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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Mikroarrays
und insbesondere die Verbesserung von cDNA Mikroarrays durch den
Einsatz von Zufallsspacern bzw. Zufallsabstandhaltern bzw. wahlfreien
Spacern (random spacer) einer Länge
von mindestens 50 bis 80 Nukleotiden. Ein erfindungsgemäßer cDNA
Mikroarray kann beispielsweise in Gebieten wie der Bestimmung der
Genexpression, DNA Sequenzierung, Fingerprinting oder Kartierung
eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin
ein Verfahren zur Herstellung des cDNA Mikroarrays, den Einsatz
von Spacermolekülen
mit Zufallssequenz und einen Kit.
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Stand der
Technik
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Nukleinsäuresequenzen
können
prinzipiell durch den Einsatz von entweder der Gelelektrophorese
eines DNA Fragments (beispielsweise von Restriktionsfragmenten) – dem so
genannten Southernblot, Hybridisierungsereignissen, und dem unmittelbaren
Sequenzieren der DNA (beispielsweise mit dem Verfahren nach Maxam-Gilbert)
analysiert werden. Alle der vorstehend aufgeführten Verfahren sind in den
biologischen Wissenschaften, der Medizin und dem Agrarwesen weit
verbreitet. Die Nachteile der drei Verfahren liegen darin, dass
Southernblots und Hybridisierungsversuche schnell durchgeführt werden
können,
sie allerdings nur für
die Analyse kurzer DNA Stränge
eingesetzt werden können.
Die DNA Sequenzierung führt
zu der genauen Bestimmung bzw. Nachweis der Nukleinsäuresequenzen,
ist allerdings zeitaufwendig, kostspielig und mit gewissem Aufwand
verbunden, wenn sie auf größere Projekte, beispielsweise
der Sequenzierung eines gesamten Genoms, angewandt wird. Im Gegensatz
dazu hat die Mikroarray Technologie bereits gezeigt, dass sie einige
der vorstehend genannten Vorteile zusammenführt und ist inzwischen ein
gut etabliertes Verfahren, falls Versuche kostengünstig, zuverlässig und mit
einem hohen Durchsatz durchgeführt
werden müssen.
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Die
Mikroarrays, die in manchen Fällen
auch als Hybridisierungsarrays, Genarrays oder Genchips bezeichnet
werden, umfassen in Kürze
einen Carrier oder Träger
auf dem in bestimmten Stellen unter einer möglichsten hohen Dichte Fänger-Moleküle unmittelbar
oder über
ein geeignetes Spacer-Molekül angebracht
sind. Die Spacer-Moleküle
können
in der Funktion als "Brücke" zwischen dem Fänger-Molekül und der
Oberfläche
des Trägers
betrachtet werden, um ein einfacheres Anbringen der Fänger-Moleküle zu ermöglichen.
Die Fänger-Moleküle bestehen
aus vergleichsweise kurzen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere
DNA, die an die Zielmoleküle
oder Sondenmoleküle,
die analysiert werden sollen, spezifisch hybridisieren können, was
für gewöhnlich zu DNA:DNA
oder DNA:RNA Hybriden führt.
Das Auftreten des Hybridisierungsereignisses wird anschließend mit
beispielsweise fluoreszierenden Farbstoffen bestimmt und analysiert.
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Die
Vorteile des Mikroarray-Konzepts liegen hauptsächlich in seiner Befähigung sehr
viele hybridiserungsbasierende Analysen gleichzeitig durchzuführen. Als
Beispiel für
Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays dient Maniatis et al.,
Molecular Cloning – A
Laboratory Manual, First Edition, Cold Spring Harbor, 1982.
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Es
hat sich erwiesen, dass das Hybridisierungsereignis selbst charakteristisch
und entscheiden für
das Mikroarrayverfahren ist, da die gewählten Hybridisierungsbedingungen
und die Stringenz der Reaktionsbedingungen eine großen Einfluss
auf das Ergebnis ausüben.
Daher wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, um eine verbesserte Auslegung
bzw. Ausführung
der Mikroarrays zu erhalten.
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In
diesem Zusammenhang ist es dem Fachmann gut bekannt, dass durch
die Verwendung von Spacer ein gewisser Abstand zwischen den Fänger-Molekülen und
der Oberfläche
des Trägermaterials
erzeugt werden kann. Dies erleichtert wiederum die Hybridisierung
der Sonden an die Fänger-Moleküle, da sie
leichter zugänglich
sind und die Hybridisierung über
die Gesamtlänge
der angebrachten Nukleinsäure
ermöglichen.
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Chemische
Modifikationen des Trägers durch
das Anbringen von geeigneten Spacern stellt daher einen der wichtigsten
Gesichtspunkte der Herstellung von Mikroarrays und für die Implementierung in
anderen beispielsweise Biosensor und Nanotechnologie basierenden
Verfahren dar. Trotz der Tatsache der Entwicklung von zahlreichen
Verfahren zur Einführung
von spezifischen chemischen oder physikalischen Änderungen der interessante
festen Oberfläche,
besteht eine fortdauernde Suche nach neuen synthetischen Ansätzen, die
eine größere synthetische
Flexibilität
anbieten, den Aufbau neuer molekularer Strukturen ermöglichen,
um neue Moleküle
an der interessanten festen Oberfläche anzubringen, und/oder eine
Verbesserung der Anzahl/Ausbeute von sowohl an der Oberfläche des
Trägers
als auch an den Fänger-Molekülen angebrachten
Spacern.
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Daher
wurden in zahlreichen wissenschaftlichen Gebieten Anstrengungen
in erster Linie mit dem Ziel unternommen Spacer mit verbesserten
Eigenschaften zu erhalten, die wiederum für die Herstellung von Mikroarrays
verwendet werden können.
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Die
WO 03070982 beschreibt die Verbindung von Biomolekülen in Sätzen von
zwei oder mehr mit vorbestimmter dreidimensionaler Ausrichtung und
Beabstandung zwischen den zwei oder mehr Biomolekülen. Das
Verbindungsverfahren wird bei der Auslegung von neuen, hoch spezifischen
Vehikeln zur Arzeimittelgabe eingesetzt, beispielsweise bei der
Gentherapie, und bei der Auslegung und Durchführung von Assays zur Studie
biomolekulare Wechselwirkungen, wie beispielsweise Rezeptor-Ligand
Wechselwirkungsstudien.
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Die
US 6,818,376 betrifft den
sauren Abbau der Vernetzungseinheit eines Fotolackpolymers, dass
zu einem verbesserten Musterprofil, erhöhter Klebefähigkeit, hervorragender Auflösung, Sensitivität, Beständigkeit
und Wiederholbarkeit führt.
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In
der
US 6,773,888 wird
der Einsatz von photoaktivierbaren Silanverbindungen für die Herstellung
von Spacern beschrieben. Die Verbindungen weisen die allgemeine
Formel PG-LS-SN
auf, worin PG eine photoaktivierbare Gruppe, LS eine Verbindungs-
und Spacer Gruppe und SN eine Silangruppe darstellt. Die Silane
ermöglichen
den photoaktivierbaren Silanverbindungen an die Oberfläche eines Substrats,
wie beispielsweise Silica, kovalent gebunden zu werden. Ein Verbinder
und Spacer verbindet das Silan mit der photoaktivierbaren Gruppe.
Die photoaktivierbare Gruppe bildet eine hydrophobe Schicht, die
mit einer Schicht von hydrophilen funktionellen Polymeren photochemisch
vernetzt werden kann.
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Die
US Anmeldung 2005004356 beschreibt ein Verbinder-Nukleosid, seine
Herstellung und Einsatz für
das kovalente Binden von Biomolekülen an Oligonukleotide.
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Diese
im Stand der Technik beschriebenen Verbesserungen ermöglichen
in erster Linie das einfachere Anbringen des Spacers auf den Träger und eine
verbesserte Bindung. Derartige Technologien und Verfahren setzen
im Allgemeinen Spacer mit der gleichen Sequenz ein.
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Es
besteht immer noch ein Bedarf bei der Verbesserung der Zugängigkeit
der Sondenmoleküle für die Fänger-Moleküle. Es ist
ebenso wünschenswert
das Anbringen der Fänger-Moleküle an die Spacer
zu fördern,
um eine bessere und einfachere Hybridisierung der jeweiligen Sondenmoleküle darauf
zu erhalten.
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Aufgabe der
Erfindung
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Die
vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, dass durch die Bereitstellung
des vorliegenden Mikroarrays mit Spacern, die eine Zufallssequenz
bzw. zufällige
Sequenz und eine jeweilige Länge
von mindesten 50 bis 80 Monomeren aufweisen, wobei die Spacer durch
eines ihrer jeweiligen Enden auf die Oberfläche des Träger angebracht sind, das jeweilige
andere Ende für
das Fängermolekül einfacher
zugänglich
ist und ein einfaches Anbringen der Spacer-Moleküle während der Herstellung des Mikroarrays
ermöglicht.
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Ein
anderer Vorteil des erfindungsgemäßen Mikroarrays besteht darin,
dass die zufälligen
Sequenzen der Spacer-Moleküle
zu einer verbesserten Bewegung der jeweiligen Enden und der daran
angebrachten Fänger-Molekülen beitragen,
was wiederum die Hybridisierung durch die jeweiligen Sondenmoleküle erleichtert.
Es wird angenommen, dass die Gesamtlänge eines Fängermoleküls daher für das jeweilige (entsprechende)
Sondenmolekül
einfacher zugänglich
ist.
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Definitionen
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Der
Begriff Mikroarray, wie hierin verwendet, betrifft einen Carrier
beziehungsweise Träger,
der vorzugsweise fest ist und mehrere Moleküle an bestimmten Stellen seiner
Oberfläche
gebunden aufweist. Der Mikroarray besteht vorzugsweise aus Spacer-Molekülen, die
auf speziell, örtlich
begrenzten Gebieten auf der Oberfläche des Trägers vorliegen. Die Spacer- Moleküle sind
mit ihrem zweiten Ende an jeweilige Fänger-Moleküle angebracht. In dem vorstehenden
Zusammenhang ist ein örtlich
begrenztes Gebiet das Gebiet auf der Oberfläche des Trägers, das Fänger-Moleküle enthält, die durch Spacer auf die
Oberfläche
des Trägers
angebracht sind, wobei die Fängermoleküle für ein bestimmtes Ziel-/Sondenmolekül spezifisch
sind. Das örtlich
begrenzte Gebiet ist entweder durch die Auslegung des Mikroarrays
bekannt oder wird während
oder nach dem Nachweis festgelegt und führt zu einem speziellen Muster.
Eine Stelle (spot) ist ein Gebiet wo spezielle Zielmoleküle auf ihren
Fänger-Molekülen befestigt
sind und durch einen Detektor bestätigt werden.
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Wie
hierin verwendet betrifft der Ausdruck Träger irgendein Material, dass
eine feste oder halbfeste Struktur und eine Oberfläche zum
Anbringen von irgendeinem(welchen) Molekül(en) bereitstellt. Derartige
Materialien sind vorzugsweise fest und beinhalten beispielsweise
Metall, Glas, Kunststoff, Silicon und Keramik genau so wie strukturierte
und poröse
Materialien. Sie können
ebenso weiche Materialien wie beispielsweise Gele, Gummi, Polymere
und andere nicht-feste
Materialien beinhalten. Bevorzugte feste Träger sind Nylonmembranen, Epoxidglas und
Borfluoratglas. Feste Träger
müssen
nicht flach sein und können
irgendeinen Formtyp, einschließlich einer
Kugelform (beispielsweise Kügelchen
oder Microspheres) beinhalten. Vorzugsweise weisen feste Träger eine
flache Oberfläche
wie beispielsweise bei Objektträgern
(wie bei Objektträgern)
und Mikrotiterplatten auf, wobei eine Mikrotiterplatte ein geschüsselter
(dished) Behälter
mit mindestens zwei Vertiefungen darstellt.
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Die
Begriffe Kügelchen,
Teilchen und Mikrosphere betreffen kleine feste Träger, die
sich in einer Lösung
bewegen können
(d.h. sie weisen Abmessungen auf, die kleiner als jene der Kapselung
ist in der sie sich befinden). Die Kügelchen können eine vollständige oder
teilweise kugelförmige
oder zylindrische Form aufweisen, auch wenn sie nicht auf irgendeine
bestimmte dreidimensionale Form begrenzt sind.
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Der
Ausdruck angebracht beschreibt eine nicht-zufällige chemische oder physikalische
Wechselwirkung durch die eine Verbindung zwischen zwei Molekülen erhalten
wird. Das Anbringen kann durch eine kovalente Bindung erzielt werden.
Das Anbringen muss allerdings nicht kovalent oder permanent sein.
Andere Arten des Anbringens beinhalten beispielsweise die Bildung
von metallorganischen oder ionischen Bindungen, ein Binden basierend
auf van der Waal's
Kräften,
oder irgendeiner Art von Enzym Substrat Wechselwirkungen oder der
so genannten Affinitätsbindung.
Ein Anbringen an die Oberfläche eines
Trägers
kann ebenso als Immobilisierung bezeichnet werden.
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Bei
Spacern handelt es sich um Moleküle, die
dadurch charakterisiert sind, dass sie ein erstes an das biologische
Material angebrachtes Ende und ein zweites an den festen Träger angebrachtes
Ende aufweisen. Daher trennt das Spacer-Molekül den festen Träger und
das biologische Material, ist allerdings mit beiden verbunden. Die
Spacer können
unmittelbar oder vorzugsweise als ganzes auf den festen Träger an spezifischen
Stellen angebracht synthetisiert werden, wobei Masken bei jedem
Verfahrensschritt eingesetzt werden können. Die Synthese umfasst
die Addition eines neuen Nukleotids an eine sich verlängernde
Nukleinsäure,
um eine gewünschte
Sequenz an einer gewünschten
Stelle durch beispielsweise photolitographische Verfahren zu erhalten,
die dem Fachmann gut bekannt sind. Ein Binden innerhalb des Spacers
beinhaltet Kohlenstoff-Kohlenstoff Einfachbindungen, Kohlenstoff-Kohlenstoff
Doppelbindungen, Kohlenstoff-Stickstoff Einfachbindungen oder Kohlenstoff-Sauerstoff
Einfachbindungen.
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Der
Spacer weist vorzugsweise eine Länge von
mindestens 50 Monomeren und mehr bevorzugt von 50–80 Monomeren
auf. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Spacer
beinhalten vorzugsweise Nukleotide, die Adenin, Cytosin, Guanin
und Thymin als Basen und Desoxyribose als strukturelles Element
enthalten. Eine Nukleotid kann weiterhin allerdings ebenso irgendeine
künstliche dem
Stand der Technik bekannte Base umfassen, die unter Verwendung von
mindestens einer der vorstehend genannten Basen zur Basenpaarung
geeignet ist (beispielsweise Inosin). Weiterhin im Begriff Nukleotid
enthalten sind Derivate der vorstehend angemerkten Verbindungen,
insbesondere Derivate mit Farbstoffen aus fluoreszierenden Markern.
Der hierin verwendete Begriff zufällig betrifft die Sequenz des Spacer-Moleküls, insofern
die Abfolge der jeweiligen Nukleotide/Monomere, die das Spacer-Molekül bilden,
vor einem Sequenzieren der jeweiligen Spacer-Moleküle unbekannt
ist.
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Der
Spacer kann ebenso aus Nukleinsäure-Analogen
(beispielsweise durch Ersetzen der einzelnen Nukleotide mit künstlichen
Nukleotiden wie Inosin) bestehen. Der Spacerbereich besteht vorzugsweise
aus einer zufälligen
Sequenz von Basen. Der Spacer kann allerdings ebenso aus einer Sequenz
pseudo-zufälliger
oder nicht-zufälliger
Basen bestehen.
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Der
Spacer kann ebenso gestaltet sein, um vom Templat unabhängiges Rauschen
zu minimieren, das das Ergebnis eines (in der Abwesenheit) von dem
Templat unabhängigen
Signalnachweises darstellt.
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Der
Spacer weist weiterhin geeignete reaktive Gruppen, vorzugsweise
an jedem Ende zum Anbringen an den festen Träger, jeweils an ein Fänger- und
Sonden-Molekül,
auf. Derartige reaktive Gruppen können beispielsweise Hydroxy-,
Thiol-, Aldehyd-, Amid- und Thioamid-Gruppen umfassen. Die Spacer können zusätzlich Seitenketten
oder andere Substitutionen aufweisen. Die aktive Gruppe kann mit
geeigneten Mitteln zur Reaktion gebracht werden, um beispielsweise
eine kovalente Bindung zwischen dem Spacer und dem festen Träger, Fänger- oder Sonden-Molekül, zu bilden.
Geeignet Mittel umfassen beispielsweise Licht. Die reaktive Gruppe kann
optional anfänglich
durch Schutzgruppen maskiert/geschützt sein. Unter einer breiten
Vielfalt von nützlichen
Schutzgruppen sind beispielsweise FMOC, BOC, t-Butylester und t-Butylether.
Die reaktive Gruppe wird zum Aufbau, zum spezifischen Anbringen
daran (nach dem Abspalten der Schutzgruppe) an ein anderes Molekül eingesetzt.
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Ein
Polynukleotid oder Oligonukleotid ist als ein Molekül festgelegt,
dass zwei oder mehr Desoxyribonukleotide, vorzugsweise mindesten
10 bis 100 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens etwa 20 bis 80
Nukleotide und am meisten bevorzugt mindestens etwa 20 bis 40 Nukleotide,
umfasst. Die genaue Größe wird
von mehreren Faktoren abhängen,
die wiederum von der letztendlichen Funktion oder Verwendungszweck
der Oligonukleotide abhängen.
Das Oligonukleotid kann auf irgendeine, dem Fachmann bekannte Art,
einschließlich
chemischer Synthese, DNA Replikation, reverse Transkription, PCR
oder einer Kombination davon, hergestellt werden.
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Die
Begriffe komplementär
oder Komplementarität
werden hinsichtlich Polynukleotide (d.h. einer Nukleotidsequenz,
wie von einem Oligonukleotid oder einer Ziel-Nukleinsäure) angesichts
der Regeln zur Basenpaarung verwendet. Eine Komplementarität kann teilweise
vorliegen, bei der nur einige Basen der Nukleinsäuren gemäß den Regeln zur Basenpaarung
passend sind. Alternativ dazu kann eine vollständige Komplementarität derart
zwischen den Nukleinsäuren
vorliegen, dass es keine Fehlanpassung gibt. Der Grad an Komplementarität zwischen Nukleinsäure-Strängen hat
bedeutende Auswirkungen auf die Stringenz und Stärke der Hybridisierung zwischen
zwei verschiedenen Nukleinsäure-Strängen. Dies
ist bei Mikroarrays als Nachweisverfahren von besonderer Wichtigkeit,
die von einer Bindung zwischen Nukleinsäuren abhängen. Komplementarität, wie hierin
verwendet, ist nicht auf die überwiegend
natürliche
Basenpaarung beschränkt.
Der Begriff umfasst ebenso vielmehr modifizierte und nicht-natürliche Basen
einschließlich
deren, aber nicht darauf beschränkt,
die eine Paarung mit modifizierten oder alternativen Mustern von
Wasserstoff aufweisen. Hinsichtlich einer Komplementarität, ist eine
Bestimmung für
manche Anwendungen von Bedeutung, ob die Hybridisierung eine vollständige oder teilweise
Komplementarität
darstellt. Falls es beispielsweise erwünscht ist, die Anwesenheit
oder Abwesenheit einer bestimmten DNA (wie beispielsweise von einem
Virus, Bakterium, Pilzen oder Protozoen) zu bestimmen, ist die einzig
wichtige Bedingung, dass das Hybridisierungsverfahren eine Hybridisierung
gewährleistet,
sofern die relevante Sequenz vorliegt. Andere Anwendungen dagegen
können
es erfordern, dass das Hybridisierungsverfahren zwischen einer teilweisen
und vollständigen
Komplementarität,
beispielsweise bei der Bestimmung von genetischen Polymorphismen,
unterscheidet.
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Der
Begriff Homologie und homolog betreffen einen Grad an Identität. Eine
teilweise oder vollständige
Homologie können
vorliegen. Eine teilweise homologe Sequenz ist eine solche, die
weniger als 100% zu einer anderen Sequenz identisch ist.
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Hybridisierung
wird hinsichtlich der Paarung von komplementären Nukleinsäuren verwendet.
Eine Hybridisierung und die Stärke
der Hybridisierung (d.h. die Stärke
der Verbindung zwischen den Nukleinsäuren) wird durch solche Faktoren
wie dem Grad an Komplementarität
zwischen den Nukleinsäuren, der
Stringenz der beteiligten Bedingungen und der Schmelztemperatur
des gebildeten Hybrids beeinflusst. Eine Hybridisierung bezieht
das Annealing bzw. Anlagern einer Nukleinsäure an eine andere komplementäre Nukleinsäure, d.h. einer
Nukleinsäure
mit einer komplementären
Nukleotidsequenz, ein.
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Stringenz
betrifft die Bedingungen, die in ein korrektes Hybridisierungsereignis,
wie beispielsweise Temperatur, Ionenstärke, pH und ein Vorliegen anderer
Verbindungen, einbezogen, bei denen Nukleinsäure Hybridisierungen durchgeführt werden.
Unter Bedingungen hoher Stringenz wird sich eine Nukleinsäure-Basenpaarung
ausschließlich
zwischen Nukleinsäurefragmenten
ereignen, die eine hohe Häufigkeit
an komplementären
Basensequenzen aufweisen. Daher werden Bedingungen von schwacher oder
niedriger Stringenz häufig
benötigt,
falls es erwünscht
ist, dass die Nukleinsäuren,
die nicht vollständig
zueinander komplementär
sind, hybridisiert oder aneinander angelagert werden.
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Ein
Marker oder Label betrifft irgendein Atom oder Molekül, das zur
Bereitstellung einer nachweisbaren (vorzugsweise quantifizierbaren)
Auswirkung eingesetzt werden kann und das an eine Nukleinsäure angebracht
werden kann. Marker können
jedoch Farbstoffe; radiaktive Label; Binde-Reste wie Biotin; Haptene
wie Digoxgenin; lumineszierende, phosphoreszierende oder fluoreszierende
Reste und fluoreszierende Reste allein oder in Kombination mit Resten beinhalten,
die Emissionsspektren durch die Energieübertragung der Fluoreszenz
unterdrücken
oder verschieben. Marker können
Signale bereitstellen, die beispielsweise durch Fluoreszenz, Radioaktivität, Colorimetrie,
Gravimetrie, Röntgen-Beugung
oder Absorption, Magnetismus und enzymatischer Aktivität nachgewiesen
werden können.
Ein Marker kann ein geladener Rest (mit positiver oder negativer
Ladung) sein oder kann ebenso eine neutrale Ladung aufweisen. Sie
können
eine Nukleinsäure
oder Proteinsequenz beinhalten oder daraus bestehen. Bevorzugte
Marker sind fluoreszierende Marker.
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Ein
Ziel- oder Sondenmolekül
betrifft ein nachzuweisendes Nukleinsäure-Molekül. Ziel-Nukleinsäuren können eine Sequenz enthalten,
die zumindest eine teilweise Komplementarität mit zumindest einem Sonden-Oligonukleotid
aufweist. Die Ziel-Nukleinsäure
kann einzel- oder doppelsträngige
DNA oder RNA umfassen.
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Sonden
oder Sondenmoleküle
betreffen Nukleinsäuren,
die mit einer Ziel-Nukleinsäure
wechselwirken/hybridisieren, um einen Nachweis-Komplex zu bilden.
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Der
Ausdruck Signalsonde oder Sonde betrifft ein Sondenmolekül, das einen
nachweisbaren Rest, wie bereits vorstehend ausgeführt, enthält.
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Wie
hierein verwendet betrifft der Ausdruck Quencher ein Molekül oder Material,
das ein nachweisbares Signal eines nachweisbaren Restes unterdrückt oder
verringert, falls sich der Quencher sich in physikalischer bzw.
körperlicher
Nähe des
nachweisbaren Rests befindet. Beispielsweise sind Quencher in einigen
Ausführungsformen
Moleküle,
die den Betrag eines nachweisbaren Signals von einem einen fluoreszierenden
Label enthaltenden Oligonukleotid unterdrücken, falls sich der Quencher
dem fluoreszierenden Label physikalisch Nahe befindet. Ein Quenchen
betrifft irgendein Verfahren, das die Lebensdauer des angeregten
Zustands des fluoreszierenden Chromophors verringert. Einige der
Verfahren, die zu einer Verringerung einer Lebensdauer beitragen,
sind Zusammenstoß-bedingtes
und statisches Quenchen und Energübertragung, wohingegen eine
Lichtstreuung den Anschein eines Quenchen aufweisen kann (Verlust
eines fluoreszierenden Signals).
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Der
Ausdruck Probe wird in seiner breitesten Bedeutung verwendet. Einerseits
beabsichtigt er eine Probe bzw. Prüfling oder Kultur (beispielsweise mikrobiologische
Kulturen) und andererseits sowohl biologische als auch Umwelt-Proben
zu enthalten. Eine Probe kann sogr eine Probe synthetischen Ursprungs
enthalten. Biologische Proben können
tierische, einschließlich
menschlicher, flüssige,
feste Gewebe, alternativ Lebensmittel- oder Futter-Erzeugnisse wie
Molkerei-Artikel, Gemüse,
Fleisch und Fleisch-Nebenprodukte sein. Umweltproben beinhalten
Umweltmaterial wie Oberflächensubstanz,
Boden, Wasser, industrielle Proben und Abfall, genauso wie Proben,
die von Nahrungsmittel und Molkerei verarbeitenden Werkzeugen, Geräten, Ausrüstung, Utensilien,
Einweg- oder nicht Einwegartikel erhalten wurden.
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Ein
Polymerisierungsagens betrifft irgendein Agens, das die Addition
von Nukleosidtriphosphaten an ein Oligonukleotid erleichtern kann.
Bevorzugt betrifft eine Polymerisierung jeweilige Polymerasen zu umfassen,
die Nukleinsäuren
ligieren können.
Der Begriff Ligation betrifft die Bildung einer Phosphodiester-Bindung
zwischen einem 3'-OH
und 5'-P, die sich
an den Enden zweier Stränge
einer Nukleinsäure
befinden.
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Der
Begriff Polyol betrifft einen Polyhydroxy-Alkohol. Bei den Polyolen
handelt es sich um organische Moleküle, die aus einem Kohlenstoff-Rückrat und
einigen Sauerstoffgruppen, die ausschließlich Alkoholgruppen sind,
hergestellt sind und beispielsweise Mannitol und Sorbitol beinhalten.
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Der
Begriff Kit bezieht sich, wie hierin verwendet, auf irgendein Liefer-System
zur Lieferung von Materialien. Hinsichtlich von Reaktionsassays, beinhalten
solche Liefersysteme Systeme, die die Lagerung, Transport oder Lieferung
von Reaktions-Reagenzien (beispielsweise Oligonukleotiden, Enzymen,
etc. in geeigneten Behältern)
und/oder unterstützenden
Materialen (beispielsweise Puffern, geschriebenen Anweisungen zur
Durchführung
des Assays etc.) von einem Ort zu einem anderen ermöglichen.
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Genaue Beschreibung
der vorliegenden Erfindung
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Gemäß einer
ersten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein cDNA Mikroarray bereitgestellt,
der einen Träger
oder Carrier umfasst. Auf der Oberfläche des Trägers befinden sich Spacer-Moleküle mit einer
Zufallsequenz, die mit ihren jeweiligen ersten Enden auf bestimmten
Stellen in Form eines Musters angebracht sind. Das Muster erleichtert
die nachfolgende Analyse der Ergebnisse derart, dass jede Stelle
(spot) auf dem Mikroarray zu einem spezifischen Hybridisierungsereignis
einfach zugeordnet werden kann. Die Spacer-Moleküle weisen eine Länge im Bereich
von mindestens 50 bis 80 Nukleotiden auf, was zu einer höheren Beweglichkeit der
jeweiligen zweiten Enden führt.
Als ein Ergebnis von beidem, der langen Spacer-Moleküle und ihrer Zufallssequenz,
sind die Wechselwirkungen zwischen den Fänger- Molekülen und ihren Angrenzenden
bzw. Benachbarten verringert. Diese Abnahme an sterischer Hinderung
erlaubt wiederum eine einfachere Hybridisierung der Sondenmoleküle an die
jeweiligen Fänger-Moleküle.
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Der
Träger
des erfindungsgemäßen cDNA Mikroarray
ist vorzugsweise fest und besteht aus Glas, Metall oder Kunststoff.
Der Träger
des festen Trägers
kann ebenso chemisch modifiziert oder behandelt sein, um das Anbringen
der Spacer-Moleküle zu
erleichtern. Vorzugsweise sind ebenso mindestens 1 Quadratzentimeter
der Oberfläche
des Trägers
zum Anbringen von Sparer-Molekülen zugänglich.
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Der
Mikroarray weist vorzugsweise mindestens 100 Spacer-Moleküle pro Quadratzentimeter des
festen Träger
angebracht auf. Diese Dichte kann allerdings höher sein und an den jeweiligen
Verwendungszweck des Mikroarrays angepasst werden. Beispielsweise
beträgt
die Dichte der pro Quadratzentimeter festen Trägers angebrachten Nukleinsäuren mehr
bevorzugt mindestens 1.000, immer noch mehr bevorzugt mindestens
5.000 und am meisten bevorzugt mindestens 10.000 Nukleotide pro
Quadratzentimeter.
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Die
Spacer-Moleküle
des erfindungsgemäßen cDNA
Mikroarray können
auf der Oberfläche
des Trägers
Monomer um Monomer unter Verwendung von beispielsweise einer Ligationsreaktion
synthetisiert werden, um die jeweiligen Monomere zu verbinden, und
sind vorzugsweise mittels bestimmter reaktiven Gruppen auf der Oberfläche des
Träger
angebracht/immobilisiert. Diese reaktiven Gruppen sind ausgewählt von
Hydroxy-, Thiol-, Aldehyd-, Amid- und Thioamid-Gruppen und ermöglichen
ein einfaches Anbringen.
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Um
den erfindungsgemäßen cDNA
Mikroarray aufzubauen bzw. zu errichten werden die jeweiligen reaktiven
Gruppen vorzugsweise mit Schutzgruppen, die FMOC, BOC, t-Butylester
und t-Butylether umfassen, geschützt.
Die Schutzgruppen können
von einem Ende des Spacer-Moleküls abgespalten
werden, um ein spezifisches Anbringen des Endes an entweder die
Oberfläche
des Trägers
oder an ein Fänger-Molekül zu ermöglichen.
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Das
Fänger-Molekül des erfindungsgemäßen cDNA
Mikroarray ist vorzugsweise ebenfalls an ein Markermolekül angebracht.
Das Markermolekül ist
vorzugsweise von einem fluoreszierenden Marker ausgewählt und
kann vor Verwendung des vorliegenden cDNA Mikroarray abgespalten
werden. Durch die Verwendung der Marker kann eine Vor-Normalisierung des
cDNA Mikroarray durchgeführt
werden, um die Analyse der Ergebnisse zu erleichtern. In diesem
Zusammenhang sind die in der vorliegenden Erfindung verwendeten
Spacer- und Fänger-Moleküle vorzugsweise
derart ausgewählt,
dass der Quench-Effekt soweit wie möglich verringert wird (beispielsweise
durch derartige Auswahl der Monomere, die die Spacer- und Fänger-Moleküle bilden, dass
sie keine oder eine geringe Eigenfluoreszenz aufweisen). Manche
der in der vorliegenden Erfindung verwendeten fluoreszierenden Marker
sind Cyanin-Farbstoffe, vorzugsweise Cy3 und/oder Cy5, Renaissance-Farbstoffe,
vorzugsweise ROX und/oder R110, und fluoreszierende Farbstoffe,
vorzugsweise FAM und/oder FITC.
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Die
vorliegende Erfindung stellt in einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ein Verfahren zur Herstellung eines cDNA Mikroarrays unter Verwendung
von Zufallsspacer-Molekülen mit
einer Länge
in dem Bereich von mindestens 50 bis 80 Nukleotiden bereit. Das
vorgeschlagene Verfahren umfasst genauer gesagt die Herstellung
eines cDNA Mikroarrays, worin
- – entweder
ein erstes Ende eines Spacer-Moleküls oder eines einzelnen Nukleotids
(das anschließend
zu einem Volllängen
Spacer-Molekül aufgebaut
wird) durch beispielsweise die Verwendung eines Palymersierungsagens
auf die Oberfläche
eines Trägers
an einer bestimmten Stelle davon angebracht wird;
- – ein
in der Spotting-Lösung
vorliegendes Fänger-Molekül zu dem
Mikroarray hinzugefügt
wird, wobei ein Spotting-Volumen für gewöhnlich weniger als 1 Mikroliter
beträgt;
- – das
Anbringen des in der Spotting-Lösung
vorliegenden Fänger-Moleküls durch
beispielsweise die Verwendung eines Polymerisierungsagens an das
zweite Ende des Spacer-Moleküls ermöglicht wird;
und
- – ein
Trocknen der gespotteten Lösung
auf dem Träger
ermöglicht
wird.
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Der
derartig erhaltene Mikroarray kann zur Identifizierung und/oder
Quantifizierung von in einer Probe vorliegenden DNA/RNA durch Anbringen
auf Fänger-Moleküle verwendet
werden. Die Spacer-Moleküle
und Fänger-Moleküle können durch
ein Tropfen-Abgabesystem, Piezzo- oder Tintenstrahl-Bedrucken, Mikropipettieren
und Nanopipettieren abgeschieden bzw. abgegeben werden. In einer
bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Abgabe der Spacer-Moleküle und Fänger-Moleküle durch
ein Kontakt-Druck-System.
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Ein
Polyol kann zusätzlich
zu der Spotting-Lösung
entweder vor dem Anbringen des Fänger-Moleküls an dem
zweiten Ende des Spacer-Moleküls
oder unmittelbar danach hinzugefügt
werden, um eine längere
Lagerstabilität
des cDNA Mikroarrays sowohl bei Umgebungs- als auch Kühltemperaturen
zu erreichen. Die Polyole können
irgendeine Art von Polyolen sein, die sich vorzugsweise sehr einfach
in Spotting-Lösungen
mit verschiedenen wässrigen
Puffern lösen
und zur Solubilisierung der Nukleotide passend sind. Die Polyole
können
cyclisch sein oder ein lineares Rückrat aufweisen und können von Hydroxy
oder Wasserstoff verschiedene Atome/Gruppen enthalten. Die Polyole
können
ebenso mit anderen Molekülen
durch eine Alkoholfunktion oder eine andere Funktion verbunden werden.
Die bevorzugten Polyole gemäß der Erfindung
sind Mannitol und Sorbitol.
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Der
Träger
des cDNA Mikroarrays gemäß der vorstehend
erwähnten
Ausführungsform
ist ebenso vorzugsweise fest und besteht aus Glas, Metall oder Kunststoff
und kann chemisch modifiziert oder behandelt werden, um das Anbringen
der Spacer-Moleküle
zu erleichtern. Vorzugsweise ist mindestens 1 Quadratzentimeter
der Oberfläche
des Trägers
für das
Anbringen von Spacer-Molekülen
zugänglich.
Auf der Oberfläche
sind vorzugsweise mindestens 100 Spacer-Moleküle pro Quadratzentimeter angebracht.
Ebenso kann eine höhere
Dichte der pro Quadratzentimeter an festem Träger angebrachten Nukleinsäuren in
Abhängigkeit
von der jeweiligen Anwendung des Mikroarrays gewählt werden, die mehr bevorzugt
mindestens 1.000, immer noch mehr bevorzugt mindestens 5.000 und
am meisten bevorzugt 10.000 Nukleotide pro Quadratzentimeter beträgt. Die
Spacer-Moleküle
der vorstehend erwähnten
Ausführungsform
sind ebenso vorzugsweise durch bestimmte reaktive Gruppen auf der
Oberfläche
des Trägers
immobilisiert, die von Hydroxy-, Thiol-, Aldehyd-, Amid- und Thioamid-Gruppen
ausgewählt
werden können
und optional durch Schutzgruppen maskiert sein können, die FMOC, BOC, t-Butylester und t-Butylether
umfassen.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Spacer-Molekülen mit
Zufallssequenzen in einem cDNA Mikroarray bereitgestellt, worin
die Länge
der Spacer-Moleküle
in dem Bereich von mindestens 50 bis 80 Nukleotiden liegt.
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Die
vorliegende Erfindung stell ebenso einen Kit für die Herstellung von Spacer-Molekülen mit
Zufallssequenzen und einer Länge
von mindestens 50 bis 80 Nukleotiden für jedes Spacer-Molekül bereit, wobei
die Spacer-Moleküle
für die
Herstellung des erfindungsgemäßen cDNA
Mikroarrays verwendet werden können.
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Die
Vorteile des vorliegenden cDNA Mikroarrays liegen überwiegend
in der Wahl der vorliegenden Spacer-Moleküle, die eine Zufallssequenz
und eine Länge
von mindestens 50 bis 80 Nukleotiden aufweisen. Die vorliegenden
Erfinder haben gefunden, dass die langen Spacer-Moleküle mit Zufallssequenz untereinander
(über Hybridisierung)
wechselwirken können.
Dieser Effekt trägt überraschenderweise
nichtsdestoweniger zu besseren Ergebnissen bei beiden, der Herstellung
des Mikroarrays und der Hybridisierung der Sondenmoleküle, bei.
Es kann angenommen werden, dass die jeweiligen Enden der Spacer-Moleküle (mit
oder ohne Fänger-Moleküle) keine
regelmäßige Oberfläche bilden,
wobei jedes Ende eines bestimmten Spacer-Molekül näherungsweise den gleichen Abstand
zu den anderen umgebenden aufweist. Die Hybridisierung zwischen Spacer-Molekülen führt vielmehr
zu einer unregelmäßigen Oberfläche und
daher an manchen Stellen zu einer geringeren sterischen Hinderung
für ein
Anbringen der Sondenmoleküle
an die Fänger-Moleküle. Es wird
angenommen, dass sich die Hybridisierung zwischen den Spacer-Molekülen lediglich
in einem kurzen Abschnitt des Spacers (beispielsweise 4 Nukleinsäuren) ereignet,
wobei die Hybridisierung bald wieder gelöst sein wird, so dass die Enden
der anderen Spacer-Moleküle
wiederum frei verfügbar
sind. Die gewählte
Länge der
Spacer-Moleküle
von mindestens 50 bis 80 Nukleotiden stellt bereit, dass sich die
Hybridisierung zwischen den Spacer-Molekülen über einen kurzen Abschnitt
(im Vergleich zu der Länge
de4r Spacer-Moleküle)
ereignet und bald wieder gelöst
vorliegt (durch beispielsweise die Umgebungstemperatur).
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De
erfindungsgemäße cDNA
Mikroarray beinhaltet auf seiner Oberfläche mehrere einzelne Bereiche,
die die Spacer-Moleküle
und daran angebrachte Fänger-Moleküle tragen,
die an eine entsprechende Ziel-Nukleotidsequenz (Sondenmoleküle) hybridisieren
können,
wenn die jeweiligen Sequenzen einen ausreichen Grad an Komplementarität aufweisen.
Die Hybridisierung der Fänger-Moleküle an die
Sonden-Moleküle,
die in der zu analysierenden Probe vorliegend können, führt zu einem spezifischen und
charakteristischen Muster auf dem Mikroarray. Falls die Zielsequenz
geeignet markiert ist kann ein Signal unmittelbar an der Hybridisierungsstelle
nachgewiesen, identifizier und gemessen werden. Die Intensität des jeweiligen
Signals ermöglich die
Abschätzung
der Menge an Sondenmolekülen, die
in der Probe vorliegen. Das zu identifizierende Sondenmolekül kann ebenso
vor der Hybridisierung an die einzelsträngigen Fänger-Moleküle markiert werden. Das Markieren
kann durch ein Einschließen von
markierten Sonden-Molekülen
oder durch ein Anbringen eines Markers an die Hybride (Amplikons) der
Fänger-
mit den Sondenmolekülen
erfolgen.
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Zur
Implementierung eines typischen Mikroarrays gemäß der bevorzugten Ausführungsformen
werden drei Komponenten benötigt.
Zuerst den Mikroarray oder beziehungsweise den Träger, zweitens
eine Leseeinheit und drittens irgendwelche Mittel zur Bewertung
der Ergebnisse, beispielsweise eine geeignete Computersoftware.
Die Eigenschaften und Charakteristika des Mikroarrays wurden bereits
vorstehend erläutert.
Die Leseeinheit umfasst im Allgemeinen einen beweglichen Boden (tray),
Fokusierlinse(n), Spiegel und einen geeigneten Detektor, beispielsweise
eine CCD Kamera. Der bewegliche Boden trägt den Mikroarray und kann
bewegt werden, um den Mikroarray in dem Lichtweg einer oder mehrerer
geeigneter Lichtquellen, beispielsweise ein Laser mit einer geeigneten
Wellenlänge
zur Anregung einer fluoreszierenden Verbindung, zu platzieren. Das
Auswertungsprogramm oder Software kann beispielsweise zum Erkennen
spezifischer Muster auf dem Array dienen oder zur Analyse von verschiednen
Expressionsprofilen von Genen. In diesem Fall sucht die Software
farbige Punkte auf dem Array und vergleicht die Intensität verschiedener Farbspektren
des gleichen Punktes. Das Ergebnis kann von einer Analyseeinheit
interpretiert und danach in einem geeigneten Dateiformat zur Weiterverarbeitung
gespeichert werden.
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Die
Sonden, die an die jeweiligen Fänger-Moleküle hybridisiert
werden, sind im Allgemeinen an zwei oder mehr fluoreszierende Farbstoffe
kovalent gebunden und die Intensität der Fluoreszenz bei verschiedenen
Wellenlängen
eines jeden Punkts wird mit dem Hintergrund verglichen. Der Detektor, beispielsweise
ein Photomultiplier oder CCD Array, wandelt geringe Lichtintensitäten in ein
elektrisches Signal um, das verstärkt werden kann. Andere Verfahren
verwenden verschiedene Enzyme, die an das Nukleotid mit einem Linkermolekül kovalent
gebunden sind. Die enzymatische Colorimetrie verwendet beispielsweise
alkalische Phosphatase und Meerrettich Peroxidase als Marker. Durch
Kontaktieren mit einem geeigneten Molekül kann ein nachweisbarer Farbstoff
erhalten werden. Andere chemolumineszierende oder fluoreszierende
Marker umfassen Proteine, die ein Chemolumineszenz- oder Fluoreszenz-Signal
ausstrahlen können,
wenn sie mit Licht einer bestimmten, spezifischen Wellenlänge, beispielsweise 488
nm für
das Grüne
Fluoreszenzprotein, bestrahlt werden. Radioaktive Marker werden
im Fall verwendet, dass niedrige Nachweisgrenzen erforderlich sind,
sie sind allerdings aufgrund ihrer gesundheitsschädlichen
Eigenschaften nicht weit verbreitet. Eine Fluoreszenzmarkierung
wird mit Nukleotiden vorgenommen, die an ein fluoreszierendes Chromophor gebunden
sind. Kombinationen von Nukleotiden und fluoreszierendem Chromophor
umfassen im Allgemeinen Cy3 (Cyanin 3)/ Cy5 (Cyanin 5) markiertes dUTP
as Farbstoff, da sie leicht aufgenommen werden können, der Elektronenübergang
für die
Fluoreszenz durch gewöhnliche
Laser angeregt werden kann und sie ebenso bestimmte Emisionsspektren aufweisen.
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Die
Hybridisierung bei der Mikroarray Technologie folgt im Wesentlichen
den herkömmlichen Bedingungen
von Southern oder Northern Hybridisierungen, die dem Fachmann gut
bekannt sind. Die Schritte umfassen eine Vor-Hybridisierung, die
eigentliche Hybridisierung und einen Waschschritt nach dem Eintreten
der Hybridisierung. Die Bedingungen müssen derart gewählt werden,
dass Hintergrundsignale klein gehalten werden, dass eine minimale
Kreuzhybridisierung (im Allgemeinen eine verringerte Anzahl von
Abweichungen) auftritt und dass die Signalstärke ausreichend ist, die für manche
Anwendungen zur Konzentration des Zielmoleküls proportional sein muss.
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Das
Hybrdisierungsereignis kann im Allgemeinen durch zwei verschiedene
Arten von Array-Scannern nachgewiesen werden. Ein Verfahren bedient
sich des Prinzips der konfokalen Lasermikroskopie, das zumindest
einen Laser zur Durchmusterung des Arrays auf eine Punkt-zu-Punkt Art verwendet.
Eine Fluoreszenz wird anschließend
durch Photomultiplier nachgewiesen, die das ausgestrahlte Licht
verstärken.
Die kostengünstigeren
GGD basierenden Leseeinheiten verwenden für gewöhnlich gefiltertes weißes Licht
zur Anregung. Die Oberfläche des
Arrays wird mit diesem Verfahren in Abschnitten durchmustert, was
den schnelleren Erhalt von Ergebnissen einer niedrigen Aussagekraft
ermöglicht.
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Von
Wichtigkeit ist ebenso das so genannte Gridding zur Analyse der
Ergebnisse, bei dem ein idealisiertes Modell des Mikroarraylayouts
mit den durchmusterten Daten verglichen wird, um die Punkt (spot)
Bestimmung zu erleichtern. Bildpunkte werden als Punkt (Vordergrund)
oder Hintergrund eingestuft (segmentiert), um die Punkt-Maske zu
erzeugen. Segmentierungsverfahren können in feste Segmentierungskreise,
anpassende Kreissegmentierung, anpassende Formsegmentierung und
Histogrammsegmentierung unterteilt werden. Die Verwendung dieser Verfahren
hängt von
der Form der Punkte (regelmäßig, unregelmäßig) und
der Qualität
der Nahanordnung der Punkte ab.
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Ein
anderer wichtigerer Punkt für
die Auswertung der Ergebnisse liegt in der Intensität der verschiedenen
Punkte, da die Konzentration der hybridisierten Nukleotide in einem
Punkt zu der Gesamtfluoreszenz dieses Punktes proportional ist.
Die gesamte Bildpunktintensität
und das Verhältnis
der verwendeten verschieden fluoreszierenden Chromophore (im Fall
con Cy3 und Cy5, grün
und rot) sind insbesondere für
die Berechnung der Punktintensität
von Wichtigkeit.
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Neben
der Punktintensität
muss ebenso die Hintergrundintensität berücksichtigt werden, da verschiedene
Effekte die Fluoreszenz der Punkte stören können, beispielsweise die Fluoreszenz
des Trägers und
der für
die Hybridisierung verwendeten Chemikalien. Dies kann durch die
so genannte Normalisierung durchgeführt werden, die die vorstehend
genannten Effekte und andere beinhaltet, wie Fluktuationen der Lichtquelle,
die geringere Verfügbarkeit/Aufnahme
der verschiednen Markermoleküle (Cy5
schlechter als Cy3) und deren Unterschiede bei Emissionsintensitäten. Von
Wichtigkeit für
die Normalisierung ist weiterhin die Referenz gegen die normalisiert
werden soll. Im Allgemeinen kann es ein bestimmter Satz von Genen
oder eine Gruppe von Kotrollmolekülen sein, die auf dem Mikroarray
vorliegen. Die Ergebnisse können
weiterhin durch frei oder käuflich
verfügbare
Softwarewerkzeuge analysiert werden