren Einheit erzeugte optisch detektierbare Signal aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Absorption, Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- und Biolumineszenzemission besteht.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen bestehen die detektierbaren Einheiten aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern.

Optional können nach dem In-Kontakt-bringen der detektierbaren Einheiten mit dem Komplex ein oder mehr Waschschritte durchgeführt werden, um nicht gebundene detektierbare Einheiten zu entfernen, welche ansonsten mit dem Messergebnis interferieren können.

Die Komplexbildung wird durch Messung des von der mindestens einen detektierbaren Einheit insgesamt erzeugten Signals detektiert. Der Begriff "insgesamt erzeugtes Signal" bedeutet dabei, dass bei Verwendung mehr als einer detektierbarer Einheit die optisch detektierbaren erzeugten Einzelsignale erfasst (Koinzidenzmessung), miteinander korreliert und ausgewertet werden. Dadurch wird die Spezifität des Nachweises erhöht, da positive Signale nur dann auftreten, wenn die verschiedenen detektierbaren Einheiten gleichzeitig an den nachzuweisenden Komplex gebunden sind.

Vorzugsweise werden die zu bestimmenden Proteinablagerungen mit Hilfe spektroskopischer Detektionsverfahren nachgewisene, wie zum Beispiel konfokaler Fluoreszenzspektroskopie, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), FCS in Kombination mit Kreuzkorrelation und Single Particle Immunosorband Laserscanning Assay.

Diese spektrokopischen Detektionsverfahren werden jeweils in Verbindung mit entsprechenden Auswerteverfahren, z.B. Fluoreszenzintensitätsdistributionsanalyse, angewendet. Hierbei regt ein Laserstrahl die nachzuweisenden Proteinkomplexe zu starkem Fluoreszenzlicht an, welches mit Hilfe eines Detektors, bevorzugt einer konfokalen Optik, registriert wird. Auf Grund der optischen Eigenschaften des Systems wird ein Einzelmolekülnachweis ermöglicht, sodass individuelle Proteinaggregate gezählt werden können. Wie bereits erwähnt, kann über eine Kreuzkorrelation die Sensitivität und Spezifität des Nachweises zusätzlich gesteigert werden, indem beispielsweise zwei verschiedene monoklonale Antikörper, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, benutzt werden und die gleichzeitige Bindung über Kreuzkorrelation der Signale bestimmt wird.

Durch die Immobilisierung der zu bestimmenden Proteinablagerungen auf einer Oberfläche ist es im Gegensatz zu einer Bestimmung in Lösung möglich, das von der mindestens einen detektierbaren Einheit erzeugte Gesamtsignal durch Abrastern ("Scannen") der Oberfläche zu messen, zum Beispiel mittels eines Single Particle Immunosorband Laserscanning Assays, wobei eine Mehrzahl nebeneinander liegender Teilbereiche der Oberfläche abgerastert wird, und die Einzelwerte anschließend addiert werden
Die Erfindung wird ferner durch die folgenden nicht einschränkenden Figuren und Beispiele veranschaulicht.
1 zeigt eine schematische Darstellung des für die Reinigung von PrP^Sc aus Hamsterhirngewebe mittels NaPTA-Fällung ohne Proteinase K-Zugabe verwendeten Protokolls.
2 zeigt eine Western Blot-Analyse der einzelnen Schritte der NaPTA-Fällung zur Proteinase K-freien Reinigung von pathogenem PrP aus Scrapieinfiziertem Hamsterhirn Die Western Blot-Analyse nach SDS-PAGE zeigt jeweils gleiche Mengen (1 × 10^–3 gÄ) der einzelnen Reinigungsschritte der NaPTA-Fällung. HH: Hirnhomogenat, Ü: Überstand, W: Überstand aus Waschschritt, P: resultierendes Pellet. Von jedem Schritt sind Kontrollen, welche proteolytisch für eine Stunde bei 37°C mit 5 μg/ml Proteinase K (PK) behandelt wurden (+) aufgetragen. Die Reinigung wurde mit Scrapie-infiziertem Hirnhomogenat (A) und mit einer nicht infizierten Hirnprobe (B) dargestellt
3 zeigt eine Western Blot-Analyse der NaPTA-Fällung zur Reinigung von pathogenem PrP^BSE aus der medulla oblongata eines BSE-infizierten Rindes. Die Western Blot-Analyse nach SDS-PAGE zeigt die jeweiligen Mengen (2.5 × 10^–3 – 1 × 10^–2 gÄ) der einzelnen Reinigungsschritte der NaPTA-Fällung. Die Reinigung wurde mit Proben einer BSE-infizierten medulla oblongata vom Rind (A) und einer nicht infizierten Kontrolle (B) durchgeführt. HH: Hirnhomogenat, ÜS: Überstand, W1-2: Überstand aus Waschschritt, P: resultierendes Pellet. Von jedem Schritt sind jeweils Kontrollen, welche proteolytisch für eine Stunde bei 37°C mit 5 μg/ml PK behandelt wurden (+) aufgetragen. Als Kontrolle ist in beiden Fällen 200 ng bovines rekombinantes PrP(29-231) aufgetragen (rekPrP).
4 zeigt eine schematische Darstellung eines Single Particle Immuno-sorband Laserscanning Assays (SPILA).
5 zeigt Fluoreszenzintensitätsmessungen ("Höhenscans") immobilisierter negSHa- (A) bzw. PrP^Sc-Proben (B). Als Sonde zur Detektion wurde fluoreszenzmarkierter (Alexa 633) D13 Antikörper (Inpro, USA) eingesetzt. Die Proben wurden im Abstand von 0–20 μm von der Chipoberfläche in 5 μm-Schritten für jeweils 30 Sekunden im FCS gemessen.
6 zeigt 2D-FIDA Plots von Fluoreszenzintensitätsmessungen immobilisierter negSHa- (A) bzw. PrP^Sc-Proben (B). Als Sonden zur Detektion wurden die fluoreszenzmarkierten Antikörper R1 und D13 (Alexa 488-markierter R1, Alexa 633-markierter D13; Inpro, USA) eingesetzt. Die Proben wurden im Abstand von 0–20 μm von der Chipoberfläche in 5 μm-Schritten für jeweils 30 Sekunden im FCS gemessen.
7 zeigt schematisch die Schritte des erfindungsgemäßen Protokolls zur Immobilisierung und Markierung pathologischer Prionenaggregate.
8 zeigt die Bestimmung und Summierung von sieben definierten Flächen einer immobilisierten PrP^Sc-Probe. Die Messung wurde im Abstand von 15 μm über der Chipoberfläche durchgeführt. Als Sonden zur Detektion wurden die fluoreszenzmarkierten Antikörper R1 und D13 (Alexa 488-markierter R1, Alexa 633-markierter D13; Inpro, USA) eingesetzt. Die Messungen wurden für jeweils 30 Sekunden an sieben nebeneinander liegenden Flächen unter "Scanningbewegung" (Abrastern) durchgeführt. Die Ergebnisse der Einzelmessungen wurden summiert.
9 zeigt die Auswertung von 2D-FIDA Messungen durch eine immobilisierte PrP^Sc-Probe (rot) sowie eine Negativkontrolle (grün). Als Fängermolekül wurde der Antikörper R1, als Detektionssonden die fluoreszenzmarkierten Antikörper R1 und D13 (Alexa 488-markierter R1, Alexa 633-markierter D13; Inpro, USA) eingesetzt. Die Proben wurden im Abstand von 5–25 μm von der Chipoberfläche in 5 μm-Schritten für jeweils 30 Sekunden im FCS gemessen.
10 zeigt eine Messung ("Höhenscan") von jeweils vier immobilisierten PrP^Sc-Proben (rot) bzw. Negativkontrollen (grün) via 2D-FIDA Messung. Als Fängermolekül wurde der Antikörper R1 und als Sonden zur Detektion die fluoreszenzmarkierten Antikörper R1 und D13 (Alexa 488-markierter R1, Alexa 633-markierter D13; Inpro, USA) eingesetzt. Die Proben wurden im Abstandsbereich von 5–25 μm von der Chipoberfläche in 5 μm-Schritten für jeweils 30 Sekunden im FCS gemessen. (A) Gesamtheit aller Messungen in den unterschiedlichen Distanzen zur Chipoberfläche, (B) Darstellung der Messungen nach Höhen 5–25 μm getrennt.
11 zeigt eine Messung ("Höhenscan") von jeweils vier immobilisierten PrP^BSE-Proben (rot) bzw. Negativkontrollen (grün) via 2D-FIDA Messung. Als Fängermolekül wurde der Antikörper Saf32 und als Detektionssonden die fluoreszenzmarkierten Antikörper 12F10 und Saf32 (Alexa 488-markierter 12F10, Alexa 633-markierter Saf32; Spibio, USA) eingesetzt. Die Proben wurden im Abstand von 10–25 μm von der Chipoberfläche in 5 μm-Schritten für jeweils 30 Sekunden im FCS gemessen. (A) Gesamtheit aller Messungen in den unterschiedlichen Distanzen zur Chipoberfläche, (B) Darstellung der Messungen nach Höhen 10–25 μm getrennt.
Beispiel 1: Reinigung von PrP^Sc aus Hamsterhirngewebe ohne Proteolyse
Die Aufreinigung von PrP^Sc (1) erfolgte in Anlehnung an ein Protokoll von Safar und Kollegen (Safar, J. et al. (1998) Nat. Med. 4, 1157–1165). Hirngewebe von Scrapieinfizierten syrischen Goldhamstern sowie von nicht infizierten Kontrollproben wurde von der RKI Berlin (Dr. M. Beekes) und der UCSF, San Francisco, USA (Dr. S. Prusiner) erhalten. Das Hirngewebe in PBS mit 2% Sarkosyl wurde mit Hilfe eines Homogenisators (PowerGen 125, Fisher Scientific) zu einem 5% (w/v) Homogenat verarbeitet. Dieses wurde für eine Minute bei 5.000 × g zentrifugiert, um größere Gewebefragmente zu sedimentieren. Anschließend wurde Benzonase (Merck, Darmstadt) bis zu einer Endkonzentration von 50 U/ml zugesetzt, um DNA und RNA abzubauen (Inkubation unter Schütteln für 45 Minuten bei 37°C). Danach wurden NaPTA (Endkonzentration 0.25%) und MgCl₂ (Endkonzentration 10.6 mM) zugegeben, und der Fällungsansatz wurde über Nacht bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurde die Probe für 30 Minuten bei 14.000 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 250 μl PBS/250 mM EDTA für mindestens 30 Minuten bei 37°C gewaschen und erneut für 30 Minuten bei 14.000 × g zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Die Verwendung von PBS/250 mM EDTA, pH 8 als Waschpuffer erbrachte im Vergleich zu bekannten Waschpuffern mit nur 50 mM EDTA, die von Wadsworth und Kollegen (Wadsworth, J. D. et al. (2001) Lancet 358, 171–180) für die PrP^CJD-Reinigung aus menschlichem Hirngewebe von CJD-Patienten beschrieben wurden, eine erheblich verbesserte Aufreinigung.
Eine Western Blot-Analyse der Reinigungsschritte der NaPTA-Fällung von Scrapie-infizierten und nicht infizierten Hirnproben ist in 2 dargestellt. In der Pelletfraktion der Aufreinigung aus Hirngewebe des Scrapie-infizierten Hamsters war eine große PrP-Menge nachweisbar. Ein Vergleich mit der Pelletfraktion der Probe des nicht infizierten Hamsters, die kein PrP enthielt, lässt den Schluss zu, dass es sich bei dem PrP der Scrapieinfizierten Probe ausschließlich um pathogenes PrP handelt. Darauf deutet auch die Proteinase K-Resistenz des größten Teils des gefällten PrPs hin. 2B zeigt, dass PrP^C fast vollständig im Überstand verbleibt.
Damit konnte gezeigt werden, dass durch die Fällung große Teile des vorhandenen pathogenen PrPs im Gegensatz zum natürlichen PrP^C selektiv angereichert und konzentriert werden konnten. Durch die einzelnen Waschschritte wurde kein Verlust an pathogenem PrP hervorgerufen.
Beispiel 2: Reinigung von PrP^BSE aus der medulla oblongata des Rinderhirns ohne Proteolyse
BSE-infizierte Gewebeproben aus der medulla oblongata des Rindes sowie gereinigte BSE-Proben bzw. entsprechende Negativkontrollen wurden von der VLA Weighbridge, Großbritannien (Dr. R. Jackmann) sowie der Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Insel Riems erhalten. Die Aufreinigung von PrP^BSE aus der medulla oblongata des Rinderhirns ohne Proteolyse entspricht prinzipiell der oben beschriebenen PrP^Sc-Aufreinigung aus Hamsterhirn. Unterschiede bestehen hinsichtlich der Sarkosylkonzentration bei der Homogenisierung des Gewebes. Bei Rindergewebe wurde im Gegensatz zum Hamstergewebe 4% Sarkosyl eingesetzt (nach Safar et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20, 1147–1150), da sich bei geringeren Sarkosylkonzentrationen im Homogenat die Reinigungseffizienz und die PrP^BSE-Ausbeute erheblich verringerten. Zusätzlich wurde die Fällungsdauer auf vier Stunden reduziert. Es waren zwei Waschschritte erforderlich, um einen für FIDA-Messungen notwendigen Reinheitsgrad zu erreichen.
In 3 ist eine Western Blot-Analyse der einzelnen Reinigungsschritte der Fällung für eine Gewebeprobe eines BSE-infizierten Rindes und einer Kontrollprobe aus medulla oblongata-Gewebe abgebildet. Durch den Vergleich des mit Proteinase K behandelten BSE-Hirnhomogenats mit dem nicht behandelten (3A) wird deutlich, dass die BSE-infizierte Probe nur einen geringen resistenten PrP^BSE-Anteil enthielt. Bei der Negativkontrolle (3B) ist deutlich zu erkennen, dass PrP^C vollständig im Überstand verbleibt und das Pellet augenscheinlich PrP^C-frei ist. In der BSE-Probe waren im ersten Waschschritt geringe PrP-Mengen nachweisbar. Der Vergleich der Pelletfraktionen der BSE-Probe mit der Kontrollprobe lässt den Schluss zu, dass es sich bei dem PrP im Pellet der BSE-Probe um pathogenes PrP^BSE handelte. Die Tatsache, dass diese Probe nur einen geringen resistenten PrP^BSE-Anteil aufweist, lässt auch den Schluss zu, dass dieses PrP zum größten Teil sensitives PrP^BSE ist.
Beispiel 3: Resupendierung der gefällten PrP-Aggregate
Auf das PrP^Sc/BSE-Pellet aus der NaPTA-Fällung wurden 200 μl PBS gegeben. Im Anschluss wurde das Pellet verschiedenen Ultraschallbedingungen ausgesetzt. Die Ultrabeschallbehandlung erfolgte drei mal zwei Sekunden mit Hilfe einer Ultraschall-Nadelsonde (Sonificator Labsonic U, Braun Dissel, Melsungen). Beim Einsatz der Nadelsonde wurde die Ultraschall-Sonde direkt in den Puffer eingetaucht.
Beispiel 4: Entwicklung einer neuen Analysestrategie durch Immobilisierung pathologischer Prionenaggregate und Nachweis mittels 2D-FIDA-SPILA
Mittels eines SPILA (Single Particle Immuno-sorband Laserscanning Assay) werden gereinigte Prionenaggregate auf der Oberfläche eines Messchips mit Hilfe eines Fängermoleküls ("Capture-Molekül", etwa ein Antikörper) zu immobilisieren und anschließend zu detektieren (4). Da die Immobilisierung eine Bewegung der Aggregate verhindert, kann die Oberfläche durch „Scannen" (i.e. durch Bewegung des konfokalen Volumenelements) nach Aggregaten abgesucht werden. Durch die Fixierung der Aggregate sollten zwei Vorteile genutzt werden. Zum einen sollte die Fixierung zur Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beitragen und zum anderen sollten die Aggregate konzentriert werden. Weiterhin können Waschschritte durchgeführt und damit das Signal-Rauschverhältnis verbessert werden.
Eine Voraussetzung für den Nachweis immobilisierter einzelner Prionenpartikel mittels Messungen im FCS ist eine genaue Fokussierbarkeit des konfokalen Volumenelements auf die Höhe der zu scannende Fläche. Aus diesem Grund wurde in Zusammenarbeit mit dem Gerätehersteller Evotec Technologies (Hamburg) das FCS-Gerät um ein Piezoelement erweitert, das eine Höheneinstellung unabhängig von der Motorsteuerung mit einer Genauigkeit von 100 nm ermöglicht.
Beispiel 5: Beschichtung von Glasoberflächen mit Fängermolekülproteinen
Um die Aggregate spezifisch auf der Glasoberfläche der verwendeten Messchips zu immobilisieren, muss diese zuvor mit einem Fängermolekül (z.B. einem Antikörper) beschichtet werden. Verfahren zur Beschichtung von Glasoberflächen mit Proteinen sind Fachleuten bekannt. Zur Evaluierung des Messansatzes wurde eine adhäsive Bindung des Fängermoleküls auf eine zuvor mit poly-D-Lysin aktivierte Oberfläche durchgeführt. Der gleiche Ansatz wurde auch mit kovalent gebundenen Antikörpern durchgeführt. Die weiteren Applikationen wurden jedoch mit adhäsiv beschichteten Fängermolekülen durchgeführt. Die Effizienz der Aktivierung der Glasoberfläche kann durch kurzes Abflammen der Glasoberfläche gesteigert werden. Zur Beschichtung wurden die 24-Well Assay-Chips (Evotec, Hamburg) mit Glasboden kurz mit Hilfe eines Bunsenbrenners abgeflammt. Anschließend wurden 20 μl poly-D-Lysin (10 μg/μl) in PBS in die Wells der Assay-Chips gegeben und eine Stunde bei 37°C (optional über Nacht bei 4°C) inkubiert. Anschließend wurde jeweils 1 μg Fängermolekül in PBS (in späteren Versuchen die Antikörper R1 (Inpro, USA) für Scrapie-Proben und Saf32 (Spibio, USA) für BSE-Proben) in die Wells gegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden drei Waschschritte mit PBS durchgeführt und freie Bindungsstellen durch eine einstündige Inkubation mit 5% (w/v) BSA geblockt.
Beispiel 6: Immobilisierung von pathologischen PrP-Aggregaten
Zur spezifischen Immobilisierung der pathologischen PrP-Aggregate wurden PrP-spezifische Fängermoleküle verwendet. Zunächst wurde der Antikörper R1 als Fängermolekül für gereinigtes PrP^Sc aus Hirngewebe Scrapie-infizierter Hamster und entsprechender Negativkontrollen aus nicht infizierten Tieren eingesetzt. Hierfür wurden jeweils 1.25 × 10^–3 gÄ gereinigte und mittels Ultraschall resuspendierte Proben in die mit R1 beschichteten Wells gegeben und für drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde dreimal für 10 Minuten mit TBST gewaschen. Um die immobilisierten Prionenpartikel mittels Fluoreszenzmessung nachweisen zu können, wurden die fluoreszenzmarkierten Antikörper R1 und D13 (Inpro, USA) in einer Konzentration von 0.1 μg/ml in TBST verwendet und für zwei Stunden unter Schütteln inkubiert. Abschließend wurde der Ansatz dreimal eine Stunde mit TBST gewaschen.
Um die Höhenbereiche über der Glasoberfläche des Analysechips zu evaluieren, in denen sich die immobilisierten Partikel befanden, wurden zunächst Messungen im FCS in z-Richtung durchgeführt werden. Anschließend wurden vergleichende Fluoreszenzmessungen mit PrP^Sc-Proben und Negativkontrollen durchgeführt. Die Fluoreszenzintensitätsverläufe lassen deutliche Unterschiede erkennen (5). Bei Höhen von 5–20 μm über der Glasoberfläche, traten bei Scrapie-Proben viele Fluoreszenzintensitätspeaks auf, die in der Negativkontrolle nicht vorkamen. Diese sind auf die Bindung fluoreszenzmarkierter Antikörper an die pathologischen Prionenaggregate zurückzuführen.
Die Unterschiede zwischen Scrapie-infizierten und nicht infizierten Proben werden durch die Darstellung der 2D-FIDA-Daten noch deutlicher (6). Die Bindung der beiden fluoreszenzmarkierten Antikörper an immobilisierte PrP-Aggregate führt zum Auftreten einer charakteristischen Diagonale der Fluoreszenzintensitäten im 2D-FIDA-Plot. Hierbei sind auf der x-Achse, die Fluoreszenz-Intensitäten des mit Alexa 488-markierten Antikörpers und auf der y-Achse die Fluoreszenz-Intensitäten des mit Alexa 633-markierten Antikörpers aufgetragen. Die Häufigkeiten des Auftretens der Fluoreszenzintensitäten sind in der z-Achse codiert (Graustufen). Da enorm starke Signale gemessen wurde, konnte diese charakteristische Kreuzkorrelationsdiagonale erst bei einer Höhe von 15 μm aufgelöst werden.
Das hier etablierte erfindungsgemäße Protokoll zur Immobilisierung pathologischer Prionenaggregate und anschließender Markierung mit Hilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper ist in 7 zusammengefasst.
Beispiel 7: Optimierung der Messung immobilisierter Proteinaggregate mittels 2D-FIDA
Um Aggregate auf einer möglichst großen Fläche erfassen zu können, wurde der Messfokus nicht nur wie durch das FCS standardmäßig vorgegeben bestimmt ("gescannt"), sondern die zu erfassende Fläche erweitert. Hierzu wurden sieben nebeneinander liegende Flächen in einem Well des Assay-Chips (8) gemessen. Eine komplette Messung der Bodenfläche eines Wells war bislang nicht möglich, da nur Chips mit runden Wells zur Verfügung standen und der Mittelpunkt des Wells manuell eingestellt werden musste, so dass ein "Sicherheitsabstand" nötig war, um zu verhindern einen Well während der Messung zu verlassen. Wie in den einzelnen Bestimmungen zu sehen, war die Aggregatverteilung über die verschiedenen Flächen erwartungsgemäß nicht gleich. Durch Summierung der Flächen ergibt sich jedoch eine repräsentative Beschreibung der Probe.
Mit Hilfe der etablierten Immobilisierungs- und Messprobe wurde ein "Höhenscan" durch eine Scrapie-Probe und eine Negativkontrolle durchgeführt. Die Messungen wurden ausgewertet, indem die Häufigkeiten der Fluoreszenzintensitäten über 15 μm summiert wurden. Die Ergebnisse der 2D-FIDA-Messungen zeigen, dass zwischen der PrP^Sc-Probe und der Negativkontrolle ein signifikanter Unterschied messbar ist (9).
Beispiel 8: 2D-FIDA Reihenmessungen von PrP^Sc und PrP^BSE
Um die Messprobe hinsichtlich einer diagnostischen Anwendbarkeit zu evaluieren, wurden Messreihen mit Proben von vier verschiedenen infizierten und vier nicht infizierten Tieren als Kontrollen durchgeführt.
Dazu wurden Hirngewebeproben Scrapie-infizierter Hamster und Negativkontrollen mittels NaPTA-Fällung gereinigt und 1.25 × 10^–3 gÄ nach Resuspension mittels 3 × 2 Sekunden Ultraschall mit dem Antikörper R1 als Fängermolekül auf den Assay-Chips immobilisiert. Zur Detektion wurden je 0.1 μg/ml fluoreszenzmarkierter Antikörper R1 und D13 als Sonden eingesetzt. Nach drei einstündigen Waschschritten mit TBST wurden Fluoreszenzmessungen im FCS von sieben einzelnen Flächen durchgeführt. Die Messungen wurden in verschiedenen Höhen über dem Glasboden durchgeführt. Die Ergebnisse (10) zeigen, dass in den Höhenbereichen von 5 μm bis 25 μm ein signifikanter Unterschied zwischen mit Scrapie infizierten und nicht infizierten Hamstern erkennbar ist. Die Messhöhe zwischen 10 μm und 20 μm stellte sich dabei als geeignete Messhöhe dar, da oberhalb dieser Distanz die positiven Signale erheblich abfallen und unterhalb 10 μm der Messhintergrund durch unspezifische Antikörperbindung und freie Farbstoffmoleküle erhöht ist.
Zusammenfassend ließ sich die Aussage treffen, dass im Hamstermodell Scrapie-infizierte von nicht infizierten Hamstern signifikant unterschieden werden konnten und im Vergleich zum Messansatz in Suspension nicht nur die Unterschiede zwischen positiven und negativen Proben eindeutiger waren, sondern vor allem die Standardabweichungen enorm reduziert werden konnten.
Das System wurde anschließend für BSE-Proben adaptiert. Hierzu wurde als Fängermolekül der Antikörper 12F10 (Firma Spibio) eingesetzt. Alle anderen Schritte erfolgen analog zu denen des oben beschriebenen Scrapie-Systems. Als Sonden zur Detektion wurden die fluoreszenzmarkierten Antikörper 12F10 und Saf32 (Spibio, USA) eingesetzt.
Die Ergebnisse für vier BSE-infizierte Tiere und vier Negativkontrollen sind in 11 dargestellt. Die Messung zeigt, dass im Bereich von 10 μm bis 25 μm Abstand zur Chipoberfläche in allen Fällen ein signifikanter Unterschied zwischen BSE-infizierten und nicht infizierten Tieren zu erkennen war. Der Bereich von 10 μm bis 15 μm war der am besten geeignete Messbereich, da ab 20 μm das positive Signal in einigen Proben stark absank.
Durch diese Messreihen konnte gezeigt werden, dass das SPILA für einen diagnostischen Assay zur Detektion von BSE und für Scrapie geeignet ist.

Claims

Verfahren zur selektiven Bestimmung der Gegenwart und/oder der Menge pathologischer Proteinablagerungen, das umfasst: (a) Immobilisieren eines Fängermoleküls, das spezifische Bindungsaffinität für Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen aufweist, auf einer Oberfläche; (b) In-Kontakt-bringen des immobilisierten Fängermoleküls mit einer Messprobe, von der vermutet wird, dass sie pathologische Proteinablagerungen oder Teilstrukturen davon enthält; (c) Inkubieren des Ansatzes, sodass die Bildung eines Komplexes aus dem immobilisierten Fängermolekül und den Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen ermöglicht wird; (d) In-Kontakt-bringen des Komplexes mit mindestens einer detektierbaren Einheit, die spezifische Bindungsaffinität für die Teilstrukturen der zu bestimmenden Proteinablagerungen aufweist, und die ein optisch detektierbares Signal erzeugt, wobei mindestens eine der mindestens einen detektierbaren Einheit ein mittels spektroskopischer Verfahren detektierbares Signal erzeugt; und (e) Detektieren der Komplexbildung durch Messung des von der mindestens einen detektierbaren Einheit insgesamt erzeugten Signals.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Teilstrukturen der zu bestimmenden pathologischen Proteinablagerungen monomere oder oligomere Einheiten der Proteinablagerungen oder Fragmente davon umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Proteinablagerungen mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die neurodegenerativen Erkrankungen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus transmissiblen spongiformen Encephalopathien, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und vererbbarer cerebraler amyloider Amyloidose besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die transmissiblen spongiformen Encephalopathien aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung, Scrapie und boviner spongiformer Encephalopathie besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, das ferner die Aktivierung der Oberfläche vor dem Immobilisieren des Fängermoleküls umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Fängermolekül aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Fängermolekül aus Teilstrukturen pathologischer Proteinablagerungen besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Messprobe aus einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Körperflüssigkeit aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Cerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Blut, Urin und Sputum besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Gewebe Hirngewebe ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Messprobe vor dem In-Kontakt-bringen mit dem immobilisierten Fängermolekül gereinigt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Reinigung eine Phosphowolframat-Fällung ohne Zugabe einer Proteinase umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei zwei detektierbare Einheiten simultan an den Komplex aus dem immobilisierten Fängermolekül und den Teilstrukturen der Proteinablagerungen binden.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das von den zwei oder mehr detektierbaren Einheiten durch Koinzidenzmessung bestimmt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die mindestens eine detektierbare Einheit ein Protein oder ein Polypeptid umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Protein oder Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das von der mindestens einen detektierbaren Einheit erzeugte optisch detektierbare Signal aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Absorption, Fluoreszenzemission, Chemilumineszenzemission und Biolumineszenzemission besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die spektroskopischen Detektionsverfahren aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus konfokaler Fluoreszenzspektroskopie, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und FCS kombiniert mit Kreuzkorrelation und Single Particle Immunosorband Laserscanning Assay besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei zur Auswertung der Ergebnisse einer Fluoreszenzintensitätsdistributionsanalyse durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das von der mindestens einen detektierbaren Einheit insgesamt erzeugte Signal durch Abrastern der Oberfläche gemessen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei eine Mehrzahl nebeneinander liegender Teilbereiche der Oberfläche abgerastert wird, und die Einzelwerte anschließend addiert werden.