DE102005011367A1

DE102005011367A1 - Verfahren zur Herstellung von Cellulosesulfat mit verbesserten Eigenschaften

Info

Publication number: DE102005011367A1
Application number: DE102005011367A
Authority: DE
Inventors: Oliver Hauser; Steffen Fischer; Kay Hettrich; Wolfgang Wagenknecht
Original assignee: Austrianova Biotechnology GmbH; Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Ziel Biopharma Ltd Limerick Ie; Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2005-03-11
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2025-03-12
Also published as: UA88508C2; CN101137675B; EP1863851A1; ATE420116T1; US8337901B2; CN101137675A; KR20070116096A; ZA200708630B; AU2006221969A1; NO20075053L; EA200701944A1; PL1863851T3; AU2006221969B2; CA2602079A1; NZ562309A; US20090011033A1; HK1112472A1; DE602006004719D1; DK1863851T3; EP1863851B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cellulosesulfat, das auch bei niederem DS vollständig wasserlöslich ist und sich auf Grund der biologischen Verträglichkeit, der hohen Lösungsviskosität in wässriger Lösung und der sehr guten Reaktionsfähigkeit mit Polykationen als Hilfsstoff für biologische und medizinische Anwendungen eingesetzt werden kann und insbesondere für die Immobilisierung von biologischen Objekten, wie z. B. Gewebe, Zellen, Mikroorganismen, Enzyme oder Viren, in Mikrokapseln geeignet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von regioselektiv substituiertem Natrium-Cellulosesulfat (NaCS) mit verbesserten Eigenschaften, sowie die Verwendung des verbesserten NaCS für die Mikroverkapselung von biologisch aktiven Substanzen. Derartige Mikrokapseln, auch Symplex-Mikrokapseln genannt, werden z.B. durch Eintropfen der erfindungsgemäß verbesserten Cellulosesulfat-Lösung in eine wässrige Lösung des Polykations pDADMAC (Polydiallyldimethylammoniumchlorid) hergestellt.
Natrium-Cellulosesulfat (NaCS) ist ein seit langem bekanntes, wasserlösliches Polymer des Schwefelsäurehalbesters der Cellulose. NaCS wird gebildet durch die Veresterung der Hydroxylgruppen der Cellulose mit einem Sulfatierungsmittel, wie z.B. Schwefelsäureanhydrid, Schwefelsäure oder deren Derivate und der nachfolgenden Umsetzung des aziden Halbesters in ein neutrales Natriumsalz.
Zur Herstellung von NaCS sind grundsätzlich Verfahren bekannt, bei denen die Sulfatierung in heterogener Phase ohne Auflösung des Polymers oder in homogener Phase entweder unter Auflösung des Polymers (quasihomogen) oder nach vorheriger Auflösung des Polymers (homogen) durchgeführt wird.

Lukanoff und Dautzenberg (1994, Das Papier, Heft 6, 287-298) entwickelten ein bekanntes heterogenes Herstellungsverfahren unter der Verwendung von Schwefelsäure und Propanol als Reaktionsmedium und Sulfatierungsmittel weiter. Für ein solches heterogenes Herstellungsverfahren wird z.B. nach Bohlmann et al. (2002, Chemie Ingenieur Technik, 74, 359-363) zunächst das Reaktionsmedium aus 96%iger Schwefelsäure und Isopropanol in einem molaren Verhältnis von 1,8:1 hergestellt. Die Sulfatierung der Cellulose erfolgt hierin bei –5°C über einen Zeitraum von 150 min. Zum Abbruch der Reaktion wird das Reaktionsgemisch von dem gebildeten Celluloseschwefelsäurehalbester mit Waschalkohol abgetrennt und ausgewaschen. Anschließend wird das gewaschene Produkt mit Natronlauge in das Natriumsalz überführt.

Wesentliche Nachteile dieses heterogenen Sulfatierungsverfahrens von Cellulose bestehen darin, dass es sich um eine schwer kontrollierbare, exotherme Reaktion in heterogener Phase handelt, die zwangsläufig zu Ungleichmäßigkeiten in der Substituentenverteilung entlang und zwischen den Polymerketten führt und so das Löslichkeitsverhalten und den Polymerisationsgrad der erhaltenen Cellulosesulfate beeinträchtigt.

Ein weiterer gravierender Nachteil des heterogenen Herstellungsverfahrens ist der beträchtliche Kettenlängenabbau der Cellulose während der fortschreitenden Sulfatierung. Zur Reduzierung eines fortschreitenden Kettenlängenabbaus der Cellulose wird die Sulfatierungsreaktion z. B. durch Waschschritte, die hinreichend Wärme abführen und so einen weiteren Temperaturanstieg vermeiden, abgebrochen. Dennoch gewinnen Diffusions- und Quellprozesse sowie die morphologische Struktur der Cellulose einen wesentlichen Einfluss auf den Reaktionsablauf, da die Reaktion insgesamt unter Erhaltung einer Festkörperstruktur der Cellulose abläuft.

Um vollständige Wasserlöslichkeit der heterogen hergestellten Cellulosesulfate ohne Abtrennung unlöslicher Anteile im DS-Bereich < 0,8 zu erreichen, wird in DD 295858A5 und DE 4019116A1 eine Voraktivierung der Cellulose vorgeschlagen, wobei allerdings trotzdem nur sehr niederviskose Produkte mit maximal 8,5 mPas in 1%iger wässriger Lösung erhalten werden. Beim Einsatz dieser Cellulosesulfate zur Herstellung von Symplexmikrokapseln ist zu beobachten, dass nur Mikrokapseln mit sehr geringer mechanischer Festigkeit entstehen.

Nach DE 4021049 können höherviskose Cellulosesulfate aus dem anfallenden Reaktionsprodukt isoliert werden, indem durch zusätzliche Verfahrensschritte die wasserunlöslichen Anteile abgetrennt und die enthaltenen löslichen, aber zu niederviskosen Anteile herausgewaschen werden.

Im Ergebnis führt der heterogene Herstellungsprozess bei Umsetzung der Cellulose bis zur vollständigen Wasserlöslichkeit zu Produkten mit relativ hohem Substitutionsgrad (mindestens DS = 0,8), einer daraus resultierenden inhomogenen Substituentenverteilung und trotz Einsatz von hochmolekularer Ausgangscellulose zu niederviskosen NaCS.

Bei der homogenen Sulfatierung von Cellulose wird gewöhnlich ein organolösliches Cellulosezwischenderivat eingesetzt, wodurch sich der Kettenlängenabbau der Cellulose während der Sulfatierungsreaktion besser unterdrücken lässt. Da die Sulfatierung nach oder unter vollständiger Auflösung der Festkörperstruktur in einem dipolar aprotischen Lösungsmittel abläuft, wird eine gleichmäßigere Substituentenverteilung erreicht. Das Endprodukt hat eine höhere Lösungsviskosität und ist zum Teil schon bei DS-Werten von 0,25 vollständig wasserlöslich. Beispielsweise wurden bei Einsatz von relativ niedermolekularem Celluloseacetat (DS = 2,4; Cuoxam-DP ca. 250) Lösungsviskositäten der synthetisierten NaCS bis nahe 10 mPas (Messung einer 2% Lösung in 2n NaOH in einem Ubbelohde-Viskosimeter) erhalten (vgl. DE 4435180 ).

Durch weitere Modifizierung des Herstellungsverfahrens basierend auf der homogenen Veresterung von teilsubstituierten Celluloseacetaten konnte die zielgerichtete Substituierung der OH-Gruppen an den verschiedenen C-Atome der Anhydroglucoseeinheit der Cellulose erreicht werden. Wagenknecht et al. ( DE4435082 ; DE 4435180 und Das Papier, 1996, 712-720) beschreiben die regioselektive Sulfatierung an der C2/C3 oder C6 Position, wobei organolösliche Celluloseacetate als Ausgangspolymer eingesetzt wurden.

Wesentliche Nachteile sind die zu niedrigen Polymerisationsgrade der eingesetzten, handelsüblichen Celluloseacetate (Cuoxam-DP ca. 200 bis 350), so dass sich daraus nach dem gegenwärtigen Stand der Technik keine Cellulosesulfate höherer Lösungsviskosität als ca. 10 mPas in 1%iger wässriger Lösung herstellen lassen. Die Einstellung eines gewünschten Lösungsviskositäts-Bereichs der erhaltenen NaCS bei gegebenem Ausgangs-DP des Celluoseacetats ist nach wie vor wünschenswert.

Die Acetosulfatierung von nativer Cellulose als ein Grundprinzip zur Herstellung von Celluloseacetatsulfat, Celluloseacetat bzw. Cellulosesulfat durch Mischveresterung ist seit langem bekannt. Dabei wurden als Reagenzien fast ausschließlich Schwefelsäure mit Essigsäureanhydrid in glacialer Essigsäure als Reaktionsmedium eingesetzt (US-PS 2683143, US-PS 2969356, US-PS 3086007, US-PS 3075963, US-PS 4005251). Anstelle von Schwefelsäure wurde auch Natriumchlorsulfonat eingesetzt (US-PS 2969355). Im Ergebnis der Untersuchungen von Chauvelon (G. Chauvelon et al., Carbohydrate Resarch 338 (2003) 743-750) zur Herstellung wasser-löslicher Celluloseacetatsulfate zeigte sich eine starke Uneinheit-lichkeit dieser Heterogenreaktion, so dass das Zielprodukt nur durch Fraktionierung gewonnen werden konnte.

Es ist weiterhin bekannt, dass eine unter Auflösung verlaufende Acetosulfatierung von Cellulose bei Verwendung von N,N-Dimethylformamid als Reaktionsmedium möglich ist. Dabei wurden als Reagenzmischung Acetanhydrid/SO₃ (Wagenknecht, W. et al., "Cellulosics: materials for selective separations and other technologies", Kennedy, Phillips, Williams, Horwood (1993) 205-211 oder Acetanhydrid/Chlorsulfonsäure (Wagenknecht, W.: Das Papier 50(1996)12, 712-720) eingesetzt. Nach alkalischer Abspaltung der instabilen Acetylgruppen wurden bis zu DS-Sulfat von ca. 0,8 ausschließlich in C6-Stellung der Anhydroglucoseeinheit substituierte wasserlösliche Cellulosesulfate erhalten.

Nachteile der bisher auf diesem Wege synthetisierten Cellulosesulfate bestehen in der Ungleichmäßigkeit bei DS < 0,6, die zu Heterogenitäten in einer wässrigen Lösung und damit zur Unbrauchbarkeit für die Herstellung von Symplexmembranen führt.

NaCS als Polyanion, die den erfindungsgemäßen Anwendungen zur automatisierten Herstellung von sphärischen Symplexmikrokapseln definierter Größe, ausreichender mechanischer Festigkeit und Langzeitstabilität genügen sollen, müssen eine Reihe von Anforderungen erfüllen:

– Rückstandsfreie Löslichkeit in wässrigen Medien
– einstellbare Lösungsviskositäten bei gegebener Konzentration
– geringe Strukturviskosität, um auch bei hohen Eintropfgeschwindigkeiten reguläre Mikrokapseln zu erhalten
– Einstellbarer Sulfat-DS im Bereich von 0,3 bis 0,7 für stabile Symplexbildung
– regioelektive Sulfatierung in C-6-Position der AGU
– Sterilisierbarkeit wässriger Lösungen bei pH-Wert um 7
– Bioverträglichkeit z. B.: Keim- und Endotoxinfreiheit, geringer Schwermetallgehalt

Der größte Nachteil heterogener aber auch homogener Herstellungsverfahren ist der unkontrollierte Kettenlängenabbau während der Sulfatierungsreaktion. Aufgrund dieses Kettenlängenabbaus ist es bislang nicht möglich NaCS herzustellen, welches bei einem DS von 0,3 bis nahe 1, vorzugsweise 0,3 bis 0,6, vollständig wasser-löslich ist, und deren Lösungviskösität in 1%iger Lösung über die Führung der Acetosulfatierungsreaktion z.B. so eingestellt wurde, dass sie im Bereich von 15 bis 50 mPas liegt.

Eine genügend hohe, einstellbare Lösungsviskosität der gelösten NaCS ist insbesondere interessant, wenn NaCS zur Verkapselung von biologisch aktivem Material eingesetzt wird, denn in den hierfür verwendeten Verfahren wird eine Suspension von biologisch aktivem Material in einer wässrigen NaCS-Lösung über eine Düse in eine gegenionische Lösung getropft. Die Tropfenbildung, Tropfenhomogenität und Tropfengröße ist dabei direkt abhängig von der Lösungsviskosität der gelösten NaCS. Die Dicke und Festigkeit der Kapselwand wird wiederum durch den Polymerisationsgrad und die Konzentration des eingesetzten NaCS beeinflusst.

Zu geringe Lösungsviskositäten erlauben zwar die Tropfenbildung und damit eine potentielle Verkapselung von biologischen Materialien, es kommt jedoch leicht zu Unregelmäßigkeiten bei besagter Tropfenbildung und den daraus entstehenden Mikrokapseln. Derartige Unregelmäßigkeiten zeigen sich in fehlender Homogenität, ungleicher Größenverteilung, mangelnder Stabilität und ungleichmäßigen Einschlüssen von biologischen Materialien. Eine zu geringe Lösungsviskosität des wassergelösten NaCS ist daher ein gravierender Nachteil, der mit üblichen Verfahren hergestellten NaCS's und aller daraus erzeugten Produkte.

Dieser Nachteil, nämlich die zu geringe Lösungsviskosität, wird z.T. potenziert durch die Eingrenzung verschiedener Herstellungsverfahren nur auf bestimmte Celluloseausgangsprodukte zurückgreifen können. Das häufig eingesetzte, im Handel erhältliche Celluloseacetat (Cellulose-2,5-acetat) hat durchschnittlich 250-270 Polymereinheiten (DP). Allein durch diese DP-Obergrenze lassen sich daraus keine höherviskosen NaCS gewinnen. Während des Herstellungsverfahrens von NaCS kommt es bei der Sulfatierung mit den stark aciden Reagenzien zu einem weiteren Kettenlängenabbau, wodurch die Lösungsviskosität ebenfalls reduziert wird. Typischerweise werden Lösungsviskositäten von unter 10 mPas erreicht (siehe z. B. DE4435180 ).

Zellstoff, der manchmal als Ausgangsmaterial eingesetzt wird, hat DP-Werte von um die 600. Auch beim Einsatz von Zellstoff in den bekannten Herstellungsverfahren, kommt es zu deutlichem Kettenlängenabbau und dementsprechend einem Endprodukt mit zu geringer Lösungsviskosität.

Idealerweise würde man native hochmolekulare Cellulose wie Baumwoll-Linters, die hohe DP-Werte mit etwa 1250 bis 1400 Polymereinheiten hat, zu NaCS umsetzen, um möglichst lange Polymerketten und damit eine hohe Lösungsviskosität zu erhalten.

Baumwoll-Linters werden als Ausgangsmaterial im heterogenen Schwefelsäure/Propanol-Verfahren eingesetzt, jedoch führt das Verfahren wie bereits erwähnt zu einer erheblichen Anzahl von Kettenbrüchen, so dass die nach der Synthese anfallenden Produkte nur niedrige Lösungsviskositäten aufweisen. Da das heterogene Herstellungsverfahren weiterhin keine gleichmäßige Verteilung der Sulfatestergruppen erlaubt, sind auch noch die Produkteigenschaften, z. B. die Wasserlöslichkeit der potentiell entstehenden NaCS, deutlich negativ beeinflusst.

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein weiteres und verbessertes Herstellungsverfahren für regioselektiv substituiertes NaCS bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes der Technik löst und bei gegebenem DP des eingesetzten Celluloseausgangsmaterials die gezielte Einstellung der Lösungsviskosität bei vollständiger Wasserlöslichkeit des Endproduktes erlaubt.

Die Aufgabe wird gelöst durch die Verfahrensschritte des Hauptanspruchs 1. Besondere Ausführungsformen sind in den Merkmalen der abhängigen Ansprüche dargestellt.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird Cellulose, insbesondere Linters-Cellulose, durch eine quasihomogene Reaktion in einem polaren Lösungsmittel mittels Mischveresterung mit einem Reagenzgemisch, bestehend aus einem Acetylierungs- und einem Sulfatierungsmittel, zu einem Acetatsulfatmischester aufgelöst. Vorteilhafterweise wird die Cellulose zunächst im gewählten Reaktionsmedium bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise im Bereich von 30 bis 100°C, über einen längeren Zeitraum, vorzugsweise 0,5 bis 12h, unter Rühren vorgequollen und zur weiteren Quellung bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird unter ständigem Rühren das zuvor bereitete Reagenzgemisch definierter Zusammensetzung zudosiert. Die partiellen Substitutionsgrade (DS)-Sulfat und DS-Acetat können in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise bis zu einem maximalen Gesamt-DS=3 über das molare Verhältnis der Reagenzien zueinander und das Molverhältnis zur Cellulose eingestellt werden. Die Acetosulfatierungsreaktion bei einer Reaktionstemperatur vorzugsweise im Bereich von 30 bis 80°C durchgeführt, wobei sich das entstehende Celluloseacetatsulfat im Reaktionssystem zu einer viskosen Lösung auflöst. Bei geeigneter, weitgehend konstant gehaltener Temperatur verringert sich mit der Reaktionszeit langsam die Viskosität der Polymerlösung, so dass diese auf einen gewünschten Bereich eingestellt werden kann.

Erfindungsgemäß wesentlich ist, dass der weitere Abbau durch definierte Neutralisation abgestoppt wird und dadurch der Polymerisationsgrad und damit verbunden die Lösungsviskosität des nach Aufarbeitung erhaltenen Cellulosesulfats fixiert wird.

Zur Neutralisation werden die Sulfatestergruppen ohne Abspaltung der Acetylgruppen vor (alternativ auch gleichzeitig und während) der Fällung in die Natriumsalzform überführt. Unter den erfindungsgemäßen Bedingungen werden dazu die Sulfatestergruppen vor, (alternativ auch gleichzeitig und während) der Fällung durch ein basisches Neutralisationsmittel, vorzugsweise definierte Mengen NaOH, gelöst in einem geeigneten Neutralisations- und/oder Fällungsmittel, auf jeden Fall aber ohne Abspaltung der Acetylgruppen vorsichtig neutralisiert.

Anschließend wird der vorzugsweise in partikulärer Form ausgefällte neutrale Celluloseacetatsulfat-Mischester mit einem geeigneten Waschmedium, vorzugsweise mit Natriumacetat enthaltendem Ethanol oder Ethanol/Wasser-Gemisch, gereinigt.

Die Aufarbeitung zum Endprodukt erfolgt dann durch alkalische Abspaltung der Acetylgruppen in heterogener Phase mittels ethanolischer NaOH, Rückneutralisation auf pH-Werte nahe 7, wiederholte Wäsche vorzugsweise mit wasserhaltigem Ethanol bis zur Salzfreiheit und anschließende Trocknung des Natriumcellulosesulfats im Vakuum bei ca. 40°C.

Nach diesem Syntheseverfahren können rückstandsfrei klarlösliche Natriumcellulosesulfate bei DS größer gleich 0,3 hergestellt werden, die eine für die Simplexmembranherstellung sehr vorteilhafte sehr gleichmäßige und regioselektive Substituentenverteilung der Sulfathalbestergruppen in C6-Position aufweisen und gekennzeichnet sind durch eine einstellbare Lösungsviskosität in einem Bereich von größer 10 mPas bis 500 mPas, vorzugsweise 15 bis 400 mPas, weiter vorzugsweise 20 bis 300 mPas, weiter vorzugsweise 15 bis 100 mPas, weiter vorzugsweise 20 bis 50 mPas, bei gegebener Konzentration von 1% in Wasser.

Während bei allen bislang bekannten Verfahren die Neutralisation im Anschluss an die Wachschritte und/oder Deacetylierung durchgeführt wurde, konnten die Erfinder zeigen, dass die Qualität der zu erzeugenden NaCS deutlich verbessert ist, wenn die Neutralisation direkt im Anschluss an die Sulfatierung und ohne vorherige Deacetylierungs- oder Waschschritte erfolgt. Befriedigend gute Ergebnisse sind auch zu erzielen, wenn die Neutralisation gleichzeitig mit der Fällung durchgeführt wird.

Zur Neutralisation wird im erfindungsgemäßen Verfahren Lauge, vorzugsweise NaOH zu dem Reaktionsgemisch gegeben, wobei die Lauge oder NaOH genau auf das Sulfatierungsreagenz abgestimmt ist. Zum Beispiel wird 1 Mol einer 3basigen Säure, wie Chlorsulfonsäure, mit 3 Mol NaOH neutralisiert und 1 Mol einer 2basigen Säure, wie Schwefelsäure, wird mit 2 Mol NaOH neutralisiert.

Zügiges Arbeiten ist bei der Neutralisation vorteilhaft, da im sauren System Polymerketten immer angegriffen und abgebaut werden und durch das Verkürzen der Zeitdauer während der Neutralisation ein solcher Polymerkettenlängenabbau reduziert wird.

Durch die neue Anordnung der Verfahrensschritte beim erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren von NaCS und die vorgezogene Neutralisation im aziden System ist das Herstellungsverfahren bezüglich des Polymerkettenlängenabbaus kontrollierbar. Das erfindungsgemäß erzeugte NaCS besitzt keine oder geringe Strukturviskosität bei gleichzeitig einstellbaren Lösungsviskositätsbereich von 10 bis 500 mPas, vorzugsweise 15 bis 400 mPas, weiter vorzugsweise 20 bis 300 mPas, weiter vorzugsweise 15 bis 100 mPas, weiter vorzugsweise 20 bis 50 mPas, gemessen in einer 1%-igen wässrigen Lösung bei 25°C in einem Ubbelohde-Viskosimeter.

Darüber hinaus ist das gemäß dem erfinderischen Verfahren erzeugte NaCS bei DS-Werten ab 0,25 im Gegensatz zum Heterogenverfahren H₂SO₄/Isopropanol-Verfahren rückstandsfrei wasserlöslich, so dass keine wasserunlöslichen Anteile vor einer weiteren Verarbeitung entfernt werden müssen.

Entsprechend einer Ausführungsform wird für das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren die Cellulose in polaren Lösungsmitteln wie z. B. N,N-Dimethylacetamid (DMAc), N-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylsulfoxid (DMSO) oder N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Vorzugsweise wird DMF als Lösungsmittel eingesetzt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren mit Schwefelsäure, Amidoschwefelsäure, Schwefeltrioxid, Sulfurylchlorid oder Chlorsulfonsäure als Sulfatierungsmittel durchgeführt werden. Vorzugsweise wird Chlorsulfonsäure als Sulfatierungsmittel eingesetzt.

Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kann gemäß einer weiteren Ausführungsform mit Acetylchlorid oder Essigsäureanhydrid als Acetylierungsmittel ausgeführt werden. Vorzugsweise wird Essigsäureanhydrid als Acetylierungsmittel eingesetzt.

Die erfindungsgemäße Herstellung von NaCS findet bevorzugt bei den nachfolgend beschriebenen Reaktionsbedingungen statt:
Zunächst wird das Vorquellen der nativen Cellulose im erhöhten Temperaturbereich bis zu 150°C, vorzugsweise 30 bis 100°C, vorzugsweise 40 bis 60°C für einen Zeitraum bis zu 24h, vorzugsweise bis zu 12h, weiter vorzugsweise 3 bis 8h und anschließender Phase der Abkühlung auf Raumtemperatur, sowie einer Weiterquellung bei Raumtemperatur (RT) bis zu 48h durchgeführt. Die Lösung wird vorzugsweise während der gesamten Dauer des Vorquellens gerührt. Während dem Weiterquellen bei RT ist das Rühren nicht länger erforderlich.

Anschließend wird das Sulfatierungsreagenz und das Acetylierungsreagenz unter ständigem Rühren und bei einer Reaktionstemperatur von bis zu 110°C, vorzugsweise 20 bis 80°C, weiter vorzugsweise 30 bis 70°C, weiter vorzugsweise 40 bis 65°C, weiter vorzugsweise 50 bis 60°C zu der vorgequollenen Cellulose gegeben.

Die direkt anschließende Neutralisation erfolgt vorzugsweise unter ständigem vorsichtigem Rühren bei RT, wobei die Polymerlösung entsprechend der Reaktionstemperatur noch warm sein kann. D.h., die Reaktion wurde z.B. bei 50°C durchgeführt und wird nach kurzer Abkühlung entsprechend warm in das Neutralisations/Fällungsbad eingeleitet. Das Neutralisations/Fällungsbad hat Raumtemperatur und hat das 3 bis 10-fache Volumen.

In einer Ausführungsform ist das NaCS, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, im Wesentlichen keimfrei, endotoxinfrei und/oder schwermetallfrei. Hierzu wird das Verfahren unter sterilen Bedingungen und insbesondere unter keimfreien Bedingungen durchgeführt. Insbesondere sind die Bedingungen und Ausgangsmaterialien so zu wählen, dass keine Hefen, aerobe Bakterien, Salmonellen, E.coli, Stapphylococcus aureus, Pseud. aeruginosa etc. darin nachweisbar sind. Der Endotoxingehalt des Endproduktes liegt bei 0,02-0,11 I.E./ml ermittelt in einem LAL-Test gemäß Europäischem Arzneibuch Ph. Eur. 4.00 Methode C (turbidimetrischkinetrisch) mit einer 1%-igen wässrigen NaCS-Lösung (w/v).

Ferner ist darauf zu achten, dass alle Ausgangsmaterialien weitestgehend frei von Schwermetallen sind, wie z. B. Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn und Cu, damit das erfindungsgemäße NaCS folgende Grenzwerte nicht überschreiten:
Gesamtschwermetallgehalt ohne Eisen: ≤ 10ppm,
Eisengehalt: ≤ 20ppm,
wobei als Gesamtschwermetallgehalt ohne Eisen die Summe der Gehalte aller denkbaren Schwermetalle verstanden wird.

Gemäß weiterer Ausführungsformen wird ist das erfindungsgemäß hergestellte NaCS regioselektiv substituiert. Bevorzugt sind eine homogene Substituentenverteilung an der C6 Position oder alternative an der C2/3 Position. Die gewünschte regioselektive Sulfatierung ist entsprechend der im Stand der Technik beschriebenen Methode (Wagenknecht et al., 1996) durch die eingesetzten Reagenzien steuerbar.

Die erfindungsgemäße NaCS ist insbesondere für den Einsatz zur Mikroverkapselung von biologischen Materialien geeignet. Aufgrund ihrer einstellbaren Lösungsviskosität in Bereichen von 10 bis 50 mPas, 40 bis 70 mPas, 60 bis 100 mPas, 80 bis 200mPas, 150 bis 300 mPas oder 250 bis 500 mPas (bei Messung einer 1%-igen wässrigen Lösung in einem Ubbelohde-Viskosimeter) erlaubt es eine unkomplizierte Handhabung und überraschend hohe Arbeitsgeschwindigkeit beim Verkapseln von biologischen Materialien.

Im Gegensatz dazu wurden in den zahlreichen bekannten Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Cellulosesulfaten bisher nur wenige beschrieben, die bei einer Verwendung zum Erzeugen von Mikrokapseln Produkte liefern, die eine ausreichende mechanische Festigkeit haben und die biochemische Anforderungen für einen potentiellen medizinischen Einsatz erreichen.

So werden in DD 218734A4 und DE 3306259C2 Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln dargestellt, wobei die Immobilisierung von lebensfähigen biologischen Objekten beschrieben wird. Das verwendete NaCS ist hierbei mittels des N₂O₄/SO₂/DMF- Verfahrens erzeugt. Die Verwendung des sehr toxischen Stickoxids ist ein wesentlicher Nachteil dieser Methode, bei der über einen Redoxprozess zunächst ein in Dimethylformamid (DMF) lösliche Nitrit-Sulfat-Mischester entsteht. Nach Abspaltung der instabilen Nitritestergruppen müssen für Arbeiten mit lebenden biologischen Objekten, insbesondere für biomedizinische Anwendungen die toxischen Nebenprodukte, darunter das entstehende Dimethylnitrosamin, quantitativ aus den Cellulosesulfaten entfernt werden. Dennoch eignen sich Mikrokapseln, die derart hergestellt wurden, nicht für medizinische Anwendungen.

In DE 4021050A1 und EP0892852 ist die Herstellung von NaCS mittels des heterogenen H₂SO₄/Propanol-Verfahrens beschrieben. Es wurde versucht dieses NaCS zur Herstellung von Simplexmikrokapseln zu verwenden und zur Immobilisierung lebensfähiger biologischer Objekte einzusetzen. Aufgrund der Kettenlängenbrüche bei der NaCS Herstellung ist aber eine Abtrennung von wasserunlöslichen Anteilen und/oder die Entfernung hochsubstituierter, niedermolekularer Anteile kaum zu vermeiden. Mikrokapseln, die aus so erzeugtem NaCS hergestellt wurden, sind wenig stabil und sehr inhomogen geformt. Sie sind daher z. B. nicht für medizinische Anwendungen in Form von Injektionen geeignet.

In WO 2000010694A1 wurde die Verwendung von Sulfoalkylcellulose als anionische Simplexkomponente zur Herstellung von Flachmembranen beschrieben. Eine Simplex-Flachmembranherstellung unterscheidet sich grundsätzlich von einer Kapselherstellung. Es können daher keine Schlüsse aus der Verwendung NaCS für die Herstellung von Mikrokapseln gezogen werden.

Auch bei Richau, K. et al., J. Membr. Sci 1996, 113, 31-41 und in DD 298790A5 wird beschrieben, dass NaCS zur Herstellung von Simplex-Flachmembranen eingesetzt werden kann. Eine Simplex-Flachmembranherstellung unterscheidet sich grundsätzlich von einer Kapselherstellung und es können daher keine Schlüsse aus der Verwendung von NaCS für die Herstellung von Mikrokapseln gezogen werden.

Wagenknecht et al. ( DE 4435180 C1 ; Das Papier 50 (1996) 12, 712-720) beschreiben die Verwendung von NaCS für Simplexmembranen, das aus Celluloseacetat hergestellt wurde. Das NaCS wird dabei durch Umsetzung von zumeist niedermolekularem Celluloseacetat in N,N'-Dimethylformamid mit verschiedenen Sulfatierungsmitteln und anschließender Abspaltung der Acetylgruppen umgesetzt, wobei die Aufarbeitung salzfrei erfolgt. Die Lösungsviskosität des so hergestellten NaCS ist infolge des unkontrollierten Kettenlängenabbaus unbefriedigend gering. Mikrokapseln, die aus so erzeugtem NaCS hergestellt wurden, sind wenig stabil und sehr inhomogen geformt. Sie sind daher z. B. nicht für medizinische Anwendungen in Form von Injektionen geeignet.

Das niederviskose NaCS, wie es in DE4435180 beschrieben ist, eignet sich z.B. für die destillationsfreie Lösungsmitteltrennung durch Pervaporation. Das hierbei beschriebene NaCS wird, wie oben dargestellt, durch Sulfatierung von handelsüblichen Celluloseacetaten hergestellt und weist verkürzte Polymerketten sowie eine geringe Lösungsviskosität auf. Mikrokapseln, die aus so erzeugtem NaCS hergestellt wurden, sind wenig stabil und sehr inhomogen geformt. Sie sind daher z. B. nicht für medizinische Anwendungen in Form von Injektionen geeignet.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass zahlreiche Verfahren zur Herstellung von NaCS bekannt sind, die jedoch alle Endprodukte liefern, die entweder eine zu geringe Lösungsviskosität haben, unregelmäßige Substituentenverteilung aufweisen, durch zahlreiche Kettenlängenbrüche nur noch oder vorwiegend aus kurzen Fasern bestehen oder durch die Verwendung von toxischen Reagenzien belastet sind.

Auch wenn solche NaCS teilweise im Labormaßstab schon für die Mikroverkapselung von biologischen Materialien eingesetzt wurde, erwiesen sich die Kapseln als wenig stabil und als inhomogen in ihrer Größenverteilung oder Membrandicke. Erhebliche nachteilige Auswirkungen zeigten sich auch durch die toxische Belastung des Herstellungsprozesses auf die Lebensfähigkeit der eingeschlossenen Zellen bzw. bei der Verträglichkeit der Kapseln.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher ausgehend von nativer Cellulose die Synthese von klarlöslichen Celluloseacetatsulfaten mit definierter Molekülstruktur, sowie daraus hergestellter vollständig wasserlöslicher, biologisch verträglicher NaCS mit verbesserten Lösungseigenschaften bereitzustellen, die als Hilfsstoffe für biologische und medizinische Anwendungen, insbesondere zur Immobilisierung aktiver biologischer Objekte in Mikrokapseln aus Simplexmembranen verwendet werden können

Im Unterschied zu den im Vorangegangenen beschriebenen Herstellungsverfahren und Endprodukten zeichnet sich das erfindungsgemäß hergestellte NaCS z. B. durch einen definiert einstellbaren Lösungsviskositätsbereich aus, woraus auf einen hohen DP-Wert und wenige Kettenbrüche während des Herstellungsverfahrens geschlossen werden kann. Das NaCS, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, löst aufgrund dieser Eigenschaften die im Vorangegangenen beschriebenen Probleme bei der Mikroverkapselung von biologischen Materialien.

Grundsätzlich können Mikrokapseln in drei Kategorien eingeteilt werden: Vollkugeln, ummantelte Kugeln und Hohlkugeln.

Vollkugeln können hergestellt werden indem gelierende Substanzen (z. B. Agarose, Gelatine) in flüssigem Aggregatzustand in Tropfen zerteilt werden und zur Verfestigung bis unter ihren Schmelzpunkt abgekühlt werden. Die gebräuchlichste Matrix für Vollkugeln stellt die Kombination aus Alginat und CaCl oder anderen polyvalenten Metallionen dar. Hohlkugeln können wie Vollkugeln durch Eintropfen der Polymerlösung in ein Bad mit Gegenionen hergestellt werden. Es werden Gegenionen verwendet, die aufgrund von Diffusionslimitierung den eingetauchten Tropfen nicht durchdringen können. Die Vernetzungsreaktion findet somit nur an der Tropfenoberfläche statt, wodurch sich eine stabile Membran um einen flüssigen Kern ausbildet. Hohlkugeln können ebenfalls durch das Auflösen des vernetzten Kerns oder dem Kern einer Vollkugel aus gelierenden Substanzen gebildet werden. Ummantelte Kugeln werden durch Aufbringen einer, oder mehrere Schichten weiterer, komplexbildener Substanzen, die aus entgegengesetzt geladenen Polyionen (z. B. PLL, Chitosan) bestehen, auf Voll- oder Hohlkugeln hergestellt.

Das NaCS, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, eignet sich besonders zur Herstellung von Hohlkugeln oder ummantelten Kugeln.

Für die Herstellung von Mikrokapseln sind eine Vielzahl von Verfahren und hierzu technischen Varianten bekannt. Im einfachsten Fall erfolgt die Kapselherstellung durch einfache Abtropfung einer Flüssigkeit, die durch eine Kanüle strömt. Die Größe des abtropfenden Tropfens wird durch Gewichtskraft und dem Produkt aus Grenzflächenspannung und Außendurchmesser der Kanüle bestimmt. Dieses Verfahren ist nur für Kapseln größer 1 mm geeignet besitzt aber nur eine geringe Produktivität.

Beim so genannten AirJet-Verfahren, auch AirStripping-Verfahren, wird ein gravimetrisch austretender Flüssigkeitstropfen am Ende einer zuführenden konzentrischen Kapillare durch einen die Kapillare umfließenden laminaren Gasstrom mitgerissen. Durch dieses Verfahren kann der Durchmesser der Tropfen reduziert werden.

Beim AirKnife-Verfahren Verfahren wird der austretende Flüssigkeitsstrahl durch turbulente Luftwirbel in kleine Tröpfchen zerstäubt. Beide Verfahren besitzen aber eine geringe Produktivität von ca. 0,1-2 ml/min.

Im Gegensatz zum AirJet-Verfahren, bei dem die Tropfenbildung rein gravimetrisch erfolgt und daher für höher viskose Lösungen nicht geeignet ist, wird beim JetCutter-Verfahren bei gegebenen Druck ein konstanter Flüssigkeitsstrom erzeugt. Der Flüssigkeitsstrahl wird mittels eines rotierenden Drahtes mechanisch zerteilt. Aus den abgetrennten Flüssigkeitszylindern bilden sich, in Abhängigkeit von der Oberflächenspannung des Fluids über eine entsprechende Fallstrecke, sphärische Partikel aus. Nachteilig bei diesem Verfahren ist ein systembedingter Schnitt- und Spritzverlust.

Eine elektrostatisch unterstützte Tropfenbildung beschleunigt die Tropfenbildung an der Kapillare durch Anlegen eines starken elektrischen Feldes zwischen Kapillare und Vernetzungsbad, wodurch wesentlich kleinere Tropfen von der Kapillare abtropfen als beim normalen Abtropfen.

Beim Verfahren der Tropfenherstellung mittels rotierender Scheiben, wird die zu vertropfende Flüssigkeit nahe des Mittelpunkts einer schnell rotierenden Scheibe aufgebracht und fließt dann durch die auftretenden Zentrifugalkräfte zum Scheibenrand. Am Scheibenrand zerreißt der Flüssigkeitsfilm in kleine Tröpfchen. Die Tropfenbildung lässt sich durch Aufprägung einer Schwingung verbessern.

Beim Verfahren der Tropfenherstellung mittels rotierender Zylinder fließt die zu vertropfende Flüssigkeit durch einen rotierenden Zylinder mit entsprechenden Öffnungen. Die Zentrifugalkräfte unterstützen die Tropfenbildung am Zylinderrand, wobei die Flüssigkeit in kleine Tröpfchen zerreißt.

Die Tropfenbildung aus Flüssigkeitsstrahlen ermöglicht es den Volumenstrom und somit die Produktivität zu erhöhen. Man unterscheidet hier hauptsächlich 3 Verfahren:
Beim Tauchstrahlverfahren wird ein Flüssigkeitsstrahl mit hoher Geschwindigkeit in eine weitere Flüssigkeit eingespritzt. Durch die hohen Scherkräfte wird der Strahl in feine Tröpfchen allerdings mit großer Größenverteilung zerteilt.

Beim Vibrations-Verfahren wird ein aus einer Düse austretender laminarer Flüssigkeitsstrahl mittels Überlagerung einer sinusförmigen Schwingung mit geeigneter Frequenz zerteilt. Das Prinzip geht auf Lord Rayleigh (Proc. London Math. Soc. 10(4),4-13, 1878) zurück, der für einen nicht-zähen Flüssigkeitsstrom belegt hat, dass ein Flüssigkeitszylinder gleichmäßig zerfällt, wenn die Wellenlänge einer rotationssymmetrischen Schwingung größer wird, als der Umfang des ungestörten Strahls. Die optimale Wellenlänge hängt vom Düsendurchmesser, der dynamischen Viskosität, der Dichte und der Oberflächenspannung des Fluids ab.

Daneben gibt es zahlreiche weitere Verfahren und Abwandlungen der oben beschriebenen Verfahren. Eine Übersicht über diese Verfahren gibt Renken und Hunkeler (A. Renken, D. Hunkeler, Microencapsulation: A Review of Polymers and Technologies with a Focus on Bioartificial Organs, Polimery, 43(9), 530-537 (1998)).

Alle diese Verfahren eignen sich für die Herstellung von Mikrokapseln im Sinne dieser Erfindung.

Für die erfindungsgemäße Herstellung von Mikrokapseln bzw. von NaCS-Tröpfchen mit homogener Größenverteilung und kugelförmiger Geometrie wurden Verkapselungsgeräte (IE-50R) der Firma Inotech (Dottikon, Schweiz) verwendet, die nach dem oben beschriebenen Vibrations-Verfahren arbeiten. Für biomedizinische Anwendungen können hierbei alle Arbeitsschritte auch unter keimfreien Bedingungen durchgeführt werden. Eine Beschreibung eines solchen Verkapselungsgerätes und der Funktionsweise findet sich z. B. in EP 1 062 032 B1 .

Bei dem Verkapselungsverfahren nach Rayleigh wird eine wässrige NaCS-Lösung mittels einer peristaltischen Pumpe oder mittels eines Linearantriebs aus einem Vorratsgefäß über eine Kapillare zur Düse, an der die Tropfenbildung erfolgt, transportiert. Hierbei kann ein konstanter Volumenstrom eingestellt werden. Aufgrund der Lösungsviskosität, die bedingt durch die chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen NaCS, frei einstellbar ist, ist eine hohe Arbeitsgeschwindigkeit möglich. Es können pro Austrittskapillare Volumenströme im Bereich von 1-15 ml/min, vorzugsweise 6-8 ml/min genutzt werden.

Die wässrige NaCS-Lösung kann je nach Verwendungszweck in unterschiedlichen Anteilen weitere Komponenten enthalten. Hierzu zählen zunächst die zu verkapselnden Materialien. Daneben können weitere Komponenten in veränderlichen Anteilen hinzukommen (z.B. Substrate, Gefrierschutzmittel (Glycerin, DMSO) oder Salze, wie z.B. 0,9% NaCl) oder das NaCS kann direkt in speziellen Lösungen (z. B. Zellkulturmedien) gelöst werden.

Ein Schwingungsgeber erzeugt und überträgt eine vertikale Sinusschwingung auf die Düse in einem variablen Bereich von 100 bis 4000 Hz. Vorzugsweise werden für die Herstellung von Mikrokapseln Frequenzen im Bereich von 600 bis 3000 Hz verwendet. Zusätzlich zur Frequenz kann die Schwingungsamplitude von 0 bis 100% variiert werden. Durch die hierbei erzeugte Vertikalschwingung wird das Abreißen des austretenden Flüssigkeitsstrahls in Tröpfchen mit gleichem Volumen gewährleistet. Über die Frequenz kann im Prinzip die Einstellung einer definierten Kapselgröße vorgegeben werden.

Um die Kollision von Tröpfchen zu verhindern, wird durch das Anlegen einer Hochspannung im Bereich von 0,8 bis 1,5 kV zwischen Düse und einem positiv geladenen Spannungsarm (Anode) eine Ladungsverschiebung im austretenden Flüssigkeitsstrahl erzeugt. Beim Passieren des Spannungsarms werden die an der Düse negativ polarisierten Tröpfchen in Richtung Anode abgelenkt und hierbei horizontal aufgefächert.

Die entstehenden Tröpfchen bilden durch das Vernetzen zweier gegenionischer Polyelektrolyte beim Eintropfen einer NaCS-Lösung, einem anionischem Polyelektrolyt, in eine kationische Lösung (z.B. pDADMAC) mit dieser an der Phasengrenzfläche eine Simplexmembran aus, die einen nicht-polymerisierten, flüssigen Kern schalenförmig umgibt, wobei die Membrandicke mit ihrer Verweildauer in der Lösung zunimmt.

Das Polymerisationsbad besteht aus einer wässrigen Lösung eines polymeren Kations. Die Stabilität der gebildeten Simplexmembran wird hierbei durch die chemischen Eigenschaften (funktionelle Gruppen, Anzahl der Substituenten) bestimmt. Geeignet für den Verkapselungsprozess sind z.B. Dodecylamin, Ethylendiamin, Piperazin, Methylenblau, Arginin, Triethyltetramin oder Spermin. Vorzugsweise werden aber Polymere mit quarternären Ammoniumgruppen verwendet, präferentiell Polydimethylallylammonium (pDADMAC) oder Polyvinylbenzyltrimethylammonium.

Der Vernetzungsgrad bzw. die Stabilität der erzeugten Mikrokapseln korreliert weiterhin mit der Kettenlänge des verwendeten Polykations. Das durchschnittliche Molekulargewicht kann im Falle von pDADMAC im Bereich von 10.000 bis 500.000 liegen. Für die Verkapselung eignen sich pDADMAC-Konzentrationen im Bereich von 0,5-5% (w/v), vorzugsweise im Bereich von 0,8-2% (w/v).

Die wässrige Polykation-Lösung kann je nach Verwendungszweck in veränderlichen Anteilen weitere Komponenten enthalten, z. B. Substanzen, die die Oberflächenspannung der wässrigen Lösung herabsetzen, organische Lösungsmittel, Gefrierschutzmittel (Glycerin, DMSO) oder Salze, wie z.B. 0,9% NaCl) oder das Polykation kann direkt in speziellen Lösungen (z. B. Kulturmedien) gelöst werden.

Im Polymersisationsbad befindet sich ein Magnetrührer, der eine Strömung vertikal zur Fallrichtung der Tropfen erzeugt und somit die eintauchenden Tröpfchen aus dem Einfallbereich der nachkommenden Tröpfchen heraustransportiert und somit das Risiko einer Aggregation von nicht-auspolymerisierten Mikrokapseln minimiert. Weiterhin hält er die Tröpfchen in Schwebe, was für die Konvektion der Membranbildungsreaktion vorteilhaft ist und auch die anschließenden Waschschritte optimiert.

Für die erfindungsgemäße Herstellung von Mikrokapseln zunächst eine wässerige NaCS-Lösung hergestellt. Die NaCS Lösung sollte eine Konzentration zwischen 1% und 4% NaCS (w/v), vorzugsweise zwischen 1,5% (w/v) und 3% (w/v) aufweisen. In Abhängigkeit von der Scherbelastung können die geeigneten Parameter aus einem Viskositätsdiagramm abgelesen werden. So sollte z. B. eine 1%-ige Lösung aus dem erfindungsgemäßen NaCS eine Lösungsmittelviskosität im Bereich von 10-500 mPas, vorzugsweise von 10-200 mPas, weiter vorzugsweise zwischen 15 und 70 mPas,, weiter vorzugsweise zwischen 20 und 50 mPas aufweisen (gemessen mit einem Bohlin Visco 88 Rotationsviskosimeter).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weisen die mit der erfindungsgemäß hergestellten NaCS erzeugten, im wesentlichen kugelförmigen Partikel bzw. Mikrokapseln im Sinne dieser Erfindung einem Durchmesser von 0,1-50 μm, 1-100 μm, 50-250 μm, 50-500 μm, 100-250 μm, 100-500 μm, 250-500 μm, 250-700 μm, 500-1000 μm, 700-1500 μm, 1000-2500 μm, 1500- 3000 μm, 2500-4000 μm, 3000-5000 μm auf. Vorzugsweise weisen die Mikrokapseln einen Durchmesser von 200-1500 μm, präferenziell einen Durchmesser von 600-800 μm auf.

Für biomedizinische Anwendungen kann die NaCS-Lösung aus dem erfindungsgemäßen NaCS mit gängigen Verfahren z. B. durch radioaktive Bestrahlung sterilisiert werden. Die Stabilität des erfindungsgemäßen NaCS erwies sich selbst bei der Sterilisation im gespannten Dampf für 30min bei 121°C als gegeben.

Das erfindungsgemäße NaCS ist insbesondere geeignet, stabilere und homogenere Mikrokapseln als bislang bekannt, herzustellen. Solche Mikrokapseln eignen sich zum Einschluss von biologischen Objekten z.B. Bakterien, Viren, Hefen, Zellen und Gewebe für die biomedizinische Anwendung, aber auch zur gezielten Wirkstoffproduktion im biotechnologischen Maßstab. Sie sind aber auch einsetzbar zur Immobilisierung von Wirkstoffen, z.B. Pulverkatalysatoren, Kolloiden, Metallkomplexen, Enzymen und Farbstoffen für technische Anwendungen.

Die erfindungsgemäß erzeugten Kapseln sind daher insbesondere für die Anwendung in der Veterinär- und Humanmedizin geeignet, denn sie genügen den hohen Anforderungen wie nachfolgend dargestellt.

Für die Applikation der Mikrokapseln in das Blutkreislaufsystem oder in tierisches oder humanem Gewebe bzw. Organe z.B. zur Behandlung von Krebserkrankungen, ist eine entsprechende gleichmäßige und reproduzierbare Größenverteilung der Mikrokapseln notwendig, damit einerseits ein Verstopfen der Injektionskanüle und/oder schlimmer noch der Blutgefäße vermieden werden kann. Weiterhin kann hierüber die Applikation einer konstanten Menge an verkapseltem Agens pro Kapsel (z.B. Wirkstoff, Enzym, Anzahl Zellen pro Kapsel) gewährleistet werden. Die kugelförmige Geometrie der Kapseln gewährleistet ein gutes Fließverhalten z. B. in Kathedern und eine in alle Richtungen gleichmäßige, somit ideale Wirkstofffreisetzung. Weiterhin ist für die Applikation die geringe Kompressibilität der Kapseln nützlich, da sie das Verklemmen der Kapseln und somit das Verstopfen des Katheders durch z. B. komprimierte Kapseln reduziert. Eine geringe Klebrigkeit der Kapseloberfläche, insbesondere in biologischen Flüssigkeiten, verhindert das Agglomerieren der Kapseln. Das NaCS, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde erlaubt aufgrund der einstellbaren Lösungsviskosität eine unkomplizierte Handhabung und eine unerwartet hohe Arbeitsgeschwindigkeit beim Verkapseln von biologischen Materialien, was insbesondere für die industrielle Fertigung von auf Mikrokapseln basierten pharmazeutischen Präparaten vorteilhaft ist.

Weitere Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen mit Bezug auf die Figuren dargestellt, wobei:

1 eine mikroskopische Vermessung der Größenverteilung von NaCS-Mikrokapseln mit unterschiedlichen Sollgrößen (1A-D) hergestellt aus unterschiedlichen Batches zeigt. In allen Fällen enthielt die NaCS-Lösung sowie die pDADMAC-Lösung zudem 1% NaCl (w/v). Die Amplitude der Düsenschwingung beträgt jeweils 100%. Die weiteren variablen Parameter wurden wie folgt eingestellt. Die Mikroverkapselung erfolgte mit Hilfe des Inotech-Verkapselungsgerätes (IE-50R) und die Vermessung mit Hilfe eines Zeis Axiovert

Tabelle 1

Durch die Wahl geeigneter Parameter für die Kapselherstellung kann die Größe der gebildeten Mikrokapseln über einen weiten Bereich eingestellt werden. Die Bandbreite reicht aufgrund der einstellbaren Lösungsviskositäten des erfindungsgemäßen NaCS von 10 bis 5000 μm.

Die gebildeten Mikrokapseln weisen in allen getesteten Größenbereichen eine nahezu ideal kugelförmige Geometrie und eine hohe Reproduzierbarkeit auf.

2 zeigt in 2a und 2b das Wachstumsverhalten von HEK293-Zellen in NaCS-Kapseln zu verschiedenen Zeitpunkten. Hierbei wurden die Kapseln über einen Zeitraum von 36 Tagen in DMEM-Medium mit 4,5% Glukose (w/v) und 10% Fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert und zu verschiedenen Zeitpunkten Aliquots entnommen.

2a zeigt von links oben nach rechts unten qualitativ die Zunahme der Zellzahl innerhalb der Mikrokapseln, wobei Stichproben an den Tagen 1, 2, 3, 7, 14 und 21 nach der Verkapselung entnommen wurden. Die zu verkapselnde 2%ige (w/v) NaCS-Lösung enthielt initial 2 × 10⁶ Zellen/ml und zusätzlich 1% NaCl. Weitere Parameter für die Verkapselung waren: Konzentration der pDADMAC-Lösung: 1,1% (w/v), Kapselsolldurchmesser: 600 μm, Düsendurchmesser: 300 μm, Volumenstrom: 6,1 ml/min, Amplitude: 100%, Frequenz: 900 Hz und Dispersionsspannung: 1100 V.

2b zeigt das Wachstumsverhalten verkapselter HEK293-Zellen in Kapseln mit einem Solldurchmesser von 600 bzw. 1200 μm unter Verwendung des MTT-Tests für lebende, immobilisierte Zellen. Die Kapseln wurden hierzu über einen Zeitraum von 36 Tagen in T75- Zellkulturflaschen kultiviert. Die Parameter für die Verkapselung in 600 μm Kapseln (-⦁-) entsprechen denen wie unter 2a beschrieben. Für die Verkapselung in 1200 μm Kapseln (-'-) wurden folgende Parameter verwendet: Die zu verkapselnde 2%ige (w/v) NaCS-Lösung enthielt initial 1,5 × 10⁶ Zellen/ml und zusätzlich 1% NaCl. Weitere Parameter für die Verkapselung waren: Konzentration der pDADMAC-Lösung: 2,5% (w/v), Düsendurchmesser: 300 μm, Volumenstrom: 12,9 ml/min, Amplitude: 100%, Frequenz: 600 Hz und Dispersionsspannung: 1200 V.

Beide Kurven sind nicht direkt vergleichbar, zeigen aber beide ein ideales logarithmisches Wachstumsverhalten der HEK293-Zellen. Dies zeigt augenscheinlich, dass weder das polymerisierte, noch das im Kapselinneren befindliche nicht-polymerisierte NaCS einen zytotoxischen Effekt, oder eine negative Wirkung auf die verkapselten Zellen ausübt.

3 zeigt eine mikroskopische Aufnahme von NaCS-Kapseln, die HEK293 Zellen enthalten, nach dem Einfrieren und Wiederauftauen. Die Kapseln wurden vor dem Einfrieren für 21 Tage in DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glukose und 10% fötalem Kälberserum kultiviert. Das Einfrieren erfolgte in DMEM-Medium mit 10% DMSO. Nach einer Inkubationsdauer von 2 Std. bei Raumtemperatur wurden die Kapseln in ein Kryoeinfriergerät (MrFrosty, Heraeus, Deutschland) eingebracht und mit einer Einfrierate von –1°C/min auf –80°C abgekühlt. Die Die Lagerung erfolgte bei –80C°. Nach dem Wiederauftauen bleibt die makroskopische Membranstruktur vollständig Intakt. Der Auftauprozess erfolgte unter leichtem Schütteln bei 37°C im Wasserbad. Für eine Weiterkultivierung wird das DMSO-Medium wiederholt durch frisches DMEM-Medium ausgetauscht, um überschüssiges DMSO zu entfernen.

Anhand der schwarz/violetten Farbe (MTT-Vitalfärbung), ist erkennbar, dass die immobilisierten Zellen die Einfrier-/Auftauprozedur trotz sehr hoher Zelldichte im Innern der Kapsel überleben und erfolgreich weiter kultiviert werden können. Die Kapselstruktur und -geometrie bleibt hierbei intakt.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele sind nicht als Einschränkung der Erfindung zu verstehen. Vielmehr sind im Rahmen der Beschreibung der Ausführungsbeispiele auch solche Varianten, Elemente und Kombinationen als offenbart anzusehen, die sich durch eine Kombination oder Abwandlung von einzelnen, in der allgemeinen Beschreibung, den Ausführungsbeispielen, den Ansprüchen oder den Zeichnungen enthaltenen Merkmalen ergeben, und diese Merkmalskombinationen oder Abwandlungen nicht ausdrücklich in einem Ausführungsbeispiel gezeigt bzw. beschrieben sind und gegebenenfalls zu einem geänderten Gegenstand oder zu neuen Verfahrensschritten bzw. einer neuen Abfolge von Verfahrensschritten führen.

Beispiel 1
Herstellung von Natrium Cellulosesulfat (NaCS)
10 g Cellulose (atro) wurde in 333 ml Dimethylformamid (DMF) gegeben. Die Cellulose wurde bei Raumtemperatur in einem Zeitraum von ca. 14 Stunden gequollen.
Die Mischveresterung wurde nach erfolgter Quellung durch Zugabe des Reagenzgemisches, welches sich aus 8 mol/mol AGU Essigsäureanhydrid (47ml) als Acetylierungsmittel und 0,7 mol/mol AGU Chlorsulfonsäure (2,9 ml) als Sulfatierungsmitteln sowie 100 ml DMF zusammensetzt, gestartet. Die Synthese erfolgte bei einer Temperatur von 50° C. Die Cellulose beginnt sich aufzulösen und nach ca. 3 h lag eine klare transparente Polymerlösung vor.
Nach 5h erfolgte die Neutralisation/Fällung unter ständigem Rühren durch langsames Hineingießen der Polymerlösung (innerhalb von ca. 15 min) in ein Neutralisations/Fällmedium, welches sich aus 42,9 g Natriumhydroxid (NaOH), 80 g H₂O und 20 g Natriumacetat aufgefüllt auf 1,5 1 mit Ethanol zusammensetzt und vorzugsweise Raumtemperatur hat. Nachdem die Polymerlösung komplett in das Neutralisations/Fällmedium gegossen worden ist, wurde noch 1 h gerührt. Anschließend wurde filtriert, und dreimal mit je 600 ml mit einer Waschlösung gewaschen, bestehend aus 4% (w/w) Natriumacetat in Ethanol-Wasser-Gemisch (1:1, w/w).
Anschließend erfolgte die Deacetylierung, durch Zugabe von 333 ml Deacetylierungsreagenz (13g NaOH, 27g H₂O auf 333 ml mit Ethanol auffüllen). Das Gemisch wurde 1h gerührt und ca. 12h stehen gelassen. Die Neutralisation der Mischung erfolgte Einstellung des pH-Wertes auf 8,0 mit einem Essigsäure-Ethanol-Gemisch (1:1, w/w). Abschließend wurde dreimal 11 Ethanol gewaschen. Getrocknet wurde bei 40°C im Vakuumtrockenschrank.
Das Verhältnis und die Mengen der eingesetzten Acetylierungs- und Sulfatierungsmittel sind abhängig von der zu erzielenden regioselektiven Substitution an den C₂, C₃ oder C₆ Positionen. Geeignete Mischverhältnisse sind dem Fachmann bekannt.
Beispiel 2
Herstellung von NaCS-Mikrokapseln aus dem erfindungsgemäßen NaCS
Entsprechend den bekannten Verfahren (AirJet-Verfahren; JetCutter-Verfahren; Vibrationsverfahren) zur Herstellung von Mikrokapseln (Orive et al., 2004, Trends Biotechnol. 22 (2): 87-92) wurde mit einer Verkapselungsmaschine Inotech, Modell IE-50R), die Cellulosesulfat-Lösung zur Komplexierung in eine Polykationlösung (z. B. pDADMAC) eingetropft.
Beim Eintauchen eines Cellulosesulfattröpfchens in eine gerührte wässrige Lösung eines Polykations (pDADMAC), bildet sich an der Phasengrenzfläche durch eine spontan ablaufende Komplexierungsreaktion eine semipermeable Simplexmembran, die einen nichtkomplexierten, flüssigen Kern umschließt. Mit fortlaufender Reaktionszeit wächst die Membranstärke durch Diffusion des Polykations in die Kapselmembran solange an, bis die Dichte des sich bildenden dreidimensionalen Netzwerkes zu einer Diffusionsbarriere für das Polykation wird.
Konkret wurde für die Kapselherstellung eine homogene wässrige NaCS-Lösung mit einer Cellulosesulfat Konzentration von 1,5-3,5% erzeugt. Das hierfür eingesetzte NaCS hatte einen Substitutionsgrad (DS) zwischen 0,3 und 0,99. Diese NaCS-Lösung wurde mit einer laminaren Strömungsgeschwindigkeit von 1-15 ml/min über eine 100-300 μm Düse in eine 0,8-2% pDADMAC-Lösung eingetropft. Durch die geringe Strukturviskosität bei gleichzeitig hoher Oberflächenspannung der erfindungsgemäßen NaCS-Lösung ist eine hohe Arbeitsgeschwindigkeit möglich. Die Tropfenbildung und Tropfengröße wird zum einen durch den Volumenstrom, die Wahl der Düse und beim Vibrationsverfahren zum anderen aber auch durch die Frequenz und Frequenzamplitude, mit der der Zerfall des Flüssigkeitsstrahls in Tröpfchen gesteuert wird, festgelegt. Diese Frequenz wurde auf 600-1100 Hz eingestellt, um kugelförmige Mikrokapseln mit einem Durchmesser von etwa 650-700 μm Durchmesser zu erzeugen. Durch Heraufsetzen der Frequenz wird die Kapselgröße kleiner, sowie sie größer wird sofern die Frequenz herabgesetzt wird. Vorzugsweise wird zur Erzeugung von Kapsel einer durchschnittlichen Größe von 700 μm Durchmesser mittels einer 250 μm Düse ein Frequenzbereich von 650 Hz gewählt. Für die Erzeugung von Kapsel in einer durchschnittlichen Größe von 500 μm ist z.B. ein Frequenzbereich von 1100 Hz zu wählen und weiterhin ist für die Erzeugung von Kapsel in einer durchschnittlichen Größe von 800 μm z.B. ein Frequenzbereich von 500 Hz zu wählen. Ein Feintuning ist über die Modulation der anderen Parameter möglich.
Des Weiteren wird die Größe der Kapseln auch durch die Reaktion des Cellulosesulfats mit der pDADMAC beeinflusst. Verlängerte Reaktionszeiten, erhöhte Konzentration und ein geringeres Molekulargewicht des pDADMACs verringern die Kapselgröße. Es konnte gezeigt werden, dass die Simplexmikrokapseln, die mit dem erfindungsgemäßen NaCS hergestellt werden eine reproduzierbare und quasi ideale, kugelförmige Geometrie und eine gleichzeitig geringe Größenstreuung aufweisen (1)
Beispiel 3
Herstellung von NaCS-Kapseln mit biologischen Objekten
Der Prozess der Herstellung von NaCS-Mikrokapseln umfasst als wesentliche Schritte die Herstellung der NaCS-Lösung, die Herstellung der NaCS-Zellsuspension, die Vertropfung sowie die Komplexierung der Kapseln im Polymerisationsbad.
Das erfindungsgemäße NaCS wird zunächst in einer Konzentration von 1,5 – 3,5% (w/v) unter rühren bei Raumtemperatur in physiologischer Kochsalzlösung (0,8-1,0% (w/v)) gelöst und der pH-Wert mit 0,1N NaOH bzw. 0,1N HCl auf pH 7,2 eingestellt. Die hergestellte NaCS-Lösung wird vor der Vermischung mit Zellen für 20-30 Minuten bei 121°C autoklaviert und der pH-Wert gegebenenfalls nachjustiert.
Herstellen von NaCS-Zellsuspensionen:
Für die Verkapselung in NaCS-Kapseln wurden HEK293-, Jurkat-Zellen oder HIT-Zellen verwendet. Prinzipiell sind aber eine Vielzahl von sowohl adhärenten als auch Suspensionszellen verwendbar. Die Zellkulturen werden in geeigneten, konventionellen Zellkulturverfahren, z. B. in T75-Flasks oder Rollerflaschen exponentiell vermehrt und nach Ausbildung eines Monolayers bei 90% Konfluenz geerntet. Die verwendeten Zelllinien werden in DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glukose (Gibco, Glasgow, UK) mit 10% fötalem Kälberserum (Gibco, Glasgow, UK) inkubiert. Die abgelösten Zellen werden in ein 50 ml Falcon-Tube überführt, für 5 Minuten bei 200g abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wird dann vorsichtig mit PBS-Puffer gewaschen und final in NaCS-Lösung aufgenommen, homogen suspendiert und mittels einer Spritze unter sterilen Bedingungen an die mit allen Schlauchverbindungen und Vorlagegefäßen versehene und autoklavierte Verkapselungseinheit angeschlossen. Direkt im Anschluss erfolgt die Vertropfung der Zellsuspension.
Vertropfung und Kapselproduktion:
Zur Verkapselung wird die Geschwindigkeit zunächst soweit erhöht, dass ein gleichmäßiger Flüssigkeitsstrom an der Kapillare austritt, anschließend kann der Volumenstrom auf die für die Vertropfung optimale Geschwindigkeit abgesenkt werden. Die bis zu diesem Zeitpunkt vertropfte NaCS-Zellsuspension wird noch vor dem Einfallen ins Vernetzungsbad durch einen schwenkbaren Auffangbehälter abgefangen, der nach Ausbildung eines gleichmäßigen Flüssigkeitsstrahles (stabile Betriebsphase) zur Seite geschwenkt wird, so dass die Kapselpolymerisation erfolgen kann. Die erzeugten Mikrokapseln können kontinuierlich aus dem Reaktionsraum abgepumpt werden und sollten, um nicht-polymerisiertes pDADMAC zu entfernen, mit physiologischer Kochsalzlösung, PBS oder Kulturmedium gespült oder verdünnt werden. Auch die Überführung in ein Sammelgefäß kann hierbei steril erfolgen.
Anschließend wird an einem sterilen Arbeitsplatz die überschüssige Waschflüssigkeit nach dem Sedimentieren der Kapseln durch Pipettieren aus dem Sammelgefäß entnommen und durch Kulturmedium ersetzt. Direkt anschließend werden die verkapselten Zellen z. B. in T-Flaschen oder in Rollflaschen bei 37°C und 2 U/min kultiviert. Nach 4 bis 8 Stunden wird das Medium nochmals gewechselt, um restliches pDADMAC zu entfernen. Bei der Herstellung der Kapseln ist auf die Sterilität aller Komponenten und Lösungen zu achten.
Vitalitätsbestimmung durch Trypanblaufärbung:
Die Vitalitätsbestimmung durch Trypanblaufärbung dient der Bestimmung von Gesamtzellzahlen (tote und lebende Zellen). Trypanblau ist ein negativ geladener Farbstoff, der selektiv in Zellen mit nicht intakter Zellmembran eindiffundieren kann und deren Cytoplasma blau anfärbt. Tote Zellen erscheinen daher im mikroskopischen Lichtbild blau-violett, während vitale Zellen weiß bis gelblich erscheinen. Die Anzahl lebender und toter Zellen kann dann z.B. mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer mikroskopisch ermittelt werden.
Vitalitätsbestimmung mittels MTT-Test
Die Vitalitätsbestimmung mittels MTT-Test erfasst im Gegensatz zur vorgenannten Trypanblaufärbung nur die Lebendzellzahl.
Bei dieser Meßmethode handelt es sich um einen kolorimetrischen Test, bei dem das gelbe Tetrazoliumsalz 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid (MTT) passiv in lebende Zellen aufgenommen und durch Dehydrogenasen zu wasserunlöslichen, lila Formazankristallen reduziert wird. Die Menge des gebildeten Formazans ist bei konstanter und ausreichend langer Inkubationszeit proportional zur Lebendzellzahl. Die Bestimmung erfolgt photometrisch bei λ = 570 nm nach einer Inkubationszeit von 4 Std.
MTT-Vitalitätstest für verkapselte Zellen
Der MTT Test wurde ursprünglich entwickelt, um Lebendzellzahlen von Zellsuspensionen zu ermitteln. Ein qualitativer MTT-Test kann an intakten Kapseln vorgenommen werden. Für die quantitative Bestimmung müssen die Zellen durch Inkubation für 1 Std. in 20% SDS-Lösung (Sigma-Aldrich, Deutschland) im Ultraschallbad aus den Kapseln herausgelöst werden. Durch Zugabe eines Lysepuffers werden noch intakte Zellen aufgeschlossen, so dass eine homogene Farbstofflösung gebildet wird. Noch vorhandenes NaCS- und Zellfragmente werden abzentrifugiert. Die MTT-Konzentration wird spektrophotometrisch gemessen.
Beispiel 4:
Bestimmung der Reproduzierbarkeit der Kapselqualität bei Verwendung unterschiedlicher NaCS-Herstellungschargen
Zur Produktion von 600 μm Kapseln wird eine 2%ige NaCS mit 1% NaCl und eine 1,0% pDADMAC Lösung mit 1% NaCl hergestellt. Die pDADMAC Lösung wird auf 30C° temperiert. Es werden 20 ml NaCS in 300 ml einer gerührten, 1,0%igen pDADMAC-Lösung vertropft. Die Reaktionsdauer beträgt 3 min.
Der Düsendurchmesser beträgt 200 μm. Der Volumenstrom beträgt 6,1 ml/min. Die Amplitude der Düsenschwingung beträgt 100%, die Frequenz wird auf 900 Hz eingestellt. Die Dispersionsspannung beträgt 1100 V.
Zur Produktion von 600 μm Kapseln mit immobilisierten Zellen wird unter Beispiel 3 beschrieben verfahren. Zusätzlich werden die in einer T75-Flask zu 90% konfluent wachsenden Zellen abtrypsiniert, in NM-Medium (DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glukose + 10% FCS (Gibco, Glasgow, UK)) aufgenommen und bei 200g für 5min pelletiert. Das Pellet in wurde in PBS resuspendiert und die Zellkonzentration wird bestimmt. Ein Aliquot der Zellsuspension wird pelletiert um eine Zellkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml NaCS zu erreichen. Das gewaschene Pellet wird in der NaCS-Lösung resuspendiert und in eine Spritze gefüllt. Direkt im Anschluss erfolgt die Vertropfung der Zellsuspension.
Kapselgrößenbestimmung:
Die Kapselgrößen wurden mikroskopisch (Lichtmikroskop „Carl Zeiss Jena M200", Jena, Deutschland) bei 4facher Vergrößerung vermessen. Die Kalibrierung wurde hierbei mit einer Neubauerzählkammer durchgeführt. Zur Auswertung wurde die Software „Zeiss Imaging Vers. 4" (Carl Zeiss Jena, Jena, Deutschland) durchgeführt.
Stabilitätsmessung von Mikrokapseln:
Zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften der NaCS-Mikrokapseln wurde ein Kraft-Weg-Messgerät (LUMiTexture, Lerche GmbH, Berlin, Deutschland) verwendet.
Ein Stempel belastet das Untersuchungsobjekt mit programmierbarer Geschwindigkeit, während eine elektronische Waage die resultierende Kraft misst. Aus dem Kraft-Weg-Verlauf lassen sich die Kenngrößen Berstdruck und die dabei maximal auftretende Spannung in der Simplexmembran ermitteln. Stabilitätsmessungen wurden sowohl für Kapseln ohne als auch mit immobilisierten Zellen sowie für die Untersuchungen zur Langzeitstabilität von Kapseln mit immobilisierten Zellen verwendet.
Tabelle 2
Die Messungen von Kapseln, die mit denselben Verkapselungsparametern, aber mit 4 verschiedenen Produktionschargen hergestellt wurden, zeigen, dass die erzielten Kapselstabilitäten absolut vergleichbar sind. Die mittleren Stabilitäten variieren um 6%. Die Streuung zwischen unterschiedlichen Chargen ist geringer als die Standardabweichung der jeweiligen Messreichen. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass die Komplexierungsreaktion durch die die Simplexmembranbildung abläuft, aufgrund der reproduzierbaren NaCS-Synthese und der gewählten Prozessführung sehr gut kontrollierbar ist. Die konstant hohe Kapselstabilität ermöglicht eine Abschätzung der Verwendbarkeit der produzierten Kapseln für spezielle Einsatzzwecke mit hohen mechanischen Belastungen und minimiert so das Risiko einer mechanischen Beschädigung der Kapseln. Die Kapseln sind ausstreichend stabil für Kultivierung in ruhenden und gerührten Kulturgefäßen, sowie zur intravenösen Injektion und zur Implantation in Gewebe von Mensch und Tier.
Beispiel 5
Einfluss von verkapselten Zellen auf die Kapselstabilität:
Die Kapselherstellung erfolgte wie unter Beispiel 3 beschrieben.
Die Stabilitätsmessung wurde analog zu dem in Beispiel 4 aufgeführten Verfahren durchgeführt. Die Kapseln wurden anfangs mit 300 Zellen/Kapsel beladen. Die Messung erfolgte 14 Tage später.
Tabelle 3
Liegen die suspendierten Zellen an der Oberfläche des vernetzenden Tröpfchens, so werden sie in die Membran während der Vernetzungsreaktion zwischen NaCS und pDADMAC fest eingeschlossen. Die gemessen Kapselstabilitäten verdeutlichen, dass die in NaCS suspendierten Zellen die Stabilität der Kapselmembran nicht negativ beeinflussen. Dies ist eine Grundvoraussetzung für die Immobilisierung von nicht-löslichen Festkörpern wie beispielsweise Geweben, humane und tierische Zellen, Mikroorganismen, Mikropartikeln, Nanopartikeln, immobilisierten Enzymen, Katalysatoren und kristallinen, in Wasser unlöslicher Substanzen.
Beispiel 6
Langzeitstabilität von NaCS Kapseln mit immobilisierten Zellen:
Die Herstellung und Kultivierung der Kapseln erfolgte analog zu dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. Die Stabilitätsmessungen wurden wie unter Beispiel 4 angegeben ausgeführt. Initial wurden 300 Zellen/Kapsel verkapselt und die Kapseln für 60 Tage in DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glukose + 10% Fötalem Kälberserum (Gibco, Glasgow, UK) bei 37°C in Rollflaschen bei 4 U/min kultiviert.
Tabelle 4
Die Messungen der maximalen Spannung innerhalb der Kapselmembran, die kurz vor der Zerstörung der Kapsel auftritt, zeigen, dass die Kapselstabilität über eine Kultivierdauer von 60 Tagen um 18% abfällt, jedoch immer noch ausreichend hoch ist um die Integrität der Kapseln zu bewahren. Die gebildete Symplexmembran ist resistent gegenüber osmotischer, chemischer und physikalischer Beanspruchung, die bei der Kultivierung von immobilisierten Zellen in Zellkulturmedien auftreten. Dies ermöglicht den Einsatz in Medien mit hohen Salzkonzentrationen, wechselnden pH-Werten und unter permanenter mechanischer Belastung.
Beispiel
Herstellung und Reproduzierbarkeit von NaCS-Mikrokapseln mit vorgegebenem Durchmesser
Zur Herstellung von Kapseln mit einem Solldurchmesser von 250 μm wird eine 1,5%ige NaCS Lösung mit 1% NaCl und eine 0,85% pDADMAC Lösung mit 1% NaCl hergestellt. Die pDADMAC Lösung wird auf 30C° temperiert. Es werden 10 ml NaCS in 300 ml einer gerührten, 0,85%igen pDADMAC-Lösung vertropft. Das Konzentrationsverhältnis pDADMAC (g) zu NaCS (g) beträgt 17. Die Reaktionsdauer beträgt 2 min.
Der Spritzenantrieb wurde mit 10 ml Plastikspritzen bestückt. Der Düsendurchmesser beträgt 100 μm. Der Volumenstrom beträgt 1,5 ml/min. Die Amplitude der Düsenschwingung beträgt 100%, die Frequenz wird auf 2000 Hz eingestellt. Die Dispersionsspannung beträgt 1300 V. Die Ergebnisse sind in 1A dargestellt.
Zur Herstellung von Kapseln mit einem Solldurchmesser von 520 μm wird eine 1,8%ige NaCS Lösung mit 1% NaCl und eine 1,0% pDADMAC Lösung mit 1% NaCl hergestellt. Die pDADMAC Lösung wird auf 30C° temperiert. Es werden 20 ml NaCS in 300 ml einer gerührten, 1,0%igen pDADMAC-Lösung vertropft. Das Konzentrationsverhältnis pDADMAC (g) zu NaCS (g) beträgt 11,1. Die Reaktionsdauer beträgt 3 min.
Der Spritzenantrieb wurde mit Plastikspritzen bestückt. Der Düsendurchmesser beträgt 200 μm. Der Volumenstrom beträgt 6,1 ml/min. Die Amplitude der Düsenschwingung beträgt 100%, die Frequenz wird auf 1100 Hz eingestellt. Die Amplitude wird auf den Maximalwert eingestellt. Die Dispersionsspannung beträgt 1100 V. Die Ergebnisse sind in 1B dargestellt.
Zur Herstellung vom NaCS-Mikrokapseln mit einem Solldurchmesser von 7000 μm wird eine 2,8%ige NaCS Lösung mit 1% NaCl und eine 1,5% pDADMAC Lösung mit 1% NaCl hergestellt. Die pDADMAC Lösung wird auf 30C° temperiert. Es werden 15 ml NaCS in 8,5 ml einer gerührten, 1,5%igen pDADMAC-Lösung vertropft. Das Konzentrationsverhältnis pDADMAC (g) zu NaCS (g) beträgt 10,7. Die Reaktionsdauer beträgt 3 min.
Der Spritzenantrieb wurde mit Plastikspritzen bestückt. Der Düsendurchmesser beträgt 250 μm. Der Volumenstrom beträgt 8,5 ml/min. Die Amplitude der Düsenschwingung beträgt 100%, die Frequenz wird auf 700 Hz eingestellt. Die Dispersionsspannung beträgt 1100 V. Die Ergebnisse sind in 1C dargestellt.
Zur Herstellung von Kapseln mit einem Solldurchmesser von 1200 μm wird eine 2%ige NaCS Lösung mit 1% NaCl und eine 2,5% pDADMAC Lösung mit 1% NaCl hergestellt. Die pDADMAC Lösung wird auf 30C° temperiert. Es werden 30 ml NaCS in 300 ml einer gerührten, 2,5%igen pDADMAC-Lösung vertropft. Das Konzentrationsverhältnis pDADMAC (g) zu NaCS (g) beträgt 10,7. Die Reaktionsdauer beträgt 5 min.
Der Spritzenantrieb wurde mit Plastikspritzen bestückt. Der Düsendurchmesser beträgt 300 μm. Der Volumenstrom beträgt 12,9 ml/min. Die Amplitude der Düsenschwingung beträgt 100%, die Frequenz wird auf 600 Hz eingestellt. Die Dispersionsspannung beträgt 1200 V. Die Ergebnisse sind in 1D dargestellt.
Die Kapselgrößen selbst wurden mikroskopisch (Lichtmikroskop „Carl Zeiss Jena M200", Jena, Deutschland) bei 4facher Vergrößerung vermessen. Die Kalibrierung wurde hierbei mit einer Neubauerzählkammer durchgeführt. Zur Auswertung wurde die Software „Zeiss Imaging Vers. 4" (Carl Zeiss Jena, Jena, Deutschland) durchgeführt.
Die übrigen Herstellungsangaben entsprechen dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren.
Die in 1 gezeigten Beispiele verdeutlichen dass monodisperse NaCS-Mikrohohlkapseln mit den unterschiedlichsten mittleren Durchmessern hergestellt werden können, was ein weites Spektrum an Einsatzmöglichkeiten der Kapseln eröffnet. Die Standardabweichungen der Kapseldurchmesser liegen im Mittel bei niedrigen 4%. Dies setzt voraus, dass der aus der Düse Flüssigkeitsstrahl eine konstante Flussrate aufweist, was nur mit sehr homogenen Polymerlösungen erreichbar ist. Von großem Interesse ist die Herstellung von Kapseln mit geringem Durchmesser, da diese eine große spezifische Oberfläche besitzen, die den diffusen Stoffaustausch über die Symplexmembran verbessert. Auch bei geringen mittleren Kapseldurchmessern von 265 μm wird eine Standardabweichung von 4% erreicht (1a), obwohl sich hier schon minimale Volumenänderungen durch inhomogene NaCS-Lösungen negativ auswirken würden. Bei 520 μm Kapseln sind Standardabweichungen von 2% realisierbar (16). Die Monodispersität der produzierten Kapseln ermöglicht eine sehr genaue Dosierbarkeit, der immobilisierten Wirkstoffe, da die Oberfläche der Kapseln genau berechnet werden kann. Die immobilisierten Zellen bewachsen monodisperse Partikel gleichmäßiger. Bei gerührten Kultiviergefäßen garantieren monodisperse Kapseln eine gleichmassige Dispersion und somit eine optimale Wachstumsbedingungen für alle kultivierten Zellen. Eine Applikation von Mikrokapseln mittels Kanülen ist nur mit Kapseln mit geringen Größenstreuungen möglich, da diese die Verstopfungsgefahr minimieren. Größere Düsendurchmesser erlauben die Immobilisierung von kleinen Gewebekulturen bei minimierter Verstopfungsgefahr. Auch hiermit können monodisperse Kapseln hergestellt werden (1C). Die minimal herstellbare Größe der Kapseln ist durch das angewendete Vertropfungsverfahren und nicht durch die verwendete NaCS-Lösung limitiert.
Beispiel 8
Untersuchungen zum Einfluss von NaCS-Kapseln auf das Wachstumsverhalten von Zellen
In einem Zeitverlaufsexperiment wurde das Wachstumsverhalten von HEK293 Zellen verfolgt. Für die Herstellung der NaCS-Kapseln wurden die in einer T75-Flask zu 90% konfluent wachsenden Zellen abtrypsiniert, in DMEM-Medium aufgenommen und bei 200g für 5min pelletiert. Das Pellet wurde in PBS resuspendiert und die Zellkonzentration bestimmt. Die Zellen wurden erneut abzentrifugiert und in einer Zellkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in NaCS-Lösung resuspendiert und in eine Spritze gefüllt. Direkt im Anschluss erfolgte die Vertropfung der Zellsuspension.
Zur Produktion von 600 μm Kapseln wurde eine 2%ige NaCS mit 1% NaCl und eine 1,1% pDADMAC Lösung mit 1% NaCl hergestellt. Die pDADMAC Lösung wurde auf 30C° temperiert. Es wurden 20 ml NaCS in 300 ml einer gerührten, 1,1%igen pDADMAC-Lösung vertropft. Die Reaktionsdauer betrug 3 min.
Der Düsendurchmesser beträgt 200 μm. Der Volumenstrom betrug 6,1 ml/min. Die Amplitude der Düsenschwingung beträgt 100%, die Frequenz wird auf 900 Hz eingestellt. Die Dispersionsspannung betrug 1100 V
Zur Produktion von 1200 μm Kapseln wurde eine 2%ige NaCS Lösung mit 1% NaCl und eine 2,5% pDADMAC Lösung mit 1% NaCl hergestellt. Die pDADMAC Lösung wurde auf 30C° temperiert. Es wurden 30 ml NaCS in 300 ml einer gerührten, 2,5%igen pDADMAC-Lösung vertropft. Die Reaktionsdauer betrug 5 min. Der Düsendurchmesser betrug 300 μm. Der Volumenstrom betrug 12,9 ml/min. Die Amplitude der Düsenschwingung betrug 100%, die Frequenz wurde auf 600 Hz eingestellt. Die Dispersionsspannung betrug 1200 V.
2a zeigt von links oben nach rechts unten qualitativ die Zunahme der Zellzahl innerhalb der Mikrokapseln, wobei Stichproben an den Tagen 1, 2, 3, 7, 14 und 21 nach der Verkapselung entnommen wurden.
Die in 2a gezeigten mikroskopischen Aufnahmen verdeutlichen das gute Zellwachstum von immobilisierten HEK 293 Zellen in NaCS-Kapseln. Die Zellen werden als Einzelzellen immobilisiert und lagern sich zunächst an der Innenseite der Kapselmembran an und wachsen dann die Kapsel nahezu komplett aus. Die Zellen liegen dann in dichten, gewebeartigen Zellverbänden innerhalb der Kapselmembranen.
In 2B wird Wachstumskurve von immobilisierten HEK293 Zellen in 600 μm, bzw. 1200 μm Kapseln gezeigt. Die Graphen verdeutlichen die Zunahme an verkapselten HEK293 Zellen über einen Zeitraum von 36 Tagen. Die Kapseln wurden hierzu in T175-Flasks mit 30 ml NM-Medium kultiviert. Die Lebendzellzahl pro ml NaCS-Lösung wurde mit dem MTT-Test für immobilisierte Zellen bestimmt.
Die in 2b gezeigten Wachstumskurven zeigen nach der Verkapselung zunächst eine logarithmische Wachstumsphase, die über eine ausgedehnte Übergangsphase mit verminderter Wachstumsgeschwindigkeit, in die finale, stationäre Phase übergeht. Es werden selbst in statischer Kultivierung sehr hohe Zelldichten von 5,61 × 10⁷ Zellen pro ml NaCS bei einem Durchmesser von 600 μm und 3,1 × 10⁷ Zellen pro ml NaCS bei einem Durchmesser von 1200 μm erzielt. Die höhere Zelldichte in kleineren Kapseln ist proportional zur vergrößerten spezifischen Austauschfläche, die den diffusen Stofftransport von Gasen und Nährstoffen limitiert (Tabelle 5).
Tabelle 5
Die gemessenen Verdoppelungszeiten in der frühen logarithmischen Wachstumsphase sind mit: t_D _600μm = 73 Stunden und t_D1200μm = 86 Stunden vergleichbar hoch, da zu diesem Zeitpunkt die Diffusion noch nicht limitierend wirkt.
Beispiel 9
Stabilität von NaCS-Kapseln nach Einfrieren und Wiederauftauen
Für die Untersuchungen wurden die in einer T75-Flask zu 90% konfluent wachsenden Zellen abtrypsiniert, in DMEM-Medium aufgenommen und bei 200g für 5min pelletiert. Das Pellet in wurde in PBS resuspendiert und die Zellkonzentration wird bestimmt. Ein Aliquot der Zellsuspension wird pelletiert um eine Zellkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml NaCS zu erreichen. Das gewaschene Pellet wird in der NaCS-Lösung resuspendiert und in eine Spritze gefüllt. Direkt im Anschluss erfolgte die Vertropfung der Zellsuspension.
Für die Herstellung von 600 μm Kapseln wurde eine 2%ige NaCS mit 1% NaCl und eine 1,1% pDADMAC Lösung mit 1% NaCl hergestellt. Die pDADMAC Lösung wurde auf 30C° temperiert. Es wurden 20 ml NaCS in 300 ml einer gerührten, 1,1%igen pDADMAC-Lösung vertropft. Die Reaktionsdauer betrug 3 min.
Der Düsendurchmesser betrug 200 μm. Der Volumenstrom betrug 6,1 ml/min. Die Amplitude der Düsenschwingung betrug 100%, die Frequenz wurde auf 900 Hz eingestellt. Die Dispersionsspannung betrug 1100 V.
Die Kapseln wurden für 21 Tage vor dem Einfrieren in T175-flasks mit 30ml DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glukose + 10% FCS kultiviert.
Das Einfrieren erfolgte in DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glukose + 10% FCS dem zusätzlich 10% DMSO (v/v) zugesetzt wurde. Hierbei wurde nach einer Inkubationsdauer von 2 Std. bei Raumtemperatur die Kapseln in ein Kryoeinfriergerät (MrFrosty, Heraeus, Deutschland) eingebracht und mit einer Einfrierrate von –1°C/min auf –80°C abgekühlt. Die Lagerung der Kapseln erfolgte bei –80C°.
Die Mikroskopische Aufnahme (3) zeigt aufgetaute und anschließend für 24 Stunden in DMEM-Medium kultivierte Kapseln mit immobilisierten Zellen nach Lebendfärbung mit dem MTT-Färbeverfahren. Nach dem Wiederauftauen bleibt die makroskopische Membranstruktur ist vollständig Intakt. Die Kapseln halten auch weiterhin die immobilisierten Zellen zurück. Anhand der schwarz/violetten Farbe (MTT-Vitalfärbung), ist erkennbar, dass die immobilisierten Zellen die Einfrier- und Auftauprozedur, trotz sehr hoher Zelldichte im Innern der Kapsel überleben und wieder kultiviert werden können. Die Kapselmembran erscheint durcheinend hell. Dies ermöglicht, dass man Kapseln mit hohen Konzentrationen an immobilisierten, humanen Zellen großtechnisch produzieren, aliquotieren und anschließend kostengünstig kryokonservieren kann.

Claims

Verfahren zur Herstellung von regioselektiv substituiertem Cellulosesulfat gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: a) Vorquellen von nativer Cellulose in einem polaren aprotischen Lösungsmittel; b) Zugabe des Sulfatierungsreagenzes und des Acetylierungsreagenzes, zur gleichzeitigen Mischveresterung und Verteilung der Acetat- und Sulfatgruppen entlang und zwischen den Polymerketten; c) direkt anschließende, vollständige Neutralisation mit Lauge, vorzugsweise NaOH, wobei das Sulfat ohne Abspaltung der Acetylgruppe in ein Natriumsalz (NaCS) überführt wird, und wobei das Abspalten von Acetatgruppen und damit auch der Abbau der Celluloseketten vermieden wird; und d) anschließendes Deacetylieren, Waschen und Trocknen der NaCS, wobei das NaCS durch eine Lösungsviskosität von größer 10 mPas bei gegebener Konzentration von 1% in Wasser charakterisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Neutralisation gleichzeitig mit der Fällung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass der Lösungsviskositätsbereich des erzeugten NaCS zwischen 10 und 500 mPas, insbesondere 15 bis 400 mPas, weiter insbesondere 20 bis 300 mPas, weiter insbesondere 15 bis 100 mPas, weiter insbesondere 20 bis 50 mPas, gemessen an einer 1%-igen Lösung in Wasser, einstellbar ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass die native Cellulose in einem polaren Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-Dimethylacetamid (DMAc), N-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylsulfoxid (DMSO) und N,N-Dimethylformamid (DMF) vorgequollen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die vorgequollene Cellulose mit einem Sulfatierungsreagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schwefelsäure, Amidoschwefelsäure, Schwefeltrioxid, Sulfurylchlorid und Chlorsulfonsäure sulfatiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die vorgequollene Cellulose mit Acetylchlorid oder Essigsäureanhydrid acetyliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass die Vorquellung bei Temperaturen von Raumtemperatur bis zu 150°C, insbesondere 20 bis 100°C, insbesondere 40 bis 60°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass die Acetylierung und Sulfatierung bei Temperaturen von Raumtemperatur bis 110°C, insbesondere 20 bis 80°C, insbesondere 30 bis 70°C, insbesondere 40 bis 65°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass alle Ausgangsmaterialien im Wesentlichen frei von Schwermetallen wie Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn oder Cu sind, und der Eisengehalt des erzeugten NaCS ≤ 20ppm ist sowie der Gesamtschwermetallgehalt ohne Eisen des erzeugten NaCS ≤ 10ppm ist.
Natriumcellulosesulfat (NaCS) erhältlich durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass der Lösungsviskositätsbereich des erzeugten NaCS zwischen 10 und 500 mPas, insbesondere 15 bis 400 mPas, weiter insbesondere 20 bis 300 mPas, weiter insbesondere 15 bis 100 mPas, weiter insbesondere 20 bis 50 mPas gemessen an einer 1%-igen Lösung in Wasser einstellbar ist.
Natriumcellulosesulfat (NaCS) gemäß Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass das erzeugte NaCS frei von Schwermetallen wie Cd, Pb, Hg, Fe, Ni, Ti, Mn, Zn oder Cu ist, der Eisengehalt des erzeugten NaCS ≤ 20ppm ist und der Gesamtschwermetallgehalt ohne Eisen des erzeugten NaCS ≤ 10ppm ist.
Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: a) Herstellung einer 0,5 bis 10%igen wässrigen Lösung aus der NaCS gemäß der Ansprüche 10 oder 11; b) Herstellung der NaCS-Verkapselungssuspension durch Zugabe der zu verkaspelnden Materialien zu der wässrigen NaCS-Lösung und optional die Zugabe von weiteren Trägermaterialien, Additive, Lösungs- oder Konservierungsmitteln, Salzen, Glycerin oder DMSO; c) Vertropfung; und d) Komplexierung der Kapseln im Polymerisationsbad.
Verfahren nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass die zu verkapselnden Materialien biologischen Ursprunges, insbesondere native oder veränderte Zellen von Mensch oder Tier, native oder veränderte Bakterien, native oder veränderte Viren, nativer oder veränderter Hefen, isolierte Proteine oder Proteingemische, Antikörper oder Antikörperbestandteile, und/oder Nukleinsäuremoleküle sind.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13 dadurch gekennzeichnet, dass die Vertropfung mit dem Vibrations-Verfahren und in einem Frequenzbereich von 100 bis 4000 Hz durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexierung in einem Polymerisationsbad durchgeführt wird, wobei ein polymeres Kation aus der Gruppe bestehend aus Dodecylamin, Ethylendiamin, Piperazin, Methylenblau, Arginin, Triethyltetramin, Spermin, Polydimethylallylammonium (pDADMAC) und Polyvinylbenzyltrimethylammonium oder einer Mischung derselben ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexierung in einem Polymerisationsbad mit Polydimethylallylammonium (pDADMAC) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10.000 bis 500.000 durchgeführt wird.
Verwendung der NaCS gemäß der Ansprüche 10 oder 11 zur Mikroverkapselung von biologischen Materialien.
Verwendung der NaCS gemäß der Ansprüche 10 oder 11 in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16.
Mikrokapseln aus NaCS gemäß der Ansprüche 10 oder 11.
Mikrokapseln aus NaCS hergestellt in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16.
Mikrokapseln aus NaCS gemäß der Ansprüche 19 oder 20 dadurch gekennzeichnet, dass sie eine homogene Größenverteilung mit einem mittleren Durchmesser von 0,1-50 μm, 1-100 μm, 50-250 μm, 50-500 μm, 100-250 μm, 100-500 μm, 250-500 μm, 250-700 μm, 200-1500 μm, 500-1000 μm, 600-800 μm, 700-1500 μm, 1000-2500 μm, 1500-3000 μm, 2500-4000 μm oder 3000-5000 μm haben.
Verwendung der Mikrokapseln aus NaCS nach einem der Ansprüche 19 bis 21 als Arzneimittel.
Verwendung der Mikrokapseln aus NaCS nach einem der Ansprüche 19 bis 21 zur Implantation und/oder Injektion.