DE102005029070B3 - Analytical compound separating and analytic substance detection, involves subjecting electrodes with uniform alternating voltage signal, measuring voltage and/or current values in electrodes to determine conductivity values - Google Patents
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Abstract
Ein Verfahren zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (CFFE), bei welchem ein Analytgemisch eine miniaturisierte Separationskammer hydrodynamisch durchströmt, wobei die Separationskammer quer zur Hauptflussrichtung mit einem elektrischen Feld beaufschlagt wird, durch welches die einzelnen Analytsubstanzen unterschiedlich gegenüber der Hauptflussrichtung abgelenkt werden, soll so weiterentwickelt werden, dass die Notwendigkeit entfällt, Analytsubstanzen mit optischen Markern labeln zu müssen. DOLLAR A Dies wird dadurch erreicht, dass über der Fläche der Separationskammer an einer Vielzahl von Punkten kontaktlos die elektrische Leitfähigkeit ermittelt wird und die ermittelten Leitfähigkeitswerte computerunterstützt visualisiert werden.A method for separating an analyte mixture and for the detection of the analyte substances by means of continuous carrier-free electrophoresis (CFFE), in which an analyte mixture flows hydrodynamically through a miniaturized separation chamber, the separation chamber being subjected to an electric field transversely to the main flow direction, through which the individual analyte substances differ from the Main flow direction are deflected, should be developed so that the need to label analyte substances with optical markers is eliminated. DOLLAR A This is achieved in that the electrical conductivity is determined contactlessly at a large number of points over the surface of the separation chamber and the determined conductivity values are visualized with the aid of a computer.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (continuous free-flow electrophoresis, CFFE), bei welchem ein Analytgemisch eine Separationskammer hydrodynamisch durchströmt, wobei die Separationskammer quer zur Hauptflussrichtung mit einem elektrischen Feld beaufschlagt wird, durch welches die einzelnen Analytsubstanzen unterschiedlich gegenüber der Hauptflussrichtung abgelenkt werden, wobei in der Separationskammer an einer Vielzahl von Punkten die elektrische Leitfähigkeit ermittelt wird und die ermittelten Leitfähigkeitswerte visualisiert werden.The The invention relates to a method for separating an analyte mixture and for the detection of the analyte substances by means of continuous carrier-free electrophoresis (continuous free-flow electrophoresis, CFFE) in which an analyte mixture a separation chamber flows through hydrodynamically, wherein the separation chamber Applied to an electrical field transversely to the main flow direction becomes, through which the individual analyte substances different across from the main flow direction are deflected, wherein in the separation chamber at a variety of points the electrical conductivity is determined and the determined conductivity values visualized become.
Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (CFFE) mit einer miniaturisierten Separationskammer, welche in einer Hauptflussrichtung vom Analytgemisch hydrodynamisch durchströmt und quer zur Hauptflussrichtung mit einem elektrischen Feld beaufschlagt wird.Further The invention relates to a device for separating an analyte mixture and for the detection of the analyte substances by means of continuous unsupported Electrophoresis (CFFE) with a miniaturized separation chamber, which hydrodynamically flows through the analyte mixture in a main flow direction and transversely applied to the main flow direction with an electric field becomes.
Neben der Chromatographie zählt die Elektrophorese, und zwar insbesondere die sogenannte Kapillarelektrophorese, zu den am häufigsten eingesetzten Trennmethoden. Die Elektrophorese beruht auf unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld, welche von der Art und Anzahl der Ladungen sowie vom Molekülradius abhängig sind. Diese stoffspezifische Abhängigkeit wird als elektrophoretische Mobilität μ bezeichnet.Next the chromatography counts electrophoresis, in particular so-called capillary electrophoresis, the most common used separation methods. The electrophoresis is based on different Migration rates of charged molecules in an electric field, which of the type and number of charges as well as the molecular radius dependent are. This substance-specific dependence is referred to as electrophoretic mobility μ.
Eine andere elektrophoretische Technik ist die kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese (continuous free-flow electrophoresis, CFFE), die ursprünglich als Trenntechnik zur Isolierung und Reinigung von Zellen und Proteinen entwickelt wurde.A Another electrophoretic technique is the continuous carrier-free Electrophoresis (continuous free-flow electrophoresis, CFFE), the originally as a separation technique for the isolation and purification of cells and proteins was developed.
Während bei der Kapillarelektrophorese das elektrische Feld entlang der Fließrichtung angelegt wird und sich somit eine longitudinale Wanderung und Trennung der Analytmoleküle ergibt, wird das elektrische Feld bei der CFFE orthogonal zu einem Fluss des Analytgemisches appliziert, das die Separationskammer hydrodynamisch durchströmt. Dabei wirken auf jedes Analytmolekül zwei senkrecht aufeinander stehende Geschwindigkeitsvektoren. Ein Geschwindigkeitsvektor wirkt entlang des Pufferflusses mit dessen Betrag, der zweite entlang des elektrischen Feldes mit einem Betrag, der von der elektrophoretischen Mobilität des entsprechenden Analyten abhängig ist. Der resultierende Summationsvektor ist um einen Winkel von der Flussrichtung abgelenkt. Bei einem Gemisch aus mehreren Analytmolekülen, die sich in ihren elektrophoretischen Mobilitäten unterscheiden, ergeben sich von einander verschiedene Summationsvektoren, die eine Ablenkung der Analytmoleküle von der Hauptflussrichtung und damit eine zweidimensionale Trennung des Substanzgemisches nach sich zieht. In einem sich etablierenden Gleichgewichtszustand können die aufgetrennten Substanzen für weitere Bearbeitungsschritte am Ausgang der Trennkammer kontinuierlich gesammelt oder abgeleitet werden, während die Trennung bei der Kapillarelektrophorese nur diskontinuierlich im Zyklus zwischen Probeninjektion und Separation erfolgen kann.While at the capillary electrophoresis the electric field along the flow direction is created and thus a longitudinal migration and separation the analyte molecules results in the electric field in the CFFE orthogonal to a flow of the analyte mixture, which hydrodynamically separates the separation chamber flows through. In this case, two analyte molecules act perpendicular to each other standing speed vectors. A velocity vector acts along the buffer flow with its amount, the second along of the electric field with an amount different from the electrophoretic mobility of the corresponding analyte is. The resulting summation vector is at an angle of deflected the flow direction. For a mixture of several analyte molecules, the differ in their electrophoretic mobilities different from each other summation vectors, a distraction of the analyte from the main flow direction and thus a two-dimensional separation of the substance mixture. In an established Equilibrium state the separated substances for further processing steps at the output of the separation chamber continuously collected or diverted while the separation at the Capillary electrophoresis only intermittently in the cycle between Sample injection and separation can be done.
Die kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese wurde mittlerweile für den Einsatz in verschiedenen Modi adaptiert, die aus der Kapillarelektrophorese bekannt sind. Beispiele sind Zonenelektrophorese, Isotachophorese, Feldsprungelektrophorese und isoelektrisches Fokussieren.The continuous carrier-free Electrophoresis has since become available for use in various Adapted modes known from capillary electrophoresis. Examples are zone electrophoresis, isotachophoresis, feldspared electrophoresis and isoelectric focusing.
Während kommerzielle Geräte Separationskammer- bzw. Trennbettvolumen von mehreren Millilitern haben und die Trennzeit mehrere Minuten beträgt, konnten für miniaturisierte Strukturen mit Volumen von wenigen Mikro- oder Nanolitern Trennzeiten von Sekunden und Subsekunden erreicht werden. So konnte beispielsweise ein Gemisch von Fluorescein und Rhodamin-110 im Modus der Zonenelektrophorese innerhalb von 100 ms getrennt werden (Zeitschrift "Analytical Chemistry", 1. November 2003, Volume 75, Seiten 5759–5766).While commercial equipment Separation chamber or separation bed volume of several milliliters have and the separation time is several minutes, could be for miniaturized Structures with volumes of a few micro- or nanoliters separation times of Seconds and subseconds can be achieved. So, for example a mixture of fluorescein and rhodamine-110 in the zone electrophoresis mode within 100 ms ("Analytical Chemistry" journal, November 1, 2003, Volume 75, pages 5759-5766).
Ein erheblicher Nachteil bei diesen bekannten Verfahren ist, dass gegenwärtig eine Verfolgung einer zweidimensionalen Trennung der Analytsubstanzen nur mittels optischer Methoden nach vorangegangener Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen möglich ist. Eine Markierung durch Farbstoffe verändert jedoch einerseits physiko-chemische Eigenschaften der Analytsubstanzen und führt damit zu verfälschten analytischen Aussagen und behindert andererseits mögliche weitere Untersuchungen. Eine andere Möglichkeit ist, die intrinsische Fluoreszenz zu messen. Dazu wird jedoch ein UV-transparentes Material benötigt, das sehr kostenintensiv ist.One A significant disadvantage of these known methods is that currently a Pursuit of a two-dimensional separation of the analyte substances only by optical methods after previous marking with Fluorescent dyes possible is. However, labeling with dyes changes physico-chemical on the one hand Properties of the analyte substances and thus leads to falsified analytical statements and on the other hand hinders possible further Investigations. Another possibility is to measure the intrinsic fluorescence. But this is one UV-transparent material needed, which is very expensive.
Ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffes des Patentanspruches 1 ist aus der Veröffentlichung "HEINRICH, J.; WAGNER, H.: A potential gradient-conductivity-scanner for the investigation of effects leading to buoyancy-driven convection on continuous-flow-electrophoresis. In: Advances in Space Research, 1992, Vol. 12, No. 1, S. 385–392" bekannt. Dieses bekannte Verfahren ist für eine Miniaturisierung nicht ohne Weiteres geeignet.One Method with the features of the preamble of claim 1 is from the publication "HEINRICH, J .; WAGNER, H .: A potential gradient conductivity scanner for the investigation buoyancy-driven convection on continuous-flow electrophoresis. In: Advances in Space Research, 1992, Vol. 12, no. 1, pp. 385-392 " known method is for a miniaturization not readily suitable.
Aus
WO 98/49549 A1 ist ein Elektrophoresesystem zur Trennung und Detektion
bekannt, bei dem die elektrische Leitfähigkeit kontaktlos an einer Vielzahl
von Punkten über
der Fläche
einer miniaturisierten Separationskammer gemessen wird. Eine weitere
miniaturisierte Vorrichtung zur Ionenanalyse ist aus
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung der gattungsgemäßen Art so weiterzuentwickeln, dass eine Miniaturisierung der Vorrichtung besonders einfach möglich ist.task The invention is a method and a device of the generic type to develop so that a miniaturization of the device especially easy is.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die elektrische Leitfähigkeit kontaktlos über der Fläche der miniaturisierten Separationskammer zur Detektion der Analytsubstanzen gemessen wird, wobei die Leitfähigkeitsmessung mittels ober- und unterseitig der Separationskammer gitterartig angeordneter Elektroden erfolgt, wobei die Elektroden einer Seite nacheinander mit einem einheitlichen Wechselspannungssignal oder gleichzeitig mit Wechselspannungssignalen unterschiedlicher Frequenzen beaufschlagt werden und an den Elektroden der anderen Seite an einer Vielzahl von Punkten die Spannung und/oder der Stromwert gemessen und daraus jeweils die Leitfähigkeitswerte bestimmt werden.These Task is in a method of the type described in the present invention solved, that the electrical conductivity contactless over the area the miniaturized separation chamber for the detection of the analyte substances is measured, with the conductivity measurement by means of upper and on the underside of the separation chamber grid-like arranged electrodes takes place, wherein the electrodes of one side in succession with a uniform AC signal or simultaneously with AC signals different frequencies are applied and at the electrodes the other side at a variety of points the voltage and / or the current value is measured and from this in each case the conductivity values be determined.
Gegenüber der Detektion und Bildgebung mittels optischer Methoden entfällt beim erfindungsgemäßen Verfahren die Notwendigkeit, Analytsubstanzen mit optischen Markern labeln zu müssen oder teure Materialien für die Chipherstellung einsetzen zu müssen, falls ohne Marker mit UV-Licht detektiert wird. Gleichzeitig bietet das Verfahren die Möglichkeit, auch nicht transparentes Material für die Chipherstellung (für die Separationskammer) einzusetzen.Opposite the Detection and imaging by means of optical methods is eliminated in the inventive method the need to label analyte substances with optical markers to have or expensive materials for to use the chip production, if without marker with UV light is detected. At the same time, the process offers the Possibility, also non-transparent material for chip production (for the separation chamber) use.
Die so ermittelten Leitfähigkeitswerte werden anschließend mittels numerischer Methoden in Grauwerte umgerechnet und pixelweise zu einem Bild zusammengesetzt. Das an den jeweiligen Messpunkten gemessene Signal (Spannung oder Strom) ist abhängig von der Leitfähigkeit des an den jeweiligen Messpunkten fließenden Mediums. Man erhält somit für jeden Messpunkt einen Leitfähigkeitswert, wobei die Wechselspannung nacheinander an die Elektroden der einen Seite angelegt wird und dementsprechend jeweils an den Elektroden der anderen Seite der Spannungswert gemessen wird, so dass für eine Vielzahl von Punkten ein Leitfähigkeitswert erhalten wird. Alternativ kann auch an jeder Elektrode der einen Seite eine Wechselspannung unterschiedlicher Frequenz angelegt werden und an einer Elektrode der anderen Seite können mittels Frequenzanalysator die Intensitäten der einzelnen Frequenzen gemessen werden, auf diese Weise wird jede (Elektroden-) Zeile direkt ausgelesen.The thus determined conductivity values will be afterwards converted into gray values by numerical methods and pixel by pixel assembled to a picture. That at the respective measuring points measured signal (voltage or current) depends on the conductivity of the medium flowing at the respective measuring points. So you get for everyone Measuring point a conductivity value, wherein the alternating voltage successively to the electrodes of the one Side is applied and accordingly respectively to the electrodes the other side of the voltage value is measured, so for a variety of points a conductivity value is obtained. Alternatively, the one at each electrode Side an alternating voltage of different frequencies are applied and on an electrode of the other side can by means of frequency analyzer the intensities Each frequency is measured in this way (Electrode) line read directly.
Wenn eine besonders empfindliche Detektion erforderlich ist, ist vorgesehen, dass die Spannungs- und/oder Stromwerte mittels Lock-In-Verstärkern gemessen werden.If a particularly sensitive detection is required, is provided that the voltage and / or current values are measured by means of lock-in amplifiers become.
Zur Lösung der eingangs gestellten Aufgabe sieht die Erfindung auch eine gattungsgemäße Vorrichtung vor, die sich . dadurch auszeichnet, dass ober- und unterseitig der Separationskammer gitterartig angeordnete Elektroden vorgesehen sind, wobei die Elektroden einer Seite mit einer Wechselspannungsquelle verbunden sind und die Elektroden der anderen Seite mit einer Messeinrichtung verbunden sind, welche mit einer computerunterstützten Auswerteeinheit zur Bestimmung der Leitfähigkeitswerte aus den gemessenen Spannungs- und/oder Stromwerten und zur Visualisierung der Leitfähigkeitswerte verbunden ist.to solution The problem initially set, the invention also provides a generic device before that. characterized in that the top and bottom the separating chamber grid-like arranged electrodes provided are, wherein the electrodes of a side with an AC voltage source are connected and the electrodes of the other side with a measuring device which are connected to a computer-aided evaluation unit for determining the conductivity values from the measured voltage and / or Current values and visualization of the conductivity values is connected.
Dabei ist die Anordnung bevorzugt so getroffen, dass die Elektroden der einen Seite parallel zueinander angeordnet sind und die Elektroden der anderen Seite ebenfalls parallel, aber im Winkel zu den Elektroden der anderen Seite angeordnet sind. Somit gibt es in Aufsicht gesehen eine Vielzahl von Kreuzungspunkten zwischen den Elektroden der beiden Seiten, welche die Messpunkte darstellen.there the arrangement is preferably made such that the electrodes of the one side are arranged parallel to each other and the electrodes the other side also parallel, but at an angle to the electrodes the other side are arranged. Thus, there is seen in supervision a plurality of crossing points between the electrodes of the two sides, which represent the measuring points.
Bevorzugt sind die parallelen Elektroden der einen Seite im Winkel von 90° zu den parallelen Elektroden der anderen Seite angeordnet.Prefers are the parallel electrodes of one side at an angle of 90 ° to the parallel Arranged electrodes of the other side.
In ganz besonders bevorzugter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass die Elektroden der einen Seite in einer Deckplatte und die Elektroden der anderen Seite in einer Bodenplatte angeordnet sind und die Deckplatte und die Bodenplatte mit einer Vielzahl von elektrisch nicht leitenden, die Separationskammer durchdringenden Stützpfosten miteinander verbunden sind, zwischen denen Strömungskanäle ausgebildet sind.In Particularly preferred embodiment is provided that the Electrodes one side in a cover plate and the electrodes the other side are arranged in a bottom plate and the cover plate and the bottom plate with a plurality of electrically non-conductive, the separating chamber penetrating support post connected to each other are formed between which flow channels are.
Eine solche miniaturisierte Anordnung mit Stützpfosten ohne Elektroden in der Deck- und Bodenplatte ist grundsätzlich aus der Zeitschrift "Analytical Chemistry", 1. November 2003, Volume 75, Seiten 5759–5766, bekannt. Weist die Separationskammer beispielsweise Abmessungen von 4 mm × 12 mm auf, sind ca. 31.000 bevorzugt quadratische Stützpfosten mit einer Grundfläche von 30 × 30 μm so angeordnet, dass die Entfernung zwischen den Mittelpunkten zweier benachbarter Stützpfosten 40 μm beträgt. Dadurch werden zwischen den Pfosten Kanäle mit einer Breite von 10 μm gebildet. Die quadratischen Pfosten sind vorzugsweise um 45° zur Symmetrieebene der Separationskammer gedreht, wodurch sich eine Verlängerung der effektiven Trennstrecke um den Faktor 1,414 ergibt. Desweiteren wird das Oberflächen-Volumenverhältnis vergrößert und führt damit zu einer schnelleren Wärmeableitung.Such a miniaturized arrangement with support posts without electrodes in the top and bottom plate is basically known from the journal "Analytical Chemistry", November 1, 2003, Volume 75, pages 5759-5766. If the separation chamber has, for example, dimensions of 4 mm × 12 mm, approximately 31,000 preferably square support posts with a base area of 30 × 30 μm are arranged so that the distance between the centers of two adjacent support posts is 40 μm. As a result, channels with a width of 10 microns are formed between the post. The square posts are preferably rotated 45 ° to the plane of symmetry of the separation chamber, resulting in an extension of the effective Separation distance by a factor of 1.414 results. Furthermore, the surface volume ratio is increased and thus leads to a faster heat dissipation.
In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass in die Stützpfosten Elektroden der einen bzw. der anderen Seite integriert sind. Dadurch ist es möglich, die Leitfähigkeit des zwischen zwei benachbarten Stützpfosten fließenden Mediums bestimmen zu können. Hierzu ist bevorzugt jede Elektrode separat ansteuerbar ausgebildet.In Another advantageous embodiment is provided that in the support posts Electrodes of one or the other side are integrated. This is it is possible the conductivity of the medium flowing between two adjacent support posts to be able to determine. For this purpose, each electrode is preferably formed separately controllable.
Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Diese zeigt in:The The invention is explained in more detail below with reference to the drawing by way of example. These shows in:
Eine
Vorrichtung zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion
der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese ist in
Am
Eingang der Separationskammer
Am
in Hauptströmungsrichtung
Wesentlich
ist nun, dass ober- und unterseitig der Separationskammer
Die
Elektroden der einen Seite, beispielsweise die Elektroden
Wie
am besten aus
Die für jeden Kanalschnittpunkt ermittelten Leitfähigkeitswerte werden von der Auswerteeinheit mittels numerischer Methoden in Grauwerte umgerechnet und pixelweise zu einem Bild zusammengesetzt.The for each Conductivity values determined by the channel intersection are determined by the Evaluation unit converted into gray values using numerical methods and put together pixel by pixel to form a picture.
Eine
andere Möglichkeit
der Detektion bietet sich, wenn an jeder der Elektroden
Alternativ
kann, wie dies die
Natürlich ist
die Erfindung nicht auf die dargestellten Ausführungsbeispiele beschränkt. Weitere Ausgestaltungen
sind möglich,
ohne den Grundgedanken der Erfindung zu verlassen. So kann selbstverständlich auch
eine Vorrichtung
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