[go: up one dir, main page]

DE102005011003B9 - Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren - Google Patents

Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren Download PDF

Info

Publication number
DE102005011003B9
DE102005011003B9 DE102005011003A DE102005011003A DE102005011003B9 DE 102005011003 B9 DE102005011003 B9 DE 102005011003B9 DE 102005011003 A DE102005011003 A DE 102005011003A DE 102005011003 A DE102005011003 A DE 102005011003A DE 102005011003 B9 DE102005011003 B9 DE 102005011003B9
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
genes
thyroid
transcripts
gene
benign
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE102005011003A
Other languages
English (en)
Other versions
DE102005011003A1 (de
DE102005011003B4 (de
Inventor
Ralf Prof. Dr. Paschke
Markus Eszlinger
Knut Dr. Krohn
Dagmar Dr. Führer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Leipzig
Original Assignee
Universitaet Leipzig
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Leipzig filed Critical Universitaet Leipzig
Priority to DE102005011003A priority Critical patent/DE102005011003B9/de
Publication of DE102005011003A1 publication Critical patent/DE102005011003A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE102005011003B4 publication Critical patent/DE102005011003B4/de
Publication of DE102005011003B9 publication Critical patent/DE102005011003B9/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Tumoren bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von Genen ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 erfolgt, wobei eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen und eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens vier Genen aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen erfolgt, wobei
a.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie der Gene 23 bis 27 und 33 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert,
b.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9,...

Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren, insbesondere zur Unterscheidung von gutartigen nodulären Schilddrüsenveränderungen (sog. heissen und kalten Knoten) von malignen Schilddrüsenkarzinomen (papilläres und follikuläres Karzinom). Das Verfahren und die Mittel kommen in der klinischen Tumordiagnostik zur Anwendung.
  • Die Häufigkeit nodulärer Schilddrüsenveränderungen, im folgenden Text als Schilddrüsenknoten bezeichnet, liegt in Iodmangelgebieten, wie Deutschland, bei ca. 30 Prozent der adulten Bevölkerung (1). Die Diagnose eines Schilddrüsenknotens ist oft ein zufälliger Befund bei der Erhebung des klinischen Status, bzw. ein Nebenbefund bei sonographischen Untersuchungen (2; 3).
  • Die Klassifizierung der Schilddrüsenknoten beruht sowohl auf morphologischen (4), als auch auf funktionellen Kriterien („heißer” oder „kalter" Knoten). Etwa 85% aller Schilddrüsenknoten stellen sich szintigraphisch als „kalte" Knoten dar (5). Dieser Gruppe kommt in der Differentialdiagnostik nodulärer Schilddrüsenerkrankungen eine besondere Bedeutung zu, da Schilddrüsenkarzinome meist als „kalte" Knoten imponieren. Der kalte Knoten ist ein Knoten, der funktionell inaktiv ist, d. h. weniger Schilddrüsenhormone produziert als gesundes Schilddrüsengewebe. Liegt ein kalter Knoten vor, so muss abgeklärt werden, ob es sich um einen gutartigen Tumor handelt oder ein Verdacht auf ein Schilddrüsenkarzinom besteht. Das durchschnittliche Risiko für ein Schilddrüsenkarzinom ist jedoch sehr gering (1–5% der Schilddrüsenknoten). Die Prävalenz von Schilddrüsenkarzinomen ist auch in Iodmangelgebieten nicht generell erhöht.
  • Zirka fünf Prozent aller Schilddrüsenknoten stellen sich szintigraphisch als „heiße" Knoten (autonome Schilddrüsenadenome) dar (5). Ursache dafür sind konstitutiv aktivierende Mutationen des TSH-Rezeptors (TSHR), (bis zu 82%) und des Gsα Proteins (bis zu 35%). Der heiße Knoten ist ein gutartiger Tumor, der mehr Schilddrüsenhormone produziert als gesundes Schilddrüsengewebe, dadurch entsteht eine "latente" oder "manifeste" Überfunktion. Bei diesem Knoten besteht – im Gegensatz zum kalten Knoten – kein Karzinomverdacht, er ist fast immer gutartig. Es kann ein einzelner (solitärer) autonomer Knoten vorliegen oder die Schilddrüse von vielen heißen Knoten durchsetzt sein.
  • Das wichtigste diagnostische Verfahren zur Differenzierung gutartiger (benigner) und bösartiger (maligner) Schilddrüsenerkrankungen ist die Feinnadelaspirationszytologie (FNAZ). Mittels FNAZ können in der Regel klassische papilläre, anaplastische und medulläre Schilddrüsenkarzinome sowie Metastasen anderer Primärtumoren, gegebenenfalls in Ergänzung mit entsprechenden immunzytologischen Markern, präoperativ diagnostiziert werden (6; 7). Qualität beziehungsweise Aussagekraft der FNAZ sind entscheidend von der Erfahrung des Punktierenden und des beurteilenden Zytopathologen abhängig: Bei einem sehr erfahrenen Team können mittels FNAZ eine sehr hohe Präzision (85 bis 100%), Spezifität (72–100%) und Sensitivität (55–98%) bei der Differentialdiagnose von Schilddrüsenknoten (noduläre Schilddrüsenerkrankungen) erreicht werden. Allerdings zeigen Ergebnisse der bislang umfangreichsten FNAZ-Studie bei 15.000 Patienten, die über einen Zeitraum von 16 Jahren an der Mayo Clinic wegen nodulärer Schilddrüsenerkrankungen behandelt wurden, daß auch bei geübten Untersuchern in bis zu 32% der punktierten Schilddrüsenknoten keine ausreichende zytologische Beurteilung möglich ist (7). Hierfür sind einerseits nicht verwertbare (bis zu 21%), andererseits „suspekte" Punktate (etwa 10%) verantwortlich (6–11). Bei der letzteren Gruppe liegt meist der problematische Befund einer follikulären Neoplasie vor. Unter dieser, derzeit nicht weiter differenzierbaren, zytologischen Gruppendiagnose werden follikuläre Adenome, follikuläre Karzinome sowie die follikuläre und oxyphile Variante des papillären Schilddrüsenkarzinoms zusammengefaßt. In Ermangelung geeigneter differentialdiagnostischer Marker für die follikuläre Neoplasie gilt diese bislang als Indikation zur Knotenresektion, obwohl nur in maximal 20 bis 25% der Fälle tatsächlich ein Karzinom vorliegt (7).
  • Bisher sind für differenzierte Schilddrüsenkarzinome folgende molekulare Ursachen bekannt: Ret-Rearrangements werden in ca. 20% der papillären Schilddrüsenkarzinome gefunden (16). PAX8-PPARγ-Rearrangements wurden kürzlich in follikulären Schilddrüsenkarzinomen nachgewiesen. Sie treten nicht in papillären Schilddrüsenkarzinomen auf, wurden jedoch auch in gutartigen Schilddrüsenadenomen gefunden (12, 18).
  • Die bisherigen präoperativen Selektionsverfahren führen zu einer histologischen Karzinomrate bei Schilddrüsenoperationen wegen Schilddrüsenknoten von 5 bis maximal 30%. Demzufolge sind über 70% der derzeitig wegen Karzinomverdacht in Schilddrüsenknoten durchgeführten Operationen eigentlich unnötig.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Mittel zur Diagnose von nodulären Schilddrüsenerkrankungen anzugeben, insbesondere zur differentiellen Diagnose von gutartigen Schilddrüsenknoten („heisse" und „kalte" Knoten) gegenüber malignen Schilddrüsenkarzinomen, insbesondere gegenüber den follikulären und papillären Schilddrüsenkarzinomen.
  • Die Erfindung beruht auf wissenschaftlichen Untersuchungen zur differentiellen Genexpression in gutartigen kalten und heißen Schilddrüsenknoten im Vergleich zu den jeweiligen korrespondierenden, gesunden Umgebungsgeweben und dem nachfolgenden Vergleich dieser Daten mit den entsprechenden Genexpressionsdaten von Schilddrüsenkarzinomen. Die erfindungsgemäß in gutartigen und bösartigen Schilddrüsentumoren unterschiedlich exprimierten Gene werden als Marker zur Differentialdiagnose von Schilddrüsentumoren herangezogen.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren, insbesondere zur Unterscheidung von gutartigen Schilddrüsenknoten von Schilddrüsenkarzinomen anzugeben. Bösartige Tumore, die mit der Erfindung diagnostiziert werden sollen, sind insbesondere follikuläre und papilläre Schilddrüsenkarzinome.
  • Die Erfindung beruht auf wissenschaftlichen Untersuchungen zur differentiellen Genexpression in gutartigen kalten und heißen Schilddrüsenknoten im Vergleich zu den jeweiligen korrespondierenden, gesunden Umgebungsgeweben und dem anschliessenden Vergleich dieser Daten mit Expressionsdaten in papillären und follikulären Schilddrüsenkarzinomen. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression von ca. 10.000 Genen erfolgte mit Hilfe hochdichter Genexpressionsarrays (Affymetrix GeneChips U95Av2, Affymetrix; Santa Clara, CA, USA). Durch den Vergleich der Expressionsdaten in den Schildrüsenknoten bzw. Karzinomen mit den Daten der gesunden Umgebungsgewebe erfolgte eine Normalisierung, die es ermöglichte, Expressionsunterschiede von Genen zwischen den unterschiedlichen Pathologien festzustellen.
  • Die erfindungsgemäß in gutartigen und bösartigen Schilddrüsentumoren unterschiedlich exprimierten Gene werden als Marker zur differentialen Diagnose von Schilddrüsentumoren herangezogen.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Tumoren bei dem:
    • 1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
    • 2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 erfolgt, wobei eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen und eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens vier Genen aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen erfolgt, wobei a.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie der Gene 23 bis 27 und 33 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, b.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9, 10, 12, 16 bis 18 sowie der Gene 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, c.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie der Gene Nr. 133 und 134 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert, d.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 13, 15, 22, 33, 42, 46, 53, 63, 69, 72, 73, 76, 86, 88, 90, 95 bis 100, 108, 109, 111, 116, 117, 120, 126 bis 129, 132 sowie der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert um die Aussagekraft weiter zu verbessern.
  • Die in den Tabellen 1 bis Tabelle 4 aufgeführten Gene sind fortlaufend nummeriert (Gen-Nummer). Zur eindeutigen Identifizierung der Gene sind jeweils die Veröffentlichungsnummer des zugehörigen Genbank-Eintrags in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene) und die Identifikationsnummer des Affymetrix-Chips (ProbeSet-ID) angeben. Unter „ProbeSet-ID" ist in den Tabellen die von Affymetrix standardisierte Bezeichnung einer Gruppe von 16–20 Proben, die auf dem Affymetrix-Chip immobilisiert sind, angegeben, mit der das jeweilige Gen hybridisiert und die zum Nachweis eines spezifischen Transkripts dienen. Der gebräuchlichste Name des jeweiligen Gens ist ebenfalls angegeben.
  • In den Tabellen 1 bis 4 sind die SLR-Werte der Gene in den jeweiligen Geweben (Spalten „Expression in HK" (heißen Knoten), „Expression in KK" (kalten Knoten), „Expression in PTC" (papilläres Karzinom), „Expression in FTC" (follikuläres Karzinom)) aufgeführt. Der SLR (signal log ratio) wurde folgendermassen aus den der Erfindung zugrundeliegenden Expressionsdaten bestimmt:
    Figure 00050001
  • Ein Signal log ratio (SLR)-Wert von 1 entspricht somit einer 2-fach höheren Expression des Gens im jeweiligen Tumorgewebe im Vergleich zum normalen Umgebungsgewebe, ein SLR-Wert von 2 entspricht einer 4-fach höheren Expression im Vergleich zum Umgebungsgewebe.
  • Ein negativer SLR-Wert entspricht einer verminderten Expression im jeweiligen Tumorgewebe im Vergleich zum normalen Umgebungsgewebe. So entspricht ein SLR-Wert von –1 einer im Tumorgewebe im Vergleich zum normalen Gewebe um die Hälfte verringerten Expression. Ein SLR-Wert von –2 entspricht einer auf ein Viertel der Expression im Normalgewebe verringerten Expression.
  • Die SLR-Werte werden in den 1 bis 4 in Balkendiagrammen dargestellt. In den 1 bis 4 ist als „mean HK" der Mittelwert der „signal log ratio" für heiße Knoten angegeben (HK als Tumorgewebe, UGHK als Umgebungsgewebe in Formel 1). Entsprechend erhaltene Werte für die gutartigen kalten Schilddrüsenknoten (KK), papillären Schilddrüsenkarzinome (PTC) und follikulären Schilddrüsenkarzinome (FTC) sind als „mean KK", „mean PTC" bzw. „mean FTC" angegeben. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus den Tabellen 1 bis 4.
  • In Tabelle 1 sind die Gene aufgelistet, deren Expression in gutartigen heißen Schilddrüsenknoten im Mittel gegenüber ihrer Expression in normalem Umgebungsgewebe, gegenüber ihrer Expression in kalten Knoten und gegenüber ihrer Expression in Schilddrüsenkarzinomen (papilläres und follikuläres Schilddrüsenkarzinom) mindestens doppelt so hoch oder mindestens um die Hälfte vermindert ist.
  • Ein bevorzugter Bestandteil der Erfindung ist daher ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen heißen Knoten gegenüber gutartigen kalten Knoten, bösartigen follikulären Karzinomen und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
    • 1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
    • 2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von zusätzlich mindestens drei Genen ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 22 erfolgt,
    • 3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9, 10, 12 und 16 bis 18 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen heißen Knotens liefert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens vier oder fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert, um die Aussagekraft zu verbessern.
  • Die in Tabelle 1 zusammengefassten differentiellen Expressionswerte werden nachfolgend anhand der Gene Gen Nr. 2 (type I 5 iodothyronine deiodinase) und Gen Nr. 4 (single-stranded-DNA-binding protein) näher erläutert:
    Gen Nr. 2 (type I 5 iodothyronine deiodinase, NM_000792, Proben-Set-ID 31966_at) weist eine SLR von 2.0 in heißen Knoten (HK) im Vergleich zu den normalen Umgebungsgeweben heißer Knoten auf, das entspricht einer 4-fach höheren Expression in den HK im Vergleich zum Umgebungsgewebe heißer Knoten (UGHK). In kalten Knoten (KK) beträgt die SLR 0.8 im Vergleich zu den normalen Umgebungsgeweben kalter Knoten (UGKK). Das entspricht einer 1.2-fach höheren Expression in den KK im Vergleich zu UGKK. Im Vergleich der papillären Karzinome (PTC) zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR –3.8, das entspricht einer 0.07-fachen Expression, d. h. einer um ca. Faktor 14 verminderten Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben (UGPTC). In follikulären Karzinomen (FTC) beträgt die SLR –0.8 im Vergleich zu den normalen Umgebungsgeweben follikulärer Karzinome (UGFTC). Das entspricht einer 0.6-fachen Expression, d. h. einer um ca. Faktor 1.7 verminderten Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
  • Folglich ist Gen Nr. 2 (type I 5 iodothyronine deiodinase) in Heißen Knoten gegenüber Kalten Knoten und gegenüber follikulären und papillären Schilddrüsenkarzinomen spezifisch überexprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von heißen Schilddrüsenknoten dar.
  • In PTC ist die type I 5 iodothyronine deiodinase spezifisch vermindert exprimiert. Sie stellt daher auch einen spezifischen Marker zur Diagnose von Schilddrüsenkarzinomen, insbesondere zur Diagnose von papillären Schilddrüsenkarzinomen dar und ist nochmals in Tabelle 3 aufgeführt.
  • Gen Nr. 4 (single-stranded-DNA-binding protein, NM_012446, Proben-Set-ID 32668_at) weist eine SLR von –0.9 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben (UGHK) auf, das entspricht einer 0.53-fachen Expression in den HK, d. h. einer um ca. Faktor 1.9 verminderten Expression, in den HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben (UGHK). In kalten Knoten (KK) beträgt die SLR 0.3 im Vergleich zu deren Umgebungsgewebe, das entspricht einer 1.23-fachen Expression in den KK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.8, das entspricht einer 1.74-fachen Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.0, das entspricht einer unveränderten Expression.
  • Folglich ist Gen Nr. 4 in HK spezifisch vermindert exprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von heißen Schilddrüsenknoten dar.
  • 1 zeigt die differentielle Expression der Gene 1 bis 22 aus Tabelle 1, die als spezifische Marker für heiße Schilddrüsenknoten fungieren, in einem Balkendiagramm. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus Tabelle 1.
  • In Tabelle 2 sind die Gene aufgelistet, deren Expression in gutartigen kalten Schilddrüsenknoten im Mittel gegenüber ihrer Expression in normalem Umgebungsgewebe, gegenüber ihrer Expression in heißen Knoten und gegenüber ihrer Expression in Schilddrüsenkarzinomen (papilläres und follikuläres Schilddrüsenkarzinom) mindestens doppelt so hoch oder mindestens um die Hälfte vermindert ist.
  • Ein bevorzugter Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen kalten Knoten gegenüber gutartigen heissen Knoten, bösartigen follikulären Karzinomen und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
    • 1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
    • 2.) in der isolierten RNA zusätzlich eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen ausgewählt aus den in Tabelle 2 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 23 bis 35 erfolgt,
    • 3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 23 bis 27 und 33 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen kalten Knotens liefert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens vier oder fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 2 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert, um die Aussagekraft zu verbessern.
  • Die in Tabelle 2 zusammengefaßten differentiellen Expressionswerte werden nachfolgend anhand der Gene Nr. 23 (fibroblast growth factor 7) und Nr. 29 (chromosome 21 open reading frame 5) näher erläutert:
    Gen Nr. 23 (fibroblast growth factor 7, NM_002009, Proben-Set-ID 1466_s_at) weist eine SLR von –1.2 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer 0.44-fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 1.3, das entspricht einer 2.46-fachen Expression in den KK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR –0.8, das entspricht einer 0.57-fachen Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR –3.0, das entspricht einer 0.125-fachen Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
  • Folglich ist Gen Nr. 23 (fibroblast growth factor 7) in KK gegenüber HK, FTC und PTC spezifisch überexprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von kalten Schilddrüsenknoten dar.
  • Gen Nr. 29 (chromosome 21 open reading frame 5, NM_005128, Proben-Set-ID 37827_r_at) weist eine SLR von 0.5 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben (UHK) auf, das entspricht einer 1.41-fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR –0.9, das entspricht einer 0.54-fachen Expression in den KK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.8, das entspricht einer 1.74-fachen Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR –0.1, das entspricht einer 0.93-fachen Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
  • Folglich ist Gen Nr. 29 (chromosome 21 open reading frame 5) in KK gegenüber HK, FTC und PTC vermindert exprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von kalten Schilddrüsenknoten dar.
  • 2 zeigt die differentielle Expression der Gene 23 bis 35 aus Tabelle 2, die als spezifische Marker für kalte Schilddrüsenknoten fungieren, in einem Balkendiagramm. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus Tabelle 2.
  • In Tabelle 3 sind die Gene aufgelistet, deren Expression in bösartigen papillären Schilddrüsenkarzinomen im Mittel gegenüber ihrer Expression in normalem Umgebungsgewebe, gegenüber ihrer Expression in follikulären Schilddrüsenkarzinomen und gegenüber ihrer Expression in gutartigen Schilddrüsentumoren (heiße Knoten und kalte Knoten) mindestens doppelt so hoch oder mindestens um die Hälfte vermindert ist.
  • Ein bevorzugter Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von bösartigen papillären Karzinomen gegenüber gutartigen heißen Knoten, gutartigen kalten Knoten und bösartigen follikulären Karzinomen, bei dem:
    • 1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
    • 2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen ausgewählt aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen erfolgt,
    • 3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 83, 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 15, 46, 63, 69, 88, 95 bis 97, 108, 109, 111, 120, 126 bis 129 und 132 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen papillären Schilddrüsenkarzinoms liefert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens vier oder fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert, um die Aussagekraft zu verbessern.
  • Die in Tabelle 3 zusammengefassten differentiellen Expressionswerte werden nachfolgend anhand der Gene Nr. 36 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1) und Nr. 42 (homogentisate 1 2-dioxygenase) näher erläutert:
    Gen Nr. 36 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1, NM_003254, Proben-Set-ID 1693_s_at) weist eine SLR von 0.0 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer unveränderten Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR –0.7, das entspricht einer 0.62-fachen Expression in den KK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 2.9, das entspricht einer 7.46-fachen Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.0, das entspricht einer unveränderten Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
  • Folglich ist Gen Nr. 36 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1) in PTC gegenüber HK, KK und FTC spezifisch überexprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von Schilddrüsenkarzinomen, insbesondere zur Diagnose von papillären Schilddrüsenkarzinomen dar.
  • Gen Nr. 42 (homogentisate 1 2-dioxygenase, NM_000187, Proben-Set-ID 31844_at) weist eine SLR von 1.3 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer 2.46-fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.8, das entspricht einer 1.74-fachen Expression in den KK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR –3.4, das entspricht einer 0.09-fachen Expression d. h. einer um ca. Faktor 10.5 verminderten Expression, in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR –3.3, das entspricht einer 0.1-fachen Expression d. h. einer um ca. Faktor 10 verminderten Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
  • Folglich ist Gen Nr. 42 (homogentisate 1 2-dioxygenase) in PTC und FTC (s. Tabelle 4) gegenüber HK und KK spezifisch vermindert exprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von Schilddrüsenkarzinomen dar.
  • 3 zeigt die differentielle Expression der Gene 2, 13, 15, 16, 22, 32, 33 und 36 bis 132 aus Tabelle 3, die als spezifische Marker für papilläres Schilddrüsenkarzinom fungieren, in einem Balkendiagramm. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus Tabelle 3.
  • In Tabelle 4 sind die Gene aufgelistet, deren Expression in bösartigen follikulären Schilddrüsenkarzinomen im Mittel gegenüber ihrer Expression in normalem Umgebungsgewebe, gegenüber ihrer Expression in papillären Schilddrüsenkarzinomen und gegenüber ihrer Expression in gutartigen Schilddrüsentumoren (heiße Knoten und kalte Knoten) mindestens doppelt so hoch oder mindestens um die Hälfte vermindert ist.
  • Ein bevorzugter Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von bösartigen follikulären Karzinomen gegenüber gutartigen heißen Knoten, gutartigen kalten Knoten und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
    • 1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
    • 2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens vier Genen ausgewählt aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen erfolgt,
    • 3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 133 und 134 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen follikulären Schilddrüsenkarzinoms liefert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert, um die Aussagekraft zu verbessern.
  • Die in Tabelle 4 zusammengefaßten differentiellen Expressionswerte werden nachfolgend anhand der Gene Nr. 133 (UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactosyltransferase) und Nr. 138 (BENE protein) näher erläutert:
    Gen Nr. 133 (UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactosyltransferase, NM_001497, Proben-Set-ID 40960_at) weist eine SLR von 0.1 in HK im Vergleich zu den Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer 1,1-fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR –0.3, das entspricht einer 0,8-fachen Expression in den KK im Vergleich zu den Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR 2.0, das entspricht einer 4-fachen Expression in den FTC im Vergleich zu den Umgebungsgeweben und im Vergleich der papillären Karzinome zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR 0.0, das entspricht einer unveränderten Expression in den PTC im Vergleich zu den Umgebungsgeweben.
  • Folglich ist Gen Nr. 133 in FTC spezifisch gegenüber HK, KK und PTC überexprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von follikulären Schilddrüsenkarzinomen dar.
  • Gen Nr. 138 (BENE protein, NM_005434, Proben-Set-ID 33331_at) weist eine SLR von 0.7 in HK im Vergleich zu den Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer 1,62-fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR 1.0, das entspricht einer 2-fachen Expression in den KK im Vergleich zu den Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR –1.6, das entspricht einer 0,33-fachen Expression in den FTC im Vergleich zu den Umgebungsgeweben und im Vergleich der papillären Karzinome zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR 1.3, das entspricht einer 2,46-fachen Expression in den PTC im Vergleich zu den Umgebungsgeweben.
  • Folglich ist Gen Nr. 138 in FTC gegenüber HK, KK und PTC spezifisch vermindert exprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von follikulären Schilddrüsenkarzinomen dar.
  • 4 zeigt die differentielle Expression der Gene 8, 13, 22, 33, 42, 53, 72, 73, 76, 84, 86, 90, 98, 99, 100, 116, 117 und 133 bis 153 aus Tabelle 4, die als spezifische Marker für follikuläres Schilddrüsenkarzinom fungieren, in einem Balkendiagramm. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus Tabelle 4.
  • Die Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Karzinomen erfolgt vorzugsweise, indem in der isolierten RNA zusätzlich eine quantitative Bestimmung der Transkripte eines Referenzgens erfolgt. Die Expression des Referenzgenes dient als interner Standard. Der ermittelte Wert für die mRNA-Expression des tumorspezifischen Genes wird bevorzugt durch den ermittelten Wert für die Expression des Referenzgens geteilt. Aus der Höhe des so erhaltenen Quotienten können dann Rückschlüsse auf den Grad der Malignität des Tumors getroffen werden.
  • Das Referenzgen ist ein Gen, welches in gesundem Schilddrüsengewebe sowie in gutartigen und bösartigen Tumoren der Schilddrüse in gleicher Höhe exprimiert wird. Bevorzugte Referenzgene werden in Tabelle Nr. 5 angegeben.
  • Vorteilhaft ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine verbesserte Unterscheidung von gutartigen kalten Schilddrüsenknoten von bösartigen Schilddrüsenkarzinomen anhand der Quantifizierung der oben genannten Gene in einer äußerst kleinen Probe von Schilddrüsengewebe, insbesondere in FNAZ-Material, möglich. Durch die Quantifizierung dieser Gene kann der Prozentsatz der Schilddrüsenpunktionen, bei denen nach dem Stand der Technik keine ausreichende Beurteilung möglich ist, minimiert werden. Somit können unnötige Schilddrüsenoperationen vermieden werden.
  • Der Vergleich der Meßwerte mit Referenzbereichen, die für die unterschiedlichen benignen und malignen Schilddrüsenerkrankungen erstellt werden, gestattet somit eine Unterscheidung zwischen gutartigen (benignen) und bösartigen (malignen) Schilddrüsenknoten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen ausgewählt aus den in Tabelle 2 (spezifische Gene für gutartige kalte Knoten) aufgeführten Genen und mindestens drei Genen ausgewählt aus den in den Tabelle 3 und mindestens vier Genen ausgewählt aus den in den Tabelle 4 aufgeführten Genen bestimmt, wobei
    • a.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 23 bis 27 und 33 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert,
    • b.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert,
    • c.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie der Gene Nr. 133 und 134 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert,
    • d.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 13, 15, 22, 33, 42, 46, 53, 63, 69, 72, 73, 76, 86, 88, 90, 95 bis 100, 108, 109, 111, 116, 117, 120, 126 bis 129, 132 sowie der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert
    • e.) und wobei zusätzlich ein Referenzgen in der Gewebeprobe gemessen wird.
  • In alternativen Ausführungsformen des Verfahrens wird, um die Aussagefähigkeit des Verfahrens weiter zu verbessern, zusätzlich die Expression mindestens eines Gens aus der Gruppe der Gene spezifisch für heiße Knoten aus der Tabelle 1 und/oder weiterer Gene aus den Tabellen 2, 3 und 4 gemessen.
  • Die Entnahme der Gewebeprobe erfolgt vorzugsweise per Punktion der Schilddrüse bzw. Feinnadelaspirationszytologie (FNAZ). Aus der Gewebeprobe wird in bekannter Weise RNA isoliert (14).
  • Bevorzugt erfolgt die quantitative Messung der mRNA-Genexpression mittels quantitativer RT-PCR. In dem bekannten Prozess der RT-PCR wird zunächst mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) basierend auf der isolierten RNA komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert. Als Primer für die RT kann grundsätzlich ein Oligo-dT verwendet werden. Die Verwendung von Random-Hexamer-Primern für die RT führte jedoch erfindungsgemäß zu einer deutlichen Erhöhung der Sensitivität (mind. Faktor 4). Das Random-Hexamer-Oligonukleotid enthält jeweils eine Mischung von A, G, T, C an allen sechs Positionen und hybrisiert unspezifisch mit mRNA-Sequenzen.
  • Einzelne cDNAs werden in der anschließenden PCR mit einem sequenzspezifischen Primerpaar amplifiziert. Die Primer für die PCR haben bevorzugt eine Länge von 15 bis 30 Basenpaaren und werden Intron-überlappend konzipiert, um im Falle einer Verunreinigung der RNA mit genomischer DNA nur cDNA zu amplifizieren.
  • Besonders bevorzugt wird die PCR als Real-time-PCR durchgeführt. Bekannte Real-time PCR Verfahren sind z. B. die TaqMan®, FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), LightCycler® und Beacon-Verfahren. Durch die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Primern oder dem Einsatz von genspezifischen Oligonukleotiden als Hybridisierungsproben mit unterschiedlichen Farbstoff- oder Fluoreszenzmarker-Anbindung (TaqMan®, FRET, Beacon) kann bei diesen Verfahren vorteilhaft das PCR-Produkt während der PCR spezifisch quantifiziert werden.
  • In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt zusätzlich ein Nachweis von Pax8/PPARγ- und/oder Ret/PTC-Rearrangements und/oder von BRAF-Mutationen bevorzugt ebenfalls mittels PCR, besonders bevorzugt nach den von Cheung CC et al (17) für die Pax8/PPARγ- und von Nikiforova MN (18) für die Ret/PTC-Rearrangements und von Salvatore G et al. (19) für die BRAF-Mutationen beschriebenen Verfahren.
  • Beim Screening auf das Pax8-PPARγ-Rearrangement (17) wird das Auftreten eines Rearrangements zwischen dem Pax8- und dem PPARγ-Gen, das in einem Teil der follikulären Schilddrüsenkarzinome nachgewiesen wurde, analysiert. Dieses Rearrangement stellt daher einen zusätzlichen diagnostischen Marker für follikuläre Schilddrüsenkarzinome dar.
  • Beim Screening auf das Ret-PTC-Rearrangement (18) wird das Auftreten der häufigsten Rearrangements zwischen der zytoplasmatischen Domäne des ret-Protoonkogens mit ubiquitär in der Schilddrüse exprimierten Promotoren (Ret/PTC1: H4 und Ret/PTC3: ele1) analysiert. Diese Rearrangements wurden in einem Teil der papillären Schilddrüsenkarzinome nachgewiesen und stellen daher einen zusätzlichen diagnostischen Marker für papilläre Schilddrüsenkarzinome dar.
  • Beim BRAF-Mutationsscreening (19) wird die Basensequenz des in 45% der papillären Schilddrüsenkarzinomen mutierten Genes BRAF (V600E) (Homo sapiens BRAF) Marker analysiert. Eine BRAF-Mutation stellt daher einen zusätzlichen diagnostischen Marker für papilläre Schilddrüsenkarzinome dar.
  • Durch die Analyse dieser zusätzlichen diagnostischen Marker kann die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Verfahrens über die Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Schilddrüsentumoren noch weiter erhöht werden.
  • Durch die Messung eines solchen zusätzlichen Markers kann die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Verfahrens über die Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Schilddrüsentumoren noch weiter erhöht werden.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur differentiellen Diagnose mittels RT-PCR wird bevorzugt ein diagnostischer Kit verwendet, der jeweils folgende Bestandteile enthält:
    • 1) für die cDNA-Synthese: a) Random-Hexamer-Primer, b) Reverse Transkriptase;
    • 2) für die PCR: c) pro nachzuweisendem mRNA-Transkript mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines der Gene ausgewählt aus den Gruppen der tumorspezifischen Gene aus den Tabellen 1, 2, 3 und 4 hybridisieren; d) mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines Referenzgens, bevorzugt ausgewählt aus der in der Tabelle 5 angegebenen Gruppe der Referenzgene, hybridisieren, e) eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, wie z. B. taq-Polymerase;
    sowie dNTP-Mix (bevorzugt 10 mM), DDT, RNase-Inhibitor und entsprechende Reaktionspuffer.
  • In einer weniger bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit für die cDNA-Synthese oligo-dT anstelle des Random-Hexamers.
  • Beispiele für Primerpaare, welche die spezifische Amplifizierung der Gene Nr. 66 und 67 sowie 154 bis 157 ermöglichen, sind in den SEQ ID no 1 bis 12 angegeben.
  • In einer Ausführungsform des Kits ist jeweils einer der Primer aus 2)c) (für das tumorspezifische Gen) und 2)d) (für das Referenzgen) Fluoreszenz-markiert.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der diagnostische Kit zur Durchführung einer Real-Time PCR bevorzugt als zusätzliche Bestandteile:
    • f) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenz-markierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit dem tumorspezifischen Gen aus Tabelle 1, 2, 3 oder 4 hybridisieren, und
    • g) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenz-markierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit dem Referenzgen aus Tabelle 5 hybridisieren.
  • Sowohl als Primer, als auch als Hybridisierungssonden werden bevorzugt DNA-Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 30 Nukleotiden gewählt.
  • In einer Ausführungsform des Kits enthält die Hybridisierungssonde neben dem Fluoreszenzfarbstoff einen weiteren Farbstoff, der durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) die Fluoreszenz quencht, solange die Probe nicht mit der amplifizierten cDNA hybridisiert.
  • In einer alternativen Ausführungsform des Kits werden zwei Hybridisierungssonden eingesetzt, bei denen jeweils eine Sonde mit einem Farbstoff markiert ist. Ein solches Sondenpaar wird so gewählt, dass sie in einem geringen Abstand, bevorzugt im Abstand von 1–5 bp, auf der amplifizierten cDNA hybridisieren. Durch die Hybridisierung werden die Fluoreszenzfarbstoffe so nahe zueinander gebracht, dass FRET stattfindet und die cDNA quantifiziert werden kann. Anschließend werden (in der Extensionsphase der PCR), durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase, die Sonden von der cDNA abgetrennt. In einer bevorzugten Variante ist in einem Sondenpaar, die erste Sonde am 3'-Ende mit Fluorescein (FL) und die andere an ihrem 5'-Ende mit LightCycler-Red-640 markiert.
  • Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonden sind z. B. als LightCycler®, TaqMan® oder „molecular beacons" auf dem Markt und ermöglichen eine Quantifizierung während der PCR.
  • Beispiele für Hybridisierungssonden, welche die spezifische Erkennung von cDNA der Gene Nr. 67, 154, 155 und 157 ermöglichen, sind in den SEQ ID no 13 bis 20 angegeben. Die Sequenzen gemäß SEQ ID no 13 und 14, 15 und 16, sowie 17 und 18 können jeweils als Sondenpaar eingesetzt werden, da sie in einem geringen Abstand, bevorzugt im Abstand von 1 bis 5 bp, auf der amplifizierten cDNA hybridisieren.
  • Dazu sind die SEQ ID No. 13, 15 und 17 vorzugsweise am 3'-Ende mit Fluorescein (FL) und die SEQ ID No. 14, 16 und 18 an ihrem 5'-Ende mit LightCycler-Red-640 markiert und ermöglichen die Quantifizierung nach dem LightCycler®-Verfahren.
  • Die 3'-Hydroxylgruppe der SEQ ID No. 14, 16 und 18 ist dazu vorzugsweise mit einer Phosphatgruppe gegen die nicht erwünschte Extension durch die Polymerase blockiert. Nach der Hybridisierung bleibt zwischen den beiden Sonden ein Abstand von einer bis fünf Basen, damit die Farbstoffe nicht kollidieren.
  • Die Sonde für Gen Nr. 67 (COX-2) gemäß SEQ ID No. 19 und für Gen Nr. 155 (β-Aktin) gemäß SEQ ID No. 20 ist vorzugsweise am 5'-Ende mit VIC und am 3' Ende mit TAMRA-3' markiert und ermöglicht die Quantifizierung nach dem TaqMan®-Verfahren.
  • Für eine Multiplex-PCR unterscheiden sich die Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Primer bzw. Hybridisierungssonden markiert sind, in ihren Absorptions- und/oder Emissionsspektren. Dies ermöglicht eine parallele Quantifizierung der amplifizierten cDNA des tumorspezifischen Gens und der cDNA des Referenzgens.
  • Durch nachfolgende Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung und die der Erfindung zugrunde liegende wissenschaftlicher Erkenntnis näher erläutert:
  • Dabei zeigen
  • 1 Mittelwert ± SEM (SEM = Standardfehler des Mittelwertes) der „signal log ratio" der Gene 1 bis 22 aus Tabelle 1 in heißen Schilddrüsenknoten, gutartigen kalten Schilddrüsenknoten sowie papillären und follikulären Schilddrüsenkarzinomen jeweils im Verhältnis zu der Expression im korrespondierenden Umgebungsgewebe.
  • 2 Mittelwert ± SEM (SEM = Standardfehler des Mittelwertes) der „signal log ratio" der Gene 23 bis 35 aus Tabelle 2 in heißen Schilddrüsenknoten, gutartigen kalten Schilddrüsenknoten sowie papillären und follikulären Schilddrüsenkarzinomen jeweils im Verhältnis zu der Expression im korrespondierenden Umgebungsgewebe.
  • 3 Mittelwert ± SEM (SEM = Standardfehler des Mittelwertes) der „signal log ratio" der Gene 2, 13, 15, 16, 22, 32, 33 und 36 bis 132 aus Tabelle 3 in heißen Schilddrüsenknoten, gutartigen kalten Schilddrüsenknoten sowie papillären und follikulären Schilddrüsenkarzinomen jeweils im Verhältnis zu der Expression im korrespondierenden Umgebungsgewebe.
  • 4 Mittelwert ± SEM (SEM = Standardfehler des Mittelwertes) der „signal log ratio" der Gene 8, 13, 22, 33, 42, 53, 72, 73, 76, 84, 86, 90, 98, 99, 100, 116, 117 und 133 bis 153 aus Tabelle 4 in heißen Schilddrüsenknoten, gutartigen kalten Schilddrüsenknoten sowie papillären und follikulären Schilddrüsenkarzinomen jeweils im Verhältnis zu der Expression im korrespondierenden Umgebungsgewebe.
  • Ausführungsbeispiel 1:
  • Untersuchung der differentiellen Genexpression mit Affymetrix GeneChips U95Av2 (Affymetrix; Santa Clara, CA, USA):
  • Zunächst wurde dazu Total-RNA aus 15 heißen Schilddrüsenknoten, deren Umgebungsgewebe, 22 kalten Schilddrüsenknoten, sowie deren Umgebungsgewebe mittels TRIzol-Reagenz (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) entsprechend der Herstellerangaben isoliert. Anschließend wurde die Total-RNA mit Hilfe des RNeasy Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend dem Protokoll des Herstellers aufgereinigt. Qualität und Quantität der RNA wurden auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) unter Verwendung des RNA 6.000 LabChip Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) entsprechend der Herstellerangaben ermittelt.
  • Herstellung, Aufreinigung und Analyse der cRNA erfolgte nach den mitgelieferten Protokollen von Affymetrix. Die Synthese doppelsträngiger cDNA erfolgte aus 10 μg Total-RNA. Dabei wurde die Superscript II Reverse-Transcriptase (Superscript II, Life Technologies, Gaithersburg, MD USA) und ein oligo-dT-Primer mit einer T7-RNA-Polymerase-Promoter-Sequenz (Genset SA, Paris, Frankreich) verwandt. Die cDNA wurde anschließend mittels Phenol-Chloroform-Extraktion aufgereinigt. Danach erfolgte die cRNA-Synthese in einer in vitro-Transkription unter Verwendung des ENZO BioArray RNA Labeling Kits (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Nicht inkorporierte Nukleotide wurden durch eine RNeasy Kit-Aufreinigung (QIAGEN, Hilden, Deutschland) entfernt. Die cRNA wurde danach entsprechend dem Affymetrix Protokoll fragmentiert und über Nacht auf die Affymetrix GeneChips U95Av2 hybridisiert. Waschen, Färben und Scannen der GeneChips erfolgte ebenfalls entsprechend den Vorschriften des Affymetrix Protokolls.
  • Der Vergleich der Expressionsdaten dieser 15 heißen Schilddrüsenknoten, 22 kalten Schilddrüsenknoten und deren normaler Umgebungsgewebe erfolgte mit Expressionsdaten von 8 follikulären Karzinomen und 8 Normalgeweben und 8 papillären Karzinomen und deren Umgebungsgewebe.
  • Die Datenanalyse erfolgte in einem ersten Schritt mit der „Significance analysis of microarrays" (SAM)-Methode. Es handelt sich dabei um einen Algorithmus, mit dessen Hilfe differentiell exprimierte Gene mit statistisch adjustierter Signifikanz (in Bezug auf die große Anzahl parallel berechneter Gene) identifiziert werden können. Dabei wurden die Einstellungen der SAM-Analyse so gewählt, daß maximal 1% Falsch-Positive Gene detektiert wurden. In einem zweiten Schritt der Datenanalyse wurden aus der resultierenden Genmenge der SAM-Analyse die Gene identifiziert, deren absolute Signalwerte größer als 200 waren, was garantiert, daß diese Gene mittels real-time RT-PCR nachgewiesen werden können und zusätzlich mindestens zweifache Expressionsunterschiede zwischen den untersuchten Entitäten (heiße Knoten, kalte Knoten, papilläre Karzinome und follikuläre Karzinome) aufwiesen, was sicherstellen soll, daß quantitative Expressionsunterschiede mittels real time RT-PCR detektiert werden können. Die resultierenden Genmengen wurden schließlich gemäß ihrer Spezifität unterteilt in Gene, die ein spezifisches Expressionsmuster für heiße Schilddrüsenknoten aufweisen; Gene, die ein spezifisches Expressionsmuster für kalte Schilddrüsenknoten aufweisen; Gene, die ein spezifisches Expressionsmuster für papilläre Karzinome aufweisen und Gene, die ein spezifisches Expressionsmuster für follikuläre Schilddrüsenkarzinome aufweisen.
  • Ausführungsbeispiel 2:
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren wird zunächst eine Gewebeprobe mittels Feinnadelaspirationszytologie (FNAZ) entnommen.
  • Die Feinnadelaspiration erfolgt am liegenden Patienten nach Hautdesinfektion ohne Lokalanästhesie durch Einmalkanülen mit einem Außendurchmesser von 0,6 bis 0,7 mm möglichst unter sonographischer Kontrolle. Pro Knoten sollten fächerartig mindestens zwei Punktionen in verschiedene Knotenareale durchgeführt werden. Zystenpunktate sollten zentrifugiert werden und bei Versand der Zystenflüssigkeit sollte Heparin zugesetzt werden. Nach Zystenentleerung ist zudem eine erneute Punktion solider Knotenanteile anzustreben.
  • Ausführungsbeispiel 3:
  • Zur Extraktion von RNA werden die Einmalkanülen mit der Gewebeprobe aus Ausführungsbeispiel 2 in 1 ml TRIzol (in 1,5 ml Eppendorf-Tubes) mehrfach gründlich ausgespült. Anschließend wird das Homogenat gevortext und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgt eine Zugabe von 200 μl Chloroform. Vor einer erneuten Inkubation bei Raumtemperatur (2–3 min) wird das Eppendorf-Tube ca. 15 sec kräftig geschüttelt. Nach dem Inkubationsschritt wird 15 min bei 4°C und 15.000 rpm abzentrifugiert. Die obere Phase wird anschließend in ein neues Tube überführt und nach Zugabe von 500 μl Isopropanol leicht das Tube geschwenkt und abermals für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. (Die Interphase und die phenolische Phase werden zur Extraktion der DNA verwandt (siehe Ausführungsbeispiel 8)). Danach erfolgt eine erneute Zentrifugation für 15 min bei 4°C und 15.000 rpm. Nachdem der Überstand abgenommen wurde wird das RNA-Pellet mit 150 μl 70 %igem Ethanol gewaschen und nochmals für 5 min bei 4°C und 15.000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wird erneut abgenommen und das RNA-Pellet kurz bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wird es in 12 μl Wasser aufgenommen.
  • Die Synthese der cDNA erfolgte in einem Reaktionsansatz bestehend aus 11,5 μl RNA (s. o.), 0,5 μg Random-Hexamer-Primer, 5 × Erststrang-Puffer (250 mM Tris-HCl [pH 8.3], 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland), 0.5 mM dNTPs, 5 mM DTT (GibcoBRL), 15 U Prime RNase Inhibitor (PeqLab, Erlangen, Deutschland), und 200 U Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland) für 1 Stunde bei 37°C mit einem abschließenden Hitzeschritt bei 94°C für 5 min.
  • Ausführungsbeispiel 4:
  • Die gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltene cDNA wird einer quantitativen PCR- wie folgt differentiell auf einem LightCycler (Roche, Mannheim, Deutschland) analysiert:
    Dabei wurde die Expression des in papillären Schilddrüsenkarzinomen überexprimierten Genes Cyclooxygenase-2 (Homo sapiens COX-2, Gen Nr. 67 aus Tabelle 3) als diagnostischer Marker analysiert. Als endogene (innere) Kontrolle wurde in einem parallel PCR Ansatz die Expression des Referenzgenes β-Aktin (Gen Nr. 155 aus Tabelle 5) quantitativ analysiert.
  • Zuerst wurden optimale PCR-Bedingungen, entsprechend den Herstellervorgaben etabliert (14). Die Amplikons (COX-2 und β-Aktin) wurden anschließend in den pGEM-T-Vektor (Promega, Madison, WI, USA) kloniert und Eichkurven, mittels Plasmidverdünnungsreihen, unter Verwendung des LightCycler DNA Master SYBR Green I Kits (Roche), erstellt.
  • Der 20-μl-Reaktionsansatz zum Nachweis von COX-2 setzt sich dabei wie folgt zusammen:
    • – 2 μl LightCycler DNA Master SYBR Green I,
    • – 5 mM zusätzliches MgCl2,
    • – je 0,5 μM Forward- und Reverse-Primer gemäß SEQ ID No. 3 und 4,
    • – 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3.
  • Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
    95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, 64°C 7 sec, 72°C 13 sec.
  • Der 20-μl-Reaktionsansatz zum Nachweis des Referenzgens β-Aktin setzt sich dabei wie folgt zusammen:
    • – 2 μl LightCycler DNA Master SYBR Green I,
    • – 4 mM zusätzliches MgCl2,
    • – je 0,5 μM Forward- und Reverse-Primer gemäß SEQ ID No. 7 und 8,
    und 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3.
  • Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
    95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, 55°C 7 sec, 72°C 9 sec.
  • Die Primer wurden von MWG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert.
  • Ausführungsbeispiel 5:
  • Die gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltene cDNA wird einer quantitativen PCR wie folgt differentiell auf einem LightCycler (Roche, Mannheim, Deutschland) analysiert:
    Dabei wurde die Expression des in papillären Schilddrüsenkarzinomen überexprimierten Genes Cyclooxygenase-2 (Homo sapiens COX-2, Gen Nr. 67 aus Tabelle 3) als diagnostischer Marker analysiert. Als endogene Kontrolle wurde in einem parallel PCR Ansatz die Expression des Referenzgenes β-Aktin (Gen Nr. 155 aus Tabelle 5) quantitativ analysiert.
  • Zuerst wurden optimale PCR-Bedingungen, entsprechend den Herstellervorgaben etabliert (14). Die Amplikons (COX-2 und β-Aktin) wurden anschließend in den pGEM-T-Vektor (Promega, Madison, WI, USA) kloniert und Eichkurven, mittels Plasmidverdünnungsreihen, unter Verwendung des LightCycler DNA Master Hybridization Probes Kits (Roche), erstellt.
  • Der 20-μl-Reaktionsansatz zum Nachweis von COX-2 setzt sich dabei wie folgt zusammen:
    • – 2 μl LightCycler DNA Master Hybridization Probes,
    • – 5 mM zusätzliches MgCl2,
    • – je 0,5 μM Forward- und Reverse-Primer gemäß SEQ ID No. 3 und 4,
    • – 0,15 μM der 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonde mit einer DNA Sequenz gemäß SEQ ID No. 19
    und 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3.
  • Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
    95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, 64°C 7 sec, 72°C 13 sec.
  • Der 20-μl-Reaktionsansatz zum Nachweis des Referenzgens β-Aktin setzt sich dabei wie folgt zusammen:
    • – 2 μl LightCycler DNA Master Hybridization Probes,
    • – 4 mM zusätzliches MgCl2,
    • – je 0,5 μM Forward- und Reverse-Primer gemäß SEQ ID No. 7 und 8,
    • – 0,15 μM der 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonde mit einer DNA Sequenz gemäß SEQ ID No 20
    und 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3.
  • Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
    95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, 55°C 7 sec, 72°C 9 sec.
  • Die Primer wurden von MWG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Die 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonden sind bei Applied Biosystems (Darmstadt, Deutschland) erhältlich.
  • Ausführungsbeispiel 6:
  • Für andere Marker bzw. Referenzgene wird eine PCR entsprechend den in Ausführungsbeispiel 4 angegebenen Bedingungen durchgeführt. Das zusätzlich zugesetzte MgCl2, die Annealingtemperatur und die Elongationszeit sind abhängig von dem zu amplifizierenden Marker bzw. Referenzgen und werden so optimiert, daß eine Schmelzkurve mit einem einzigen Maximalwert detektiert wird. Zusätzlich wurden die Amplikons mittels Agarosegelelektrophorese hinsichtlich einer korrekten Größe der Bande untersucht.
  • Die Amplifikationen wird generell mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
    95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, x°C 7 sec, 72°C y sec.
  • Dabei entspricht x der optimierten Annealing-Temperatur für das spezifische Gen und y entspricht der Elongationszeit des spezifischen Amplikons. Die PCR Konditionen für die Gene Nr. 66 und 67 aus Tabelle 3 und die Gene 154 bis 157 aus Tabelle 5 werden in der nachfolgenden Übersicht zusammengefasst:
    Gen Nr. Gen-Symbol MgCl2-Konz. Annealingtemperatur x Elongationszeit y
    66 ETS 1 5 mM 64°C 13 sec
    67 COX 2 5 mM 64°C 13 sec
    154 GAPDH 4 mM 57°C 8 sec
    155 β-Aktin 4 mM 55°C 9 sec
    156 18S rRNA 4 mM 64°C 15 sec
    157 TG 4 mM 62°C 18 sec
  • Ausführungsbeispiel 7:
  • Ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens per real time PCR enthält beispielhaft folgende Komponenten zum Nachweis des in papillären Schilddrüsenkarzinomen überexprimierten Genes Homo sapiens cyclooxygenase-2 (COX-2, Gen Nr. 67 aus Tabelle 3) als diagnostischem Marker und des Referenzgenes β-Aktin (Gen Nr. 155 aus Tabelle 5):
    • 1. Für die cDNA-Synthese: – 20 μg Random-Hexamer-Primer – 0,1 M DTT – 10 mM dNTP-Mix (je 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) – 10.000 U Reverse Transkriptase – 10.000 U RNase Inhibitor – 5 × Erststrang-Puffer
    • 2. Für die real time PCR – 5 nmol Forward-Primer COX-2 (Nr. 96; Markergen) gemäß SEQ ID No. 3, – 5 nmol Reverse-Primer COX-2 (Nr. 96; Markergen) gemäß SEQ ID No. 4, – 1 nmol einer 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonde für COX-2 (Nr. 67; Markergen) mit einer DNA Sequenz gemäß SEQ ID No. 19, – 5 nmol Forward-Primer β-Aktin (Nr. 155; Referenzgen) gemäß SEQ ID No. 7, – 5 nmol Reverse-Primer β-Aktin (Nr. 155; Referenzgen) gemäß SEQ ID No. 8, – 1 nmol einer 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonde für β-Aktin (Nr. 155; Referenzgen) mit einer DNA Sequenz gemäß SEQ ID No. 20, – 5 × PCR-Puffer – 100 U Taq-Polymerase.
  • Ausführungsbeispiel 8:
  • Nachdem die wäßrige Phase zur RNA Extraktion (Ausführungsbeispiel 3) abgenommen wurde, wird die DNA aus der Interphase und der organischen Phase mittels Ethanol präzipitiert. Dazu werden 0,3 ml 100% Ethanol zur Interphase und organischen Phase zugegeben und durch leichtes Schwenken gemischt. Anschließend werden die Proben 2–3 min bei 15–30°C gelagert und dann die DNA bei 2.000 × g für 5 min bei 4°C abzentrifugiert. Nach Entfernen des Phenol/Ethanol-Überstandes wird die DNA mit 1 ml einer 0,1 M Natriumcitrat in 10% Ethanollösung gewaschen. Das DNA-Pellet wird dabei 30 min bei Raumtemperatur in der Lösung gelagert und anschließend bei 2.000 × g für 5 min bei 4°C abzentrifugiert. Nachdem dieser Waschschritt wiederholt wurde, wird die DNA in 1,5 ml 75% Ethanol für 15–20 min bei Raumtemperatur gelagert und anschließend bei 2.000 × g für 5 min bei 4°C abzentrifugiert. Das DNA-Pellet wird Luft getrocknet und in 8 mM NaOH resuspendiert.
  • Ausführungsbeispiel 9:
  • Mit der gemäß Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen DNA wird wie folgt ein BRAF-Mutationsscreening (19) durchgeführt:
    Der 25-μl-Reaktionsansatz zur Amplifizierung von BRAF setzt sich dabei wie folgt zusammen:
    • – 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 (pH 8,3),
    • – 0,2 mM dNTP-Mix
    • – je 0,8 pmol Forward-(5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3') und Reverse-(5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3')Primer,
    • – 5 μl DNA Template aus Ausführungsbeispiel 9,
    • – 1 U AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems).
  • Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
    94°C 5 min., 40 Zyklen: (94°C 30 sec, 60°C 30 sec, 72°C 60 sec), 72°C 5 min.
  • Nach erfolgter Amplifizierung und anschließender Aufreinigung des PCR-Produktes mittels QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) (entsprechend den Herstellervorgaben), erfolgt eine Sequenzierung des PCR-Produktes mit dem Forward-Primer unter Verwendung des Big Dye Terminator Kits (Applied Biosystems) auf einem ABI Prism DNA Sequencer.
  • Die Primer wurden von MWG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert.
  • Ausführungsbeispiel 10:
  • Mit der gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltenen cDNA wird wie folgt ein Screening auf das Pax8-PPARγ-Rearrangement (17) durchgeführt:
    Der 30-μl-Reaktionsansatz zur Amplifizierung des Rearrangements setzt sich dabei wie folgt zusammen:
    • – 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 (pH 8,3),
    • – 0,2 mM dNTP-Mix
    • – je 0,8 pmol Forward-(5'-AACCTCTCGACTCACCAGAC-3') und Reverse-(5'-AGAATGGCATCTCTGTGTCAAC-3')Primer,
    • – 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3,
    • – 1 U AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems).
  • Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
    94°C 5 min., 40 Zyklen: (94°C 40 sec, 60°C 1 min, 72°C 1 min), 72°C 5 min.
  • Nach erfolgter Amplifizierung wird das PCR Produkt elektrophoretisch auf einem 1,5% Agarosegel aufgetrennt.
  • Ausführungsbeispiel 11:
  • Mit der gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltenen cDNA wird wie folgt ein Screening auf das Ret-PTC-Rearrangement (18) durchgeführt:
    Der 30-μl-Reaktionsansatz zur Amplifizierung des Rearrangements setzt sich dabei wie folgt zusammen:
    • – 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 (pH 8,3),
    • – 0,2 mM dNTP-Mix
    • – je 1 mM Forward-(Ret/PTC1: 5'-GTCGGGGGGCATTGTCATCT-3', Ret/PTC3: 5'-TGGAGAAGAGGAGCTGTATC-3') und Reverse-(Ret/PTC1: 5'-AAGTTCTTCCGAGGGAATTC-3', Ret/PTC3: 5'-CTTTCAGCATCTTCACGG-3')Primer,
    • – 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3,
    • – 1 U AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems).
  • Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
    95°C 4 min., 40 Zyklen: (95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 30 sec), 72°C 5 min.
  • Nach erfolgter Amplifizierung wird das PCR Produkt elektrophoretisch auf einem 1,5% Agarosegel aufgetrennt.
  • In der Erfindungsbeschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet:
    • bp
    Basenpaare
    cDNA
    zur mRNA komplementäre DNA
    COX-2
    Cyclooxygenase-2
    cRNA
    Kopie-RNA
    DNA
    Desoxyribonukleinsäure
    DDT
    Dithiothreitol
    ETS-1
    Human erythroblastosis virus oncogene homolog 1
    FNAZ
    Feinnadelaspirationszytologie
    FRET
    Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
    FTC
    follikuläres Schilddrüsenkarzinom
    GAPDH
    Glyzerinaldehyd-Dehydrogenase
    HK
    heiße Schilddrüsenknoten
    KK
    kalte Schilddrüsenknoten
    MEN
    Multiple endokrine Neoplasie
    μM
    μmol/Liter
    mM
    mmol/Liter
    mRNA
    Messenger-RNA
    NCBI
    National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA
    PBS
    Phosphatsalzpufferlösung
    PCR
    Polymerasekettenreaktion
    PTC
    papillären Schilddrüsenkarzinomen
    RT-PCR
    Reverse Transkriptase PCR
    RNA
    Ribonukleinsäure
    mRNA
    Messenger-RNA
    rRNA
    Ribosomale Ribonukleinsäure
    SEM
    Standardfehler des Mittelwertes
    SLR
    Signal log ratio
    TG
    Thyroglobulin
    TSH
    thyroid stimulating hormone, Thyrotropin
    TSHR
    Thyrotropinrezeptor
    UG
    Umgebungsgewebe
  • Literaturverzeichnis:
    • 1. Hampel R, Kulberg T, Klein K et al. [Goiter incidence in Germany is greater than previously suspected]. Med Klin 1995; 90(6): 324–329.
    • 2. Tan GH, Gharib H. Thyroid incidentalomas: management approaches to nonpalpable nodules discovered incidentally on thyroid imaging. Ann Intern Med 1997; 126: 226–231.
    • 3. Ezzat S, Sarti DA, Cain DR, Braunstein GD. Thyroid incidentalomas. Prevalence by palpation and ultrasonography. Arch Intern Med 1994; 154: 1838–1840.
    • 4. Hedinger C, Williams ED, Sobin LH. The WHO histological classification of thyroid tumors: a commentary on the second edition. Cancer 1989; 63: 908–911.
    • 5. Cavallieri RR, McDouglas IR. In vitro isotopic test and imaging. In: Braverman LE, Utiger RD, editors. Werner and Ingbar's the thyroid: A fundamental and clinical text. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1996: 902–909.
    • 6. Mazzaferri EL. Thyroid cancer in thyroid nodules: finding a needle in the haystack. Am J Med 1992; 93: 359–362.
    • 7. Gharib H. Changing concepts in the diagnosis and management of thyroid nodules. Endocrinol Metab Clin North Am 1997; 26: 777–800.
    • 8. Fuhrer D, Warner J, Sequeira M, Paschke R, Gregory J, Ludgate M. Novel TSHR germline mutation (Met463Val) masquerading as Graves' disease in a large Welsh kindred with hyperthyroidism. Thyroid 2000; 10(12): 1035–1041.
    • 9. Rojeski MT, Gharib H. Nodular thyroid disease. Evaluation and management. N Engl J Med 1985; 313: 428–436.
    • 10. Mazzaferri EL. Management of a solitary thyroid nodule. N Engl J Med 1993; 328: 553–559.
    • 11. Castro MR, Gharib H. Thyroid nodules and cancer. When to wait and watch, when to refer. Postgrad Med 2000; 107(1): 113–124.
    • 12. Elisei R, Romei C, Vorontsova T et al. RET/PTC rearrangements in thyroid nodules: studies in irradiated and not irradiated, malignant and benign thyroid lesions in children and adults. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86(7): 3211–3216.
    • 13. Engelbach M, Kunt T, Kann P et al. Prädiktive genetische Untersuchungen. Individualisierung von Diagnostik und Therapie bei Familien mit multipler endokriner Neoplasie Typ II. Dtsch Med Wochenschr 2000; 125(3): 37–44.
    • 14. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 162(1): 156–159.
    • 15. Westfall PH, Young SS. Resampling-based multiple testing: Examples and methods for multiple p-value adjustment. New York: John Wiley & Sons, 1993.
    • 16. Eszlinger M, Krohn K, Paschke R. Complementary DNA expression array analysis suggests a lower expression of signal transduction proteins and receptors in cold and hot thyroid nodules. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86(10): 4834–4842.
    • 17. Cheung CC et al. Analysis of ret/PTC Gene Rearrangements Refines the Fine Needle Aspiration Diagnosis of Thyroid Cancer. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 6(5): 2187–90.
    • 18. Nikiforova, MN. et al. PAX8-PPARγ Rearrangement in Thyroid Tumors: RT-PCR and Immunohistochemical Analyses. Am J Surg Pathol. 2002; 6(8): 1016–23.
    • 19. Salvatore, G. et al. Analysis of BRAF Point Mutation and Ret/PTC Rearrangement Refines the Fine-Needle Aspiration Diagnosis of Papillary Thyroid Carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 2004; 89(10): 5175–5180.
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • SEQUENZPROTOKOLL – SEQUENCE LISTING
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001

Claims (9)

  1. Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Tumoren bei dem: 1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird, 2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von Genen ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 erfolgt, wobei eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen und eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens vier Genen aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen erfolgt, wobei a.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie der Gene 23 bis 27 und 33 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, b.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9, 10, 12, 16 bis 18 sowie der Gene 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, c.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie der Gene Nr. 133 und 134 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert, d.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 13, 15, 22, 33, 42, 46, 53, 63, 69, 72, 73, 76, 86, 88, 90, 95 bis 100, 108, 109, 111, 116, 117, 120, 126 bis 129, 132 sowie der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Unterscheidung von bösartigen papillären Karzinomen oder bösartigen follikulären Karzinomen, von gutartigen heißen Knoten, gutartigen kalten Knoten und den jeweils anderen genannten bösartigen Karzinomen, bei dem: a.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen ausgewählt aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen erfolgt und eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 83, 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 15, 46, 63, 69, 88, 95 bis 97, 108, 109, 111, 120, 126 bis 129 und 132 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen papillären Schilddrüsenkarzinoms liefert; oder b.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens vier Genen ausgewählt aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen erfolgt und eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 133 und 134 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen follikulären Schilddrüsenkarzinoms liefert.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Unterscheidung von gutartigen heißen Knoten oder gutartigen kalten Knoten, von bösartigen follikulären Karzinomen, bösartigen papillären Karzinomen und von den jeweils anderen genannten gutartigen kalten Knoten, bei dem: a.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 22 erfolgt und eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9, 10, 12 und 16 bis 18 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen heißen Knotens liefert; oder b.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens drei Genen ausgewählt aus den in Tabelle 2 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 23 bis 35 erfolgt und eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 23 bis 27 und 33 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen kalten Knotens liefert.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der isolierten RNA zusätzlich eine quantitative Bestimmung der Transkripte eines Referenzgens erfolgt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzgen aus der Gruppe der in Tabelle 5 angegebenen Gene mit den Gen-Nummern 154 bis 157 gewählt wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Gewebeprobe ein Schilddrüsenpunktat oder eine Feinnadelaspirationszytologie (FNAZ) gewählt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine Analyse auf das Vorhandensein von Pax8/PPARγ- und/oder Ret/PTC-Rearrangements und/oder von BRAF-Mutationen durchgeführt wird.
  8. Diagnostischer Kit zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Tumoren mittels RT-PCR, zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 4 bis 7, der folgende Bestandteile enthält: 1.) für die cDNA-Synthese: a.) Random-Hexamer-Primer oder oligo dT, b.) Reverse Transkriptase; 2.) für die PCR: a.) pro nachzuweisendem mRNA-Transkript mindestens zwei Primer, die spezifisch mit der cDNA eines der Gene ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 hybridisieren; b.) mindestens zwei Primer, die spezifisch mit der cDNA eines Referenzgens ausgewählt aus den in Tabelle 5 angegebenen Genen mit den Gen-Nummern 154 bis 157 hybridisieren, c.) eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, sowie entsprechende Reaktionspuffer.
  9. Diagnostischer Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass er als zusätzliche Bestandteile für die PCR enthält: a.) pro nachzuweisendem mRNA-Transkript eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenz-markierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit der cDNA eines der Gene ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 hybridisieren, und b.) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit der cDNA eines Referenzgens ausgewählt aus den in Tabelle 5 angegebenen Genen mit den Gen-Nummern 154 bis 157 hybridisieren.
DE102005011003A 2004-03-03 2005-03-03 Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren Expired - Fee Related DE102005011003B9 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005011003A DE102005011003B9 (de) 2004-03-03 2005-03-03 Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004011623.7 2004-03-03
DE102004011623 2004-03-03
DE102005011003A DE102005011003B9 (de) 2004-03-03 2005-03-03 Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE102005011003A1 DE102005011003A1 (de) 2005-10-20
DE102005011003B4 DE102005011003B4 (de) 2008-07-31
DE102005011003B9 true DE102005011003B9 (de) 2009-02-26

Family

ID=35034240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102005011003A Expired - Fee Related DE102005011003B9 (de) 2004-03-03 2005-03-03 Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102005011003B9 (de)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10118452A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-31 Joern Bullerdiek Nukleinsäuresequenzen von Hyperplasien und Tumoren der Schilddrüse

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10118452A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-31 Joern Bullerdiek Nukleinsäuresequenzen von Hyperplasien und Tumoren der Schilddrüse

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Abstract: Cancer Res. 2003, 63(7), 1454-7 *
Abstract: Histopathology 2003, 42(5), 492-7 *
Abstract: J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 88(9), 4440-5 *
Abstract: Mod. Pathol. 1999, 12(1), 61-8 *
Abstract: Thyroid 1999, 9(5), 455-66 *
Chemical Abstract AN 136:245350 *
Medline AN 97154554 *
Mutation Research 2003, 533(1-2), 201-209 *
NCBI AY462100 *
NCBI AY462100; Chemical Abstract AN 136:245350; Me dline AN 97154554; Mutation Research 2003, 533(1-2 ), 201-209; Abstract: J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 88(9), 4440-5; Abstract: Cancer Res. 2003, 6 3(7), 1454-7; Abstract: Thyroid 1999, 9(5), 455-66 ; Abstract: Mod. Pathol. 1999, 12(1), 61-8; Abstra ct: Histopathology 2003, 42(5), 492-7

Also Published As

Publication number Publication date
DE102005011003A1 (de) 2005-10-20
DE102005011003B4 (de) 2008-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005085471A2 (de) Verfahren und mittel zur differentiellen diagnose von schilddrüsentumoren
DE60030281T2 (de) Methoden zur verbesserung der sensitivität und spezifität von screeningverfahren für krebs und krebs-vorstufen
DE69433816T2 (de) Die bestimmung von nukleinsäuremutationen durch analyse des sputum
DE68928500T2 (de) Nachweis des menschlichen tumorfortschrittes und heilmittelwiderstandes
DE60126592T2 (de) Verfahren, zusammensetzungen und kits zur identifizierung und überwachung von brustkrebs
DE60018616T2 (de) Digital Amplification
DE112005002742B4 (de) Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen
DE60219652T2 (de) Chromogene in-situ-hybridisierungsverfahren, kits und zusammensetzungen
DE60214725T2 (de) Verfahren zur bestimmung der expression des dihydropyrimidindehydrogenasegens
DE69015261T2 (de) Verfahren zum Nachweis des humanen Papillomvirus.
DE602004004988T2 (de) Methylierungsstatus-Detektionsassays mittels methylierungsspezifischer Primerextension (MSPE)
DE10238046A1 (de) Verfahren zum Untersuchen von Körperflüssigkeiten auf Krebszellen, dessen Verwendung, entsprechende Analysekits und Verwendung bestimmter Wirkstoffe zur Behandlung von Krebs
DE69736475T2 (de) Quantifizierung von rna-transkripten mittels genomischer dna als internen standard der amplifizierungsreaktion
DE60125171T2 (de) Verfahren zur detektion und quantifizierung von menschlichen p450-molekülen und sonde und kit für dieses verfahren
DE102010043541B4 (de) Verfahren und Mittel zur Vorhersage der Überlebensdauer beim Pankreaskarzinom durch Analyse von Biomarkern
US8367814B2 (en) Assay for BCR/ABL gene rearrangement
DE102005011003B9 (de) Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren
EP3314022B1 (de) Egfr-assay
DE60316464T2 (de) Neue real-time rt-pcr methode zur sensitiven detektierung mehrerer mage gen transkripte
DE10217102B4 (de) Verfahren zur Charakterisierung von Primärtumoren
DE19716346C1 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytokeratinen
DE102017214449A1 (de) Verfahren und Mittel zur Diagnostik von Tumoren durch Nachweis und Quantifizierung heterogen methylierter Epiallele
DE602005002390T2 (de) In vitro Verfahren zur Diagnose von neoplastischen Erkrankungen durch Analyse des Methylierungsstatus des CDH4 Gens, Oligonukleotide und Kits zur Durchführung eines solchen Verfahrens
DE102020102143B3 (de) Verfahren zur Bestimmung, ob eine Behandlung einer Krebserkrankung begonnen oder fortgesetzt werden soll, ein Biomarker, der mindestens einem Markergen entspricht, und eine Verwendung des Biomarkers in dem erfindungsgemäßen Verfahren
DE60109002T2 (de) Methode zum Nachweis von transkribierten genomischen DNA-Sequenzen

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8364 No opposition during term of opposition
8397 Reprint of erroneous patent document
8339 Ceased/non-payment of the annual fee