DE102004051043B4

DE102004051043B4 - Angleichung von Flugzeitmassenspektren

Info

Publication number: DE102004051043B4
Application number: DE102004051043A
Authority: DE
Inventors: Markus Kostrzewa; Stefan Klepel; Thomas Maier
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2004-10-20
Filing date: 2004-10-20
Publication date: 2011-06-01
Anticipated expiration: 2024-10-21
Also published as: GB0521284D0; DE102004051043A1; GB2419737B; US20060095212A1; GB2419737A; US7391017B2

Abstract

Verfahren zur Angleichung eines Flugzeitmassenspektrums an ein als Stammspektrum bezeichnetes vorhandenes Flugzeitmassenspektrum einer gleichartigen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) in dem Stammspektrum charakteristische Ionensignale ausgewählt werden,
(b) Ionensignale in dem Flugzeitmassenspektrum ausgewählt werden, die sich innerhalb von Toleranzintervallen der charakteristischen Ionensignale befinden, und
(c) die Massenwerte des Flugzeitmassenspektrums mit einer Gleichung höchstens zweiter Ordnung so transformiert werden, dass die Ionensignale des Flugzeitmassenspektrums auf die charakteristischen Ionensignale abgebildet werden.

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung der Vergleichbarkeit von Massenspektren, die in Flugzeitmassenspektrometern mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption aufgenommen wurden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem die stets leicht falschen Massenskalierungen verschiedener Massenspektren einer gleichartigen Probe aneinander angeglichen werden können. Da die Flugzeiten identischer Ionen auf Grund der Vorgänge im Ionisierungsverfahren von Massenspektrum zu Massenspektrum immer leicht verschieden ausfallen, stimmen die scheinbaren Massenwerte von Ionensignalen in verschiedenen Massenspektren nicht überein, wenn die Flugzeiten alle mit der gleichen, einmal erstellten Kalibrierungsgleichung in Massenwerte umgerechnet werden. Nach der Angleichung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Massenspektren addieren, ohne dass das Massenauflösungsvermögen verschlechtert wird und es lassen sich verbesserte Referenzspektrenbibliotheken erstellen; ferner lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zuverlässigere Bibliothekssuchen durchführen.
Stand der Technik
Für viele Anwendungen werden heute aus Gründen besonders hoher Nachweisempfindlichkeit Massenspektren in linearen Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen, obwohl an sich die Qualität der Spektren aus Flugzeitmassenspektrometern mit Reflektoren unvergleichlich besser ist. Der Reflektor im Flugzeitmassenspektrometer gleicht verschiedene Anfangsgeschwindigkeiten der Ionen aus und liefert daher eine sehr viel höhere Massenauflösung.
Die mangelnde Qualität der Massenspektren beruht vor allem auf der Ionenbildung durch matrixunterstützte Laserdesorption, die Ionen sehr unterschiedlicher Anfangsgeschwindigkeiten liefert. Eine Verbesserung der Qualität ergibt sich durch das Verfahren der verzögert einsetzenden Beschleunigung der Ionen, wodurch eine Zeitfokussierung von Ionen verschiedener Anfangsgeschwindigkeiten am Ort des Ionendetektors bewirkt wird (A. Holle et al., US 5,654,545 A ). Diese Zeitfokussierung am Ionendetektor wirkt streng nur für Ionen einer Masse im Massenspektrum, für alle anderen Ionen liegt der Ort der Zeitfokussierung vor oder hinter dem Detektor. Durch besondere Maßnahmen kann diese Zeitfokussierung für Ionen verschiedener Massen an denselben Ort (den Ort des Ionendetektors) gelegt werden, so dass ein Massenspektrum entsteht, das ein gleichmäßiges Auflösungsvermögen über das ganze Spektrum liefert (J. Franzen, DE 196 38 577 C1 , US 5,969,348 A ), wenn auch die Massenauflösung wegen der unten näher erläuterten Energiefreigabe beim Zerfall von Ionen in linear betriebenen Flugzeitmassenspektrometern stets nur mäßig gut ist.
Auch wenn diese Maßnahmen das Auflösungsvermögen der Massenspektren verbessern, können sie nicht alle leistungsverschlechternden Einflüsse bei der Aufnahme von Massenspektren beseitigen. Die Vorgänge bei der Ionisierung der Substanzen in der laserinduzierten Verdampfungswolke sind nicht sehr reproduzierbar, sie hängen stark von strukturellen Inhomogenitäten der mikrokristallinen Probe nach ihrer Präparation ab. Die Inhomogenitäten erzwingen leicht verschiedene Einstellungen der Laserenergiedichte im Laserfokus auf der Probe, und diese wiederum führen zu verschiedenen mittleren Anfangsgeschwindigkeiten der Ionen in der sich explosionsartig ausdehnenden Verdampfungswolke. Durch die ungleichmäßige Dicke der Probenpräparation entstehen die Ionen außerdem auf verschieden hohen Anfangspotentialen, wodurch sie je nach Entstehungsort verschiedene Potentialdifferenzen durch laufen und somit leicht verschiedene Energien aufnehmen. Diese beiden Effekte wirken beide auf die Flugzeiten der Ionen ein und lassen sich nicht korrigieren.
Die Aufnahme von Massenspektren mit Flugzeitmassenspektrometern erfordert im Allgemeinen die Aufnahme sehr vieler Einzelspektren, die üblicherweise Messpunkt für Messpunkt zu einem Summenspektrum aufaddiert werden. Die Ionen für jedes Einzelspektrum werden jeweils durch einen Laserschuss erzeugt. Dieses Vorgehen der Erzeugung von Summenspektren wird durch die geringe Messdynamik im Einzelspektrum erzwungen. Es werden dabei mindestens etwa 50, in einigen Fällen auch 1000 und mehr Einzelspektren aufgenommen; im Allgemeinen besteht ein Summenspektrum aus einigen Hundert Einzelspektren.
Die verschiedenartigen mittleren Anfangsgeschwindigkeiten und Gesamtenergien der Ionen in den Laserschüssen führen dazu, dass eigentlich für jeden Laserschuss eine andere Umrechnung der Flugzeit der Ionen in Massenwerte vorgenommen werden müsste. Dabei könnte ein Umrechnungsalgorithmus immer gleicher Art, aber mit verschiedenen Parametersätzen verwendet werden. Da jedoch die Parameter für die Umrechnung der Einzelspektren nicht bekannt sind, kann man ein solches Verfahren nur dann anwenden, wenn in jedem Massenspektrum einige Referenzionenarten vorkommen, deren Massen genau bekannt sind.
Diese zeitaufwändige individuelle Umrechnung jedes Einzelspektrums wird in der Praxis außerordentlich selten angewandt. Stattdessen vertraut man darauf, dass die Flugzeitspektren zumindest einer Probenpräparation soweit übereinstimmen, dass sie sich Messpunkt für Messpunkt addieren lassen. Man nimmt dabei in Kauf, dass sich Massenauflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis verschlechtern. Das Unterlassen dieser individuellen Umrechnung ist vielfach bedingt durch die Zeitersparnis, in vielen Fällen ist es aber auch grundsätzlich nicht möglich oder aus analytischen Gründen nicht angebracht, den Probenpräparationen Referenzsubstanzen für die individuelle Rekalibrierung der Einzelspektren hinzuzufügen.
Im linearen Betrieb eines Flugzeitmassenspektrometers kann man nicht nur die stabilen Ionen nachweisen, sondern auch die Fragmentionen aus so genannten „metastabilen” Zerfällen der Ionen und sogar die Neutralteilchen, die unterwegs aus Ionenzerfällen entstanden sind. Alle diese Fragmentionen und Neutralteilchen, die aus einer Mutterionensorte entstanden sind, haben die gleiche Geschwindigkeit wie die Mutterionen und erreichen daher den Ionendetektor zur gleichen Zeit. In manchen Anwendungsgebieten hat man auf diese Weise eine zehn- bis hundertfache Nachweisempfindlichkeit, das gilt beispielsweise für die Messung von Proteinprofilen bei der Suche nach Biomarkern, oder für Proteinprofile von Mikroorganismen zum Zwecke ihrer Identifizierung. Für diese Anwendungen erhöht man die Energie des desorbierenden und ionisierenden Lasers, wodurch die Ausbeute an Ionen steigt, aber auch ihre Instabilität. Diese erhöhte Nachweisempfindlichkeit ist für viele Anwendungen so entscheidend, dass man viele der oben geschilderten Nachteile des linearen Betriebsmodus der Flugzeitmassenspektrometer in Kauf nimmt.
Die geschilderten Nachteile bringen es aber mit sich, dass man keine sauber vergleichbaren Massenspektren erhält. So ist es beispielsweise schwierig, eine gute Referenzspektrenbibliothek für die Identifizierung von Mikroben an Hand ihrer Proteinprofile zu erstellen. Spektren gleicher Mikroben aus verschiedenen Probenpräparationen stimmen nicht exakt überein, sondern zeigen scheinbar unterschiedliche Massenwerte für an sich gleiche Proteine. Es sind Abweichungen bis zu einem Prozent des Massenwertes beobachtet worden.
Ist es trotz dieser Schwierigkeiten gelungen, eine gute Referenzspektrenbibliothek zu erstellen, so hat man Schwierigkeiten bei der Bibliothekssuche, weil das aufgenommene Massenspektrum einer Mikrobe zufällig längs der Massenskala verzerrt sein kann und daher in der Bibliothek kein Massenspektrum genügend guter Übereinstimmung der Massenwerte und Intensitäten gefunden wird.
Neben den geschilderten Nachteilen der Verfälschung der Massenwerte haben Massenspektren, die mit linearen Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen wurden, stets auch schlechtere Massenauflösungsvermögen. Das hängt mit den Zerfällen der Ionen zusammen. Beim Zerfall eines Ions wird stets ein kleiner Überschuss an interner Energie frei, die den beiden Bruchstücken des Ions als kinetische Energie mitgegeben wird. Je nach der Richtung des Zerfalls in Bezug auf die Flugrichtung können die Teilchen leicht beschleunigt oder leicht verlangsamt werden. Dadurch tritt eine Verschmierung der Flugzeiten von Teilchen gleicher Mutterionenmasse auf, die zu einer Verringerung des Massenauflösungsvermögens führt. Diese Verringerung des Auflösungsvermögens hängt somit fest mit der Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit zusammen und ist grundsätzlich nicht zu beseitigen. (Es hat früher einen Zweig der physikalischen Chemie gegeben, der sich mit der Messung der Überschussenergien beim Ionenzerfall beschäftigte und eigens dazu konstruierte Massenspektrometer mit Fähigkeiten zur Energieanalyse massenselektierter Fragmentionen verwendete). Die Massenauflösungen betragen etwa nur R = 1000 bis R = 2000.
Lineare Flugzeitmassenspektrometer werden heute vor allem in drei Anwendungsbereichen eingesetzt:

– in der Proteinprofilanalyse bei der Suche nach „Biomarkern” als Anzeigern für bestimmte Stresssituationen des Körpers und für entsprechende diagnostische Verfahren;
– in der Proteinprofilanalyse für die Identifizierung von Mikroben; und
– in der massenspektrometrischen Analyse von Mutationen genetischen Materials.

In allen drei Anwendungsgebieten werden Massenspektren bis in hohe Massenbereiche von beispielsweise 20 000 atomaren Masseneinheiten (u) gemessen. Aus den genannten Gründen geringer Massenauflösung können in überwiegenden Teilen des Massenspektrums die Isotopengruppen, die aus Ionensignalen bestehen, die sich jeweils um eine atomare Masseneinheit unterscheiden, nicht mehr aufgelöst werden. Es werden daher nur die Einhüllenden der Isotopengruppen gemessen, ein Faktum, das die Massenbestimmung und eine entsprechende Kalibrierung erschwert. Hinzu kommt, dass insbesondere die Proteinprofilspektren sehr signalreich sind, mit vielen Ionensignalüberlappungen, was einen Mustervergleich sehr erschwert. Die Proteinprofilspektren enthalten durchaus die Ionensignale einiger Hundert verschiedener Proteine.
Ein Verfahren, das aus einer Einhüllenden der Isotopengruppe eines Proteins die so genannte „monoisotopische Masse” zu berechnen gestattet, ist in Patent DE 198 03 309 C1 (C. Köster, US 6 188 064 B1 ) angegeben.
Flugzeitmassenspektrometer mit Reflektoren haben ein sehr viel besseres Massenauflösungsvermögen, vor allem auch deshalb, weil hier keine Fragmentmassen zum Massenspektrum beitragen. Trotzdem treten auch hier Verzerrungen der Massenskala auf. Obwohl sich Massenauflösungsvermögen weit oberhalb von R = 20 000 erreichen lassen, beträgt die Massenrichtigkeit nach guter Kalibrierung des Gerätes, aber ohne Rekalibrierung des Massenspektrums, nur etwa 30 bis 50 ppm. Eine Rekalibrierung des Massenspektrums unter Verwendung interner Referenzmassen erreicht 5 ppm Massenrichtigkeit, also Abweichungen zwischen den „wahren” und den gemessenen Massenwerten.
Ohne die Verfügbarkeit interner Referenzmassen tritt hier also das gleiche Problem auf wie bei linearen Flugzeitmassenspektrometern, nur in einem viel feineren Maßstab.
Das Patent US 6 498 340 B2 beschreibt ein Verfahren zur Rekalibrierung eines Massenspektrums, wobei Informationen aus einem einzelnen Massenspektrum ohne interne Referenzmassen verwendet werden, um die Massenskala des Massenspektrums zu rekalibrieren. Die Ionen einer Ionensorte müssen dafür in unterschiedlichen Ladungszuständen vorliegen, wodurch ein einzelnes Massenspektrum für jede Ionensorte mehrere Ionensignale mit unterschiedlichen Massenwerten (genauer: Masse-zu-Ladungsverhältnissen) aufweist. Die unterschiedlichen Massenwerte von einer oder mehreren Ionensorten werden mit einem Entfaltungsalgorithmus auf den ungeladenen Zustand umgerechnet. Die Kalibrierungsparameter werden so variiert, dass die ladungsentfalteten Massenwerte einer Ionensorte möglichst wenig voneinander abweichen.
Die Offenlegungsschrift DE 196 81 255 T1 beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung von standardisierten Spektrenbibliotheken für eine verbesserte Bibliothekssuche. Das Verfahren korrigiert eine zeitliche Änderung der Gerätefunktion eines Massenspektrometers. Dazu wird ein gespeichertes Referenzspektrums eines Standards mit einem gemessenen Spektrum des Standards verglichen und daraus eine Transferfunktion bestimmt, die die Intensitätswerte des gemessenen Standardspektrums auf das gespeicherte Referenzspektrum transformiert. Mit der so bestimmten Transferfunktion werden auch die Intensitätswerte der nachfolgend aufgenommenen Spektren transformiert, um eine zeitliche Änderung der Gerätefunktion des Massenspektrometers auszugleichen. Eine Transformation der Massenskala ist nicht offenbart.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem eine Angleichung der Massenwerte von MALDI-Massenspektren aus Flugzeitmassenspektrometern hergestellt wird. Das Verfahren soll sich vorzugsweise auf Massenspektren aus dem linearen Betrieb von Flugzeitmassenspektrometern beziehen, soll aber auch Verbesserung von Massenspektren aus einem Reflektorbetrieb ermöglichen.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Massenwerte eines Massenspektrums durch eine Transformation mit einer Gleichung höchstens zweiter Ordnung an die Massenwerte eines zweiten Massenspektrums angleicht und durch diese Angleichung der Massenwerte eine bessere Vergleichbarkeit der beiden Massenspektren herstellt. Die Vergleichbarkeit ist wiederum Voraussetzung für eine Mittelwertbildung aus beiden Spektren ohne Verschlechterung der Massenauflösung. Die Parameter der Transformationsgleichung für die Massenwerte des anzupassenden Massenspektrums können besonders im ersten Schritt durch Vergleich einiger ausgewählter, charakteristischer Ionensignale der Ionensignalmuster beider Massenspektren bestimmt werden, wobei es das Ziel ist, diese ausgewählten charakteristischen Ionensignale massenmäßig aufeinander abzubilden.
Es wird dazu vorzugsweise von so genannten Massenlisten der Spektren ausgegangen, in denen die Massenwerte und die Intensitäten der Ionensignale jeweils eines Spektrums gelistet sind, wie sie durch eine Umrechnung erhalten wurden, die auf einer bestmöglichen Kalibrierung der Massenskala des Massenspektrometers beruht. Als „charakteristische Ionensignale des Ionensignalmusters” können starke Ionensignale über entsprechenden Intensitätsschwellen, aber auch herausragend allein stehende Ionensignale ohne Überlappungen verwendet werden, selbst wenn letztere Ionensignale relativ klein sind. Es werden zunächst einige wenige charakteristische Ionensignale der Massenlisten unter Anwendung großer Massentoleranzen miteinander verglichen. Bei Vorliegen einer großen Ähnlichkeit des Musters dieser charakteristischen Ionensignale innerhalb der weiten Toleranzintervalle werden die Massenwerte der charakteristischen Ionensignale mit einer linearen Transformation möglichst gut aufeinander abgebildet. Die lineare Transformation enthält nur einen Verschiebungs- und einen Dehnungsparameter. Die Massenwerte der charakteristischen Ionensignale rücken dabei jeweils in die Mitte der Toleranzintervalle des jeweils anderen Spektrums; die charakteristischen Ionensignale stimmen damit innerhalb sehr viel kleinerer Toleranzintervalle überein. Die Ähnlichkeit der beiden Muster der charakteristischen Ionensignale kann über Toleranzwerte für die Intensitätsverhältnisse der Ionensignale definiert werden.
Es soll dabei betont werden, dass die Massenwerte durch diese Transformation keineswegs „richtiger” werden, wobei „richtig” hier im Sinne des Fehlens systematischer Fehler zu verstehen ist, also an eine Angleichung an die „wahren” Massen der Ionen. Es haben dann nach einer solchen Transformation lediglich die Ionensignale der beiden Spektren besser übereinstimmende (aber möglicherweise falschere) Massenwerte, wenn sie der gleichen Ionensorte angehören.
Im Erfolgsfall kann ein iterativer Prozess eine weitere Verbesserung der Angleichung ergeben. Im iterativen Prozess können weitere Ionensignale mit einbezogen werden. Abbruchkriterien entscheiden darüber, ob überhaupt ein genügend ähnliches Spektrum vorliegt.
Weitere Verfeinerungen können durch eine weitere Transformation unter Einbezug eines quadratischen Glieds vorgenommen werden. Es lässt sich damit insbesondere erreichen, dass die äußeren Spektrenbereiche (sehr hohe und sehr niedrige Massen) besser übereinstimmen.
Das Verfahren kann insbesondere für die Herstellung von Referenzspektren in einer Spektrenbibliothek verwendet werden. Die Referenzspektren werden aus einer großen Zahl von Massenspektren von Proben der gleichen Art gemittelt. Es werden dabei die neu aufgenommenen Spektren jeweils an das Mittelwertsspektrums der bereits miteinander abgeglichenen Massenspektren angeglichen, bevor es in den Mittelwert eingearbeitet wird.
Das Verfahren kann des Weiteren für die Bibliothekssuche selbst verwendet werden, indem bei Vorliegen einer zunächst groben Übereinstimmung der Muster einiger charakteristischer Ionensignale durch Angleichen der Massenspektren eine feinere Übereinstimmung herzustellen versucht wird.
Das Verfahren kann aber auch dazu benutzt werden, Gruppen von Spektren, die jeweils alle an einer Stelle einer Probenpräparation aufgenommen wurden, vor ihrer Addition miteinander abzugleichen und so zu einem verbesserten Summenspektrum zu gelangen.
Bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfindung gibt ein Verfahren an, das ein frisches Massenspektrum, das in einem Flugzeitmassenspektrometers gewonnen wurde, beispielsweise mit einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), an die Massenwerte eines zweiten Massenspektrums, des „Stammspektrums”, das möglicherweise oder auch sicher von einer gleichen Probe stammt, durch eine zunächst lineare, gegebenenfalls später auch quadratische Transformation der Massenwerte anpasst. Wenn im Folgenden vereinfachend von einer „Anpassung der Massenspektren” die Rede ist, so ist damit immer eine Anpassung der Massenwerte gemeint.
Das Verfahren bezieht sich vorzugsweise auf Massenspektren, die in einem linearen Flugzeitmassenspektrometer oder im Linearmodus eines Flugzeitmassenspektrometers mit Reflektor gemessen wurden, die Verbesserung kann aber, in anderen Präzisionsklassen für die Massenbestimmung, auch für Massenspektren gelten, die im Reflektormodus gemessen wurden. Das Verfahren wird hier zunächst für Massenspektren aus linearen Flugzeitmassenspektrometern geschildert.
Die Massenspektren, die miteinander verglichen werden sollen, liegen zweckmäßigerweise als „Massenlisten” vor, in denen die durch die Kalibrierkurve des Instruments berechneten Massenwerte und die Intensitäten gelistet sind. Die Massenwerte können durch die oben beschriebenen Verzerrungen leicht falsch sein. Es ist besonders zweckmäßig, neben den Intensitäten auch eine Ionensignalbreite in halber Ionensignalhöhe mitzuführen, um an Hand dieser Ionensignalbreiten Überlappungen mit weiteren Ionensignalen anderer Proteine feststellen zu können.
Die Anpassung beginnt mit einer Suche nach einer relativ kleinen Anzahl charakteristischer Ionensignale im Stammspektrum, beispielsweise nach allein stehenden Ionensignalen über einer Schwelle im Mittenbereich des Stammspektrums, wobei die Schwelle entweder absolut oder relativ zum stärksten Ionensignal des Stammspektrums gewählt werden kann. Die allein stehenden Ionensignale sind einerseits über die Breite ihrer Einhüllenden, also durch die Ionensignalbreite, und andererseits durch das Fehlen weiterer Ionensignale ähnlicher Intensität in der direkten Umgebung erkennbar. Jedes dieser Ionensignale wird mit einem Toleranzintervall umgeben. Das Toleranzintervall ist dabei zunächst recht groß, beispielsweise etwa jeweils ein Prozent des Massenwerts jedes Ionensignals. Es wird nun das frisch aufgenommene Massenspektrum daraufhin untersucht, ob die in diesen Toleranzintervallen auf der Massenskala liegenden Ionensignale des frischen Massenspektrums ein ähnliches Intensitätsmuster wie die des Stammspektrums ergeben. Für die Ähnlichkeit des Intensitätsmusters kann ein Toleranzwert für die Intensitätsverhältnisse definiert werden. Ist das Intensitätsmuster nicht ähnlich, so wird die Anpassung abgebrochen, da die beiden Massenspektren mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht von Proben gleicher Art stammen.
Ist das Muster der charakteristischen Ionensignale ähnlich, handelt es sich also wahrscheinlich um ein Spektrum einer analytisch gleichen Probe, so wird die Lage der Ionensignale in den Toleranzintervallen darauf untersucht, ob sie eine systematische Verschiebung zeigen und eine Dehnung, die mit der Masse korreliert ist. Es kann dann leicht eine lineare Transformation der Massenwerte so vorgenommen werden, dass die Ionensignale in die Mitte der Toleranzintervalle des anderen Massenspektrums transformiert werden. Es kann dann nachfolgend mit eingeschränkten, schmaleren Toleranzintervallen gearbeitet werden, beispielsweise mit Toleranzintervallen von nur noch einem Zehntel Prozent.
In einem zweiten Schritt können nun weitere Ionensignale des Massenspektrums hinzu genommen werden, beispielsweise durch Erniedrigung der Intensitätsschwelle für die Auswahl der charakteristischen Ionensignale und durch die Erweiterung des Mittenbereichs.
Wieder wird eine lineare Transformation vorgenommen, die die Massenwerte in die Mitte der Toleranzintervalle bringt. Bei Massenspektren von Proben derselben Art lassen sich dabei durchwegs die Toleranzintervalle auf etwa 200 ppm (parts per million) einschränken.
Die zunächst ausgewählten Ionensignale sollen sich dabei auf einen Bereich um die Mitte des Massenspektrums beschränken, da häufig die Ionensignale für sehr hohe oder sehr niedrige Massen mit einer linearen Transformation allein nicht einzufangen sind. Es kann sich dann ein Schritt anschließen, der die Ionensignale mit einer Transformation einfängt, die auch ein quadratisches Glied besitzt.
Als Transformation der Massenwerte m_alt in Massenwerte m_neu kann z. B. die folgende mathematische Gleichung dienen: m_neu = m_alt + a + b × m_alt + c × (m_alt – m_mittel)², wobei a eine Nullpunktverschiebung der Massenkoordinate ist, die regelmäßig nur einige wenige atomare Masseneinheiten (u) groß ist, b ist ein Dehnungswert für die Massenkoordinate, regelmäßig kleiner als ein Hundertstel, und c ist eine quadratische Randkorrektur, regelmäßig kleiner als ein Millionstel. Die Größe m_mittel gibt etwa die Mitte des Massenspektrums wieder, für diesen Mittenwert wirkt die quadratische Korrektur nicht. Beispielsweise wird für ein Proteinprofilspektrum, das den Bereich von 600 u (etwa 5 Aminosäuren) bis 20 000 u (etwa 140 Aminosäuren) umfasst, m_mittel zu etwa 10 000 u gewählt.
Ein solches Verfahren kann beispielsweise dazu benutzt werden, um Referenzspektren für Spektrenbibliotheken herzustellen. Als Beispiel werde hier die Erstellung einer Bibliothek von Massenspektren der Proteine von Mikroorganismen geschildert. Mikroorganismen einer gut identifizierten Art werden zunächst in geeigneten Kolonien auf einem geeigneten Nährmedium in Petrischalen gezüchtet. Aus den Kolonien werden jeweils einige Organismen entnommen und auf eine Stelle eines MALDI-Probenträgers geschmiert. Sie werden dort mit einer Lösung einer geeigneten Matrix-Substanz beträufelt, wobei die Proteine der dabei zerstörten Mikroorganismen in die sich bildenden Matrix-Kristalle der Probenpräparation eingebaut werden. Die Probe wird dann in einem linearen Flugzeitmassenspektrometer gemessen und ergibt jeweils ein Proteinprofil dieser Mikroben. Die Massenspektren werden im Bereich von etwa 600 u bis 20 000 u aufgenommen. Die Messungen werden dabei unter geeigneter Variation der Züchtungs- und Probenvorbereitungsbedingungen häufig wiederholt. Neue Massenspektren werden dabei jeweils an die schon existierenden Referenzspektren, die einen gewichteten Mittelwert aller bisher gemessenen Massenspektren dieses Mikroorganismus darstellen, angepasst und dann dem Mittelwert einverleibt.
Bei der Angleichung der frisch aufgenommenen Massenspektren werden dabei zunächst die Konstanten a (Nullpunktsverschiebung) und b (Dehnungskorrektur) der obigen Gleichung bestimmt, wobei möglichst nur charakteristische Intensitätsmuster im Mittenbereich des Spektrums, etwa von 5000 u bis 15 000 u, verwendet werden. Die mathematischen Verfahren der Kurvenanpassung, die dazu verwendet werden, sind jedem Fachmann bekannt. Ergibt eine nachfolgende Prüfung, dass die Übereinstimmung im Randbereich des Spektrums nicht genügend gut ist, so kann auch eine geeignete Konstante c des quadratischen Gliedes der Transformation bestimmt werden. Diese wirkt nur in den Randbereichen des Spektrums.
Es werden bei diesem Verfahren der Herstellung eines Referenzspektrums alle nachfolgend gemessenen Massenspektren an das erstaufgenommene Spektrum angeglichen. Das kann ungünstig sein, wenn das erstaufgenommene Massenspektrum zufällig am Rande des Streubereichs aller Massenspektren liegt. Um dieses zu vermeiden, kann man gewichtete Mittelwerte der Konstanten a, b und c mitführen und zuletzt eine Rücktransformation des Referenzspektrums mit den Mittelwerten durchführen. Das Referenzspektrum liegt dann in der Mitte des Streubereiches aller Massenspektren. – Man kann das Verfahren aber auch so abändern, dass jeweils die beiden Massenspektren aneinander angepasst werden, das heißt, auf mittlere Massenwerte transformiert werden. Ist das Stammspektrum ein Mittelwert aus mehreren Spektren, so ist eine gewichtete Mittelwertsbildung vorzunehmen.
In ähnlicher Weise kann das Verfahren der Angleichung der Massenwerte von Massenspektren auch verwendet werden, um eine Suche mit einem Massenspektrum einer Mikrobenart in einer Bibliothek aus Referenzspektren durchzuführen. Auch hier wird mit weiten Toleranzfenstern um einige charakteristische Ionensignale herum begonnen, um durch stufenweise Verfeinerung die Massenspektren zunehmend aneinander anzupassen, mit dem Ziel, zu einer hohen Ähnlichkeit der Spektren zu kommen, falls das Referenzspektrums einer unbekannten Mikrobe in der Bibliothek überhaupt vorhanden ist. Bei mangelnder Ähnlichkeit der ausgewählten charakteristischen Ionensignale wird der Vergleich mit einem Referenzspektrum abgebrochen, wobei der Abbruch ganz überwiegend bereits nach dem ersten Schritt erfolgt, wenn es sich nicht um ein passendes Referenzspektrum handelt; nur in relativ wenigen Fällen wird erst nach weiterer Verfeinerung des Vergleichs abgebrochen. Es wird nach Abbruch ein Vergleich mit dem nächsten Referenzspektrum versucht. Eine solche Suche führt nach unseren Erfahrungen zu sehr sicheren Identifizierungen.
Insbesondere können die Bibliotheken mit Referenzspektren bereits auf Spektrensuchen insoweit vorbereitet sein, als für jedes Referenzspektrum bereits eine Auswahl charakteristischer Ionensignale mit Toleranzintervallen mit abgespeichert sind.
Es kann aber auch die Güte von MALDI-Massenspektren, die mit linearen Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen werden, unter Anwendung dieses Verfahrens verbessert werden. Wie die Erfahrung zeigt, sind Einzelspektren, die ohne Bewegung der Probe mit einem festen Laserfokus an einer Stelle der Probe gewonnen werden, unter sich relativ ähnlich. Sie können daher punktweise addiert werden und ergeben cm Gruppenspektrum. An einer Stelle lassen sich für gewöhnlich etwa 30 bis 100 Einzelspektren gleichmäßiger Qualität messen. Diese Einzelspektren fließen in cm Gruppenspektrum ein. An einer zweiten Stelle der Probe wird jetzt ein zweites Gruppenspektrum gewonnen. Dieses kann an das alte Gruppenspektrum angepasst werden, bevor die beiden Gruppenspektren, entweder als Massenlisteinträge oder auch als Messspektren, addiert werden. Die Fortführung mit weiteren Gruppenspektrum führt schließlich zu einem Summenspektrum, das eine wesentlich besseres Auflösungsvermögen zeigt, als ein Summenspektrum, das aus den Einzelspektren addiert wird, ohne die Einzelspektren in Gruppen zusammenzufassen.
Dieses letztgeschilderte Verfahren ist besonders auch für Massenspektren interessant, die im Reflektorbetrieb gewonnen werden. Sie führen zu einer Verbesserung des Auflösungsvermögens, wenn für ein Summenspektrum sehr viele Einzelspektren zu addieren sind, die nicht mehr alle vom selben Punkt der Probe stammen. Es wird durch dieses Verfahren nicht die Massenrichtigkeit verbessert, wohl aber die Massenauflösung. Die Massenrichtigkeit kann nur durch eine Rekalibrierung des Massenspektrums unter Benutzung interner Referenzionenmassen erreicht werden.

Claims

Verfahren zur Angleichung eines Flugzeitmassenspektrums an ein als Stammspektrum bezeichnetes vorhandenes Flugzeitmassenspektrum einer gleichartigen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass (a) in dem Stammspektrum charakteristische Ionensignale ausgewählt werden, (b) Ionensignale in dem Flugzeitmassenspektrum ausgewählt werden, die sich innerhalb von Toleranzintervallen der charakteristischen Ionensignale befinden, und (c) die Massenwerte des Flugzeitmassenspektrums mit einer Gleichung höchstens zweiter Ordnung so transformiert werden, dass die Ionensignale des Flugzeitmassenspektrums auf die charakteristischen Ionensignale abgebildet werden.
Verfahren zur Angleichung zweier Flugzeitmassenspektren einer gleichartigen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass (a) in den beiden Flugzeitmassenspektren charakteristische Ionensignale ausgewählt werden, die jeweils in beiden Flugzeitmassenspektren innerhalb von Toleranzintervallen vorhanden sind, (b) die Massenwerte der entsprechenden charakteristischen Ionensignale in den beiden Flugzeitmassenspektren gemittelt werden, und (c) die Massenwerte der Flugzeitmassenspektren durch jeweils eine Gleichung höchstens zweiter Ordnung so transformiert werden, dass die charakteristischen Ionensignale der Flugzeitmassenspektren auf die gemittelten Massenwerte der charakteristischen Ionensignale abgebildet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Flugzeitmassenspektren mit einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption aufgenommen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gleichung höchstens zweiter Ordnung folgende Form hat: m_neu = m_alt + a + b × m_alt + c × (m_alt – m_mittel)², wobei a ein Verschiebungsparameter, b ein Dehnungsparameter und c ein Parameter für eine quadratische Randkorrektur sind und m_mittel die Mitte der Flugzeitmassenspektren festlegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in einem ersten Schritt der Angleichung der Massenwerte zunächst eine lineare Gleichung mit einem Verschiebungs- und einem Dehnungsparameter für die Transformation verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Angleichung der Massenwerte durch Hinzunahme weiterer charakteristischer Ionensignale iterativ verbessert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Angleichung der Massenwerte in den Randbereichen des Spektrums durch eine Transformation, die auch quadratische Glieder enthält, verbessert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass solche Ionensignale als charakteristisch ausgewählt werden, die über einer festgelegten absoluten oder relativen Intensitätsschwelle liegen und/oder die allein stehend sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Flugzeitmassenspektren nach ihrer Angleichung zu Mittelwertsspektren zusammengefasst werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Stammspektrum ein Mittelwertspektrum ist und dass das Flugzeitmassenspektrum nach seiner Angleichung mit dem Stammspektrum gewichtet zu einem Mittelwertsspektrum zusammengefasst wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Flugzeitmassenspektren in Vorbereitung der Angleichung weiterer Flugzeitmassenspektren bereits mit einer Liste charakteristischer Ionensignale und zugehöriger Toleranzintervalle versehen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Angleichung nur bei Vorliegen einer Ähnlichkeit des Musters der charakteristischen Ionensignale durchgeführt wird, wobei die Ähnlichkeit über Toleranzwerte für die Intensitätsverhältnisse festgelegt wird.
Verwendung der mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10 erhaltenen Mittelwertsspektren als Referenzspektren in Spektrenbibliotheken, insbesondere in Spektrenbibliotheken von Mikroorganismen.