DE102005020754B3

DE102005020754B3 - Zelluläres Assayverfahren zur Identifizierung von PKCtheta-Inhibitoren

Info

Publication number: DE102005020754B3
Application number: DE102005020754A
Authority: DE
Inventors: Isabelle Dr. Heit; Monika Dr. Baudler; Sascha Dr. Dammeier; Michaela. Dr. Schäfer; Gottfried Prof. Dr. Baier
Original assignee: Altana Pharma AG
Current assignee: Takeda GmbH
Priority date: 2005-05-02
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2025-05-03
Also published as: CA2609640A1; JP2008539705A; WO2006117327A3; EP1880210A2; WO2006117327A2; US20090170125A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der modulierenden Wirkung einer Testsubstanz auf einen PKCTHETA-abhängigen Signaltransduktionsweg oder zum Auffinden eines PKCTHETA-Modulators in einer menschlichen oder tierischen Zelle, umfassend die Schritte DOLLAR A (a) Zusammenbringen der Zelle mit dem PKCTHETA-Modulator bzw. der Testsubstanz; DOLLAR A (b) ggf. Induzieren der Kinaseaktivität der PKCTHETA; DOLLAR A (c) Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Phosphorylierung zumindest eines Serin- oder Threoninrestes der PKCTHETA bewirken; DOLLAR A (d) ggf. Lysieren der Zelle; und DOLLAR A (e) Bestimmen des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Serin- oder Threoninrestes der PKCTHETA.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der modulierenden Wirkung von Testsubstanzen auf einen PKCθ-abhängigen Signaltransduktionsweg bzw. zum Auffinden von PKCθ-Modulatoren in einer menschlichen oder tierischen Zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform eignet sich das Verfahren zur Bestimmung der modulierenden Wirkung von Testsubstanzen auf die Kinaseaktivität der Isoform θ von Proteinkinase C (PKCθ).

Proteinkinase C (PKC) ist an vielen Signaltransduktionsvorgängen und der Regulation von Proliferation und Differenzierung beteiligt. Die Isoform θ der Proteinkinase C (PKCθ) ist eines der Schlüsselenzyme bei der Signaltransduktion in T-Zellen und spielt somit eine wichtige Rolle bei der zellvermittelten Immunantwort.

Die Aktivierung von T-Zellen erfolgt über einen komplexen Mechanismus, an dem mehrere Enzyme und Rezeptoren beteiligt sind. Die Aktivierung wird durch die Stimulierung von T-Zellrezeptor gekoppelten Tyrosinkinasen der Familien Src und Syk initiiert, welche verschiedene zelluläre Substrate phosphorylieren. Im Anschluss daran bilden sich Membran-Signal-Komplexe aus, welche an unterschiedlichen Signaltransduktionskaskaden beteiligt sind. Diese leiten Signale an den Zellkern weiter und induzieren dort verschiedene genetische Abläufe.

PKCθ ist eine Isoform der PKC-Familie, deren Kinaseaktivität von Diacylglycerin abhängt, nicht jedoch von Ca²⁺. PKCθ wird im wesentlichen selektiv in Skelettmuskelzellen und T-Zellen (T-Lymphocyten) exprimiert und spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung von T-Zellen. PKCθ aktiviert spezifisch die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) und den Transkriptionsfaktor AP-1 in T-Zellen, und wirkt synergistisch zusammen mit Calcineurin bei der Aktivierung des IL-2 Gens. Darüber hinaus ist PKCθ die einzige bisher bekannte Isoform der Proteinkinase C, welche an der Ausbildung eines Membran-Signal-Komplexes beteiligt ist, wenn die T-Zelle in Kontakt mit einer Stimulatorzelle tritt. Es sind zwei Isoformen der PKCθ bekannt, PKCθ I und PKCθ II, von denen letztere möglicherweise eine Rolle bei der Spermatogenese spielt (vgl. Y.S. Niino et al., J. Biol. Chem. 2001, 276(39), 36711).

PKCθ ist ein gutes Target bei der Suche nach neuen pharmakologischen Wirkstoffen, wie neuen Immunmodulatoren, insbesondere Immunstimulatoren und Immunsuppressiva, oder Mitteln zur Behandlung von Muskelerkrankungen.

Methoden zur Identifizierung von Agenzien, welche einen Einfluss auf die Phosphorylierung der PKCθ haben, sind im Stand der Technik bekannt. So offenbart WO 01/48236, dass PKCθ in T-Zellen der Jurkat-Zelllinie durch die Tyrosinkinase Lck, ein Mitglied der Src-Familie, infolge einer TCR/CD3-Aktivierung in der regulatorischen Domäne an Tyr⁹⁰ phosphoryliert wird. Es wird vorgeschlagen, Inhibitoren der Tyrosinkinase Lck durch Messung ihrer Wirkung auf die Tyrosin-Phosphorylierung von PKCθ in Jurkat T-Zellen nach TCR/CD3-Aktivierung zu identifizieren.

Neben Tyr⁹⁰ sind auch andere Phosphorylierungsstellen der PKCθ im Stand der Technik beschrieben, nämlich Thr⁵³⁸, Ser⁶⁷⁶ und Ser⁶⁹⁵ (vgl. Y. Liu et al., Biochem. J. (2002) 361, 255–265). Inzwischen sind auch phospho-spezifische Antikörper gegen diese Phosphorylierungsstellen kommerziell erhältlich (anti-PKCθ-phospho-Thr⁵³⁸, anti-PKCθ-phospho-Ser⁶⁷⁶ und anti-PKCθ-phospho-Ser⁶⁹⁵ Antikörper), z.B. bei den Firmen abcam Ltd., Cambridge, UK; Cell Signalling Technology Inc., Beverly, USA; BioSource International, Camarillo, USA; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA; und Novus Biologicals, Inc., Littleton, USA.

Die herkömmlichen Testsysteme zur Bestimmung der Enzymaktivität von PKCθ beruhen üblicherweise auf einem enzymatischen in vitro Substratphosphorylierungsassay, bei dem Protein eingesetzt wird, welches rekombinant exprimiert wurde. Im Unterschied zur Situation in vivo, wo das Enzym erst über eine Kaskade aktiviert werden muss, ist jedoch das in diesen Testsystemen bereitgestellte Enzym bereits aktiv und entspricht daher nicht seinem Zustand unter physiologischen Bedingungen. Dies hat zur Folge, dass beispielsweise Membraninteraktionen und Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, welche an der Signaltransduktionskaskade beteiligt sind, wie z.B. eine eventuelle Bindung an Adaptorproteine, durch die herkömmlichen Testsysteme nicht erfasst werden können.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Testsystem bereitzustellen, bei dem unter in vivo Bedingungen, also mit PKCθ als physiologischem Substrat, eine Untersuchung der modulierenden Wirkung einer Testsubstanz auf einen PKCθ-abhängigen Signaltransduktionsweg, insbesondere auf die Enzymaktivität von PKCθ, möglich bzw. ein PKCθ-Modulator auffindbar ist. Das Testsystem sollte empfindlich und nach Möglichkeit zum High-Throughput-Screening (HTS) von Testsubstanzbibliotheken geeignet sein. Die Aufnahme von Dosis-Wirkungs-Beziehungen sollte ermöglicht werden.

Es wurde überraschend gefunden, dass diese Aufgabe gelöst werden kann durch ein Verfahren

– zur Untersuchung der modulierenden Wirkung einer Testsubstanz auf einen PKCθ-abhängigen Signaltransduktionsweg bzw.
– zum Auffinden eines PKCθ-Modulators

in einer menschlichen oder tierischen Zelle, umfassend die Schritte

(a) Zusammenbringen der Zelle mit der Testsubstanz bzw. mit dem PKCθ-Modulator;
(b) ggf. Induzieren der Kinaseaktivität der PKCθ;
(c) Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Phosphorylierung zumindest eines Threoninrestes der PKCθ bewirken, vorzugsweise die Phosphorylierung des Threoninrestes in Position 219 der PKCθ;
(d) ggf. Lysieren der Zelle; und
(e) Bestimmen des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ, vorzugsweise des Threoninrestes in Position 219 der PKCθ,

wobei die Phosphorylierung des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ zumindest teilweise als Autophosphorylierung erfolgt.

Eine "Testsubstanz mit modulierender Wirkung" auf einen PKCθ-abhängigen Signaltransduktionsweg im Sinne der Beschreibung umfasst eine Substanz, welche einen aktivierenden oder inhibierenden Einfluss auf einen Signaltransduktionsweg hat, an dem PKCθ beteiligt ist, d.h. innerhalb dessen PKCθ eine zu durchlaufende Reaktion katalysiert. Der modulierende, d.h. aktivierende bzw. inhibierende Einfluss der Testsubstanz kommt vorzugsweise dadurch zum Ausdruck, dass in Anwesenheit der Testsubstanz ein End- oder Zwischenprodukt innerhalb des Signaltransduktionswegs in verstärktem bzw. verringertem Umfang in vivo gebildet wird, bezogen auf die Situation der Abwesenheit dieser Testsubstanz unter ansonsten gleichen Bedingungen. Dabei wird dieses End- oder Zwischenprodukt vorzugsweise innerhalb des Signaltransduktionswegs gebildet, nachdem PKCθ ihre Funktion bereits erfüllt hat. Dieses End- oder Zwischenprodukt ist bevorzugt das unmittelbare Reaktionsprodukt der Phosphorylierungsreaktion, welche von PKCθ katalysiert wird. Die modulierende Wirkung der Testsubstanz kommt vorzugsweise aber auch bei den Folgeprodukten zum Ausdruck, welche letztendlich, ggf. unter Beteiligung weiterer Enzyme, aus diesem unmittelbaren Reaktionsprodukt in vivo hervorgehen.

Ein "PKCθ-abhängiger Signaltransduktionsweg" im Sinne der Beschreibung ist grundsätzlich jeder biochemische Reaktionsweg, an welchem PKCθ beteiligt ist, vorzugsweise eine Enzymkaskade. Dabei kann PKCθ ihrerseits das Substrat einer bestimmten Reaktion sein, beispielsweise einer Phosphorylierungsreaktion, wobei die Testsubstanz eine unmittelbare oder mittelbare Wirkung auf die Geschwindigkeit dieser Phosphorylierungsreaktion entfaltet. Es ist bevorzugt, dass die Testsubstanz ihre modulierende Wirkung auf eine Phosphorylierungsreaktion entfaltet, welche von PKCθ selbst katalysiert wird. Dabei entfaltet die Testsubstanz ihre modulierende Wirkung auf eine durch PKCθ katalysierte Phosphorylierungsreaktion, wobei PKCθ selbst das Substrat dieser Reaktion ist (Autophosphorylierung).

Die Testsubstanz muss dabei nicht unmittelbar auf PKCθ einwirken. Vielmehr ist es beispielsweise auch möglich, dass bestimmte Proteine oder Enzyme von der Testsubstanz moduliert werden, welche innerhalb des Reaktionsweges (der Enzymkaskade) PKCθ vorgeschaltet sind, so dass sich die modulierende Wirkung der Testsubstanz innerhalb dieses Reaktionsweges erst mittelbar auf die Aktivität der PKCθ auswirkt.

Ein PKCθ-"Modulator" im Sinne der Beschreibung umfasst sowohl einen Aktivator als auch einen Inhibitor der PKCθ. Wegen der Funktion von PKCθ in T-Zellen können einerseits Aktivatoren der PKCθ als Immunstimulatoren und andererseits Inhibitoren der PKCθ als Immunsuppressiva wirken.

Dabei bedeutet "Modulation" im Sinne der Beschreibung, dass ein Unterschied beobachtet wird im Falle der Anwesenheit des PKCθ-Modulators (bzw. der Testsubstanz) im Vergleich zur Abwesenheit des PKCθ-Modulators (bzw. der Testsubstanz) unter ansonsten gleichen Bedingungen. Die modulierende Wirkung, welche aktivierend oder inhibierend sein kann, kommt in diesem relativen Vergleich zum Ausdruck.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Schritte (a), ggf. (b), (c), ggf. (d) und (e) in der Reihenfolge ihrer Nennung durchlaufen, wobei es möglich ist, dass einzelne Schritte gleichzeitig durchgeführt werden. Die Schritte (b) und (d) sind optional. Besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren alle Schritte (a) bis (e), wobei bevorzugt Schritte (b) und (c) gleichzeitig durchgeführt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dient PKCθ als Substrat der Phosphorylierungsreaktion in Schritt (c). Die Phosphorylierung des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ kann dabei in vivo durch verschiedene Kinasen katalysiert werden. Erfindungsgemäß erfolgt die Phosphorylierung des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ unter Katalyse der PKCθ selbst, d.h. zumindest teilweise als Autophosphorylierung.

Als Phosphorylierungsstellen sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren diejenigen Hydroxylgruppen von Threoninresten der PKCθ geeignet, welche unter in vivo Bedingungen, ggf. nach Aktivierung, phosphoryliert werden. Damit ein Einfluss der zu untersuchenden Testsubstanz auf den Phosphorylierungsgehalt dieser Threoninreste untersucht werden kann, ist es bevorzugt, dass die Phosphorylierung des zumindest einen Threoninrestes durch die Zelle wenigstens zum Teil erst dann erfolgt, nachdem die Zelle mit der Testsubstanz zusammengebracht wurde. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass die Phosphorylierungsaktivität der Zelle, vorzugsweise die Kinaseaktivität der PKCθ, durch geeignete Mittel erst induziert wird, nachdem die Zelle mit der zu untersuchenden Testsubstanz zusammengebracht und inkubiert wurde.

Es handelt sich bei dem zumindest einen Threoninrest um einen Rest, welcher zumindest teilweise unter Katalyse der PKCθ selbst phosphoryliert wird, also um eine Autophosphorylierungsstelle. Es ist bekannt, dass bei PKCθ die Serinseitenketten im turn motif bei Ser⁶⁷⁶ und im hydrophobic motif bei Ser⁶⁹⁵ autophosphoryliert werden (vgl. Y. Liu et al., Biochem. J. (2002) 361, 255–265). Im Unterschied dazu wird die Tyrosin-Seitenkette in der regulatorischen Domäne bei Tyr⁹⁰ nicht von PKCθ selbst, sondern von Lck phosphoryliert (vgl. WO 01/48236). Auch die Threonin-Seitenkette in der katalytischen Domäne bei Thr⁵³⁸ wird nicht von PKCθ selbst, sondern von PDK-1 phosphoryliert.

Insbesondere bevorzugt wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Phosphorylierungsgehalt der PKCθ von Thr²¹⁹ gemessen. Es wurde überraschend gefunden, dass PKCθ in der regulatorischen Domäne bei Thr²¹⁹ einen Threoninrest aufweist, welcher phosphoryliert wird. Durch Phosphopeptid-Mapping (vgl. B.D. Manning et al., Sci. STKE. 2002, 162, 49) und biochemische Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass es sich dabei um eine Autophosphorylierungsstelle handelt.

Eine Bestimmung des Phosphorylierungsgehalts von Thr²¹⁹ liefert somit unmittelbare Rückschlüsse auf die Enzymaktivität der PKCθ in vivo.

Die Autophosphorylierungsstelle Thr²¹⁹ hat den Vorteil, dass die Hydroxylgruppe in der Seitenkette des Threoninrestes aufgrund ihrer Lage innerhalb der Tertiärstruktur der PKCθ als Substrat für die durch PKCθ katalysierte Autophosphorylierungsreaktion gut geeignet ist und mit einer zufriedenstellenden katalytischen Konstante umgesetzt wird. Ferner ist auch das Reaktionsprodukt, d.h. der phosphorylierte Threoninrest in Position 219 der PKCθ, als Teil eines Epitops für phosphospezifische Antikörper gut zugänglich, was eine Bestimmung des Phosphorylierungsgehalts vereinfacht.

Darüber hinaus erfolgt die Autophosphorylierung – im Unterschied zu Ser⁶⁷⁶ und Ser⁶⁹⁵, den anderen beiden bekannten Autophosphorylierungsstellen der PKCθ – erst nachdem die PKCθ aktiviert wurde. Daher eignet sich Thr²¹⁹ als Autophosphorylierungsstelle besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren, da die Kinaseaktivität der PKCθ und damit die Autophosphorylierung bei Thr²¹⁹ zu einem bestimmten Zeitpunkt induziert werden kann. Die gezielte Induzierbarkeit der Phosphorylierung von Thr²¹⁹ zu einem bestimmten Zeitpunkt ist ein wesentlicher Vorteil dieser Autophosphorylierungsstelle von PKCθ gegenüber den anderen bekannten Autophosphorylierungsstellen.

Unter "Phosphorylierungsgehalt" wird im Sinne der Beschreibung derjenige molare Anteil der PKCθ-Moleküle verstanden, welcher an dem betreffenden zumindest einen Threoninrest zu einer bestimmten Zeit phosphoryliert vorliegt, bezogen auf die Gesamtheit aller an dem betreffenden zumindest einen Threoninrest phosphorylierten und unphosphorylierten PKCθ-Moleküle im System zur gleichen Zeit. Der Phosphorylierungsgehalt kann in mol.-% angegeben werden. Durch Aufnahme von Dosis-Wirkungs-Kurven ist eine Messung der Hemmung bzw. Aktivierung der zu untersuchenden Testsubstanz möglich, welche üblicherweise als IC₅₀-Wert oder in Abhängigkeit von der Konzentration der Testsubstanz in % angegeben wird.

Sofern nicht anderweitig definiert, haben alle in der Beschreibung verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die allgemein übliche Bedeutung aus Sicht des Fachmanns. Hinsichtlich Einzelheiten und Begriffsdefinitionen kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, John Wiley & Sons; D. Voet et al., Biochemistry, John Wiley & Sons; L. Stryer et al., Biochemistry, W. H. Freeman & Company; und D. Nelson et al., Lehninger Principles of Biochemistry, Palgrave Macmillan.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt in Schritt (a) das Zusammenbringen der Zelle mit der Testsubstanz, deren modulierende Wirkung untersucht werden soll, bzw. mit dem PKCθ-Modulator. Je nach Typ der verwendeten Zelle werden dazu geeignete Inkubationsmedien nach Standardprotokollen verwendet. Handelt es sich bei der Zelle um eine humane T-Zelle, vorzugsweise eine primäre oder murine humane T-Zelle, so ist als Medium beispielsweise geeignet RPMI, 10% FCS, 2 mmol/l L-Glutamin, 50 u/ml Penicillin/Streptomycin.

Die zu untersuchende Testsubstanz bzw. der PKCθ-Modulator wird dabei mit der Zelle in einer Konzentration zusammengebracht, die ausreicht, um – im Falle einer modulierenden Wirkung – einen Unterschied des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ im Vergleich zu einer Negativkontrolle detektieren zu können. Die verwendete Konzentration der Testsubstanz bzw. des PKCθ-Modulators ist unabhängig von der Anzahl der verwendeten Zellen pro Messung. Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise mit 10³ bis 10⁷ Zellen für eine Testsubstanz bzw. für einen PKCθ-Modulator durchgeführt.

Standardprotokolle und Reagenzien, welche zur Handhabung von PKCθ und von Zellen, welche PKCθ enthalten, geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf R. Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; A.D. Reith, Protein Kinase Protocols, Humana Press; A.C. Newton et al., Protein Kinase C Protocols (Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), V. 233.), Humana Press; J.N. Abelson et al., Protein Phosphorylation, Part A: Protein Kinases: Assays, Purification, Antibodies, Functional Analysis, Cloning, and Expression: Volume 200: Protein Phosphorulation Part A (Methods in Enzymology), Academic Press; J.F. Kuo, Proteinkinase C, Oxford University Press; und G. Hardie et al., Protein Kinase Facts Book (Two-Volume Set), Academic Press.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird bevorzugt in Schritt (b) die Kinaseaktivität der PKCθ induziert. Geeignete Substanzen zur Aktivierung der PKCθ sind dem Fachmann bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt (b) mit Hilfe von anti-CD3-Antikörpern, welche vorzugsweise an Beads immobilisiert sind. Geeignete Anti-CD3-Antikörper sind beispielsweise bei der Firma Janssen Cilag unter der Bezeichnung Orthoclone OKT^®3 erhältlich und können beispielsweise an Beads, welche von der Firma Dynal Biotech Ltd. unter der Bezeichnung Dynabeads^® Pan Mouse IgG (solid Phase CD3) vertrieben werden, immobilisiert werden. In diesem Fall erfolgt die Aktivierung der PKCθ indirekt über den T-Zell-Rezeptor (TCR).

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt (b) mit Hilfe von direkten Aktivatoren. Beispielsweise eignen sich Diacylglycerin, Bryostatine oder kommerziell erhältliche Phorbolester, wie z.B. 4α-Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), welche einen direkten Einfluss auf die Kinaseaktivität der PKCθ haben. Auf diese Weise wird die Kaskade über den T-Zellrezeptor und andere Kinasen umgangen. Demnach wird bevorzugt die Kinaseaktivität in Schritt (b) durch Zugabe eines Phorbolesters, Bryostatins oder anti-CD3 Antikörpers induziert.

Die ggf. durchgeführte Induzierung der Aktivierung der PKCθ in Schritt (b) erfolgt bevorzugt nicht sofort, nachdem Schritt (a) durchgeführt wurde. Vielmehr wird die Zelle bevorzugt nach Schritt (a), d.h. dem Zusammenbringen mit der zu untersuchenden Testsubstanz bzw. mit dem PKCθ-Modulator, für eine gewisse Dauer, die z.B. im Bereich von einer Stunde liegen kann, inkubiert. Erfindungsgemäß sind aber auch längere oder kürzere Inkubationszeiten möglich. Kürzere Inkubationszeiten, beispielsweise in der Größenordnung von 20 bis 40 Minuten sind bevorzugt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in Schritt (c) die Zelle unter Bedingungen inkubiert, welche die Phosphorylierung zumindest eines Threoninrestes der PKCθ bewirken. Von der Gesamtheit aller Threoninreste der PKCθ sind dies nur einige bestimmte Threoninreste, welche reaktiv sind und als Substrate für die Phosphorylierung innerhalb der Zelle zur Verfügung stehen. Bevorzugt handelt es sich dabei um Thr²¹⁹ der PKCθ.

Dazu wird die Zelle bevorzugt für eine Dauer von 1 bis 30 min, bevorzugter 2 bis 10 min bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Bevorzugt wird die Zelle für eine Dauer inkubiert, welche sie benötigt, um in Abwesenheit der zu untersuchenden Testsubstanz bzw. des PKCθ-Modulators unter ansonsten identischen Bedingungen mindestens 10% des zumindest einen Threoninrestes, bevorzugter mindestens 15%, noch bevorzugter mindestens 20% des zumindest einen Threoninrestes zu phosphorylieren. Die dafür erforderliche Zeit kann durch einfache Vorversuche ermittelt werden.

Umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den Schritt (b), d.h. die Induzierung der Kinaseaktivität der PKCθ, so erfolgt Schritt (c) bevorzugt unter den gleichen Bedingungen wie Schritt (b).

Besonders bevorzugt werden die Schritte (b) und (c) gleichzeitig durchgeführt. Umfasst die Induzierung der Kinaseaktivität der PKCθ beispielsweise die Zugabe eines Phorbolesters, so verbleibt der Phorbolester bevorzugt im Inkubationsmedium während der Durchführung von Schritt (c). Es erfolgt also bevorzugt eine kontinuierliche Aktivierung der PKCθ durch die Anwesenheit des Phorbolesters (Schritt (b)), und gleichzeitig werden Bedingungen geschaffen, welche eine Phosphorylierung des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ bewirken (Schritt (c)).

Es ist aber auch möglich, die Induzierung der Kinaseaktivität der PKCθ in Schritt (b) vor oder während Schritt (c) abzubrechen. Dies kann beispielsweise in Schritt (b) durch die Verwendung von anti-CD3-Antikörpern realisiert werden, die an magnetischen Partikeln immobilisiert sind und von der Zelle bzw. den Zellen abgetrennt werden, noch ehe Schritt (c) abgeschlossen ist.

Bevorzugt erfolgt jedoch die Induzierung der Kinaseaktivität der PKCθ in Schritt (b) während der gesamten Dauer von Schritt (c).

Umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte (a), (b) und (c), so wird die Zelle bevorzugt nach dem Zusammenbringen mit der zu untersuchenden Testsubstanz bzw. mit dem PKCθ-Modulator in Schritt (a) für eine gewisse Dauer inkubiert, z.B. für eine Stunde, ehe die Kinaseaktivität der PKCθ in Schritt (b) induziert wird und die Zelle in Schritt (c) unter Bedingungen inkubiert wird, welche die Phosphorylierung zumindest eines Threoninrestes der PKCθ bewirken.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird bevorzugt in Schritt (d) die Zelle lysiert. Zur Lyse eignen sich die allgemein üblichen Verfahren nach Standardprotokollen. Osmotische Lyse oder der Einsatz von Tensiden, wie z.B. Triton oder Tween in geeigneten Puffern sind bevorzugt. Ein geeigneter Lysepuffer hat beispielsweise die folgende Zusammensetzung: 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0), 100 mmol/l NaCl, 2% Nonidet P-40, 1 mmol/l Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,5 μg Leupeptin pro ml, und 1,0 μg Aprotinin pro ml und 5 mmol/l Natriumorthovanadat. Ein anderer geeigneter Lysepuffer besteht aus 50 mmol/l HEPES (pH 7,5), 2% Nonidet P-40, 5 mmol/l Natriumorthovanadat, 5 mmol/l Natriumpyrophosphat, 5 mmol/l NaF, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l NaCl und 50 μg/ml Aprotinin und Leupeptin.

Die Bestimmung des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt (e). Dazu sind grundsätzlich die üblichen Verfahren nach Standardprotokollen geeignet. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf A.C. Newton et al., Protein Kinase C Protocols (Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), V. 233.), Humana Press; J.N. Abelson et al., Protein Phosphorylation, Part A: Protein Kinases: Assays, Purification, Antibodies, Functional Analysis, Cloning, and Expression: Volume 200: Protein Phosphorulation Part A (Methods in Enzymology), Academic Press.

Beispielsweise kann in Schritt (c) durch Zusatz von [³²P]-γ-ATP zum Inkubationsmedium eine radioaktive Markierung des zumindest einen Threoninrestes erreicht und die Radioaktivität nach Lyse in Schritt (d) und Isolierung der markierten PKCθ aus dem Lysat durch Szintillationszählung in Schritt (e) quantifiziert werden. Da die radioaktive Markierung jedoch unspezifisch hinsichtlich der einzelnen Phosphorylierungsstellen ist, für HTS-Ansätze weitgehend ungeeignet ist und besondere Sicherheitsvorkehrungen erfordert, erfolgt die Messung des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ vorzugsweise mit Hilfe colorimetrischer, fluorimetrischer oder luminometrischer Methoden. Demnach umfasst Schritt (e) bevorzugt eine colorimetrische, fluorimetrische oder luminometrische Messung.

Fluorimetrische Methoden umfassen neben herkömmlichen Fluoreszenzmessungen auch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Messungen (FRET), wobei im Falle der Verwendung zweier Fluorophore (Donor und Akzeptor) sowohl die Fluoreszenzschwächung des Donors, als auch die Fluoreszenz des Akzeptors gemessen werden kann.

Luminometrische Methoden umfassen die Messung der Elektrochemolumineszenz. Auch die Messung mit Hilfe eines Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (ALPHA)Screen^® (BioSignal Packard, Inc.) kommt in Betracht.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst Schritt (e) die Anwendung der ELISA-Technologie (ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay). Die ELISA-Technologie ist dem Fachmann geläufig. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf J.R. Crowther et al., The ELISA Guidebook, Humana Press; J.R. Crowther, ELISA: Theory and Practice, Humana Press; und D.M. Kemeny, A Practical Guide to Elisa, Pergamon.

Ein enzym-gekoppelter Immunnachweis (ELISA) umfasst üblicherweise folgende Teilschritte:

(i) der Antikörper gegen das gesuchte Protein (Fängerantikörper), hier vorzugsweise ein anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper, wird auf einer inerten Festphase, wie z.B. Polystyrol, verankert;
(ii) die Lösung des zu untersuchenden Proteins wird auf die mit Antikörpern besetzte Oberfläche aufgetragen, so dass der immobilisierte Antikörper das Protein binden kann;
(iii) der entstandene Antikörper-Protein-Komplex wird mit einem zweiten proteinspezifischen Antikörper (Detektionsantikörper), hier vorzugsweise ein anti-PKCθ Antikörper, inkubiert; dieser Zweitantikörper ist vorzugsweise mit einem leicht nachweisbaren Enzym kovalent verknüpft (Antikörper-Enzym-Konjugat);
(iv) der überschüssige, ungebundene Zweitantikörper wird durch wiederholtes Waschen entfernt. Dann wird das Enzym des Fängerantikörper-Protein-Detektionsantikörper-Enzym-Komplexes nachgewiesen, woraus die Menge des gebundenen Proteins berechnet werden kann.

Die Verankerung in Schritt (i) kann auf verschiedene Weise realisiert werden. Die unterschiedlichen Möglichkeiten sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise kann die Verankerung erreicht werden

– durch Festphasen, welche ihrerseits kovalent mit Antikörpern verknüpft sind, wobei diese kovalent verknüpften Antikörper gegen Antikörper derjenigen Organismen spezifisch sind, welche zur Herstellung des Fängerantikörpers verwendet wurden;
– durch Festphasen, welche kovalent mit Streptavidin oder Biotin verknüpft sind und der Fängerantikörper seinerseits mit Biotin bzw. Streptavidin konjugiert ist; oder
– durch Festphasen, welche an ihrer Oberfläche geeignete funktionelle Gruppen tragen, die in der Lage sind, mit den funktionellen Gruppen des Fängerantikörpers, ggf. nach chemischer Aktivierung, kovalente Bindungen auszubilden; in diesem Zusammenhang kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf M. Nisnevitch et al., J. Biochem. Biophys. Methods. 2001; 49(1–3): 467–80).

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst Schritt (e) die Anwendung der FLISA-Technologie (FLISA = fluorophorlinked immunosorbent assay). Die FLISA-Technologie ist dem Fachmann geläufig. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf E.E. Swartzman et al., Anal. Biochem. 1999, 271(2), 143–51; und P. Oelschlaeger et al., Anal. Biochem. 2002, 309(1), 27–34.

Im Unterschied zur ELISA-Technologie kann bei der FLISA-Technologie auf Waschschritte verzichtet werden, und nur ein einziger Inkubationsschritt ist erforderlich. Daher eignet sich die FLISA-Technologie insbesondere zum high-throughput-screening.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein fluorophorgebundener Immunnachweis (FLISA) üblicherweise folgende Teilschritte:

(i) der Antikörper gegen das gesuchte Protein (Fängerantikörper), hier vorzugsweise ein anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper, wird an Beads aus einem inerten Material verankert (vgl. oben);
(ii) die Lösung des zu untersuchende Proteins und ein zweiter proteinspezifischer Antikörper (Detektionsantikörper), hier vorzugsweise ein anti-PKCθ Antikörper, wird mit den Beads inkubiert, wodurch sich ein Fängerantikörper-Protein-Detektionsantikörper-Komplex ausbildet. Damit dieser Komplex fluorimetrisch nachgewiesen werden kann, ist es erforderlich, dass zumindest ein geeigneter Fluorophor anwesend ist. Dies kann auf unterschiedliche Weise realisiert werden. Beispielsweise
– kann der Zweitantikörper direkt mit einem Fluorophor kovalent verknüpft sein;
– kann der Zweitantikörper mit Biotin konjugiert sein und während der Inkubation zusätzlich ein an Streptavidin gebundener Fluorophor zugegeben werden;
– kann der Fluorophor an einen dritten Antikörper gebunden sein, welcher während der Inkubation zugegeben wird und für Antikörper der Spezies, welche zur Herstellung des Detektionsantikörpers verwendet wurden, spezifisch ist;
(iii) vorzugsweise ohne Waschschritte wird die Fluoreszenz des Fängerantikörper-Protein-Detektionsantikörper-Fluorophor-Komplexes nachgewiesen, woraus die Menge des gebundenen Proteins berechnet werden kann. Bei der Messung der Fluoreszenz wird mit Hilfe geeigneter Verfahren nur die Fluoreszenz des im Komplex gebundenen Fluorophors gemessen, nicht jedoch die Fluoreszenz des frei in Lösung befindlichen überschüssigen Fluorophors; dies kann beispielsweise erreicht werden
– mit Hilfe der hydrodynamischen Fokussierung (Durchflusszytometrie), wobei die Beads vereinzelt und in ungefähr gleicher Ausrichtung an einem Laserfokus vorbeigeleitet werden, und/oder
– durch Markierung der Beads mit einem zweiten Fluorophor, wobei die Messung der Fluoreszenz dann auf einer Colokalisation beider Fluoreszenzsignale basiert.

Die Bestimmung der Phosphorylierung in Schritt (e) basiert bevorzugt auf der Verwendung phospho-spezifischer Antikörper gegen den zumindest einen Threoninrest der PKCθ, welcher nach Schritt (a), d.h. nach dem Zusammenbringen der Zelle mit der zu untersuchenden Testsubstanz bzw. mit dem PKCθ-Modulator, in Schritt (c) phosphoryliert wurde.

Ein gegen phosphoryliertes Threonin gerichteter Antikörper, dessen Epitop weitgehend auf den phosphorylierten Threoninrest beschränkt und somit weitgehend unabhängig von der Struktur der flankierenden Aminosäurereste ist, ist beispielsweise bei der Firma New England Biolabs, Inc., Herts, GB erhältlich. Dieser Antikörper ist jedoch nicht spezifisch für einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219 der PKCθ, sondern bindet grundsätzlich an jeden phosphorylierten Threoninrest jedes Proteins im Zelllysat. Da dieser Antikörper weder zwischen PKCθ und anderen Proteinen, noch zwischen einzelnen phosphorylierten Threoninresten unterscheidet, ist seine Selektivität/Sensitivität entsprechend gering.

Vorzugsweise umfasst Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch ist gegen einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219 der PKCθ, zum Zwecke der Beschreibung auch bezeichnet als "anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper". Grundsätzlich ist es aber auch möglich, dass ein Antikörper verwendet wird, welcher an jegliche phosphorylierte Threoninreste bindet, zum Zwecke der Beschreibung auch bezeichnet als "anti-phospho-Thr Antikörper".

Zum Zwecke der Beschreibung bedeutet die Schreibweise "phospho-Thr²¹⁹" einen L-Threoninrest in Position 219 innerhalb der Primärstruktur von PKCθ, dessen Hydroxylgruppe in der Seitenkette einfach phosphoryliert ist. Handelt es sich bei der oder den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zelle(n) um humane Zellen, so bedeutet der Ausdruck "phospho-Thr²¹⁹" bevorzugt einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219 innerhalb der als SEQ. ID. NO. 1 dargestellten Sequenz.

Diese Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein. Geeignete Methoden zur Herstellung solcher Antikörper sind dem Fachmann bekannt. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf E. Liddell et al., Antikörper-Techniken, Spektrum Akademischer Verlag; R. Kontermann et al., Antibody Engineering, Springer, Berlin; E. Harlow et al., Using Antibodies – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; E. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; B.K.C. Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; P.S. Shepherd et al., Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press; G. Subramanian, Antibodies Production and Purification, Kluwer Academic/Plenum Publishers; T. Clackson et al., Phage Display: A Practical Approach (The Practical Approach Series, 266), Oxford University Press; und B.K. Kay, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press.

Je nach verwendetem Organismus hat die PKCθ eine variierende Primärstruktur. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann beispielsweise die PKCθ von Mäusen, Ratten oder anderen Tieren eingesetzt werden. Bevorzugt werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren humane Zellen, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere humane T-Zellen eingesetzt, so dass die untersuchte PKCθ bevorzugt humane PKCθ ist. Bevorzugt handelt es sich bei dem untersuchten Enzym um die Isoform PKCθ I.

Bevorzugt umfasst die untersuchte PKCθ die SEQ. ID. NO. 1.

Zur Herstellung phospho-spezifischer Antikörper gegen bestimmte Phosphorylierungsstellen von PKCθ werden bevorzugt Oligopeptide synthetisiert, deren Primärstruktur der Region um die Phosphorylierungsstelle innerhalb der Primärstruktur von PKCθ entspricht. Ein phospho-spezifischer Antikörper gegen Thr²¹⁹ kann daher beispielsweise mit Hilfe eines Oligopeptids umfassend die Teilsequenz ... Glu-(phospho-Thr)-Met ... hergestellt werden, wobei "phospho-Thr" für einen in der Seitenkette phosphorylierten Threoninrest steht. Geeignete Methoden zur Herstellung derartiger Oligopeptide sind dem Fachmann bekannt. In diesem Zusammenhang kann beispielsweise verwiesen werden auf M.W. Pennington et al., Peptide Synthesis Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 1994; W.C. Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Pracfical Approach, Oxford University Press, 2000; J. Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis (Oxford Chemistry Primers, 7), Oxford University Press, 2002; J. Howl, Peptide Synthesis And Applications (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2005; und N.L. Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, 2005).

Bevorzugt wird zur Herstellung eines anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörpers ein Oligopeptid verwendet, welches eine Aminosäuresequenz aus wenigstens 5 Aminosäureresten, bevorzugt wenigstens 7, bevorzugter wenigstens 9, noch bevorzugter wenigstens 11, am bevorzugtesten wenigstens 13 und insbesondere wenigstens 15 Aminosäureresten umfasst, mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenz einer zusammenhängenden Teilsequenz von SEQ. ID. NO. 2 entspricht und dabei den phosphorylierten Threoninrest einschließt, welcher in SEQ. ID. NO. 2 die Position 19 hat. Bevorzugt umfasst die Aminosäuresequenz die Positionen 17 bis 21, bevorzugter 15 bis 23, noch bevorzugter 13 bis 25, am bevorzugtesten 11 bis 27 und insbesondere 9 bis 29 von SEQ. ID. NO. 2.

Anschließend kann das Oligopeptid beispielsweise mit Maleinimid-aktiviertem Keyhole-limpet Hämocyanin (KLH) oder bovinem Serumalbumin (BSA) konjugiert werden. Danach können mehrere Individuen, beispielsweise weiße Neuseeland Kaninchen, mit dem Peptid-KLH-Konjugat immunisiert werden, wobei die Immunisierung in regelmäßigen Abständen, beispielsweise nach 2 Wochen, wiederholt wird. Der Antikörper-Titer im Serum lässt sich durch ELISA in Peptid-BSA beschichteten Mikrotiterplatten bestimmen. Die phospho-spezifischen Antikörper, in diesem Fall vorzugsweise anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper, können dann durch geeignete Methoden aus dem Serum isoliert werden.

Durch Herstellung von Hybridomen, beispielsweise mit Hilfe immunisierter Mäuse, lassen sich analog monoklonale Antikörper herstellen, d.h. monoklonale anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper. Dazu werden nach Immunisierung die antikörperbildenden B-Lymphozyten, vorzugsweise aus der Milz von Mäusen isoliert und anschließend mit Myelomzellen fusioniert, wodurch Hybridomazellen entstehen. Auch ist es möglich, monoklonale Antikörper aus Kaninchen zu erhalten (RabMab; vgl. z.B. H. Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1995 Sep 26; 92(20): 9348–52). Ferner kann auch die Phage Display Technologie zur Erzeugung monoklonaler Antikörper verwendet werden (vgl. z.B. P.G. Schultz et al., Science 1995, 269: 1835–1842).

Die so erhaltenen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können ferner mit Fluoreszenzfarbstoffen, Enzymen, Biotin, etc. konjugiert und/oder an Festphasen immobilisiert werden. Die dazu erforderlichen Verfahrensschritte erfolgen nach Standardprotokollen.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt in Schritt (e) die folgenden Teilschritte:

(e₁) Immunpräzipitieren zumindest eines Teils der PKCθ unter Verwendung eines geeigneten ersten Antikörpers; und
(e₂) Messen des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der immunpräzipitierten PKCθ unter Verwendung eines geeigneten zweiten Antikörpers.

Bevorzugt ist dabei der erste Antikörper gegen PKCθ (anti-PKCθ Antikörper) und der zweite Antikörper gegen phospho-Thr²¹⁹ der PKCθ (anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper) gerichtet, oder umgekehrt.

Bevorzugte Ausführungsformen von Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachfolgend beschrieben:

Western Blot:

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt nach der Lyse (Schritt (d)) eine Immunpräzipitation der PKCθ aus dem Lysat mit einem anti-PKCθ Antikörper (AK1), welcher bevorzugt monoklonal ist. AK1 ist bevorzugt an eine Trägermatrix gekoppelt, beispielsweise an Protein G Sepharose.

Danach wird das Präzipitat bevorzugt in zwei, vorzugsweise gleich große Portionen aufgeteilt. Nun wird die im Präzipitat enthaltene PKCθ jeweils von den übrigen Bestandteilen abgetrennt, bevorzugt durch Gelelektrophorese (1D-SDS-PAGE), und durch Western Blot auf eine Membran übertragen.

In einer der beiden Proben wird die Phosphorylierung der Phosphorylierungsstelle, vorzugsweise Thr²¹⁹, mit Hilfe eines geeigneten phospho-spezifischen Antikörpers (AK2), vorzugsweise mit Hilfe eines anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörpers nachgewiesen.

In der anderen Probe erfolgt hingegen als Beladungskontrolle ein Nachweis der Gesamtmenge an präzipitierter PKCθ, d.h. von phosphorylierter und unphosphorylierter PKCθ. Dazu kann beispielsweise der anti-PKCθ Antikörper (AK1) verwendet werden.

Die erhaltenen Banden werden bevorzugt densitometrisch ausgewertet, wobei das Phosphosignal auf die jeweilige Gesamtmenge an PKCθ (Beladungskontrolle) normiert wird. Bevorzugt erfolgt die densitometrische Auswertung mit Hilfe von anti-PKCθ Antikörpern oder Antikörpern gegen solche anti-PKCθ Antikörper, an welche die üblichen Enzyme konjugiert sind, die nach Zugabe geeigneter Substrate eine Farbreaktion bzw. eine Chemolumineszenz-Reaktion katalysieren. Als Enzyme eignen sich beispielsweise alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase (HRPO), β-Galaktosidase, Glucoamylase, Glucose-Oxidase und Luziferase. Ein monoklonaler anti-PKCθ Antikörper, welcher an Meerrettich-Peroxidase (HRPO) konjugiert ist, ist beispielsweise bei der Firma BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA kommerziell erhältlich.

Der anti-PKCθ Antikörper kann auch direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert sein, beispielsweise mit AMCA, Cy3, Cy5, Fluorescein, Hoechst 33258, B-Phycoerythrin, R-Phycoerythrin, Rhodamin oder Texas Red^®. Eine Normierung der Messwerte erfolgt bevorzugt durch Kalibrierung der Methode. Eine rekombinante Phosphomutante kann dabei als Negativkontrolle, rekombinante PKCθ, welche bereits an Thr²¹⁹ phosphoryliert ist, als Positivkontrolle verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe nicht in zwei Teile aufgeteilt und in zwei getrennten Western-Blots analysiert, sondern vollständig auf einem einzigen Western-Blot gleichzeitig analysiert. Dazu werden bevorzugt der anti-PKCθ Antikörper (AK1) und der phospho-spezifische Antikörper (AK2) mit Hilfe unterschiedlicher Spezies hergestellt, so dass bei der Bandenauswertung eine speziesspezifische Differenzierung erfolgen kann: wurde beispielsweise AK1 durch Immunisierung von Kaninchen und AK2 durch Immunisierung von Mäusen erhalten, so können zur Auswertung zwei Fluorophore F1 und F2 zugegeben werden, von denen der eine an einen anti-Maus-Antikörper, der andere an einen anti-Kaninchen-Antikörper konjugiert ist. Auf diese Weise können beide Fluoreszenzsignale auf dem gleichen Western-Blot ausgewertet werden.

Durch mehrere Messungen bei verschiedenen Konzentrationen der zu untersuchenden Testsubstanz können Dosis-Wirkungs-Kurven generiert werden.

ELISA:

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt nach der Lyse (Schritt (d)) eine Bestimmung des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ unter Anwendung der ELISA-Technologie. Bevorzugt werden dabei in einem Sandwich-ELISA ein anti-PKCθ Antikörper und ein anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper eingesetzt. Dazu wird bevorzugt einer der beiden Antikörper auf der inneren Oberfläche der Wells einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Bevorzugt handelt es sich dabei um einen anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper. Dieser Antikörper dient bevorzugt als Primärantikörper ("Fängerantikörper").

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nun das in Schritt (d) erhaltene Lysat in die Wells der Mikrotiterplatten gefüllt. Nach einer Inkubationszeit erfolgen vorzugsweise mehrere Waschschritte.

Danach wird der zweite Antikörper zugegeben, wobei es sich dabei bevorzugt um einen, vorzugsweise monoklonalen anti-PKCθ Antikörper handelt. Dieser Antikörper dient als Sekundärantikörper ("Detektionsantikörper"). Eine Detektion des Bindungskomplexes aus der phosphorylierten PKCθ (Antigen) und den beiden Antikörpern kann nun mit Hilfe von colorimetrischen, fluorimetrischen oder luminometrischen Methoden erfolgen.

Dazu kann der Sekundärantikörper beispielsweise mit einem der üblichen Enzyme konjugiert sein, welche anschließend nach Zugabe geeigneter Substrate eine Farbreaktion bzw. eine Chemolumineszenz-Reaktion katalysieren. Als Enzyme eignen sich beispielsweise die vorstehend genannten Enzyme.

Das Enzym kann auch an Streptavidin konjugiert sein und an einen biotinylierten Sekundärantikörper gebunden werden, welcher seinerseits mit einem der vorstehend genannten Enzyme konjugiert ist. Eine Signalverstärkung ist möglich, wenn das molare Verhältnis von Biotin zu Sekundärantikörper und/oder Enzym zu Streptavidin > 1 ist.

Der Detektionsantikörper kann auch direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert sein. Beispiele für geeignete Fluoreszenzfarbstoffe sind vorstehend genannt. Eine Normierung der Messwerte erfolgt bevorzugt durch Kalibrierung der Methode. Eine rekombinante Phosphomutante kann dabei als Negativkontrolle, rekombinante PKCθ, welche bereits an Thr²¹⁹ phosphoryliert ist, als Positivkontrolle verwendet werden.

FLISA:

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt nach der Lyse (Schritt (d)) eine Bestimmung des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ unter Anwendung der FLISA-Technologie. Da in der Regel in High-Throughput-Screening (HTS)-Anlagen Waschschritte nicht möglich oder nur aufwendig realisierbar sind, erfolgt diese besonders bevorzugte Methode vorzugsweise unter Verwendung eines Antikörpers, der an Beads immobilisiert ist.

Dazu wird bevorzugt ein erster Antikörper (AK1), vorzugsweise ein anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper, als Primärantikörper auf Beads immobilisiert, welche mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff (F1) markiert sind.

Nach der Lyse der Zelle(n) in Schritt (d) werden die Lysate mit diesen Beads inkubiert. Anschließend wird ein zweiter Antikörper (AK2), vorzugsweise ein anti-PKCθ Antikörper, als Sekundärantikörper zugegeben.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Auswertung durch hydrodynamische Fokussierung (Durchflusszytometrie), beispielsweise mit Hilfe eines BD-FACSArray^® Bioanalyzer der Fa. BD Biosciences. Dazu ist lediglich ein einzelner Fluoreszenzfarbstoff erforderlich. Die Durchführung der Auswertung erfolgt nach Standardprotokollen und ist dem Fachmann geläufig.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Sekundärantikörper (AK2) mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff (F2) markiert, so dass sich zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe im System befinden. Eine Detektion des Bead-Komplexes erfolgt dann bevorzugt in einem konfokalen System (z.B. mit einem Opera-Reader der Firma Evotec OAI AG, Hamburg, Deutschland). In einer Variante dieser Ausführungsform ist der Sekundärantikörper (AK2) mit Biotin konjugiert und der zweite Fluoreszenzfarbstoff (F2) wird als Konjugat mit Streptavidin bereitgestellt, so dass er an den biotinylierten Sekundärantikörper (AK2) binden kann.

Die Auswertung auf der Grundlage der FLISA-Technologie hat die Vorteile, dass alle Schritte vom Zusammenbringen der Zelle mit der zu untersuchenden Testsubstanz bis zur Fluoreszenzmessung in derselben Mikrotiterplatte durchgeführt werden können. Wegen der konfokalen Messtechnik kann auf Waschschritte verzichtet werden.

Basiert die Messung auf der Verwendung zweier Fluorophore, so werden die Messergebnisse nur bei Colokalisation beider Fluoreszenzsignale (F1 + F2) als positiv gewertet. Daher erhöht die Verwendung zweier Antikörper und zweier Fluoreszenzmarker die Spezifität. Als Fluoreszenzfarbstoffe F1 und F2 eignen sich beispielsweise die folgenden Paare: F1: R-Phycoerythrin, Cy3 (Alexa^® 532) F2: APC, CyS, Alexa^® 647, Alexa^® 633.

Alternativ kann die Messung im Labormaßstab auch in einem Durchflusszytometer oder z.B. mit dem Luminex-Reader der Firma Luminex Corporation, Austin, USA erfolgen. Auch ist eine Auswertung über Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Messungen (FRET) möglich.

Demnach umfasst das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt in Schritt (e) die Anwendung der ELISA- oder FLISA-Technologie. Besonders bevorzugt umfasst das Verfahren in Schritt (e) die Anwendung der FLISA-Technologie, wobei zwei unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden und die Messung des Phosphorylierungsgehalts auf der Messung der Fluoreszenz beider Farbstoffe basiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den weiteren Schritt

(f) Vergleichen des in Schritt (e) bestimmten Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ mit dem entsprechenden Phosphorylierungsgehalt, welcher bestimmt wird, wenn das Verfahren unter ansonsten identischen Bedingungen, jedoch ohne Schritt (a), d.h. in Abwesenheit der Testsubstanz bzw. des PKCθ-Modulators, durchgeführt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Untersuchung der modulierenden Wirkung einer Testsubstanz bzw. eines PKCθ-Modulators auf einen PKCθ-abhängigen Signaltransduktionsweg in einer menschlichen oder tierischen Zelle.

Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren auffindbaren Testsubstanzen bzw. PKCθ-Modulatoren sind geeignet zur Vorbeugung und/oder Behandlung von PKCθ-vermittelten Krankheiten. Daher kann das Verfahren verwendet werden bei der Suche nach neuen pharmakologischen Wirkstoffen, insbesondere neuen Immunmodulatoren, wie Immunstimulatoren und Immunsuppressiva, aber auch neuen Mitteln zur Behandlung von Muskelerkrankungen.

Immunstimulatoren werden in zunehmendem Umfang zur Unterstützung der biologischen Reaktion der Patienten auf Tumoren eingesetzt. Dies kann beispielsweise durch Stärkung der Immunantwort erfolgen. Die Cytotoxizität von T-Zellen und ggf. auch die Aktivität natürlicher Killerzellen kann durch diese Substanzen erhöht werden. Immunstimulatoren werden auch in der Behandlung der chronischen Hepatitis C und von HIV eingesetzt. Einige Immunstimulatoren werden auch zur Prophylaxe von Erkältungen eingesetzt.

Immunsuppressiva sind zur Behandlung unterschiedlicher Indikationen geeignet, beispielsweise

– zur Behandlung von akuten oder chronischen inflammatorischen Prozessen und Entzündungserkrankungen (beispielsweise entzündlichen Atemwegserkrankungen, wie COPD [Chronic Obstructive Pulmonary Disease], Asthma, etc.),
– zur Behandlung von Allergien (beispielsweise der schweren anaphylaktischen Sofortreaktion, etc.),
– zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen (beispielsweise rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn, Colitis Ulcerosa, Uveitis, Psoriasis, Nephrotischem Syndrom, Diabetes 1, Diabetes 2, multipler Sklerose, etc.)
– zur Behandlung von septischen Schock,
– zur Prophylaxe oder Therapie von Ischämie/Reperfusions-Schädigungen (z.B. Myokardinfarkt, Schlaganfall, etc.) und
– zur Prophylaxe oder Therapie der Abstoßungsreaktion nach einer Transplantation (beispielsweise von Niere, Leber, Herz, Lunge, Pankreas, Augenlinsen, Knochenmark, etc.).

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Antikörper gegen einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219 der PKCθ (anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper). Dieser Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein. Dabei handelt es sich um einen Antikörper, welcher spezifisch für einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219 der PKCθ ist, d.h. es handelt sich nicht um einen unspezifischen anti-phospho-Thr Antikörper, welcher auch an phosphorylierte Threoninreste bindet, die nicht von den gleichen Aminosäuren wie Thr²¹⁹ von PKCθ flankiert werden.

Bevorzugt weist der anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper eine Affinitätskonstante gegen Thr²¹⁹ der PKCθ von weniger als 10^–4 mol/l, bevorzugter weniger als 10^–5 mol/l, noch bevorzugter weniger als 10^–6 mol/l, am bevorzugtesten weniger als 10^–7 mol/l und insbesondere weniger als 10^–8 mol/l oder sogar weniger als 10^–9 mol/l auf. Zur Bestimmung der Affinitätskonstante eignet sich beispielsweise die Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (z.B. mit einem Gerät der Firma Biacore, Neuchâtel, Schweiz).

Der erfindungsgemäße anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper ist spezifisch für Thr²¹⁹ der PKCθ, d.h. er bindet an einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219, jedoch an keinen der übrigen Threoninreste der PKCθ, sollte dieser phosphoryliert sein. Die Bindung des erfindungsgemäßen anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörpers an die PKCθ ist somit abhängig von der Struktur der Aminosäurereste, welche den phosphorylierten Threoninrest in Position 219 der PKCθ flankieren. Insbesondere umfasst der erfindungsgemäße anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper keinen anti-phospho-Thr Antikörper, welcher an beliebige phosphorylierte Threoninreste unabhängig von der Sequenz der flankierenden Aminosäurereste bindet.

Somit ist der erfindungsgemäße anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper spezifisch für ein Epitop, welches mehr als den phosphorylierten Threoninrest umfasst. Beispiele für derartige Epitop-Substrukturen sind -Glu²¹⁸-Thr²¹⁹-, -Thr²¹⁹-Met²²⁰-, und -Glu²¹⁸-Thr²¹⁹-Met²²⁰-, etc. Bevorzugt umfasst das Epitop eine Aminosäuresequenz aus wenigstens 5 Aminosäureresten, bevorzugt wenigstens 7, bevorzugter wenigstens 9, noch bevorzugter wenigstens 11, am bevorzugtesten wenigstens 13 und insbesondere wenigstens 15 Aminosäureresten, mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenz einer zusammenhängenden Teilsequenz von SEQ. ID. NO. 2 entspricht und dabei den phosphorylierten Threoninrest einschließt, welcher in SEQ. ID. NO. 2 die Position 19 hat. Bevorzugt umfasst das Epitop die Teilsequenz der Positionen 17 bis 21, bevorzugter 16 bis 22, noch bevorzugter 15 bis 23, am bevorzugtesten 14 bis 24 und insbesondere 13 bis 25 von SEQ. ID. NO. 2. In diesem Zusammenhang bedeutet "spezifisch", dass der Antikörper nicht an ein Epitop bindet, welches zwar einen phosphorylierten Threoninrest umfasst, jedoch nicht die oben genannte Teilsequenz einschließt.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper um einen polyklonalen Antikörper. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper um einen monoklonalen Antikörper, der vorzugsweise durch eine Hybridomazelllinie, als RabMab oder Phage Display hergestellt werden kann.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines vorstehend beschriebenen anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörpers umfassend die Injektion eines Oligopeptids (Antigens) in einen geeigneten Organismus, z.B. Kaninchen oder Maus, wobei das Oligopeptid eine Aminosäuresequenz aus wenigstens 5 Aminosäureresten, bevorzugt wenigstens 7, bevorzugter wenigstens 9, noch bevorzugter wenigstens 11, am bevorzugtesten wenigstens 13 und insbesondere wenigstens 15 Aminosäureresten umfasst, mit der Maßgabe, dass diese Aminosäuresequenz einer zusammenhängenden Teilsequenz von SEQ. ID. NO. 2 entspricht und dabei den phosphorylierten Threoninrest einschließt, welcher in SEQ. ID. NO. 2 die Position 19 hat.

Bevorzugt umfasst das Oligopeptid die Teilsequenz der Positionen 17 bis 21, bevorzugter 16 bis 22, noch bevorzugter 15 bis 23, am bevorzugtesten 14 bis 24 und insbesondere 13 bis 25 von SEQ. ID. NO. 2.

Dabei wird das Oligopeptid bevorzugt vor der Immunisierung an ein geeignetes Carrier Protein konjugiert, beispielsweise an KLH. Geeignete Kits zur Konjugation von Antigenen an Carrier Proteine sind kommerziell erhältlich. Ihre Anwendung erfolgt nach Standardprotokollen.

Der Antikörper kann dann mit den üblichen Methoden, beispielsweise durch Affinitätschromatographie, aus dem Plasma isoliert werden.

Monoklonale anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper sind aus Hybridomazellen von Mäusen, aus Kaninchen (RabMab) oder durch Phage Display zugänglich. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörpers einen Selektionsschritt, aufgrund dessen spezifische von möglicherweise vorhandenen unspezifischen Antikörpern, d.h. anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper von anti-phospho-Thr Antikörpern, getrennt werden. Dies kann vorzugsweise durch Affinitätschromatographie erreicht werden. Dazu können beispielsweise auf der stationären Phase phosphorylierte Threoninreste immobilisiert werden, welche in eine Peptidsequenz eingebettet sind, wobei die den phosphorylierten Threoninrest flankierenden Aminosäurereste von den Aminosäureresten abweichen, welche bei nativem Thr²¹⁹ in PKCθ in der entsprechenden Position vorhanden sind. Unspezifische anti-phospho-Thr Antikörper werden an dieser stationären Phase gebunden, wohingegen die gewünschten spezifischen anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper in Ermangelung einer geeigneten Bindungsstelle eluiert werden.

Die Erfindung betrifft auch einen anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper, der nach diesem Verfahren erhältlich ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines vorstehend beschriebenen anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörpers zum Auffinden einer Testsubstanz mit modulierender Wirkung auf einen PKCθ-abhängigen Signaltransduktionsweg bzw. eines PKCθ-Modulators in einer menschlichen oder tierischen Zelle.

Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung, sind jedoch nicht einschränkend hinsichtlich ihres Umfangs auszulegen.
Beispiel 1 – Herstellung eines anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörpers
Es wird als Antigen die Aminosäuresequenz INSRE-T(p)-MFHKE hergestellt, welche der Teilsequenz humaner PKCθ in Positionen 214 bis 224 mit phosphoryliertem Thr²¹⁹ entspricht. Die Aminosäuresequenz wird gemäß Standardprotokoll an Keyhole Limpet Hemacyanin (KLH) als Carrier gekoppelt.
Kaninchen werden unter Verwendung von komplettem Freudschen Adjuvans intraperitoneal immunisiert. Nach 28 Tagen wird die Injektion wiederholt, wobei für diese und alle weiteren Wiederholungsinjektionen inkomplettes Freudsches Adjuvans verwendet wird. Eine erste Serumprobe von ca. 5 ml wird nach 35 Tagen genommen. Nach 49 und 63 Tagen wird die Injektion erneut wiederholt. Eine zweite Serumprobe von ca. 5 ml wird nach 70 Tagen entnommen. Nach 84 Tagen wird die Injektion wiederholt. Nach 91 Tagen kann eine Entblutung durch Herzpunktion am narkotisierten Tier erfolgen. Alternativ kann im Abstand von 4 Wochen die Immunisierung wiederholt und eine Woche später jeweils eine Serumprobe entnommen werden.
Die Immunglobuline werden durch Affinitätschromatographie gereinigt, wobei dafür zuvor das Antigen im verwendeten phosphorylierten Zustand an der stationären Phase immobilisiert wird. Anschließend erfolgt eine Affinitätschromatographie an einer stationären Phase, welche ein Analog des Antigens (in unphosphoryliertem Zustand) trägt. Das Eluat wird mit Hilfe einer Rührzelle aufkonzentriert und gegen PBS dialysiert.
Beispiel 2 – Densitometrische Auswertung
Der Assay wird mittels Immunpräzipitation und Autophosphorylierungsdetektion im Western Blot durchgeführt. Dazu wird mit den PKC Inhibitoren (a) Calbiochem GF 109 203X bzw. (b) Roche Ro 31-8220 die dosisabhängige Hemmung der PKCθ Autophosphorylierung von Thr²¹⁹ in humanen T Zellen untersucht.
Es werden primäre humane T-Zellen jeweils für 1 Stunde mit den Inhibitoren (a) bzw. (b) in unterschiedlichen Konzentrationen vorinkubiert. Anschließend erfolgt die Induktion der Autophosphorylierung für 5 Minuten durch PMA (100 nmol/l).
Nach dem Waschen mit kaltem PBS werden die T-Zellen 30 Minuten auf Eis lysiert. Als Lysepuffer wird ein Puffer mit folgender Zusammensetzung verwendet: 50 mmol/l HEPES (pH 7,5), 2% Nonidet P-40, 5 mmol/l Natriumorthovanadat, 5 mmol/l Natriumpyrophosphat, 5 mmol/l NaF, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l NaCl und 50 μg/ml Aprotinin und Leupeptin. Unlösliche Anteile werden bei 10.000 g 15 Minuten bei 4°C abzentrifugiert.
Die Phosphorylierung der PKCθ an Thr²¹⁹ im Lysat wird detektiert. Dazu wird PKCθ aus den Lysaten mit einem monoklonalen anti-PKCθ Antikörper (AK1, Fa. BD Transduction Laboratories, BD Biosciences), welcher zuvor an Protein G Sepharose als Trägermatrix gekoppelt wurde, immunpräzipitiert. Die Inkubation erfolgt über 2 Stunden bei 4°C auf einem Drehrad. Nach dem Waschen der Trägermatrix wird diese mit Lämmli-Probenpuffer versetzt und bei 95°C für 5 Minuten abgekocht.
Der Überstand wird in zwei etwa gleichgroße Portionen geteilt, welche jeweils im 1D-SDS-PAGE-Gel aufgetrennt werden.
Die erste Probe wird im Western-Blot mit dem gemäß Beispiel 1 hergestellten anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper (AK2) inkubiert. Zur Bestimmung der Autophosphorylierung wird gemäß Standardprotokoll α-Kaninchen HRPO (horse raddish peroxidase) als Sekundärantikörper zugegeben.
Die zweite Probe wird im Western-Blot mit AK1 inkubiert. Danach wird zur Bestimmung der Gesamtmenge an präzipitierter PKCθ als Beladungskontrolle α-Maus HRPO (horse raddish peroxidase) gemäß Standardprotokoll als Sekundärantikörper zugegeben.
Die Detektion erfolgt durch Chemolumineszenz (Lumi-Light^Plus Western Blotting Substrate, Roche + ECL Plus, Amersham, Software Aida). Dabei wird das Phosphosignal auf die jeweilige Gesamtmenge an PKCθ (Beladungskontrolle) normiert.
Beispiel 3 – Auswertung durch FLISA
1 × 10⁷ Jurkart TAg Zellen werden mit 5–20 μg humaner rekombinanter PKCθ (pEFneo) transfiziert (vgl. Baier-Bitterlich, Mol. Cell. Biol., 1996, 16: 1842). Die transiente Transfektion wird mit dem Elektroporator Easy-jecT Plus der Fa. Equibo durchgeführt (450 V, 1650 μF).
Die Zellen werden 1 Stunde vor der Stimulation mit dem PKCθ Inhibitor GF109 203X (Calbiochem) behandelt. Die Induktion der Autophosphorylierung erfolgt für 15 Minuten durch PMA (100 nmol/l). Nach dem Waschen mit kaltem PBS werden die Zellen analog zu Beispiel 2 für 30 Minuten auf Eis lysiert. Unlösliche Anteile werden bei 10.000 g 15 Minuten bei 4°C abzentrifugiert.
LiquiChip^® activated Beads (Qiagen) werden mit dem gemäß Beispiel 1 hergestellten anti-PKCθ-phospho-Thr²¹⁹ Antikörper als Fängerantikörper gemäß Standardprotokoll kovalent gekoppelt. Anschließend werden die Beads mit dem Zelllysat für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln in 96 Well Mikrotiterplatten im Dunkeln inkubiert.
Danach wird der monoklonale anti-PKCθ Antikörper (AK1, Fa. BD Biosciences) als Detektionsantikörper zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Nun folgen 30 Minuten Schütteln bei Raumtemperatur mit einem biotinylierten anti-Maus Antikörper (eBioscience). Als Detektionsreagens wird Streptavidin gekoppeltes Phycoerythrin (Phycolink-SAPE, Prozyme) für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Diese Schritte werden ebenfalls in Lyse-Puffer durchgeführt.
Die Detektion erfolgt mit dem Messgerät Luminex 100 IS (Luminex Corporation, Texas).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren – zur Untersuchung der modulierenden Wirkung einer Testsubstanz auf einen PKCθ-abhängigen Signaltransduktionsweg oder – zum Auffinden eines PKCθ-Modulators in einer menschlichen oder tierischen Zelle, umfassend die Schritte (a) Zusammenbringen der Zelle mit der Testsubstanz oder mit dem PKCθ-Modulator; (c) Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Phosphorylierung zumindest eines Threoninrestes der PKCθ bewirken; und (e) Bestimmen des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der PKCθ, wobei die Phosphorylierung des zumindest eines Threoninrestes der PKCθ zumindest teilweise als Autophosphorylierung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es den Schritt (b) Induzieren der Kinaseaktivität der PKCθ; und/oder den Schritt (d) Lysieren der Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der zumindest eine Threoninrest der PKCB den Threoninrest in Position 219 umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verwendung eines Antikörpers gegen einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219 der PKCθ umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine T-Zelle ist, vorzugsweise eine humane T-Zelle, insbesondere eine primäre humane T-Zelle.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (e) die Teilschritte umfasst: (e₁) Immunpräzipitieren zumindest eines Teils der PKCθ unter Verwendung eines geeigneten ersten Antikörpers; und (e₂) Bestimmen des Phosphorylierungsgehalts des zumindest einen Threoninrestes der immunpräzipitierten PKCθ unter Verwendung eines geeigneten zweiten Antikörpers.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper gegen PKCθ und der zweite Antikörper gegen einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219 der PKCθ gerichtet ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kinaseaktivität in Schritt (b) durch Zugabe eines Phorbolesters oder von anti-CD3 Antikörpern induziert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (e) eine colorimetrische, fluorimetrische oder luminometrische Messung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (e) die Anwendung der Western-Blot-, ELISA- oder FLISA-Technologie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (e) die Anwendung der FLISA-Technologie umfasst, wobei zwei unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden und die Messung der Phosphorylierung auf der Messung der Fluoreszenz beider Farbstoffe basiert.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es den Schritt umfasst (f) Vergleichen des in Schritt (e) bestimmten Phosphorylierungsgehalts mit dem entsprechenden Phosphorylierungsgehalt, welcher bestimmt wird, wenn das Verfahren unter ansonsten identischen Bedingungen, jedoch ohne Schritt (a) durchgeführt wird.
Spezifischer Antikörper gegen einen phosphorylierten Threoninrest in Position 219 von PKCθ.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 13 zum Auffinden einer Testsubstanz mit modulierender Wirkung auf einen PKCθ-abhängigen Signaltransduktionsweg oder eines PKCθ-Modulators in einer menschlichen oder tierischen Zelle.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Testsubstanz oder der PKCθ-Modulator ein Immunstimulator oder ein Immunsuppressivum ist.