DE102005008765B4

DE102005008765B4 - Kontrastmittel auf der Basis von Bakteriophagen, diese enthaltende Zusammensetzung, deren Verwendung und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE102005008765B4
Application number: DE102005008765.5A
Authority: DE
Inventors: Dr. Hengerer Arne
Original assignee: Siemens Healthcare GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare GmbH
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2016-06-16
Anticipated expiration: 2025-02-26
Also published as: DE102005008765A1; US20080260642A1; WO2006089912A1

Abstract

Kontrastmittel auf der Basis von rekombinanten Phagenpartikeln (1), umfassend ein erstes Fusionsprotein, welches ein Phagen-Oberflächenprotein (5) und einen für eine nachzuweisende Zielstruktur (8) spezifischen Liganden (6) umfasst, wobei eine lokalisierte Präsentation des Liganden (6) an nur einem Ende des jeweiligen Phagenpartikels (1) möglich ist, und ein zweites Fusionsprotein, welches ein Phagen-Oberflächenprotein (3) und ein Peptid oder Polypeptid umfasst, wobei das Peptid oder Polypeptid ein signalgebendes Molekül (4) ist, und/oder in der Lage ist, an ein signalgebendes Molekül (4) zu binden, wobei das zweite Fusionsprotein in einer Anzahl von bis zu 3000 Kopien pro Phagenpartikel (1) exprimiert wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Kontrastmittel auf der Basis von Bakteriophagen, diese enthaltende Zusammensetzung, deren Verwendung und Verfahren zu deren Herstellung gemäß den Patentansprüchen.
Kontrastmittel für Molecular Imaging bestehen im allgemeinen aus einem signalgebenden Molekül, einem Liganden, der in der Lage ist, an eine nachzuweisende Zielstruktur zu binden, sowie einem Linker zur Koppelung des signalgebenden Moleküls und des Liganden.
Als signalgebende Moleküle werden im Stand der Technik bereits mit Radioisotopen markierte Moleküle, mit ferro-, para- oder supramagnetischen Elementen markierte Moleküle, Fluorophoren oder dergleichen eingesetzt. Bekannt sind z. B. Biomoleküle, bei denen ein stabiles Isotop durch einen Positronenemitter wie z. B. ¹¹C, ¹³N oder ¹⁵O ersetzt ist. Dadurch kann das metabolische Verhalten der markierten Biomoleküle verfolgt werden. Bei der Magnetresonanztomographie (MRT) werden para- oder ferromagnetische Substanzen wie z. B. cheliertes Gd oder Eisenoxid-Nanopartikel als signalgebende Moleküle verwendet.
Der Ligand ist eine Struktur, welche in der Lage ist, spezifisch an eine nachzuweisende Zielstruktur zu binden. Die nachzuweisende Zielstruktur kann jeder geeignete Marker sein, z. B. ein Krankheitsmarker, also ein möglichst spezifischer Marker für ein pathologisch verändertes Gewebe wie etwa Tumore, Entzündungsherde etc.
Bei den Liganden handelt es sich daher z. B. um spezifische Peptide, wie z. B. Antikörper oder Fragmente davon. Der Ligand wird derzeit in aufwändigen Verfahren wie z. B. High-Through-put-Verfahren gewonnen, aus chemischen oder biologische Banken isoliert, als Antikörper nach Immunisierung gewonnen oder durch „Rational Design” hergestellt.
Bakteriophagen werden im Stand der Technik bereits zum Oberflächen-Display und zur Selektion von Peptiden und Polypeptiden verwendet. Bekannt ist hierfür die so genannte Phage-Display-Technik (siehe z. B. Hoogenboom H. R., „Overview of Antibody Phage-Display Technology and its applications”, Methods of Molecular Biology, 2002, Vol. 178, S. 1–37, sowie Ladner, R. C., „Polypeptides from Phage display. A superior source of in vivo imaging analysis”, The Quarterly Journal of Nuclear Medicine, Juni 1999, Vol. 43(2), S. 119–124).
Phagen, die im Stand der Technik am häufigsten für die Phage-Display-Technik verwendet werden, sind die Bakteriophagen M13, f1 und Fd, die zu den filamentösen Phagen Ff gehören.
Beim herkömmlichen Phage-Display wird zunächst eine Bibliothek aus Phagen-DNA generiert, bei der eine Anzahl von zu selektionierenden DNA-Sequenzen in Phagengenome oder auch modifizierte Phagengenome, die Plasmiden ähneln, sogenannte Phagemide, hineinkloniert wird. Dabei wird die zu selektionierende DNA-Sequenz so in das Phagengenom hineinkloniert, dass die Expression zu einem Fusionsprotein aus einem der Phagen-Oberflächenproteine, in der Regel gpIII, gpVIII oder gpVI, sowie der von der hineinklonierten DNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz führt. Die Phagengenom-Bibliothek wird dann in eine geeignete Wirtszelle eingebracht, wo rekombinante Phagenpartikel erzeugt werden, welche Fusionsproteine auf ihrer Oberfläche präsentieren.
Durch Selektionstechniken (z. B. Panning, Affinity Maturation) können dann diejenigen Phagengenome aus der Bibliothek identifiziert werden, welche DNA-Sequenzen beinhalten, deren kodierte Peptide oder Polypeptide bestimmte Bindungseigenschaften aufweisen.
Beim Panning werden die aus der Phagengenom-Bibliothek gewonnen rekombinanten Phagenpartikel mit einer Zielstuktur in Kontakt gebracht, und es werden diejenigen Phagenpartikel mit den gewünschten Bindungseigenschaften selektioniert. Bei einer positiven Selektion werden diejenigen Phagenpartikel isoliert, welche an die Zielstruktur binden. Bei einer negativen Selektion werden hingegen diejenigen Phagen verworfen, welche an eine andere Struktur als die Zielstruktur binden. Oft werden mehrere Selektionszyklen durchgeführt.
Affinity Maturation wird im Stand der Technik in erster Linie für die Selektion von Antikörpern oder Antikörperfragmenten verwendet. Hierbei werden nach der ersten Selektion Modifikationen in den Nukleinsäureregionen vorgenommen, welche für die variable Region von Antikörpern (V) kodieren. Diese Modifikationen führen zu einer weiteren Diversifizierung der V Region, und es wird auf der Basis der so gewonnenen modifizierten Nukleinsäuresequenzen eine Sekundärbibliothek erzeugt. Diese wird dann wiederum den genannten Selektionsverfahren unterzogen.
Herkömmliche Kontrastmittel sind oft nicht spezifisch oder nicht ausreichend spezifisch. Ein weiterer Nachteil von herkömmlichen Kontrastmitteln besteht unter anderem darin, dass bei der Koppelung des Liganden an das signalgebende Molekül oft die Bindungseigenschaften des Liganden verändert werden. Das führt in vielen Fällen dazu, dass der an das signalgebende Molekül gebundene Ligand andere und meist verschlechterte Bindungseigenschaften aufweist als der nicht gekoppelte Ligand. In vielen Fällen ist die Affinität des Liganden für die nachzuweisenden Zielstrukturen erheblich verringert. Es kann sogar nach der Koppelung des Liganden an das signalgebende Molekül zu unerwünschten Kreuzreaktivitäten des Liganden kommen.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges Kontrastmittel bereitzustellen, welches die genannten Nachteile vermeidet.
Die WO 00/32625 beschreibt Hepatitis-B Virus(HBV)-Partikel, welche Fusionsproteine aus einem an ein HBV Kapsid bindendem Peptid und einem Immungen enthalten. Diese Partikel sollen die Immunreaktion gegenüber dem darin enthaltenen Immunogen erhöhen. Optional können in den an das HBV Kapsid bindenden Peptiden Marker enthalten sein.
Die Druckschrift DE 102 56 669 offenbart ein Proteingemisch, enthaltend mindestens ein erstes Fusionsprotein, enthaltend ein Protein oder Proteinfragment, eine Interaktionsdomäne und eine Proteintranslokationssequenz, die bewirkt, dass das Fusionsprotein bei Expression in ein Bakterium in einem im wesentlichen ungefalteten Zustand durch die zytoplasmatische Membran transloziert wird, und mindestens ein zweites Fusionsprotein, enthaltend ein Protein oder Proteinfragment, eine Interaktionsdomäne und eine Proteintranslokationssequenz, die bewirkt, dass das Fusionsprotein bei Expression in einem Bakterium in einem im Wesentlichen gefalteten Zustand durch die zytoplasmatische Membran transloziert wird, wobei die Interaktionsdomäne des ersten Fusionsproteins an die des zweiten Fusionsproteins binden kann.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Kontrastmittel, welches auf einem rekombinanten Phagenpartikel oder beruht, umfassend ein erstes Fusionsprotein, welches ein Phagen-Oberflächenprotein und einen für eine nachzuweisende Zielstruktur spezifischen Liganden umfasst, wobei eine lokalisierte Präsentation des Liganden an nur einem Ende des jeweiligen Phagenpartikels möglich ist, und ein zweites Fusionsprotein, welches ein Phagen-Oberflächenprotein und ein Peptid oder Polypeptid umfasst, wobei das Peptid oder Polypeptid ein signalgebendes Molekül ist und/oder in der Lage ist, an ein signalgebendes Molekül zu binden, wobei das zweite Fusionsprotein in einer Anzahl von bis zu 3000 Kopien pro Phagenpartikel exprimiert wird.
Als Phagenpartikel kommen grundsätzlich alle Phagen in Frage, welche für ein Phage-Display geeignet sind, d. h. Phagen, die auf ihrer Oberfläche Fusionsproteine aus Phagen-Oberflächenproteinen und fremden Peptiden oder Polypeptiden präsentieren können. Bevorzugt sind insbesondere Inoviridae und insbesondere die filamentösen Bakteriophagen M13, f1 und fd.
Der Ligand ist ein Peptid oder Polypeptid, welches eine Spezifität für die Bindung an eine bestimmte Zielstruktur aufweist.
Unter einer Zielstruktur wird im Sinne dieser Erfindung jede für einen Nachweis geeignete Zielstruktur verstanden. Dies können z. B. Krankheitsmarker sein, oder auch Moleküle, die auf bestimmten Geweben vorhanden sind, aber nicht auf anderen Geweben. Es kann sich hierbei um jede Art von Oberflächenmarkern handeln. Insbesondere bevorzugt sind hierbei spezifische Krankheitsmarker wie etwa Zelloberflächenmarker von Tumorzellen (z. B. Proliferationsmarker, CEA), Marker für „vulnerable Plaques” (z. B. MMP, Metallomatrixproteasen), endotheliale Neoangiogenesemarker (z. B. VEGF), Marker für rheumatische Arthritis (z. B. Metallomatrixproteasen).
Der Ligand ist vorzugsweise ein lineares Peptid oder Polypeptid, ein zyklisches Peptid oder Polypeptid, oder ein Antikörper oder Antikörperfragment, zum Beispiel ein Fab Fragment. Es können auch lediglich einzelne Teile von den variablen (V) Regionen der schweren und leichten Ketten von Antikörpern als Ligand verwendet werden (VL, VH). Als Ligand kommen sowohl natürliche als auch synthetische Peptide und Polypeptide in Frage. Das Peptid oder Polypeptid, welches ein signalgebendes Molekül ist oder in der Lage ist, an ein solches zu binden, kann jedes hierfür geeignete Peptid oder Polypeptid sein.
Wenn das Peptid oder Polypeptid selbst das signalgebende Molekül darstellt, so kann es z. B. aufgrund seiner spezifischen Struktur nach Bindung des Liganden an die Zielstruktur durch ein separates Nachweisreagenz nachgewiesen werden.
Bevorzugt ist jedoch, wenn das Peptid oder Polypeptid in der Lage ist, an ein signalgebendes Molekül zu binden.
Als signalgebende Moleküle sind z. B. mit Radioisotopen markierten Moleküle, mit para-, ferro- oder supramagnetischen Elementen markierte Moleküle, z. B. ein cheliertes Lanthanid wie Gd, und Fluorophore geeignet. Fluorophore sind z. B. GFP (Green Fluorescence Protein), DsRed (Red Fluorescence Protein), CY5.5, CY7 oder Indiocyangrün.
Bei den erfindungsgemäßen rekombinanten Phagenpartikeln ist es bevorzugt, wenn jeweils verschiedene Phagen-Oberflächenproteine mit dem für das signalgebende Molekül spezifische Peptid oder Polypeptid und dem Liganden als Fusionsproteine präsentiert werden.
Wird ein filamentöser Phage, wie etwa M13, fd oder f1 verwendet, so eigen sich insbesondere die Oberflächenproteine gpIII, gpVI und gpVIII für die Expression von Fusionsproteinen.
Es ist besonders bevorzugt, wenn der Ligand als Fusionsprotein mit gpIII exprimiert wird, z. B. über den Expressionsvektor fUSE. gpIII ist auf der Phagenoberfläche nur in etwa drei bis fünf Kopien vorhanden. Außerdem ist bei gpIII eine lokalisierte Präsentation des Liganden an nur einem Ende des Phagenpartikels möglich.
Für das Peptid oder Polypeptid, das in der Lage ist, an ein signalgebendes Molekül zu binden, ist es dagegen bevorzugt, wenn es in möglichst großer Anzahl auf der Phagenoberfläche präsentiert wird. Daher wird dieses Peptid oder Polypeptid vorzugsweise als Fusionsprotein mit dem Phagen-Oberflächenprotein gpVIII exprimiert, z. B. über den Expressionsvektor f88. Dadurch wird das Peptid oder Polypeptid fast über die gesamte Oberfläche des Phagenpartikels exprimiert und erlaubt so eine hohe Beladung mit signalgebenden Molekülen.
Ein Vorteil eines erfindungsgemäßen Kontrastmittels auf der Basis von rekombinanten Phagenpartikeln besteht darin, dass das Phagenpartikel als Linker zwischen dem signalgebenden Molekül und dem Liganden eingesetzt wird. Dadurch kann zum einen eine unspezifische Bindung von signalgebenden Molekülen an den Liganden und somit eine unerwünschte Verschlechterung der Bindungseigenschaften des Liganden vermieden werden. Des Weiteren bietet die Phage-Display-Technik auch die Möglichkeit, ein Biomolekül-Kontrastmittel herzustellen, welches eine hohe Beladung mit signalgebenden Molekülen erlaubt.
Die erfindungsgemäßen Kontrastmittel können im Prinzip bei allen herkömmliche bildgebenden Untersuchungen angewendet werden, wie z. B. Röntgen-Computertamographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT), Positronenemissionstomographie (PET), Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) oder optischer Bildgebung, wie etwa Near Infrared Fluorescence (NIRF).
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Kontrastmittels auf der Basis von rekombinanten Phagenpartikeln, bereit, wobei die Phagenpartikel ein signalgebendes Molekül aufweisen oder in der Lage sind, an ein signalgebendes Molekül zu binden, gekennzeichnet dadurch, dass bis zu 3000 signalgebende Moleküle pro Phagenpartikel gebunden werden können, und die auf ihrer Oberfläche einen für eine nachzuweisende Zielstruktur spezifischen Liganden aufweisen, wobei eine lokalisierte Präsentation des Liganden an nur einem Ende des jeweiligen Phagenpartikels möglich ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer Bibliothek aus rekombinanten Phagengenomen, umfassend eine erste Nukleinsäuresequenz, welche für ein Fusionsprotein aus einem ersten Phagen-Oberflächenprotein und einem zu selektionierenden Liganden kodiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, welche für ein Fusionsprotein aus einem zweiten Phagen-Oberflächenprotein und einem Peptid kodiert, wobei das Peptid ein signalgebendes Molekül ist oder in der Lage ist, an ein signalgebendes Molekül zu binden,
(b) Einbringen der rekombinanten Phagengenome aus (a) in eine geeignete Wirtszelle und Exprimieren der Phagengenome zur Erzeugung von rekombinanten Phagenpartikeln,
(c) gegebenenfalls Selektionieren von Phagenpartikeln, welche Peptide mit Spezifität für ein signalgebendes Molekül aufweisen,
(d) Selektionieren von Phagenpartikeln, welche Liganden mit Spezifität für die nachzuweisende Zielstruktur aufweisen, und
(e) Isolieren der selektionierten Phagenpartikel.

Schritt (a) umfasst herkömmliche Klonierungstechniken zum Phage-Display, die dem Fachmann bekannt sind. Zunächst wird eine Ligandenbibliothek ausgewählt. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um eine Bibliothek aus Nukleinsäuresequenzen, die für Antikörperfragmente kodieren.
Weiterhin wird eine zweite Nukleinsäuresequenz oder eine entsprechende Bibliothek ausgewählt, die für das Peptid kodiert, welches spezifisch an ein signalgebendes Molekül binden soll.
Beide Nukleinsäuresequenzen bzw. Nukleinsäuresequenzbibliotheken werden dann in entsprechende Phagengenome einkloniert. Hierbei können herkömmliche Kits für Phage-Display verwendet werden, wie z. B. das PRAS-System von Amersham (jetzt GE Healthcare), das PhD Peptid Display Kit von New England Biolabs, das Phage-Display Kit von Creg Winter, oder auch herkömmliche Phagemide.
Bevorzugt sind so genannte Mini-Phagemiden, welche deletierte Mutanten darstellen, die nur 20 bis 50% des Wildtyp-Phagengenoms enthalten und somit deutlich kürzer sind als Wildtyp-Phagen (Wildtyp-Phagen habe eine Länge von etwa 900 nm, Durchmesser 9 nm).
In Schritt (b) werden die Phagengenome in geeigneten Wirtszellen propagiert, insbesondere geeignet sind hier bekannte Bakterienstämme wie z. B. E. coli, insbesondere die E. coli Stämme K802, K91 oder MC1061.
In Schritt (c) werden dann durch die eingangs genannten Selektionstechniken (z. B. Panning, Affinity Maturation) diejenigen Phagenpartikel aus der Bibliothek identifiziert, die die gewünschten Peptide oder Polypeptide und Liganden mit bestimmten Bindungseigenschaften aufweisen.
Ist bereits ein spezifisches Peptid, das an ein signalgebendes Molekül binden kann, bekannt, so ist keine Selektion auf diese Peptid erforderlich.
Es kann auch eine Selektion auf ein solches Peptid stattfinden. Bei einer solchen Selektion kann man wie folgt vorgehen:
Für ein Fusionsprotein mit dem Peptid oder Polypeptid, das an ein signalgebendes Molekül binden kann, wird vorzugsweise ein Phagen-Oberflächenprotein verwendet, welches in einer großen Anzahl von Kopien exprimiert wird, z. B. das Oberflächenprotein gpVIII (Major coat Protein, 2700 bis 3000 Kopien pro Phagenpartikel). Ein Fusionsprotein aus dem Oberflächenprotein und einem aminoterminal fusionierten Peptid wird zur Erstellunge einer Phagenbank am Fremdpeptid permutiert. Hierfür werden gängige Methoden der Gentechnik zur Herstellung von Phagenbanken eingesetzt. Mittel Panning wird auf Spezifität gegen ein signalgebendes Molekül selektioniert (z. B. Radioisotope, Lanthanide, Fluorophore, derivatisierte Formen der genannten signalgebenden Moleküle, die an Chelate oder Kopplungsgruppen gebunden sind, etc.). Die so gewonnenen Phagen werden in geeigneten Kulturen (Bakterien-, Zellkultur) vermehrt und ggf. in mehrfachen Panningzyklen gegen das gleiche signalgebende Molekül angereichert. Falls erforderlich werden die Bindungseigenschaften mittels der üblichen (in der Literatur beschriebenen) „Affinity Maturation” Techniken optimiert. Die Zielstrukturbindenden Phagen werden amplifiziert und in einer Lösung des signalgebenden Moleküls inkubiert.
Zur anschließenden Selektion von Phagenpartikeln, welche Liganden mit Spezifität für die nachzuweisende Zielstruktur aufweisen, kann man wie folgt vorgehen:
Die angereicherte Phagenbank wird gegen eine gesunde Gewebeprobe, z. B. ein Homogenat, aus dem Zielorgan „gepannt”, welche die nachzuweisende Zielstruktur nicht aufweist. Diejenigen Phagen, die an eine andere Struktur als die Zielstruktur binden (die also Kreuzreaktivität zeigen), werden diesmal verworfen (negative Selektion).
Die bereits zweifach selektionierte Phagenbank wird nun ein zweites Mal permutiert, diesmal jedoch am Gen, welches für das Fusionsprotein zwischen Oberflächenprotein gpIII und aminoterminalen Fremdprotein (z. B. lineares Peptid, zyklisches Peptid, Antikörperfragment) kodiert. In den daraufhin folgenden Panningzyklen werden diejenigen Phagenpartikel isoliert, welche an die Zielstruktur binden (positive Selektion). Falls erforderlich werden die Bindungseigenschaften mittels der üblichen in der Literatur beschriebenen „Affinity Maturation” Techniken optimiert.
Vorzugsweise werden mindestens eine positive und eine negative Selektion durchgeführt. Vorzugsweise werden mehrere Selektionszyklen durchgeführt.
Da während der Selektion auf den Liganden das Peptid für das signalgebende Molekül bereits vorhanden ist, kann es nicht zu einer nachträglichen Änderung der Bindungseigenschaften des Liganden kommen, welche oft beim nachträglichen Koppeln des Liganden an das signalgebende Molekül bei Kontrastmitteln aus dem Stand der Technik auftritt.
Die Reihenfolge der Selektionsschritte ist nicht zwingend, aber vorzugsweise wird erst auf das Peptid selektioniert, das an ein signalgebendes Molekül bindet, und erst anschließend auf den Liganden.
Anschließend werden die so selektionierten Phagenpartikel isoliert. Die so isolierten Phagenpartikel können dann mit einem gewünschten signalgebenden Molekül beladen werden.
Die Phagen können nach entsprechender Aufreinigung, insbesondere nach Abtrennung von bakteriellen Toxinen, und Beladung mit signalgebenden Molekülen direkt als Kontrastmittel eingesetzt werden.
Ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen rekombinanten Phagenpartikels ist in der Zeichnung dargestellt. Darin zeigt
1: eine schematische Darstellung eines rekombinanten Phagenpartikels.
Der rekombinante Phagenpartikel 1 weist eine Hülle aus Oberflächenproteinen auf. Die Hülle umschließt das Phagengenom 2. Die Hülle umfasst zum einen ein Fusionsprotein aus einem Oberflächenprotein 3, hier gpVIII, und einem Peptid oder Polypeptid, welches ein signalgebendes Molekül 4 ist oder an ein solches bindet. Ferner enthält die Hülle ein Fusionsprotein aus einem Oberflächenprotein 5, hier gpIII, und einem für eine nachzuweisende Zielstruktur 8 spezifischen Liganden 6. Das Oberflächenprotein gpIII ist im gezeigten Beispiel in nur 5 Kopien vorhanden, so dass auch der Ligand 6 nur fünfmal vorhanden ist.
Besondere Vorteile ergeben sich für die Anwendung des oben beschriebenen Kontrastmittels in der MRT Bildgebung, da diese hinsichtlich der unteren Nachweisgrenze limitiert ist. Die oben beschriebenen Phagenkontrastmittel weisen eine hohe „pay load” (hohes Verhältnis von signalgebenden Molekülen zu Bindungsmolekülen) auf. Pro Phage können theoretisch bis zu 3000 signalgebende Moleküle gebunden werden. Dies bewirkt eine sehr starke Signalerzeugung im (pathologischen) Zielgewebe, welches einen MR-Nachweis der nur in begrenzter Kopienzahl vorhandenen molekularen Marker in manchen Fällen erst ermöglicht.
Die Erfindung stellt weiterhin eine diagnostische und/oder therapeutische Zusammensetzung bereit, welche als aktiven Stoff ein Kontrastmittel gemäß der Erfindung umfasst. Weiterhin enthält die Zusammensetzung geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
Es ist möglich, das erfindungsgemäße Kontrastmittel nicht nur diagnostisch, sondern auch therapeutisch einzusetzen. Hierfür kann entweder eine therapeutische Substanz an den Liganden angekoppelt werden, oder der Ligand ist selbst therapetisch wirksam. Besondere Anwendungsmöglichkeiten sind insbesondere bei der Tumordiagnostik und -therapie möglich.

Claims

Kontrastmittel auf der Basis von rekombinanten Phagenpartikeln (1), umfassend ein erstes Fusionsprotein, welches ein Phagen-Oberflächenprotein (5) und einen für eine nachzuweisende Zielstruktur (8) spezifischen Liganden (6) umfasst, wobei eine lokalisierte Präsentation des Liganden (6) an nur einem Ende des jeweiligen Phagenpartikels (1) möglich ist, und ein zweites Fusionsprotein, welches ein Phagen-Oberflächenprotein (3) und ein Peptid oder Polypeptid umfasst, wobei das Peptid oder Polypeptid ein signalgebendes Molekül (4) ist, und/oder in der Lage ist, an ein signalgebendes Molekül (4) zu binden, wobei das zweite Fusionsprotein in einer Anzahl von bis zu 3000 Kopien pro Phagenpartikel (1) exprimiert wird.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, wobei das erste Phagen-Oberflächenprotein (5) gpIII ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das zweite Phagen-Oberflächenprotein (3) gpVIII ist.
Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Phage (1) ausgewählt ist aus Inoviridae, M13, f1 oder fd.
Kontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das signalgebende Molekül (4) ausgewählt ist aus mit Radioisotopen markierten Molekülen, mit para-, ferro- oder supramagnetischen Elementen markierten Molekülen und Fluorophoren.
Kontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ligand (6) ausgewählt ist aus linearen Peptiden oder Polypeptiden, zyklischen Peptiden oder Polypeptiden, Antikörpern und Antikörperfragmenten.
Diagnostische und/oder therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, sowie geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
Verwendung des Kontrastmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 7 in einer bildgebenden Untersuchung bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die bildgebende Untersuchung auf Röntgen-Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT), Positronenemissionstomographie (PET), Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) oder optischer Bildgebung, wie etwa Near Infrared Fluorescence (NIRF) beruht.
Verfahren zur Herstellung eines Kontrastmittels auf der Basis von rekombinanten Phagenpartikeln (1), die ein signalgebendes Molekül (4) aufweisen oder in der Lage sind, an ein signalgebendes Molekül zu binden, gekennzeichnet dadurch, dass bis zu 3000 signalgebenden Moleküle pro Phagenpartikel (1) gebunden werden können, und die auf ihrer Oberfläche einen für eine nachzuweisende Zielstruktur (8) spezifischen Liganden (6) aufweisen, wobei eine lokalisierte Präsentation des Liganden (6) an nur einem Ende des jeweiligen Phagenpartikels (1) möglich ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Bibliothek aus rekombinanten Phagengenomen, enthaltend eine erste Nukleinsäuresequenz, welche für ein Fusionsprotein aus einem ersten Phagen-Oberflächenprotein (5) und einem zu selektionierenden Liganden (8) kodiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, welche für ein Fusionsprotein aus einem zweiten Phagen-Oberflächenprotein (3) und einem Peptid kodiert, wobei das Peptid ein signalgebendes Molekül (4) ist oder in der Lage ist, an ein signalgebendes Molekül (4) zu binden, (b) Einbringen der rekombinanten Phagengenome aus (a) in eine geeignete Wirtszelle und Exprimieren der Phagengenome zur Erzeugung von rekombinanten Phagenpartikeln (1), (c) gegebenenfalls Selektionieren von Phagenpartikeln, welche Peptide mit Spezifität für ein signalgebendes Molekül (4) aufweisen, (d) Selektionieren von Phagenpartikeln, welche Liganden (6) mit Spezifität für die nachzuweisende Zielstruktur (8) aufweisen, und (e) Isolieren der selektionierten Phagenpartikel (1).
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Selektionieren in Schritt (c) und/oder (d) durch Panning und/oder Affinity Maturation erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei in Schritt (c) und/oder (d) eine positive und eine negative Selektion durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das signalgebende Molekül (4) ausgewählt wird aus mit Radioisotopen markierten Molekülen, mit para-, ferro- oder supramagnetischen Elementen markierten Molekülen und Fluorophoren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die isolierten Phagenpartikel mit einem signalgebenden Molekül (4) in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei das erste Phagen-Oberflächenprotein (5) gpIII ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei das zweite Phagen-Oberflächenprotein (3) gpVIII ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei der Phage ausgewählt wird aus Inoviridae, M13, f1 und fd.