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Die
Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion
von Analyten in flüssigen
Medien mittels einer Cantileversonde. Sie betrifft weiterhin die
Verwendung des Verfahrens bzw. der Vorrichtung.
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Es
ist bekannt, beispielsweise aus "Cantilever-based
biosensors", Ch.
Ziegler, Review, Sonderausgabe von Analytical and Bioanalytical
Chemistry über "Nanotechnologies
for the Biosciences",
Anal. Bioanal. Chem. 379 (2004) 946-959 bzw. aus "Thickness shear mode
resonators ("mass-sensitive
devices") in bioanalysis", M. Kaspar, H. Stadler,
T. Weiß, Ch.
Ziegler, Sonderausgabe des Fresenius Journal of Analytical Chemistry über "Bioanalysis", Fres. J. Analyt.
Chem. 366 (2000) 602-610, Analyten in fluiden Medien durch Messung
der Verschiebung der Resonanzfrequenz eines mechanischen Schwingers,
auf den die genannten Objekte (möglicherweise
selektiv) adsorbiert wurden, nachzuweisen. Die Detektion erfolgt üblicherweise
auf Grundlage der Änderung
der Resonanzfrequenz, der Schwingungsdämpfung, der Schwingungsamplitude
oder der (statischen) Verbiegung.
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Bisher
wurden zu diesem Zweck entweder sogenannte Schwingquarze oder plattenartige
konventionelle Cantileversonden aus der Rasterkraftmikroskopie in
eine Flüssigkeitszelle
getaucht und die Änderung
der Resonanzfrequenz bei Massenzunahme, d.h. Adsorption von Material,
gemessen (siehe "Trendbericht
Physikalische Chemie 2003",
U. Weimar, H.-D. Wiemhöfer,
Ch. Ziegler, Nachrichten aus der Chemie 52, März 2004, 317-320). Beide Verfahren
sind aber beispielsweise nicht für
eine Einzelzellen- oder Einzelmoleküldetektion geeignet.
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Bei
Cantileversonden liegt dies darin begründet, daß aufgrund der Tatsache, daß die Schwingung senkrecht
zur Oberfläche
des Cantilevers erfolgt, sehr viel Flüssigkeit verdrängt werden
muß. Die
Folge ist eine sehr hohe Dämpfung,
die zu einer breiten Resonanzkurve (schlechte Güte des Schwingers) und damit
einer geringen Meßempfindlichkeit
führt. Weiterhin
wird Material auf dem ganzen Cantilever aufgetragen, so daß von vornherein
eine Auswertung der Meßergebnisse
schwer fällt,
da nicht bekannt ist, wo das Material anhaftet. Eine Parallelisierung
ist zwar möglich,
aber die Anzahldichte der Cantilever ist aufgrund der üblichen
Cantilevergrößen sehr
gering. Die Bestimmung der aktuellen Position z.B. einer biologischen
Zelle als Funktion der Zeit ist daher praktisch unmöglich. Die
Herstellung der Cantilever ist relativ aufwendig und kostenintensiv.
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Aus
der
WO 00/66266 A1 ist
ein Verfahren zur Detektion von Analyten in fluiden Medien mittels einer
säulen-
oder pfeilerartigen Cantileversonde bekannt, bei der jedoch die
Detektionsempfindlichkeit durch die geringe mechanische Güte des Cantileverschwingers
in dem Fluid stark reduziert ist.
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Der
Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bzw. eine
Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff
mit höherer
Meßempfindlichkeit
zu schaffen.
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Diese
Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff erfindungsgemäß dadurch
gelöst,
daß eine
säulen-
oder pfeilerartige Cantileversonde verwendet wird, deren Mantelfläche von
einem Luftspalt umgeben ist, wobei der Spaltabstand so gewählt wird,
daß das
flüssige
Medium aufgrund der Oberflächenspannung
den Luftspalt nicht benetzt und wobei der Deckel der Cantileversonde
dem flüssigen
Medium ausgesetzt wird und die sensitive Fläche darstellt.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine säulen-
oder pfeilerartige Cantileversonde so von einem Mantel eingefaßt, daß der Deckel
dem flüssigen
Material ausgesetzt ist und die Mantelfläche durch einen Luftspalt eingefaßt wird.
Hierfür
wird der Spaltabstand so gewählt,
daß die
Flüssigkeit
auf Grund der Oberflächenspannung
den Spalt nicht benetzen kann und somit die Cantileversonde mit
Ausnahme des Deckels von Luft umgeben bleibt. Dadurch wird die Dämpfung deutlich
reduziert und dennoch die Möglichkeit
gegeben, in flüssigen
Medien zu messen. Der mechanische Schwinger insgesamt wird im Gegensatz
zum Stand der Technik nicht mehr dem flüssigen Medium ausgesetzt, sondern
nur noch der Deckel, der auch als sensitive Fläche wirkt. Dadurch werden die
oben beschriebenen Dämpfungsprobleme
deutlich reduziert.
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Durch
Verwendung der säulen-
oder pfeilerartigen Cantileversonde, also einen einseitig eingespannten
mechanischen Schwinger, dessen Eigenschwingungen (alle Arten von
Schwingungen wie longitudinal, transversal oder hybride Formen der
Eigenschwingungen) durch Materialablagerung aus einem flüssigen Medium
auf dem Deckel des säulen- oder
pfeilerartigen Cantilevers gedampft werden und somit seine Resonanzfrequenz,
Dämpfung
bzw. Amplitude durch die Massenzunahme verändert, wird die Meßempfindlichkeit
gegenüber
bekannten Verfahren deutlich erhöht.
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Die
Adsorption von Materialien erfolgt immer an der gleichen Position
der Cantileversonde, so daß eine
Quantifizierung der Resonanzfrequenzen vereinfacht wird. Vorteilhaft
sind die deutlich kleineren Schwingungsstrukturen mit erhöhten Resonanzfrequenzen.
Eine gewünschte Änderung
der Flüssigkeit in
der Flüssigkeitszelle
macht sich nur noch am Deckel bemerkbar so daß Flüssigkeitsänderungen von geringeren meßtechnischen
Problemen begleitet werden. Diese Eigenschaften des neuen Verfahrens führen wiederum
zu einer erhöhten
Empfindlichkeit. Da die erfindungsgemäße Cantileversonde nur noch an
einer eingeengten Stelle empfindlich ist, ergibt sich ein einfacher
zu interpretierendes Meßergebnis.
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Darüber hinaus
ist die erfindungsgemäße Cantileversonde
durch die einfachere Herstellbarkeit kostengünstiger und eine höhere Integrationsdichte ist
möglich.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
besteht darin, daß mehrere
säulen-
oder pfeilerartige Cantileversonden verwendet werden.
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Es
können
viele Cantileversonden in einer oder zwei Dimensionen' nebeneinander angeordnet werden.
Es ist denkbar, daß die
Cantileversonden so dicht stehen, daß kein weiteres umgebendes
Material notwendig ist. In solchen Konfigurationen ist es weiterhin
denkbar, daß Material
wie Moleküle
oder Zellen von einer Cantileversonde zur nächsten weitergegeben werden,
indem z.B. eine mechanische Welle durch den "Wald" von
Cantileversonden geleitet wird. Dies beschreibt also eine Aktorenfunktion, weil
der Transport durch Beschichtung oder auch fehlende Beschichtung
selektiv erfolgen kann.
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Ein
zusätzlicher
Vorteil ergibt sich daraus, daß das
Verfahren von Seiten der Sensorherstellung leicht zu parallelisieren
ist, indem viele Säulen
matrixartig angeordnet werden. Damit ist auch ein bildgebendes Verfahren
(z.B. das Verfolgen von Molekülen durch
eine Flüssigkeitszelle)
möglich.
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Zur
Erfindung gehörig
ist auch, daß die
Cantileversonde durch externe Anregung in Schwingung versetzt wird.
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Unter
externer Anregung wird jegliche Anregung verstanden, die auf einer
externen Energiezufuhr beruht, so daß diese auch eine Anregung
durch Temperaturvariation, piezoelektrische Materialien, magnetostriktive
Materialen, etc. umfaßt.
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Weiterhin
ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß als Mittel
zur Detektion der Bewegung der Cantileversonde optische, kapazitative,
elektrische, impedimetrische, magnetische, piezoelektrische, piezoresistive
oder akustische Verfahren eingesetzt werden.
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Zur
Detektion der Bewegung der säulen- oder
pfeilerartigen Cantileversonde können
insbesondere die obengenannten Verfahren eingesetzt werden. So ist
jedes bereits aus der Rastersondenmikroskopie bekannte Verfahren,
insbesondere das Lichtzeigerverfahren, aber auch andere Meßtechniken
basierend auf der dynamischen optischen Beugung oder Streuung an
solchen Strukturen oder basierend auf nicht-linearen mechanischen
oder optischen Effekten (z.B. Heterodynverfahren zur Frequenzmischung)
einsetzbar.
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Im
Rahmen der Erfindung liegt auch eine Vorrichtung zur Detektion von
Analyten in flüssigen Medien
mittels einer Cantileversonde, wobei eine säulen- oder pfeilerartige Cantileversonde
vorgesehen ist, deren Mantelfläche
von einem Luftspalt umgeben ist, wobei der Spaltabstand so gewählt ist,
daß das
flüssige
Medium aufgrund der Oberflächenspannung
den Luftspalt nicht benetzt und wobei der Deckel der Cantileversonde
dem flüssigen
Medium ausgesetzt ist und die sensitive Fläche bildet..
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Sowohl
der Querschnitt der Cantileversonden (der z.B. rund, oval, polygonal
oder auch von unregelmäßiger Form
sein kann) als auch deren Geometrie sowie die Geometrie und die
Tiefe des Luftspaltes sind frei wählbar. Auch die Form der Cantileversonde
kann beliebig ausgelegt werden. Denkbar ist beispielsweise ein relativ
großer
Deckel auf einer dünneren
Cantileversonde oder umgekehrt. Die Oberflächenform des Deckels der Cantileversonde ist
ebenfalls variabel. So können
beispielsweise halbkugelförmige
Vertiefungen eine bessere Adhäsion von
Zellen ermöglichen.
Weiterhin kann auch eine sich durch den Deckel und auch die Säule erstreckende
Bohrung vorgesehen sein. Schließlich
ist auch eine von einem Luftspalt eingefaßte Cantileversonde möglich, die
auf einem mechanischen Schwingungssystem (Membran, Cantilever oder ähnliches) montiert
ist und über
dieses leicht anregbar ist.
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Neben
den oben zum Verfahren beschriebenen Vorteilen ist auch die Herstellung
der neuartigen Cantileversonden deutlich einfacher und kostengünstiger
als die der bisher bekannten. Da sie eingebettet sind, können sie
auch nicht abbrechen.
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Eine
Weiterbildung der Erfindung besteht darin, daß die Cantileversonde zumindest
in Teilbereichen mindestens eine Funktionalisierung aufweist.
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Dies
kann sowohl eine Beschichtung des Deckels und/oder auch der Seitenwände beinhalten,
um beispielsweise die Oberflächenenergie
an das flüssige
Medium anzupassen oder diese Bereiche zu passivieren, aber auch
beispielsweise die Integration einer Elektrode auf dem Deckel beinhalten,
um dessen elektrochemische Eigenschaften variieren zu können oder
den Deckel zu erwärmen,
um dort thermische Effekte, wie chemische Reaktion oder Desorption
zu erzielen. Weiterhin ist eine optische Anregung rückseitig
durch das Säulenmaterial
denkbar.
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Ebenso
können
komplexere elektronische Bauelemente (Impedanzen (Kondensator, Spule, Ohmscher
Widerstand und Kombinationen), Diode, Transistor, etc.) zum Zweck
der Beeinflussung des Nachweises oder zur Messung integriert werden.
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Weiterhin
ist vorgesehen, daß die
Cantileversonde aus mehreren Schichten oder aus verschiedenen Materialien
bzw. Materialgemischen besteht.
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Die
Cantileversonde (und auch das umgebende Material) kann aus verschiedenen
Schichtstapeln oder Materialgemischen bestehen.
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Weiterhin
ist es zweckmäßig, daß das die Cantileversonde
umgebende Material von dem die Cantileversonde tragenden Material
trennbar ist.
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Dies
ermöglicht
es, das umgebende Material inklusive des flüssigen Mediums abzuheben. Die
auf dem Substrat freistehenden Cantileversonden mit dem auf dem
Deckel chemi- oder physisorbierten Material können so von dem flüssigen Medium
getrennt werden. Die Trennung kann beispielsweise durch Herauslösen einer
Opferschicht erfolgen.
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Es
kann auch vorteilhaft sein, daß das
die Cantileversonde tragende Material eine Membran ist.
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Um
beispielsweise bei optischen Messungen das Schwingverhalten der
Cantileversonden außerhalb
des Fluidums zu erreichen, kann das die Cantileversonden tragende
Material eine Membran sein, die sich bei Bewegung der Cantileversonde
verformt. Die Verformung kann rückseitig
sehr empfindlich, z.B. interferometrisch oder durch Lichtzeigerverfahren
bestimmt werden.
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Eine
Weiterbildung besteht darin, daß sich die
Cantileversonde über
die Membran hinweg erstreckt.
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Wird
die Cantileversonde über
die Membran hinweg verlängert,
so daß die
eine Seite in Kontakt zum Fluidum steht und die andere Seite auf
der dieser abgewandten Seite der Membran angeordnet ist, reicht
es aufgrund der starren Kopplung beider, die Bewegung der nicht
im Medium befindlichen Cantileversonde zu untersuchen.
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Weiterhin
ist es vorteilhaft, daß die
Cantileversonde oder das umgebende Material aus einem aktuatorisch
wirksamen (piezoelektrisches, piezoresistives Material oder elektromechanische
Wandler aus Polymeren) Material bestehen.
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Bestehen
die Cantileversonden (inklusive ihres Substrates) oder das umgebende
Material aus piezoelektrischem Material, so ist es möglich, durch
externe elektrische Anregung die Schwingung der Säulen anzuregen
und/oder zu detektieren (piezokalorischer Effekt). Analog kann die
Anregung bei magnetostriktivem Material durch äußere Magnetfelder erfolgen.
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Es
ist zweckmäßig, daß optische,
kapazitative, elektrische, impedimetrische, magnetische, piezoelektrische,
piezoresistive oder akustische Mittel zur Detektion der Bewegung
der Cantileversonde vorgesehen sind.
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Es
können
verschiedene der obenaufgeführten
Mittel zur Detektion (z.B. piezoresistive oder piezoelektrische)
als Sensoren inklusive signalverstärkender oder signalverändernder
Bauelemente am Boden oder Fuß der
Cantileversonde integriert werden, um eine direkte elektrische Messung
des Schwingverhaltens zu ermöglichen.
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Im
Gegensatz zu konventionellen Cantileversonden ist es hierdurch möglich, die
Bewegung der Cantileversonde auf der Rückseite, also der dem fluiden
Medium abgewandten Seite zu bestimmen und so den Problemen durch
die Änderung
der optischen, elektrischen oder elektrochemischen Eigenschaften des
flüssigen
Mediums aufgrund der Änderung
einer anderen Eigenschaft des flüssigen
Mediums (Konzentrationsänderung
der gelösten
Spezies in dem flüssigen
Medium, Temperatur, etc.), zu entgehen.
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Schließlich liegt
auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zur Detektion von Adsorbaten in flüssigen Medien, insbesondere
von Einzelmolekülen
oder Einzelzellen im Rahmen der Erfindung.
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Da
die erfindungsgemäßen Cantileversonden
sehr klein sein können,
ist eine Integration in eine mikrofluidische Umgebung einfach durchführbar.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
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Es
zeigen
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1a und 1b eine
schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Cantileversonde,
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2a bis 2h einen
beispielartigen Herstellungsprozeß für die in den 1a und 1b dargestellte
Cantileversonde,
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3 eine
schematische Darstellung einer anderen erfindungsgemäßen Cantileversonde.
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In
den 1a und 1b ist
eine säulenartige
Cantileversonde 1 mit kreisförmigem Querschnitt dargestellt,
deren Mantelfläche
von einem Luftspalt 2 umgeben ist und deren Deckel 3,
der die sensitive Fläche
bildet, dem flüssigen
Medium 4 ausgesetzt ist. Die Doppelpfeile deuten vereinfachend
die komplexen Eigenschwingungen des Systems an. Die Breite des Luftspaltes 2 ist
so gewählt,
daß das
flüssige
Medium aufgrund der Oberflächenspannung
den Luftspalt 2 nicht benetzen kann. Der sich bildende Meniskus 5 des
flüssigen
Mediums ist deutlich erkennbar.
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Eine
derartige Cantileversonde 1 kann beispielsweise wie folgt
hergestellt werden:
Ein Substrat 10, vorzugsweise
(001) orientiertes monokristallines Siliziumsubstrat, wird mit einer
Maskierungsschicht 11 (im Fall von Silizium z.B. Siliziumdioxid,
Siliziumnitrid oder auch Metallschichten bzw. Photoresistschichten)
versehen (2a).
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Anschließend wird
ein Photoresistfilm 12 durch Aufschleudern oder Aufsprühen aufgebracht (2b).
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Der
Photoresistfilm 12 wird dann durch einen Lithographieprozeß (üblicherweise
optische Lithographie und bei sehr kleinen Strukturen durch Elektronenstrahllithographie)
belichtet und anschließend entwickelt.
Für einen
im Querschnitt kreisförmigen Cantileversensor 1 wird
dabei eine ringförmige Öffnung 13 im
Photoresistfilm 12 erzeugt. Die Breite der Öffnung 13 entspricht
später
im wesentlichen dem Spaltabstand 2 zwischen der Cantileversonde 1 und dem
diese umgebenden Material (2c).
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Die
Struktur in dem Photoresistfilm 12 wird durch subtraktive
Methoden (naßchemisches Ätzen, Plasmaätzen, etc.)
in die Maskierungsschicht 11 übertragen (2d).
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Optional
kann der Photoresistfilm 12 durch Plasmaveraschen oder
chemisches Lösen
entfernt werden. Er kann aber auch verbleiben, um die effektive
Dicke der Maskierungsschicht 11 für den nachfolgenden Plasmaätzsschritt
zu vergrößern (2e).
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Ein
stark anisotroper Ätzschritt
wirkt nun in dem Bereich ein, der von der Maskierungsschicht 11 nicht
geschützt
wird. Er sorgt dafür,
daß das
Material vorwiegend am Boden entfernt wird, die Seitenwände jedoch
nicht angegriffen werden. Durch die Dauer des Ätzschrittes wird die Höhe der Cantileversonde 1 definiert
(2f).
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Im
Fall von Silizium kann z.B. ein sogenannter gas chopping Prozeß (auch
Bosch-Prozeß genannt)
eingesetzt werden. Es handelt sich hierbei um eine Folge von zwei
nacheinander ablaufenden Plasmaprozessen. In dem ersten Schritt
wird durch reaktives Ionenätzen
(RIE, reactive ion etching), z.B. mit halogenhaltigen Gasen, wie
z.B. SF6 und Beimischungen anderer Gase
(Ar, O2, etc.) das Silizium anisotrop, d.h.
vorwiegend am Boden, geätzt.
Um die Anisotropie des Ätzprozesses
zu unterstützen,
d.h. den Ätzprozeß im wesentlichen
auf den Boden der Struktur zu konzentrieren, werden in einem zweiten Schritt
die Wände
der geätzten
Struktur durch Plasmapolymerisation (typische Gase: CH4,
CHF3, etc.) passiviert, d.h. gegenüber dem
Siliziumätzschritt
geschützt.
Durch fortwährende
Wiederholung dieser beiden Schritte wird die Höhe der säulenförmigen Cantileversonde 1 mit
nahezu senkrechten Wänden definiert.
Auch ein stark anisotroper Ätzschritt
ist denkbar. Durch das dabei auftretende starke Unterätzen der
Maskierungsschicht wird der Luftspalt deutlich vergrößert und
das Schwingungsverhalten des Schwingers wird dem in Luft ähnlicher.
Die Maskierungsschicht kann dann als Sensorfläche und somit auch als Element
der Eigenschwingung verbleiben.
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Abschließend wird
die Maskierungsschicht durch subtraktive Verfahren entfernt werden (2g).
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2h zeigt
eine Draufsicht auf die erhaltene Struktur mit einer säulenförmigen Cantileversonde 1.
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3 zeigt
eine andere Form einer erfindungsgemäßen Cantileversonde in geschnittener Darstellung,
bei der der Deckel 3 der Cantileversonde auf einer kegel-
oder pyramidenstumpfförmigen Säule 6 angeordnet
ist und seitlich deutlich über
diese hinausragt. Bei derartigen Cantileversonden ist die Säule 6,
nicht jedoch der Deckel 3 vom fluiden Medium 4 entkoppelt
und es wird das Schwingungsverhalten der gesamten Anordnung analysiert.