DE102004032995A1

DE102004032995A1 - Neue, sekretierte Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren

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Publication number: DE102004032995A1
Application number: DE200410032995
Authority: DE
Inventors: Cornelius Dr. Bessler; Jörg Dr. Feesche; Martina Plath; Stefan Evers; Karl-Heinz Dr. Maurer; Armin Dr. Ehrenreich; Birgit Veith; Heiko Dr. Liesegang; Anke Dr. Henne; Christina Herzberg; Gerhard Prof. Gottschalk; Wolfgang Dr. Stock
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2004-07-08
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2006-03-30

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft 53 zuvor nicht auf DNA-Ebene beschriebene Gene von B. licheniformis und davon abgeleitete Genprodukte, bei denen es sich um sekretierte Proteine handelt, und hinreichend ähnliche Gene und Proteine. Die betreffenden Gene können zur Verbesserung biotechnologischer Produktionsverfahren durch Mikroorganismen genutzt werden, indem einzelne oder mehrere von ihnen funktionell inaktiviert werden. Mit den Sequenzen dieser Gene und Proteine werden auch die zugehörigen Signalpeptide für die biotechnologische Produktion von Proteinen, etwa in Form sekretierter Proteine, erschlossen. Zudem stehen diese Gene für eine positive Nutzung zur Verfügung, vor allem zur Herstellung der abgeleiteten Proteine und deren Verwendung in entsprechenden Ansätzen, beispielsweise der Hydrolyse im Zusammenhang mit Wasch- oder Reinigungsprozessen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft 53 zuvor nicht auf DNA-Ebene beschriebene Gene von B. licheniformis und davon abgeleitete Genprodukte, bei denen es sich um sekretierte Proteine handelt, sowie biotechnologische Produktionsverfahren, die insofern verbessert sind, als einzelne oder mehrere dieser Gene funktionell inaktiviert werden.
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von Mikroorganismen, die zur Bildung der interessierenden Wertstoffe (Gutprodukt) in der Lage sind. Hierzu zählen beispielsweise die Herstellung niedermolekularer Verbindungen, etwa von Nahrungsmittelergänzungsstoffen oder pharmazeutisch relevanten Verbindungen, oder von Proteinen, für welche aufgrund ihrer Diversität wiederum ein großes technisches Einsatzgebiet besteht. Im ersten Fall werden die Stoffwechseleigenschaften der betreffenden Mikroorganismen zur Herstellung der Wertstoffe ausgenutzt und/oder verändert; im zweiten Fall werden Zellen eingesetzt, die die Gene der interessierenden Proteine exprimieren. In beiden Fällen handelt es sich zumeist also um gentechnisch veränderte Organismen (GVO).

Zur Fermentation von Mikroorganismen besteht ein reichhaltiger Stand der Technik, insbesondere auch im großtechnischen Maßstab. Er reicht von der Optimierung der betreffenden Stämme hinsichtlich der Bildungsrate und der Nährstoffausnutzung über die technische Gestaltung der Fermenter bis hin zur Gewinnnung der Wertstoffe aus den betreffenden Zellen selbst und/oder dem Fermentationsmedium. Hierfür kommen sowohl genetische und mikrobiologische als auch verfahrenstechnische und biochemische Ansätze zu tragen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Prozeß zu verbessern, und zwar auf der Ebene der genetischen Eigenschaften der eingesetzten Stämme.

Für die großtechnische, biotechnologische Produktion werden die betreffenden Mikroorganismen in Fermentern kultiviert, die ihren Stoffwechseleigenschaften entsprechend ausgelegt sind. Grampositive Mikroorganismen, insbesondere solche der Gattung Bacillus erfreuen sich bei der biotechnologischen Produktion unter anderem deshalb großer Beliebtheit, weil sie von Natur aus in der Lage sind, Proteine, gegebenenfalls also auch die als Gutprodukte interessierenden Proteine ins umgebende Medium zu sekretieren, aus welchem sie dann vergleichsweise einfach aufgereinigt werden können.

Während der Kultivierung verstoffwechseln die Mikroorganismen das angebotene Substrat und bilden neben dem eigentlichen Produkt üblicherweise eine Vielzahl weiterer Substanzen, an denen in der Regel kein Interesse besteht und/oder die zu unerwünschten Begleiterscheinungen führen können. Hierzu zählen auch sekretierte Proteine, die in vivo zumeist eine wichtige Funktion für die Nährstoffaufnahme der betreffenden Mikroorganismen spielen. Unter den artifiziellen Bedingungen der Kultivierung in einem Fermenter, insbesondere bei Kontrolle der zugegebenen Nährstoffe sind eine Reihe dieser sekretierten Proteine für das Leben der Zellen jedoch nicht mehr notwendig. Ihre Bildung trägt im Gegenteil zum Verbrauch des Mediums und der Stoffwechselaktivität der Zellen bei, worunter die Ausbeute an dem eigentlich interessierenden Wertstoff leidet. Darüber hinaus verfügen die betreffenden Zellen mit dem Sekretionsapparat nur über eine beschränkte Kapazität zur Produktion und insbesondere zum Ausschleusen sekretierter Proteine in das umgebende Medium. Bei der Produktion interessierender Proteine über den Sekretionsweg besteht also eine Konkurrenzsituation mit den eigentlich nicht interessierenden und unter den herrschenden Bedingungen meist nicht mehr benötigten, sekretierten Proteinen.

Darüber hinaus stellen sekretierte Proteine, insbesondere bei der Produktion eines Enzyms oder eines anderen Proteins als interessierenden Wertstoff eine Verunreinigung an chemisch sehr ähnlichen Verbindungen dar, die in nachfolgenden Aufarbeitungsschritten aufwendig wieder abgetrennt werden müssen. Hierzu gehören beispielsweise Filtrationen, Fällungsschritte und/oder Chromatographieschritte, die jeweils zu einem gewissen Maß auch das Gutprodukt beeinträchtigen, etwa hinsichtlich der Stabilität und der Ausbeute.

Es wäre also wünschenswert, einer Entstehung der nicht erwünschten sekretierten Genprodukte von vornherein entgegenzuwirken. Denn damit könnte zum einen die Zahl der nachfolgenden Reinigungs- und Aufarbeitungsschritte des Gutprodukts geringgehalten werden; dies wäre deshalb vorteilhaft, weil sie jeweils eine physikochemische Belastung für das erwünschte Produkt darstellen und die Ausbeute verringern. Insgesamt würde es also eine bessere Produktqualität erhalten. Zum anderen würden die Produktionsbedingungen an sich ökonomischer, weil ein umso größerer Teil der vorgelegten Nährstoffe zu Gutprodukt umgesetzt werden würde, je drastischer die Menge der sekretierten, im Einzelfall aber nicht interessierenden Genprodukte verringert werden könnte. Zudem würde die Effizienz bei der Ausschleusung eines Protein-Gutprodukts verbessert, sofern es sich bei der Fermentation um die Produktion von interessierenden, ebenfalls sekretierten Proteinen handelt.

Es stellte sich somit die Aufgabe, bei der Fermentation von Mikroorganismen, insbesondere grampositiven Bakterien der Spezies Bacillus die Menge der sekretierten Genprodukte zu verringern und die Produktionsstämme in dieser Hinsicht zu entlasten. Vorzugsweise sollte dies auf genetischer Ebene erfolgen, um von vornherein entsprechend vorteilhafte Mikroorganismen zu erhalten. In Teilaufgaben bedeutete dies, Gene zu identifizieren, die für sekretierte Proteine und/oder Enzyme codieren, und über Identifizierung der zugehörigen Nukleotidsequenzen Werkzeuge für die gewünschte gentechnische Modifizierung zur Verfügung zu stellen.

Unter einem Teilaspekt dieser Aufgabe sind insbesondere solche sekretierten Proteine von Interesse, für die aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften selbst für technische Anwendungsmöglichkeiten bestehen. Die Ermittlung der zugehörigen Nukleotidsequenzen würde sie wiederum einer gezielten Produktion und damit den betreffenden technischen Anwendungsmöglichkeiten zugänglich machen.

Einen weiteren Teilaspekt dieser Aufgabe stellt die Identifizierung der zugehörigen Signalpeptide dar, welche zum einen für die gewünschte Inaktivierung genutzt werden können. Zum anderen liefert ihre Zusammenschau Aufschlüsse über eine optimierte Signalsequenz. Somit könnten in einer weiteren Anwendung derartige Signalsequenzen in unveränderter oder in optimierter Form für die gesteuerte Produktion von solchen Proteinen genutzt werden, welche natürlicherweise nicht oder schlechter sekretiert werden.

Diese Aufgabe wird durch jedes der im Sequenzprotokoll angegebenen 53 für B. licheniformis gefundenen Proteine, einschließlich der jeweils hinreichend homologen Proteine gelöst; weitere eigenständige Lösungen der Aufgabe stellen die zugehörigen Nukleinsäuren dar, ebenfalls einschließlich der jeweils hinreichend homologen Nukleinsäuren. Die jeweiligen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen sind vollständig im Sequenzprotokoll (Sequence Listing) der vorliegenden Anmeldung angegeben. Weil es sich dabei, wie für sekretierte Proteine typisch, um solche handelt, die aus einem Signalpeptid und einem maturen Protein zusammengesetzt sind, gelten diese Angaben insbesondere für den Teil des maturen Proteins.

Weitere Lösungen dieser Aufgabe stellen Vekoren mit den zugehörigen Nukleinsäureabschnitten, Zellen und Verfahren zur Produktion dieser Proteine dar. Hinzu kommen die Verwendungen der betreffenden Nukleinsäuren, insbesondere der für die Signalpeptide codierenden Teile zur Inaktivierung der betreffenden Gene in einem Mikroorganismus, die hierdurch erhaltenen Mikroorganismen und die Fermentationsverfahren dar, die durch diese Mikroorganismen gekennzeichnet sind. Ferner wird die vorliegende Erfindung auch in Form der jeweiligen Signalpeptide und von Fusionsprodukten dieser Signalpeptide mit anderen Proteinen verwirklicht, sowie in Form der jeweils zugehörigen Nukleinsäuren.

Mithilfe dieser Proteine und vor allem der zugehörigen Nukleinsäuren – als den geeigneten Werkzeugen für entsprechende gentechnische Modifizierungen – können nun Verfahren zur Fermentation von Mikroorganismen, insbesondere grampositiven Bakterien der Spezies Bacillus etabliert werden, in denen einzelne oder mehrere dieser in vivo sekretierten Genprodukte eingeschränkt oder gar nicht sekretiert und vorteilhafterweise eingeschränkt oder gar nicht erst gebildet werden. Hierdurch ergeben sich die eingangs als wünschenswert beschriebenen Vorteile bei der Produktion interessierender Wertstoffe und bei deren Aufarbeitung.

Dem genannten Teilaspekt der Aufgabe zur Erschließung von solchen sekretierten Proteinen, für die aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften selbst für technische Anwendungsmöglichkeiten bestehen, wird ebenfalls entsprochen. Die zugehörigen Proteine können nun über die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten Nukleotidsequenzen gezielt produziert und den betreffenden technischen Anwendungsmöglichkeiten zugänglich gemacht werden. Hierzu zählt beispielsweise der Einsatz der erhaltenen Proteasen, Amylasen, Lipasen oder Cellulasen in Wasch- und Reinigungsmitteln.

Dem zuletzt genannten Teilaspekt dieser Aufgabe wird insofern entsprochen, als zusammen mit den genannten Genen beziehungsweise Proteinen 53 verschiedene Signalpeptide identifiziert werden konnten, die an sich oder in optimierten Varianten als Signalpeptide für die Herstellung anderer Proteine eingesetzt werden können, insbesondere über Sekretion in Form artifizieller Fusionsproteine. Derartige Signalpeptidvarianten können aus einem Vergleich einzelner oder mehrerer der angegebenen Sequenzen formuliert werden, vorzugsweise mithilfe einer aus entsprechend vielen Vertretern abgeleiteten Consensus-Sequenz.

Wie in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben, konnten über eine Sequenzierung der genomischen DNA von B. licheniformis DSM 13, dem von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) erhätlichen Referenzstamm für diese Spezies 53 neue Gene identifiziert werden. Dabei handelt es sich um solche, die für sekretierte Proteine, und darunter überwiegend für Enzymproteine mit spezifischen enzymatischen Eigenschaften codieren.

Die hierzu im Stand der Technik bekannten jeweils nächstähnlichen Gene und zugehörigen Proteine weisen die in Beispiel 3 (Tabelle 1) zur vorliegenden Anmeldung angegebenen Sequenzhomologien auf. Hierüber definiert sich der mit der vorliegenden Anmeldung jeweils abgedeckte Schutzbereich. Dementsprechend stellen alle folgenden Nukleinsäuren und Proteine prinzipiell gleichwertige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar:

– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines periplasmatischen D-Xylose-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 58% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 91 bis 1065 gemäß SEQ ID NO. 1 entspricht;
– ein Vorläufer eines periplasmatischen D-Xylose-Bindungsproteins oder matures periplasmatisches D-Xylose-Bindungsprotein mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 52% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 31 bis 354 gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer zellwandassoziierten Protease, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 91 bis 3144 gemäß SEQ ID NO. 3 entspricht;
– ein Vorläufer einer zellwandassoziierten Protease oder mature zellwandassoziierte Protease mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 51% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 31 bis 1047 gemäß SEQ ID NO. 4 entspricht;
– eine Nukleinsäure yxeB, codierend für den Vorläufer eines wahrscheinlichen ABC-Transporter-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 5 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 58% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 957 gemäß SEQ ID NO. 5 entspricht;
– ein Vorläufer eines wahrscheinlichen ABC-Transporter-Bindungsproteins YxeB oder matures wahrscheinliches ABC-Transporter-Bindungsprotein YxeB mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 40% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 318 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Levanase (E.C. 3.2.1.65), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 2034 gemäß SEQ ID NO. 7 entspricht;
– ein Vorläufer einer Levanase (E.C. 3.2.1.65) oder mature Levanase (E.C. 3.2.1.65) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 8 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 677 gemäß SEQ ID NO. 8 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Bacillopeptidase F (EC 3.4.21.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 94 bis 4299 gemäß SEQ ID NO. 9 entspricht;
– ein Vorläufer einer Bacillopeptidase F (EC 3.4.21.-) oder mature Bacillopeptidase F (EC 3.4.21.-) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 63% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 32 bis 1432 gemäß SEQ ID NO. 10 entspricht;
– eine Nukleinsäure ywmC, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 72% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 70 bis 687 gemäß SEQ ID NO. 11 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YwmC oder matures Protein YwmC mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 24 bis 228 gemäß SEQ ID NO. 12 entspricht;
– eine Nukleinsäure ywmD, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 13 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 65% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 52 bis 672 gemäß SEQ ID NO. 13 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YwmD oder matures Protein YwmD mit
einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 14 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 51% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 18 bis 223 gemäß SEQ ID NO. 14 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer D-alanyl-D-Alanin-Carboxypeptidase (E.C. 3.4.16.4), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 15 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 94 bis 1326 gemäß SEQ ID NO. 15 entspricht;
– ein Vorläufer einer D-alanyl-D-Alanin-Carboxypeptidase (E.C. 3.4.16.4) oder mature D-alanyl-D-Alanin-Carboxypeptidase (E.C. 3.4.16.4) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 16 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 32 bis 441 gemäß SEQ ID NO. 16 entspricht;
– eine Nukleinsäure yxiA, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins (einer vermutlichen Arabinase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 17 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 71 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 112 bis 987 gemäß SEQ ID NO. 17 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YxiA (einer vermutlichen Arabinase) oder matures Protein YxiA (vermutliche Arabinase) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 18 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 38 bis 328 gemäß SEQ ID NO. 18 entspricht;
– eine Nukleinsäure appA, codierend für den Vorläufer eines Oligopeptid-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 19 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 72% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 85 bis 1644 gemäß SEQ ID NO. 19 entspricht;
– ein Vorläufer des Oligopeptid-Bindungsproteins AppA oder matures Oligopeptid- Bindungsprotein AppA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 20 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 29 bis 547 gemäß SEQ ID NO. 20 entspricht;
– eine Nukleinsäure dppE, codierend für den Vorläufer eines Dipeptid-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 21 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 1626 gemäß SEQ ID NO. 21 entspricht;
– ein Vorläufer des Dipeptid-Bindungsproteins DppE oder matures Dipeptid-Bindungsprotein DppE mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 22 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 75% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 541 gemäß SEQ ID NO. 22 entspricht;
– eine Nukleinsäure yojM, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Superoxiddismutase-ähnlichen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 23 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 58 bis 594 gemäß SEQ ID NO. 23 entspricht;
– ein Vorläufer des hypothetischen Superoxiddismutase-ähnlichen Proteins YojM oder matures Superoxiddismutase-ähnliches Protein YojM mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 24 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 59% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 20 bis 197 gemäß SEQ ID NO. 24 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Mannan-endo-1,4-beta-Mannosidase (E.C. 3.2.1.78), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 25 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 1083 gemäß SEQ ID NO. 25 entspricht;
– ein Vorläufer einer Mannan-endo-1,4-beta-Mannosidase (E.C. 3.2.1.78) oder mature Mannan-endo-1,4-beta-Mannosidase (E.C. 3.2.1.78), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 26 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 360 gemäß SEQ ID NO. 26 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Pectatlyase (E.C. 4.2.2.2), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 27 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 1308 gemäß SEQ ID NO. 27 entspricht;
– ein Vorläufer einer Pectatlyase (E.C. 4.2.2.2) oder mature Pectatlyase (E.C. 4.2.2.2), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 28 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 55% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 435 gemäß SEQ ID NO. 28 entspricht;
– eine Nukleinsäure dacF, codierend für den Vorläufer eines Penicillin-Bindungsproteins (E.C. 3.4.16.4), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 29 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 70 bis 1173 gemäß SEQ ID NO. 29 entspricht;
– ein Vorläufer eines Penicillin-Bindungsproteins DacF (E.C. 3.4.16.4) oder matures Penicillin-Bindungsprotein DacF (E.C. 3.4.16.4), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 30 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 24 bis 390 gemäß SEQ ID NO. 30 entspricht;
– eine Nukleinsäure ywaD, codierend für den Vorläufer einer hypothetischen Peptidase (E.C. 3.4.11.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 96% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 91 bis 1350 gemäß SEQ ID NO. 31 entspricht;
– ein Vorläufer einer hypothetischen Peptidase YwaD (E.C. 3.4.11.-) oder mature hypothetische Peptidase YwaD (E.C. 3.4.11.-), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 32 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 31 bis 449 gemäß SEQ ID NO. 32 entspricht;
– eine Nukleinsäure gerD, codierend für den Vorläufer eines Sporenkeimungs-Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 33 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 76% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 582 gemäß SEQ ID NO. 33 entspricht;
– ein Vorläufer eines Sporenkeimungs-Proteins GerD oder matures Sporenkeimungs-Protein GerD, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 34 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 70% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 193 gemäß SEQ ID NO. 34 entspricht;
– eine Nukleinsäure ybaN, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 35 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 145 bis 765 gemäß SEQ ID NO. 35 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YbaN oder matures Protein YbaN, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 36 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 49 bis 254 gemäß SEQ ID NO. 36 entspricht;
– eine Nukleinsäure ybbC, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 37 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 72% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 1230 gemäß SEQ ID NO. 37 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YbbC oder matures Protein YbbC, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 38 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 66% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 409 gemäß SEQ ID NO. 38 entspricht;
– eine Nukleinsäure ybbD, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins (einer vermutlichen Zucker-Hydrolase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 39 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 71 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 85 bis 1932 gemäß SEQ ID NO. 39 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YbbD (einer vermutlichen Zucker-Hydrolase) oder matures Protein YbbD (vermutliche Zucker-Hydrolase), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 40 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 67% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 29 bis 643 gemäß SEQ ID NO. 40 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines zu Pal verwandten Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 41 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 64 bis 378 gemäß SEQ ID NO. 41 entspricht;
– ein Vorläufer eines zu Pal verwandten Lipoproteins oder matures zu Pal verwandtes Lipoprotein, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 42 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 46% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 22 bis 125 gemäß SEQ ID NO. 42 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Alkalischen Phosphatase D (E.C. 3.1.3.1), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 43 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 139 bis 1722 gemäß SEQ ID NO. 43 entspricht;
– ein Vorläufer einer Alkalischen Phosphatase D (E.C. 3.1.3.1) oder mature Alkalische Phosphatase D (E.C. 3.1.3.1), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 44 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 47 bis 573 gemäß SEQ ID NO. 44 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Beta-Lactamase (E.C. 3.5.2.6), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 45 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 90% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 103 bis 924 gemäß SEQ ID NO. 45 entspricht;
– ein Vorläufer einer Beta-Lactamase (E.C. 3.5.2.6) oder mature Beta-Lactamase (E.C. 3.5.2.6), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 46 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 92% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 35 bis 307 gemäß SEQ ID NO. 46 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Beta-N-Acetylglucosaminidase (E.C. 3.2.1.96), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 47 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92,5%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 70 bis 2631 gemäß SEQ ID NO. 47 entspricht;
– ein Vorläufer einer Beta-N-Acetylglucosaminidase (E.C. 3.2.1.96) oder mature Beta-N-Acetylglucosaminidase (E.C. 3.2.1.96), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 48 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 48% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 24 bis 876 gemäß SEQ ID NO. 48 entspricht;
– eine Nukleinsäure tagB, codierend für den Vorläufer eines Teichonsäure-Biosynthese-Proteins B (Homolog zu TagB), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 49 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 61 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92,5%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 130 bis 1164 gemäß SEQ ID NO. 49 entspricht;
– ein Vorläufer eines Teichonsäure-Biosynthese-Proteins B TagB (Homolog zu TagB) oder matures Teichonsäure-Biosynthese-Proteins B TagB (Homolog zu TagB), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 50 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 53% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 44 bis 387 gemäß SEQ ID NO. 50 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines periplasmatischen Spermidin/-Putrescin-Bindungsproteins 2, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 51 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 51 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92,5%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 1083 gemäß SEQ ID NO. 51 entspricht;
– ein Vorläufer eines periplasmatischen Spermidin/Putrescin-Bindungsproteins 2 oder matures periplasmatisches Spermidin/Putrescin-Bindungsprotein 2, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 52 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 31 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 360 gemäß SEQ ID NO. 52 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines Chinol-Oxidase-Polypeptids II (E.C. 1.9.3.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 53 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 969 gemäß SEQ ID NO. 53 entspricht;
– ein Vorläufer eines Chinol-Oxidase-Polypeptids II (E.C. 1.9.3.-) oder matures Chinol-Oxidase-Polypeptids II (E.C. 1.9.3.-), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 54 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 322 gemäß SEQ ID NO. 54 entspricht;
– eine Nukleinsäure yqgU, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 55 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 58% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 1110 gemäß SEQ ID NO. 55 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins YqgU oder matures hypothetisches Lipoprotein YqgU, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 56 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 35% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 369 gemäß SEQ ID NO. 56 entspricht;
– eine Nukleinsäure yurl, codierend für den Vorläufer einer extrazellulären Ribonuclease (E.C. 3.1.-.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 57 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 76 bis 813 gemäß SEQ ID NO. 57 entspricht;
– ein Vorläufer einer extrazellulären Ribonuclease Yurl (E.C. 3.1.-.-) oder mature extrazelluläre Ribonuclease Yurl, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 58 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 26 bis 270 gemäß SEQ ID NO. 58 entspricht;
– eine Nukleinsäure bofC, codierend für den Vorläufer eines Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 59 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 522 gemäß SEQ ID NO. 59 entspricht;
– ein Vorläufer eines Proteins BofC oder matures Protein BofC, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 60 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 173 gemäß SEQ ID NO. 60 entspricht;
– eine Nukleinsäure fliZ, codierend für den Vorläufer eines flagellären Biosyntheseproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 61 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 67% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 675 gemäß SEQ ID NO. 61 entspricht;
– ein Vorläufer eines flagellären Biosyntheseproteins FliZ oder matures flagelläres Biosyntheseprotein FliZ, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 62 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 59% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 224 gemäß SEQ ID NO. 62 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für ein Vorläufer einer Gamma-glutamyl-Transpeptidase, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 63 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 76 bis 1758 gemäß SEQ ID NO. 63 entspricht;
– ein Vorläufer einer Gamma-glutamyl-Transpeptidase oder mature Gamma-glutamyl- Transpeptidase, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 64 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 71 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 26 bis 585 gemäß SEQ ID NO. 64 entspricht;
– eine Nukleinsäure yqiX, codierend für den Vorläufer eines wahrscheinlichen extrazellulären Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 65 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 76 bis 540 gemäß SEQ ID NO. 65 entspricht;
– ein Vorläufer eines wahrscheinlichen extrazellulären Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsproteins YqiX oder matures wahrscheinliches extrazelluläres Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsprotein YqiX, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 66 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 53% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 26 bis 179 gemäß SEQ ID NO. 66 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Chitinase (E.C. 3.2.1.14), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 67 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 2082 gemäß SEQ ID NO. 67 entspricht;
– ein Vorläufer einer Chitinase (E.C. 3.2.1.14) oder mature Chitinase (E.C. 3.2.1.14), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 68 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 52% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 693 gemäß SEQ ID NO. 68 entspricht;
– eine Nukleinsäure yckB, codierend für den Vorläufer eines wahrscheinlichen extrazellulären Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 69 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 106 bis 876 gemäß SEQ ID NO. 69 entspricht;
– ein Vorläufer eines wahrscheinlichen extrazellulären Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsproteins YckB oder matures wahrscheinliches extrazelluläres Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsprotein YckB, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 70 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 36 bis 291 gemäß SEQ ID NO. 70 entspricht;
– eine Nukleinsäure lytA, codierend für den Vorläufer eines membrangebundenen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 71 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 56% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 70 bis 321 gemäß SEQ ID NO. 71 entspricht;
– ein Vorläufer eines membrangebundenen Proteins LytA oder matures membrangebundenes Protein LytA, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 72 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 38% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 24 bis 106 gemäß SEQ ID NO. 72 entspricht;
– eine Nukleinsäure lytE, codierend für den Vorläufer einer vermutlichen Endopeptidase, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 73 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 65% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 831 gemäß SEQ ID NO. 73 entspricht;
– ein Vorläufer einer vermutlichen Endopeptidase LytE oder mature vermutliche Endopeptidase LytE, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 74 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 60% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 277 gemäß SEQ ID NO. 74 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Lipase (E.C. 3.1.1.3), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 75 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 64 bis 1461 gemäß SEQ ID NO. 75 entspricht;
– ein Vorläufer einer Lipase (E.C. 3.1.1.3) oder mature Lipase (E.C. 3.1.1.3), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 76 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 42% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 22 bis 487 gemäß SEQ ID NO. 76 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines D-Ribose-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 77 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 915 gemäß SEQ ID NO. 77 entspricht;
– ein Vorläufer eines D-Ribose-Bindungsproteins oder matures D-Ribose-Bindungsprotein, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 78 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 304 gemäß SEQ ID NO. 78 entspricht;
– eine Nukleinsäure epr, codierend für den Vorläufer einer kleineren extrazellulären Protease (E.C. 3.4.21.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 79 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 1776 gemäß SEQ ID NO. 79 entspricht;
– ein Vorläufer einer kleineren extrazellulären Protease Epr (E.C. 3.4.21.-) oder mature kleinere extrazelluläre Protease Epr (E.C. 3.4.21.-), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 80 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 56% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 591 gemäß SEQ ID NO. 80 entspricht;
– eine Nukleinsäure mntA, codierend für den Vorläufer eines Mangan-bindenden Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 81 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 65% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 930 gemäß SEQ ID NO. 81 entspricht;
– ein Vorläufer eines Mangan-bindenden Lipoproteins MntA oder matures Mangan-bindendes Lipoprotein MntA, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 82 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 309 gemäß SEQ ID NO. 82 entspricht;
– eine Nukleinsäure yhcR, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 83 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 66% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 100 bis 3621 gemäß SEQ ID NO. 83 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YhcR oder matures Protein YhcR, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 84 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 60% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 34 bis 1206 gemäß SEQ ID NO. 84 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Alpha-Amylase (E.C. 3.2.1.1), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 85 angegebenen Nukleotidsequenz in mindestens 1537 Positionen, bevorzugt in 1538 und besonders bevorzugt in 1539 Positionen der codierenden Sequenz (CDS, umfassend die Positionen 1 bis 1539) übereinstimmt, insbesondere in mindestens 1450 Positionen, bevorzugt in 1451 und ganz besonders bevorzugt 1452 Positionen des 1452 Positionen umfassenden Teilbereichs, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 1539 gemäß SEQ ID NO. 85 entspricht; hierunter sind ganz besonders solche bevorzugt, die in den Positionen 37, 99 und/oder 1015 die Nukleotide C, A beziehungsweise G besitzen; hierunter sind weiterhin solche bevorzugt, die in den Positionen 37 bis 39 die für die Aminosäure Prolin (P) codierenden Basentripletts CCT, CCC, CCA oder CCG besitzen und/oder die in den Positionen 97 bis 99 das für die Aminosäure Lysin (K) codierende Basentriplett AAA besitzen und/oder die in den Positionen 1015 bis 1017 die für die Aminosäure Glycin (G) codierenden Basentripletts GGT, GGC, GGA oder GGG besitzen;
– ein Vorläufer einer Alpha-Amylase (E.C. 3.2.1.1) oder mature Alpha-Amylase (E.C. 3.2.1.1), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 86 angegebenen Aminosäuresequenz in mindestens 510 Positionen, vorzugsweise in 511 und besonders bevorzugt in 512 Positionen übereinstimmt, insbesondere in mindestens 481, vorzugsweise 482, besonders bevorzugt 483 Positionen des 483 Positionen umfassenden Teilbereichs, der den Aminosäurepositionen 30 bis 512 gemäß SEQ ID NO. 86 entspricht; hierunter sind ganz besonders solche bevorzugt, die in den Positionen 13, 33 und/oder 339 die Aminosäuren P, K beziehungsweise G besitzen;
– eine Nukleinsäure lplA, codierend für den Vorläufer eines Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 87 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 75% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 1506 gemäß SEQ ID NO. 87 entspricht;
– ein Vorläufer eines Lipoproteins LplA oder matures Lipoprotein LplA, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 88 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 75% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 501 gemäß SEQ ID NO. 88 entspricht;
– eine Nukleinsäure yqeF, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 89 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 70% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 732 gemäß SEQ ID NO. 89 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YqeF oder matures Protein YqeF, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 90 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 66% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 243 gemäß SEQ ID NO. 90 entspricht;
– eine Nukleinsäure yxeB, codierend für den Vorläufer eines wahrscheinlichen ABC-Transporter-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 91 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 103 bis 960 gemäß SEQ ID NO. 91 entspricht;
– ein Vorläufer eines wahrscheinlichen ABC-Transporter-Bindungsproteins YxeB oder matures wahrscheinliches ABC-Transporter-Bindungsprotein YxeB, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 92 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 35 bis 319 gemäß SEQ ID NO. 92 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines Cellulase-ähnlichen Proteins (E.C. 3.2.1.4), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 93 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 55% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 1683 gemäß SEQ ID NO. 93 entspricht;
– ein Vorläufer eines Cellulase-ähnlichen Proteins (E.C. 3.2.1.4) oder matures Cellulase-ähnliches Protein (E.C. 3.2.1.4), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 94 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 34% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 560 gemäß SEQ ID NO. 94 entspricht;
– eine Nukleinsäure prsA, codierend für den Vorläufer eines Proteinexport-Proteins (E.C. 5.2.1.8), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 95 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 861 gemäß SEQ ID NO. 95 entspricht;
– ein Vorläufer eines Proteinexport-Proteins PrsA (E.C. 5.2.1.8) oder matures Proteinexport-Protein PrsA (E.C. 5.2.1.8), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 96 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 68% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 286 gemäß SEQ ID NO. 96 entspricht;
– eine Nukleinsäure yhcN, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 97 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 63% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 561 gemäß SEQ ID NO. 97 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins YhcN oder matures hypothetisches Lipoprotein YhcN, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 98 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 53% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 186 gemäß SEQ ID NO. 98 entspricht;
– eine Nukleinsäure yhcJ, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 99 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 61 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 819 gemäß SEQ ID NO. 99 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins YhcJ oder matures hypothetisches Lipoprotein YhcJ, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 100 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 52% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 272 gemäß SEQ ID NO. 100 entspricht;
– eine Nukleinsäure c-551, codierend für den Vorläufer eines Cytochroms C551, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 101 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 327 gemäß SEQ ID NO. 101 entspricht;
– ein Vorläufer eines Cytochroms C551 oder matures Cytochrom C551, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 102 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 56% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 108 gemäß SEQ ID NO. 102 entspricht;
– eine Nukleinsäure ypjB, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 103 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 67% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 801 gemäß SEQ ID NO. 103 entspricht;
– ein Vorläufer eines hypothetischen Proteins YpjB oder matures Protein YpjB, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 104 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 266 gemäß SEQ ID NO. 104 entspricht;
– eine Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Sporulations-spezifischen extrazellulären Nuclease (E.C. 3.-.-.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 105 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 429 gemäß SEQ ID NO. 105 entspricht;
– ein Vorläufer einer Sporulations-spezifischen extrazellulären Nuclease (E.C. 3.-.-.-) oder mature Sporulations-spezifische extrazelluläre Nuclease (E.C. 3.-.-.-), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 106 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 142 gemäß SEQ ID NO. 106 entspricht.

Diese Gene und Genprodukte können nun nach an sich bekannten Methoden, und ohne daß man die in Beispiel 2 geschilderte Sequenzierung nacharbeiten muß, gezielt anhand dieser Sequenzen künstlich synthetisiert werden.

Als weitere Alternative hierzu ist es möglich, die betreffenden Gene aus einem Bacillus-Stamm, insbesondere dem von der DSMZ erhältlichen Stamm B. licheniformis DSM 13, über PCR zu gewinnen, wobei die im Sequenzprotokoll angebenen jeweiligen Randsequenzen für die Synthese von Primern verwendet werden können. Bei Verwendung anderer Stämme werden die jeweils homologen Gene hierzu erhalten, wobei die PCR umso erfolgreicher sein sollte, je enger die ausgewählten Stämme mit B. licheniformis DSM 13 verwandt sind, weil damit eine zunehmende Sequenzübereinstimmung auch innerhalb der Primer-Bindungsregionen einhergehen dürfte.

Alternativ dazu können die im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren auch als DNA-Sonden eingesetzt werden, um die jeweiligen homologen Gene in Präparationen genomischer DNA anderer Spezies nachzuweisen. Das Vorgehen hierzu ist an sich bekannt; ebenso wie die Isolierung der auf diese Weise erhaltenen Gene, deren Klonierung, deren Expression und Gewinnung der zugehörigen Proteine. Insbesondere ist dabei an solche Arbeitsschritte gedacht, wie sie in Beispiel 2 für B. licheniformis selbst dargestellt sind.

Als Nachweis für die Existenz der betreffenden Proteine in einem interessierenden Stamm dient, sofern es sich um Enzyme handelt, ein enzymatischer Nachweis der betreffenden Enzymaktivitäten aus dem Nährmedium über geeignete Nachweisreaktionen. Dies geschieht beispielsweise so, daß die für die fragliche Reaktion relevante Ausgangsverbindung vorgelegt, mit einer Probe des Überstands (der die sekretierten Enzyme enthält) inkubiert und das gebildete Produkt nach jeweils geeigneten Meßmethoden erfaßt wird.

Als Nachweis auf molekularbiologischer Ebene können die im vorliegenden Sequenzprotokoll dargestellten Proteine nach üblichen Methoden synthetisiert und hiergegen Antikörper gebildet werden; dies gilt auch für Proteine, die nicht über eine spezifische enzymatische Reaktion erkennbar sind. Diese Proteine sind dann beispielsweise in Western-Blots für den Nachweis des homologen Proteins in Nährmediumproben der interessierenden Wirtszellen verwendbar.

Unter den bisher genannten erfindungsgemäßen, unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104 und 106 definierten, sekretierten Proteinen ist jeweils solch eines bevorzugt, welches natürlicherweise von einem Mikroorganismus gebildet wird, vorzugsweise von einem Bakterium, besonders bevorzugt von einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt von einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt von einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders bevorzugt von B. licheniformis DSM13.

Entsprechendes gilt für die zugehörigen Nukleinsäuren: Unter den bisher genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, definiert unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 und 105, codierend für ein sekretiertes Protein, ist jeweils solch eine bevorzugt, welche natürlicherweise in einem Mikroorganismus enthalten ist, vorzugsweise einem Bakterium, besonders bevorzugt einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders bevorzugt B. licheniformis DSM13.

Denn es ist, wie soeben beschrieben, gegenüber der Neusynthese vergleichsweise einfach möglich, die betreffenden Genprodukte und/oder Nukleinsäuren aus natürlichen Spezies, insbesondere Mikroorganismen zu erhalten. Hierunter sind in Hinblick auf die gestellte Aufgabe zunehmend diejenigen bevorzugt, die sich fermentieren lassen und die in großtechnischen Fermentationen tatsächlich eingesetzt werden. Dazu zählen besonders Vertreter der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterium und Bacillus. Hierunter sind beispielsweise S. carnosus und C. glutamicum zu nennen, sowie B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. lentus, B. globigii und B. alkalophilus. Am meisten ist B. licheniformis DSM13 bevorzugt, weil aus diesem exakt die im Sequenzprotokoll aufgelisteten Sequenzen erhalten werden konnten.

Insbesondere bei diesen fermentierbaren Organismen stellt sich die Aufgabe, die Fermentation durch Aussschalten einzelner oder mehrerer dieser Gene beziehungsweise Verhinderung der Bildung einzelner oder mehrerer dieser Genprodukte in der oben beschriebenen Weise zu verbessern. Zum anderen sollte dies, wenn hierfür die zugehörigen Nukleinsäure verwendet werden, umso erfolgreicher sein, je enger die betreffenden Gene und/oder Genprodukte mit den im Sequenzprotokoll angegebenen verwandt sind.

Unter den genannten Nukleinsäuren sind jeweils diejenigen bevorzugt, die für eines der zuvor beschriebenen, unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104 und 106 definierten, und/oder weiteren erfindungsgemäßen sekretierten Proteine codieren.

Denn für diese besteht der mit dieser Anmeldung belegte Bezug zum sekretierten Protein, dessen Bildung unterbunden werden soll. Zudem stehen einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung zufolge die erfindungsgemäßen Proteine auch für ihre positive Nutzung zur Verfügung. Insofern ist es wichtig, diese tatsächlich über nach an sich bekannte Methoden biotechnologisch herstellen zu können. Hierzu dienen die jeweils zugehörigen Nukleinsäuren.

Besonders zwischen entfernt verwandten Spezies bestehen Unterschiede hinsichtlich des Gebrauchs synonymer, für die jeweiligen Aminosäuren codierender Codons, worauf auch der Proteinbiosyntheseapparat ausgerichtet ist, etwa über die verfügbare Anzahl der passenden beladenen tRNAs. Die Übertragung eines der genannten Gene in eine weniger verwandte Spezies kann dann besonders erfolgreich beispielsweise zur Deletionsmutation oder zur Synthese des betreffenden Proteins genutzt werden, wenn sie hinsichtlich der Codons entsprechend optimiert ist. Hierdurch können prozentual auf der DNA-Ebene zunehmende Unterschiede eingeführt werden, die auf der Aminosäureebene jedoch ohne Folge bleiben. Aus diesem Grund stellen auch solche Nukleinsäuren Verwirklichungen der vorliegenden Erfindung dar.

Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Vektoren dar, die eine der zuvor bezeichneten, unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 und 105 definierten, und/oder weiteren erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten.

Denn um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, und damit insbesondere die Produktion erfindungsgemäßer Proteine vorzubereiten, werden sie geeigneterweise in Vektoren ligiert. Solche Vektoren sowie die zugehörigen Arbeitsmethoden sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Vektoren sind in großer Zahl und Variationsbreite, sowohl für die Klonierung als auch für die Expression kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Bakteriophagen oder von Viren ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren. Ferner werden sie nach der Art der Zelltypen, in denen sie sich zu etablieren vermögen, beispielsweise nach Vektoren für gramnegative, für grampositive Bakterien, für Hefen oder für höhere Eukaryonten unterschieden. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte beispielsweise für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sowie für die Expression des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins. Insbesondere zur Herstellung von Konstrukten zur Deletion oder Verstärkung der Expression sind sie – wie aus dem hierfür einschlägigen Stand der Technik hervorgeht – praktisch unerläßlich.

Hierunter sind solche Vektoren bevorzugt, die zwei oder mehrere der zuvor bezeichneten Nukleinsäuren enthalten. Denn darüber sind zum einen die betreffenden Gene gleichzeitig lagerbar oder können unter der Kontrolle desselben Promotors exprimiert werden. Einer anderen Anwendung zufolge kann ein Vektor, der gleichzeitig zwei oder mehr intakte Kopien der erfindungsgemäßen Gene enthält, dazu dienen, eine Deletionsmutante, die gleichzeitig in mehreren dieser Genen deletiert ist, am Leben zu erhalten (Rescue). Ein gezieltes Entfernen dieses Vektors hat dann das gleichzeitige Abschalten dieser mehreren Gene zur Folge.

In einer Ausführungsform handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Klonierungsvektoren.

Denn Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifizierung oder der Selektion des interessierenden Gens für dessen molekularbiologische Charakterisierung. Gleichzeitig stellen sie transportierbare und lagerfähige Formen der beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die PCR oder In-vitro-Mutagenese-Verfahren.

Vorzugsweise handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Expressionsvektoren.

Denn derartige Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die entsprechenden Nukleinsäuren in biologischen Produktionssystemen zu realisieren und damit die zugehörigen Proteine zu produzieren. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus einem anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form einer sogenannten Expressionskassette angeordnet sein. Alternativ können einzelne oder alle Regulationselemente auch von der jeweiligen Wirtszelle bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind die Expressionsvektoren hinsichtlich weiterer Eigenschaften, wie beispielsweise die optimale Kopienzahl, auf das gewählte Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle (siehe unten) abgestimmt.

Die Möglichkeit zur Bildung intakter Genprodukte anhand eines Vektors, der ein einziges Replikon darstellt, ist insbesondere für den oben beschriebenen Rescue und das Abschalten bestimmter Gene von Bedeutung. Umgekehrt ist die Bereitstellung eines Expressionsvektors die beste Möglichkeit, ein erfindungsgemäßes Protein verstärkt zu bilden und somit die betreffende Aktivität zu erhöhen.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Zellen, die nach gentechnischer Modifizierung eine der zuvor bezeichneten, unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 und/oder 105 definierten und weiteren erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten.

Denn diese Zellen enthalten die genetische Information zur Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins. Hierunter sind insbesondere diejenigen Zellen gemeint, die nach an sich bekannten Verfahren mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren versehen worden sind, beziehungsweise die sich von solchen Zellen ableiten. Dafür werden geeigneterweise solche Wirtszellen ausgewählt, die sich vergleichsweise einfach kultivieren lassen und/oder hohe Produktausbeuten liefern.

Sie ermöglichen beispielsweise die Amplifizierung der entsprechenden Gene, aber auch deren Mutagenese oder Transkription und Translation und letztlich die biotechnologische Produktion der betreffenden Proteine. Diese genetische Information kann entweder extrachromosomal als eigenes genetisches Element, das heißt bei Bakterien in plasmidaler Lokalisation vorliegen oder in ein Chromosom integriert sein. Die Wahl eines geeigneten Systems hängt von Fragestellungen, wie beispielsweise die Art und Dauer der Lagerung des Gens, beziehungsweise des Organismus oder die Art der Mutagenese oder Selektion ab.

Daraus erklärt sich die bevorzugte Ausführungsform, nach welcher in einer solchen Zelle die genannte Nukleinsäure Teil eines Vektors ist, insbesondere eines zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Vektors.

Bevorzugt ist darunter jeweils eine Wirtszelle, bei der es sich um ein Bakterium handelt.

Denn Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert werden. Zudem verfügt man bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf etc. gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein gramnegatives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).

Denn bei gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. In der Anmeldung WO 01/81597 A1 wird ein Verfahren offenbart, nach welchem erreicht wird, daß auch gramnegative Bakterien die exprimierten Proteine ausschleusen. Die als bevorzugt genannten gramnegativen Bakterien sind in der Regel leicht, das heißt kommerziell oder über öffentliche Stammsammlungen zugänglich und im Zusammenspiel mit ebenfalls in großer Zahl zur Verfügung stehenden übrigen Komponenten wie etwa Vektoren auf spezifische Herstellbedingungen hin optimierbar.

In einer alternativen, nicht minder bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein grampositives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebakterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum, und hierunter wiederum ganz besonders bevorzugt um ein Derivat von B. licheniformis DSM 13.

Denn grampositive Bakterien besitzen den gramnegativen gegenüber den grundsätzlichen Unterschied, sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abzugeben, aus welchem sich, wenn das gewünscht ist, die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aus dem Nährmedium aufreinigen lassen. Zudem sind sie mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so daß sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. Ganz besonders bevorzugt sind Derivate von B. licheniformis DSM 13 deshalb, weil sie zum einen ebenfalls im Stand der Technik als biotechnologische Produktionsstämme weit verbreitet sind und weil zum anderen mit der vorligenden Anmeldungen exakt die erfindungsgemäßen Gene und Proteine aus B. licheniformis DSM 13 zur Verfügung gestellt werden, so daß die Realisierung der vorliegenden Erfindung am ehesten in solchen Stämmen erfolgreich sein sollte.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bilden Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer der oben beschriebenen, unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104 und 106 definierten und/oder weiteren erfindungsgemäßen Genprodukte (Proteine).

Dazu gehört jedes Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins, beispielsweise chemische Syntheseverfahren. Demgegenüber sind jedoch alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen, beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren bevorzugt. Deren Ziel besteht in erster Linie darin, die erfindungsgemäßen Proteine zu erhalten, um sie entsprechenden Anwendungen zur Verfügung zu stellen.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer oben bezeichneten, unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 und 105 definierten und/oder weiteren erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erfolgen, vorzugsweise unter Einsatz eines zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Vektors und besonders bevorzugt unter Einsatz einer zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Zelle.

Denn durch die genannten Nukleinsäuren, insbesondere den konkreten im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren wird die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch verwertbarer Form, das heißt für gentechnische Produktionsverfahren zur Verfügung gestellt. Zunehmend bevorzugt ist die Bereitstellung auf einem von der Wirtszelle besonders erfolgreich verwertbaren Vektor beziehungsweise von solchen Zellen selbst. Die betreffenden Produktionsverfahren sind dem Fachmann an sich bekannt.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so daß optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen.

Weiterhin bevorzugt sind solche derartigen Verfahren, bei denen die Nukleotidsequenz in einem, vorzugsweise mehreren und besonders bevorzugt allen Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepaßt worden ist.

Denn entsprechend dem oben Gesagten kann die Übertragung eines der genannten Gene in eine weniger verwandte Spezies dann besonders erfolgreich zur Synthese des betreffenden Proteins genutzt werden, wenn sie hinsichtlich des Gebrauchs der Codons entsprechend optimiert ist.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand besteht in der Verwendung eines oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104 und 106 definierten und/oder weiteren erfindungsgemäßen Proteins entsprechend seiner dort jeweils angegebenen biochemischen Eigenschaften.

Denn mit der vorliegenden Erfindung werden nicht allein die betreffenden Nukleinsäuren zur Inaktivierung der betreffenden Gene zur Verfügung gestellt, sondern auch deren positive Nutzung ermöglicht. Die jeweiligen von diesen Proteinen, insbesondere Enzymproteinen wahrgenommenen biochemischen Funktionen sind in den entsprechenden Zeilen des Sequenzprotokolls angegeben und auch oben schon genannt worden. Einen weiteren Hinweis auf die jeweiligen Einsatzmöglichkeiten liefern die definierten Funktionen der in Tabelle 1 jeweils zugeordneten aus dem Stand der Technik bekannten Proteine.

Können chemische Syntheseverfahren durch Einsatz geeigneter Enzyme zumindest in einem Reaktionsschritt von biologischen Katalysatoren übernommen werden, ergibt sich dadurch zumeist eine nennenswerte Vereinfachung. Dies gilt beispielsweise für stereochemische Reaktionen. Man spricht dann von Biotransformation. Dementsprechend stellen alle derartigen Syntheseverfahren, in denen erfindungsgemäße Proteine, vorzugsweise erfindungsgemäße Enzyme einsetzbar sind, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.

Eine bevorzugte derartige Verwendung ist eine, wobei es sich um eine hydrolytische Aktivität handelt, und vorzugsweise das betreffende hydrolytische Enzym im Rahmen einer Wasch- und/oder Reinigungsanwendung zur Entfernung von Anschmutzungen eingesetzt wird.

Als Beispiele hierfür seien die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 18, 26, 28, 32, 68, 74, 76, 80, 86 und 94 offenbarten beziehungsweise hierzu hinreichend verwandten erfindunsgemäßen Proteine genannt. Hierbei handelt es sich in dieser Reihenfolge um eine (putative) Arabinase, eine Mannosidase (beziehungsweise deren Precursor), eine Pektatlyase (beziehungsweise deren Precursor) – die unter dem Begriff der Hemicellulasen zusammengefaßt werden können; ferner um eine (hypothetische) Peptidase, eine Chitinase (beziehungsweise deren Precursor), eine (putative) Peptidase, eine Lipase (beziehungsweise deren Precursor), eine Protease (beziehungsweise deren Precursor), eine α-Amylase (beziehungsweise deren Precursor) und um eine (wahrscheinliche) Cellulase (beziehungsweise deren Precursor). Insbesondere bei diesen vier zuletzt genannten Enzymtypen handelt es sich einem reichhaltigen Stand der Technik zufolge um besonders erfolgreich in Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzte aktive Inhaltsstoffe.

Eine weitere Ausprägung der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 und 105 definierten und/oder einer weiteren oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder Teilen davon zur funktionellen Inaktivierung des jeweils zugehörigen Gens in einem Mikroorganismus.

Unter der funktionellen Inaktivierung ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung jede Art von Modifikation oder Mutation zu verstehen, wonach die Funktion des betreffenden Proteins unterbunden wird. Dazu gehört die Ausführungsform, daß ein praktisch vollständiges, aber inaktives Protein gebildet wird, daß inaktive Teile eines solchen Proteins in der Zelle vorliegen, bis hin zu den Möglichkeiten, daß das zugehörige Gen nicht mehr translatiert wird oder sogar vollständig deletiert ist. Somit besteht eine spezielle „Verwendung" dieser Faktoren beziehungsweise Gene dieser Ausführungsform nach darin, daß sie in der betreffenden Zelle eben nicht mehr auf ihre natürliche Weise zur Wirkung kommen. Dies wird diesem Erfindungsgegenstand zufolge auf genetischer Ebene dadurch erreicht, daß das betreffende Gen ausgeschaltet wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform davon führt die funktionelle Inaktivierung dazu, daß das betreffende Protein nicht vollständig, vorzugsweise überhaupt nicht sekretiert wird und besonders bevorzugt gar nicht erst synthetisiert wird.

Denn dann wird zum einen der Sekretionsapparat des betreffenden Organismus weniger durch dieses Protein belastet und steht entsprechend mehr für eine verstärkte Sekretion der eigentlich interessierenden Proteine zur Verfügung. Dies geschieht besonders bevorzugt dadurch, daß sie gar nicht erst synthetisiert werden und sich somit auch keine Teilprodukte im Inneren der Zellen anhäufen können. Denn damit stehen entsprechend größere Anteile des Proteinbiosynthese- beziehungsweise des Sekretionsapparats für die eigentlich interessierenden Proteine zur Verfügung. Verschiedene Ausführungsformen dieses Gegenstand werden weiter unten ausgeführt. Hierbei ist unter anderem zu berücksichtigen, daß die im Stand der Technik zur Inaktivierung auf genetischer Ebene zur Verfügung stehenden Methoden unterschiedliche Ergebnisse liefern können. So kann mit Antisense-Konstrukten (siehe unten) in der Regel zwar eine sehr weitgehende, nicht jedoch 100%ige Inaktivierung erreicht werden. Hierfür ist eine Deletion des betreffenden Gens bevorzugt.

In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei diesen Verwendungen um solche, bei denen die funktionelle Inaktivierung während der Fermentation des Mikroorganismus erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform hiervon werden die eindeutig auf die betreffenden, inaktivierten Enzyme oder Proteine zurückzuführenden Aktivitäten beziehungsweise Proteingehalte, vorzugsweise auf 50%, besonders bevorzugt auf weniger als 20%, ganz besonders bevorzugt auf weniger als 5% der ohne die Inaktivierung auftretenden Aktivitäts- beziehungsweise Konzentrationswerte reduziert.

Denn der Aufgabe entsprechend sollte die Fermentation der für eine biotechnologische Produktion eingesetzten Mikroorganismen verbessert werden. Zunächst einmal ist es sinnvoll und bei mehreren Genen in der Regel notwendig, die betreffenden molekularbiologischen Konstrukte im Labormaßstab und gegebenenfalls an Wirtsszellen durchzuführen, welche ldgl. Zwischenstufen darstellen. Ein Beispiel hierfür ist die an sich bekannte und auch in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschriebene Konstruktion eines Deletionsvektors in E. coli. Erfindungsgemäß ist es insbesondere erwünscht, daß die Inaktivierung der Gene vor allem bei der Fermentation die erhoffte Wirkung zeigt.

Die Abstufung hinsichtlich des Maßes der Inaktivierung berücksichtigt die unterschiedliche Wirksamkeit der verschiedenen zur Inaktivierung zur Verfügung stehenden Methoden. Zur Bestimmung dieser Werte werden Zellen eines nichtbehandelten Stamms und eines behandelten Stamms unter ansonsten identischen Bedingungen fermentiert und geeigneterweise während der Fermentation die betreffenden Enzynmaktivitäten aus dem Überstand der jeweiligen Kulturen bestimmt. Da die Stämme ansonsten identisch sind, sind die Aktivitätsunterschiede auf die erfindungsgemäßen Inaktivierungen zurückzuführen. Dabei ist erfindungsgemäß jede entsprechende Aktivitätserniedrigung erwünscht. Prozentual vergleichbare Werte erhält man, indem man aus beiden Fermentationen Proben nimmt und nach an sich bekannten Methoden die betreffenden Aktivitäten bestimmt. Zunehmend bevorzugt ist es, wenn der jeweilige in der erfindungsgemäßen Probe bestimmbare Wert beim Übergang in die stationäre Wachstumsphase weniger als 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% und ganz besonders weniger als 1 % des entsprechenden Werts der Vergleichsfermantation beträgt. Für Proteine, die keinem enzymatischen Nachweis zugänglich sind, kann analog eine antikörperbasierte Nachweisreaktion durchgeführt werden, wie sie prinzipiell weiter oben bereits beschrieben worden ist.

Zunehmend bevorzugt werden bei diesen erfindungsgemäßen Inaktivierungen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 und besonders bevorzugt alle der genannten Gene funktionell inaktiviert.

Denn dies stellt entsprechend zunehmende Entlastungen des Proteinbiosynthese- und/oder des Sekretionsapparats der betreffenden Zellen dar.

In einer Ausführungsform dieser Verwendungen zur funktionellen Inaktivierung handelt es sich um solche Verwendungen, wobei für die Inaktivierung jeweils eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.

Derartige Nukleinsäuren können über an sich bekannte Verfahren zur Punktmutagenese erzeugt werden. Solche sind beispielsweise in einschlägigen Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis, „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, dargestellt. Zudem stehen hierfür inzwischen zahlreiche kommerzielle Baukästen zur Verfügung, etwa das QuickChange^®-Kit der Firma Stratagene, La Jolla, USA. Dessen Prinzip besteht darin, daß Oligonukleotide mit einzelnen Austauschen (Mismatch-Primer) synthetisiert und mit dem einzelsträngig vorgelegten Gen hybridisiert werden; anschließende DNA-Polymerisation ergibt dann entsprechende Punktmutanten. Hierfür können die jeweiligen Spezies-eigenen Sequenzen dieser Gene verwendet werden. Aufgrund der hohen Homologien ist es möglich und erfindungsgemäß besonders vorteilhaft, diese Reaktion anhand der mit dem Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Nukleinsäuresequenzen durchzuführen. Diese Sequenzen können auch dazu dienen, entsprechende Mismatch-Primer für verwandte Spezies zu entwerfen, wie sie nach an sich bekannten Methoden anhand von Alignments der betreffenden Sequenzen ableitbar sind.

Nach einer alternativen Ausführungsform dieser Verwendung wird für die funktionelle Inaktivierung jeweils eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.

Auch diese Verfahren sind dem Fachmann an sich vertraut. Somit ist es möglich, die Bildung eines oder mehrerer der Faktoren im Sequenzprotokoll angegebenen Proteine durch die Wirtszelle dadurch zu verhindern, daß ein Teil des betreffenden Gens auf einem entsprechenden Transformationsvektor über Restriktionsendonukleasen herausgeschnitten und der Vektor anschließend in den interessierenden Wirt transformiert wird, wo über die – bis dahin noch mögliche – homologe Rekombination das aktive Gen gegen die inaktive Kopie ausgetauscht wird. In der Ausführungsform der Insertionsmutation kann lediglich das intakte Gen unterbrechend oder anstelle eines Genteils ein anderes Gen, beispielsweise ein Selektionsmarker eingefügt werden. Hierüber ist das Mutationsereignis in an sich bekannter Weise phänotypisch überprüfbar.

Um diese jeweils notwendigen Rekombinationsereignisse zwischen dem in die Zelle eingeführten defekten Gen und der beispielsweise auf dem Chromosom endogen vorhandenen intakten Genkopie zu ermöglichen, ist nach dem derzeitigen Wissensstand eine Übereinstimmung in jeweils mindestens 70 bis 150 zusammenhängenden Nukleinsäurepositionen, jeweils in den beiden Randsequenzen zu dem nichtübereinstimmenden Teil nötig, wobei es auf den dazwischenliegenden Teil nicht ankommt. Dementsprechend sind solche Ausführungsformen bevorzugt, die lediglich zwei flankierende Regionen mit mindestens diesen Größen umfassen.

Nach einer alternativen Ausführungsform dieser Verwendung werden Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit den für das Protein codierenden Bereich zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig flankieren. Die flankierenden Bereiche können dabei ausgehend von den bekannten Sequenzen über an sich bekannte Methoden, beispielsweise mithilfe nach außen gerichteter PCR-Primer und einer Präparation genomischer DNA als Matrize ermittelt werden (anchored PCR). Denn allein um den Austausch der beiden Genkopien über homologe Rekombination zu ermöglichen, braucht es sich dabei nicht zwangsläufig um proteincodierende Abschnitte zu handeln. Der vorliegenden Erfindung zufolge können die hierfür benötigten Primer anhand der im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleotidsequenzen auch für andere Spezies grampositiver Bakterien und hierunter insbesondere für solche der Gattung Bacillus entworfen werden. Alternativ zu diesem experimentellen Ansatz können derartige, wenigstens zum Teil nichtcodierende Bereiche für viele dieser Gene aus verwandten Spezies, beispielsweise aus B. subtilis Datenbankeinträgen entnommen werden, beispielsweise der Datenbank Subtilist des Institute Pasteur, Paris, Frankreich (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi).

Nach einer weiteren alternativen Ausführungsform dieser Verwendung wird für die funktionelle Inaktivierung jeweils eine Nukleinsäure eingesetzt, die mit der 5'-terminalen Sequenz, insbesondere der Signalsequenz des zugehörigen Gens oder Teilen davon identisch ist oder interferiert.

Hierunter ist der Einsatz solcher molekularbiologischer Konstrukte zu verstehen, mithilfe derer in den betreffenden, hiermit transformierten Zellen Antisense-RNA zu den 5'-terminalen, insbesondere für das Signalpeptid codierenden Abschnitten der jeweiligen mRNA gebildet werden. Dadurch ergibt sich eine Hybridisierung zwischen der in vivo gebildeten, für das zu inaktivierende Protein codierenden mRNA und der artifiziell erzeugten homologen einzelsträngigen RNA. Hierdurch wird eine effiziente Translation, das heißt Bildung des betreffenden Proteins verhindert und die betreffende RNA über intrazelluläre Mechanismen abgebaut. Diese Form der Inaktivierung liefert in der Regel keine volständige Inaktivierung, so daß gewisse Restaktivitäten verbleiben.

Vorzugsweise ist dies eine Verwendung, wobei es sich um eine Nukleinsäure gemäß
SEQ ID NO. 1, Positionen 1 bis 90,
SEQ ID NO. 3, Positionen 1 bis 90,
SEQ ID NO. 5, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 7, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 9, Positionen 1 bis 93,
SEQ ID NO. 11, Positionen 1 bis 69,
SEQ ID NO. 13, Positionen 1 bis 51,
SEQ ID NO. 15, Positionen 1 bis 93,
SEQ ID NO. 17, Positionen 1 bis 111,
SEQ ID NO. 19, Positionen 1 bis 84,
SEQ ID NO. 21, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 23, Positionen 1 bis 57,
SEQ ID NO. 25, Positionen 1 bis 72,
SEQ ID NO. 27, Positionen 1 bis 72,
SEQ ID NO. 29, Positionen 1 bis 69,
SEQ ID NO. 31, Positionen 1 bis 90,
SEQ ID NO. 33, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 35, Positionen 1 bis 144,
SEQ ID NO. 37, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 39, Positionen 1 bis 84,
SEQ ID NO. 41, Positionen 1 bis 63,
SEQ ID NO. 43, Positionen 1 bis 138,
SEQ ID NO. 45, Positionen 1 bis 102,
SEQ ID NO. 47, Positionen 1 bis 69,
SEQ ID NO. 49, Positionen 1 bis 129,
SEQ ID NO. 51, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 53, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 55, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 57, Positionen 1 bis 75,
SEQ ID NO. 59, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 61, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 63, Positionen 1 bis 75,
SEQ ID NO. 65, Positionen 1 bis 75,
SEQ ID NO. 67, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 69, Positionen 1 bis 105,
SEQ ID NO. 71, Positionen 1 bis 69,
SEQ ID NO. 73, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 75, Positionen 1 bis 63,
SEQ ID NO. 77, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 79, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 81, Positionen 1 bis 72,
SEQ ID NO. 83, Positionen 1 bis 99,
SEQ ID NO. 85, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 87, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 89, Positionen 1 bis 72,
SEQ ID NO. 91, Positionen 1 bis 102,
SEQ ID NO. 93, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 95, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 97, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 99, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 101, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 103, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 105, Positionen 1 bis 72 oder
einer Consensus-Sequenz daraus
oder einen für die Inaktivierung ausreichenden Teil davon handelt.

Denn eben diese Teilsequenzen werden mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellt. Es ist zu erwarten, daß sie über die betreffenden Gene von B. licheniformis DSM 13 hinaus viele weitere homologe Gene von hinreichend verwandten Spezies auf die gleiche Weise zu inaktivieren vermögen.

Die vorliegende Erfindung wird auch in der Form gentechnisch modifizierter Mikroorganismen verwirklicht, auf die das oben Gesagte entsprechend zutrifft.

Ganz allgemein sind das Mikroorganismen, bei denen mindestens eines der oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 und 105 definierten und/oder einer weiteren oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Gene funktionell inaktiviert ist.

Hierunter sind solche zunehmend bevorzugt, bei denen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 und besonders bevorzugt alle der genannten Gene funktionell inaktiviert werden, vorzugsweise über eine oben beschriebene erfindungsgemäße Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure.

Vorzugsweise sind dies Mikroorganismen, bei denen es sich um Bakterien handelt.

Hierunter sind entsprechend den bisherigen Ausführungen solche Mikroorganismen bevorzugt, bei denen es sich um gramnegative Bakterien handelt, insbesondere solche der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).

Entsprechend den bisherigen Ausführungen sind solche Mikroorganismen nicht minder bevorzugt, bei denen es sich um grampositive Bakterien handelt, insbesondere solche der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum und hierunter ganz besonders um B. licheniformis DSM 13.

Der der vorliegenden Anmeldung zugrunde gelegenen Aufgabe zufolge sollten in erster Linie technische Fermentationsverfahren verbessert werden. Dementsprechend wird die Erfindung insbesondere in entsprechenden, erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren verwirklicht.

Dabei handelt es sich ganz allgemein um Verfahren zur Fermentation eines zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Mikroorganismus.

Den bisheringen Ausführungen entsprechend sind die durch derartige Mikroorganismen gekennzeichneten Verfahren entsprechend bevorzugt.

Unter den erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren sind diejenigen zur Herstellung eines Wertstoffs bevorzugt, insbesondere zur Herstellung einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.

Denn dies ist das wichtigste Anwendungsgebiet für großtechnische Fermentationen.

Vorzugsweise sind das Verfahren, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.

Auf diese Weise werden beispielsweise Aminosäuren, Vitamine oder Oligopeptide produziert, die besonders als Nahrungsmittelergänzungsstoffe Verwendung finden. Bei pharmazeutisch relevanten Verbindungen kann es sich um Vor- oder Zwischenstufen zu Medikamenten oder sogar um diese selbst handeln. In all diesen Fällen spricht man auch von Biotransformation, wonach die Stoffwechseleigenschaften der Mikroorganismen ausgenutzt werden, um die ansonsten aufwendige chemische Synthese ganz oder zumindest in einzelnen Schritten zu ersetzen.

Nicht minder bevorzugt sind entsprechende Verfahren, bei denen es sich bei dem auf diese Weise gebildeten Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.

Industrielle Enzyme, die mit derartigen Verfahren hergestellt werden, finden beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung. So dienen α-Amylasen beispielsweise dazu, um das Altbackenwerden von Brot zu verhindern oder um Fruchtsäfte zu klären. Proteasen werden zum Aufschluß von Proteinen verwendet. All diese Enzyme sind für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben, wobei insbesondere die von grampositiven Bakterien bereits natürlicherweise hergestellten Subtilisin-Proteasen einen prominenten Platz einnehmen. Insbesondere in der Textil- und Lederindustrie dienen sie der Aufarbeitung der natürlichen Rohstoffe. Ferner können all diese Enzyme wiederum im Sinne der Biotransformation als Katalysatoren für chemische Reaktionen eingesetzt werden.

Viele dieser Enzyme stammen ursprünglich aus Bacillusspezies und werden deshalb besonders erfolgreich in grampositiven Organismen, insbesondere solchen der Gattung Bacillus produziert, worunter in vielen Fällen auch Derivate von B. licheniformis DSM13 fallen. Insbesondere Produktionsverfahren, die auf diesen mikrobiellen Systemen beruhen, können mithilfe der vorliegenden Erfindung verbessert werden, weil insbesondere die im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus eben diesem Organismus stammen.

Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen die im Sequenzprotokoll (aus technischen Gründen bei den jeweiligen Nukleotidsequenzen) jeweils als solche bezeichneten Signalpeptide zusammen mit den für sie codierenden Teilsequenzen auf Nukleotidebene dar. In Beispiel 4 ist beschrieben, wie diese mithilfe eines auf einen bestimmten Algorithmus zurückgreifenden Computerprogramms aus den jeweils vollständigen proteincodierenden Nukleotidsequenzen bestimmt werden konnten. Wie oben beschrieben ist, können diese Sequenzen zur Inaktivierung der betreffenden Gene über RNA-Interferenz genutzt werden; eine weitere Verwendungsmöglichkeit sowohl der betreffenden DNA- als auch der Aminosäureteilsequenzen wird anschließend beschrieben.

Zur vorliegenden Erfindung gehört somit jedes Signalpeptid gemäß
SEQ ID NO. 2, Positionen 1 bis 30,
SEQ ID NO. 4, Positionen 1 bis 30,
SEQ ID NO. 6, Positionen 1 bis 29,
SEQ ID NO. 8, Positionen 1 bis 22,
SEQ ID NO. 10, Positionen 1 bis 31,
SEQ ID NO. 12, Positionen 1 bis 23,
SEQ ID NO. 14, Positionen 1 bis 17,
SEQ ID NO. 16, Positionen 1 bis 31,
SEQ ID NO. 18, Positionen 1 bis 37,
SEQ ID NO. 20, Positionen 1 bis 28,
SEQ ID NO. 22, Positionen 1 bis 26,
SEQ ID NO. 24, Positionen 1 bis 19,
SEQ ID NO. 26, Positionen 1 bis 24,
SEQ ID NO. 28, Positionen 1 bis 24,
SEQ ID NO. 30, Positionen 1 bis 23,
SEQ ID NO. 32, Positionen 1 bis 30,
SEQ ID NO. 34, Positionen 1 bis 26,
SEQ ID NO. 36, Positionen 1 bis 48,
SEQ ID NO. 38, Positionen 1 bis 22,
SEQ ID NO. 40, Positionen 1 bis 28,
SEQ ID NO. 42, Positionen 1 bis 21,
SEQ ID NO. 44, Positionen 1 bis 46,
SEQ ID NO. 46, Positionen 1 bis 34,
SEQ ID NO. 48, Positionen 1 bis 23,
SEQ ID NO. 50, Positionen 1 bis 43,
SEQ ID NO. 52, Positionen 1 bis 26,
SEQ ID NO. 54, Positionen 1 bis 29,
SEQ ID NO. 56, Positionen 1 bis 22,
SEQ ID NO. 58, Positionen 1 bis 25,
SEQ ID NO. 60, Positionen 1 bis 29,
SEQ ID NO. 62, Positionen 1 bis 27,
SEQ ID NO. 64, Positionen 1 bis 25,
SEQ ID NO. 66, Positionen 1 bis 25,
SEQ ID NO. 68, Positionen 1 bis 26,
SEQ ID NO. 70, Positionen 1 bis 35,
SEQ ID NO. 72, Positionen 1 bis 23,
SEQ ID NO. 74, Positionen 1 bis 22,
SEQ ID NO. 76, Positionen 1 bis 21,
SEQ ID NO. 78, Positionen 1 bis 27,
SEQ ID NO. 80, Positionen 1 bis 26,
SEQ ID NO. 82, Positionen 1 bis 24,
SEQ ID NO. 84, Positionen 1 bis 33,
SEQ ID NO. 86, Positionen 1 bis 29,
SEQ ID NO. 88, Positionen 1 bis 27,
SEQ ID NO. 90, Positionen 1 bis 24,
SEQ ID NO. 92, Positionen 1 bis 34,
SEQ ID NO. 94, Positionen 1 bis 27,
SEQ ID NO. 96, Positionen 1 bis 29,
SEQ ID NO. 98, Positionen 1 bis 29,
SEQ ID NO. 100, Positionen 1 bis 26,
SEQ ID NO. 102, Positionen 1 bis 27,
SEQ ID NO. 104, Positionen 1 bis 22,
SEQ ID NO. 106, Positionen 1 bis 24 oder
einer Consensus-Sequenz daraus.

Ferner gehört zur vorliegenden Erfindung somit jede für ein Signalpeptid codierende Nukleotidsequenz gemäß
SEQ ID NO. 1, Positionen 1 bis 90,
SEQ ID NO. 3, Positionen 1 bis 90,
SEQ ID NO. 5, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 7, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 9, Positionen 1 bis 93,
SEQ ID NO. 11, Positionen 1 bis 69,
SEQ ID NO. 13, Positionen 1 bis 51,
SEQ ID NO. 15, Positionen 1 bis 93,
SEQ ID NO. 17, Positionen 1 bis 111,
SEQ ID NO. 19, Positionen 1 bis 84,
SEQ ID NO. 21, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 23, Positionen 1 bis 57,
SEQ ID NO. 25, Positionen 1 bis 72,
SEQ ID NO. 27, Positionen 1 bis 72,
SEQ ID NO. 29, Positionen 1 bis 69,
SEQ ID NO. 31, Positionen 1 bis 90,
SEQ ID NO. 33, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 35, Positionen 1 bis 144,
SEQ ID NO. 37, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 39, Positionen 1 bis 84,
SEQ ID NO. 41, Positionen 1 bis 63,
SEQ ID NO. 43, Positionen 1 bis 138,
SEQ ID NO. 45, Positionen 1 bis 102,
SEQ ID NO. 47, Positionen 1 bis 69,
SEQ ID NO. 49, Positionen 1 bis 129,
SEQ ID NO. 51, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 53, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 55, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 57, Positionen 1 bis 75,
SEQ ID NO. 59, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 61, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 63, Positionen 1 bis 75,
SEQ ID NO. 65, Positionen 1 bis 75,
SEQ ID NO. 67, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 69, Positionen 1 bis 105,
SEQ ID NO. 71, Positionen 1 bis 69,
SEQ ID NO. 73, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 75, Positionen 1 bis 63,
SEQ ID NO. 77, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 79, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 81, Positionen 1 bis 72,
SEQ ID NO. 83, Positionen 1 bis 99,
SEQ ID NO. 85, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 87, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 89, Positionen 1 bis 72,
SEQ ID NO. 91, Positionen 1 bis 102,
SEQ ID NO. 93, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 95, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 97, Positionen 1 bis 87,
SEQ ID NO. 99, Positionen 1 bis 78,
SEQ ID NO. 101, Positionen 1 bis 81,
SEQ ID NO. 103, Positionen 1 bis 66,
SEQ ID NO. 105, Positionen 1 bis 72 oder
einer Consensus-Sequenz daraus.

Jeweils eine eigenständige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bildet jedes Fusionsprotein aus einem N-terminal gelegenen, in den vorangegangenen Absätzen definierten Signalpeptid mit einem maturen Protein.

Denn die genannten Signalpeptide stammen von sekretierten Proteinen von grampositiven Organismen. Insofern ist zu erwarten, daß jedes Fusionsprotein, bei dem die als solche funktionierende Signalpeptidsequenez N-terminal liegt, dafür sorgt, daß das Fusionsprotein von der Translokationsmaschinerie aus den produzierenden Zellen ausgeschleust wird. Das gilt insbesondere für grampositive Organismen, insbesondere für solche der Gattung Bacilllus und hierunter insbesondere B. licheniformis. Dies kann für die Produktion des betreffenden Proteins ausgenutzt werden, indem es vergleichsweise einfach aus dem umgebendenden Medium aufgreinigt werden kann.

Dementsprechend wird die vorliegende Erfindung auch in Form solcher Nukleinsäuren verwirklicht, die für ein zuvor beschriebenes erfindungsgemäßes Fusionsprotein codieren, vorzugsweise erhalten durch Fusion einer für ein oben aufgelistetes, erfindungsgemäßes Signalpeptid codierenden Nukleotidsequenz mit einer für das betreffende mature Protein codierenden Nukleinsäure.

Dementsprechende Verfahren zur Herstellung eines Proteins in Form eines derartigen Fusionsproteins stellen entsprechende Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, verbunden mit den geschilderten Vorteilen.

Vorzugsweise wird hierfür eine oben beschriebene, durch Fusion erhaltene, erfindungsgemäße Nukleinsäure eingesetzt.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter.

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme, Baukästen (Kits) und Geräte werden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Kultivierung von Bacillus licheniformis
Zellen von B. licheniformis sind unter der Nummer DSM 13 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) erhältlich.
B. licheniformis wird in einem 500 ml-Schüttelkolben in 100 ml Horikoshi-Medium pH 9 (0,1 % K₂HPO₄, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,02 % MgSO₄, 0,3% Na₂CO₃) für 72 h bei 37°C und 200 rpm kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugation vom Überstand getrennt. Der Überstand enthält die sekretierten Proteine.
Beispiel 2
Identifizierung der erfindungsgemäßen Gene aus B. licheniformis DSM 13
Aus dem von der DSMZ erhältlichen Stamm B. licheniformis DSM 13 wurde nach Standardmethoden die genomische DNA präpariert, mechanisch fraktioniert und über Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Für eine Schrotschußklonierung der kleineren Fragmente wurden die 2 bis 2,5 kb großen Fragmente aus dem Agarosegel eluiert, dephosphoryliert und als stumpf endende (blunt ended) Fragmente in die Smal-Restriktionsschnittstelle des Vektors pTZ19R-Cm ligiert. Dabei handelt es sich um ein Chloramphenicol-Resistenz verleihendes Derivat des von der Firma Fermentas (St. Leon-Rot) kommerziell erhältliche Plasmid pTZ19R. Dadurch wurde eine Genbank der kleineren Fragmente erhalten. Als zweite Schrotschußklonierung wurden die durch eine partielle Restriktion mit dem Enzym Saulllal erhaltenen genomischen Fragmente in das SuperCos-1-Vektorsystem („Cosmid Vector Kit") der Firma Stratagene, La Jolla, USA, ligiert, wodurch eine Genbank über die überwiegend größeren Fragmente erhalten wurde.
Aus den durch Transformation mit den betreffenden Genbanken erhältlichen Bakterien E. coli DH5α (D.Hannahan (1983): „Studies on transformation on Escherichia coli"; J. Mol. Microbiol., Band 166, Seiten 557 – 580) wurden die betreffenden rekombinanten Plasmide isoliert und sequenziert. Hierbei kam die Farbstoffabbruchmethode (dye terminator chemistry) zum Einsatz, durchgeführt durch die automatischen Sequenziergeräte Mega-BACE 1000/4000 (Fa. Amersham Bioscence, Piscataway, USA) und ABI Prism 377 (Fa. Applied Biosystems, Foster City, USA).
Auf diese Weise wurden unter anderem die im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung angegebenen Sequenzen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 und 105 erhalten. Die hiervon abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in derselben Reihenfolge in den jeweils um eins höheren SEQ IDs angegeben.
Beispiel 3
Sequenzhomologien
Nach Ermittlung der DNA- und Aminosäuresequenzen gemäß Beispiel 2 wurden durch Recherche in den Datenbanken GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov) und Subtilist des Institute Pasteur, Paris, Frankreich (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi) die jeweils nächstähnlichen, bisher bekannten Homologe ermittelt.
Die ermittelten DNA- beziehungsweise Aminosäuresequenzen wurden zur Bestimmung der Homologie über Alignments einander gegenübergestellt; hierfür wurde das Computerprogramm Vector NTI^® Suite Version 7, verwendet, welches von der Firma Informax Inc., Bethesda, USA, erhältlich ist. Hierbei wurden die Standard-Parameter dieses Programms angewendet, das heißt für den Vergleich der DNA-Sequenzen: K-tuple size: 2; Number of best Diagonals: 4; Window size: 4; Gap penalty: 5; Gap opening penalty: 15 und Gap extension penalty: 6,66. Für den Vergleich der Aminosäure- Sequenzen galten folgende Standard-Parameter: K-tuple size: 1; Number of best Diagonals: 5; Window size: 5; Gap penalty: 3; Gap opening penalty: 10 und Gap extension penalty: 0,1. Die Ergebnisse dieser Sequenzvergleiche sind in folgender Tabelle 1 zusammengestellt. Die Aminosäure- und die Nukleotidsequenz stammen dabei aus verschiedenen Datenbanken, so daß zum Teil nur eine von beiden Sequenzen angegeben ist, oder auch Doppelnennungen möglich sind. Tabelle 1: Nächstähnliche Gene beziehungsweise Proteine zu den in Beispiel 2 ermittelten Genen und Proteinen.
Man erkennt, daß es sich bei den gefundenen Genen und den hiervon abgeleiteten Genprodukten um neue Gene beziehungsweise Proteine mit einem zumeist deutlichen Abstand zum bisher bekannten Stand der Technik handelt.
Beispiel 4
Bestimmung der Signalsequenzen
Die nach Beispiel 2 erhaltenen Sequenzen wurden hinsichtlich der enthaltenen Teilsequenzen von Signalpeptiden untersucht. Dies erfolgte durch den SignalP-Server V2.0 des Center for Biological Sequence Analysis am BioCentrum der Technical University of Denmark, DK-2800 Lyngby (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 2.0/#submission), mit der Option „Gram-positive bacteria". Es macht sich die Tatsache zunutze, daß Signalpeptide, insbesondere bei Bacillus-Spezies, praktisch gleich aufgebaut sind. Demnach besteht der N-Terminus sekretierter Proteine hauptsächlich aus positiv geladenen Aminosäuren, gefolgt von einem Bereich, der eine Alpha-Helix ausbilden kann und einer Erkennungssequenz für die Signalpetidase des Typs Ala-X-Ala oder einer kompatiblen Sequenz am Übergang zum maturen Protein. Die hierdurch ermittelten Signalpeptide und hierfür codierenden DNA-Abschnitte werden für die erfindungsgemäßen Proteine in folgender Tabelle 2 zusammengestellt. Dort sind die jeweiligen Positionen in der Zählung der Sequenzen des Sequenzprotokolls angegeben, zusammen mit den drei vor der Schnittstelle gelegenen und den zwei nachfolgenden Aminosäuren. Hinzu kommt eine von demselben Computerprogramm anhand der Sequenzdaten errechnete Angabe, welche Wahrscheinlichkeit dem betreffenden Übergang vom Signal zum maturen Teil zugeordnet werden kann. Der Maximalwert liegt dabei bei 1. Tabelle 2: Signalpeptid-Sequenzen der in Beispiel 2 ermittelten Gene und Proteine
Man erkennt, daß es sich bei den gefundenen Genprodukten um sekretierte oder aufgrund der Sequenz zumindest um sekretierbare Proteine handelt, die über ein Signalpeptid gekennzeichnet sind. Hiermit stehen sowohl die betreffenden Teilsequenzen für die maturen Proteine zur Verfügung als auch die für die Signalpeptide.
Beispiel 5
Rekombinante Expression der erfindungsgemäßen sekretorischen Gene
Dieses Verfahren ist dem Fachmann an sich bekannt. Durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird das gewünschte Gen aus genomischer DNA, beispielsweise von B. licheniformis amplifiziert. Zur Konstruktion entsprechender Primer stehen die im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleotidsequenzen zur Verfügung. Diese Primer enthalten vorzugsweise zusätzlich Erkennungssequenzen von Restriktionsendonucleasen, über die eine Klonierung der amplifizierten Fragmente möglich ist. Hierfür wird das durch die PCR erhaltene DNA-Fragment dem entsprechenden Restriktionsendonuklease-Verdau unterworfen und in einen Klonierungsvektor mit kompatiblen Enden unter Verwendung von Standardmethoden ligiert.
Der erhaltene Vektor wird beispielsweise über Protoplastentransformation in den Expressionsstamm Bacillus subtilis DB104 (beschrieben von F. Kawamura und R. N. Doi (1984) in „Construction of a Bacillus subtilis Double Mutant Deficient in Extracellular Alkaline and Neutral Proteases", J. Bacteriol., Band 160, Seiten 442 bis 444, transformiert.
Erhaltene Transformanten werden nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methode kultiviert. Das Genprodukt kann aus dem Überstand aufgereinigt werden.
Beispiel 6
Funktionelle Inaktivierung eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Gene in B. licheniformis
Prinzip der Herstellung eines Deletionsvektors
Jedes dieser Gene kann beispielsweise mittels eines sogenannten Deletionsvektors funktionell inaktiviert werden. Dieses Vorgehens ist an sich beispielsweise von J. Vehmaanperä et al. (1991) in der Publikation „Genetic manipulation of Bacillus amyloliquefaciens"; J. Biotechnol., Band 19, Seiten 221 – 240 beschrieben.
Ein geeigneter Vektor hierfür ist pE194, der in der Publikation „Replication and incompatibility properties of plasmid pE194 in Bacillus subtilis" von T.J. Gryczan et al. (1982), J. Bacteriol., Band 152, Seiten 722 – 735 charakterisiert ist. Der Vorteil dieses Deletionsvektors besteht darin, daß er einen Temperatur-abhängigen Replikationsursprung besitzt. Bei 33°C kann pE194 in der transformierten Zelle replizieren, so daß bei dieser Temperatur zunächst auf eine erfolgreiche Transformation selektiert wird. Anschließend werden die Zellen, die den Vektor enthalten, bei 42°C inkubiert. Bei dieser Temperatur repliziert der Deletionsvektor nicht mehr und es wird ein Selektionsdruck auf die Integration des Plasmids über einen zuvor ausgewählten homologe Bereich in das Chromosom ausgeübt. Eine zweite homologe Rekombination über einen zweiten homologen Bereich führt dann zur Excision des Vektors zusammen mit der intakten Genkopie aus dem Chromosom und damit zur Deletion des in vivo chromosomal lokalisierten Gens. Möglich wäre auch als zweite Rekombination die Umkehrreaktion zur Integration, das heißt ein Herausrekombinieren des Vektors aus dem Chromosom, so daß das chromosomale Gen intakt bliebe. Die Gen-Deletion muß daher nach an sich bekannten Methoden, etwa im Southern-Blot nach Restriktion der chromosomalen DNA mit geeigneten Enzymen oder mit Hilfe der PCR-Technik anhand der Größe des amplifizierten Bereichs nachgewiesen werden.
Erforderlich ist also die Auswahl zweier homologer Bereiche des zu deletierenden Gens, die jeweils mindestens je 70 Basenpaare umfassen sollten, beispielsweise der 5'- und der 3'-Bereich des ausgewählten Gens. Diese werden so in den Vektor kloniert, daß sie einen für ein nichtaktives Protein codierenden Teil flankieren oder unter Auslassung des dazwischenliegenden Bereichs direkt aufeinanderfolgen. Hierdurch wird der Deletionsvektor erhalten.
Deletion der hier betrachteten Gene
Zur Konstruktion eines erfindungsgemäßen Deletionsvektors werden die 5'- und 3'-Bereiche eines dieser 53 Gene mittels PCR amplifiziert. Zur Konstruktion geeigneter Primer stehen die im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 und 105 zur Verfügung. Sie stammen aus B. licheniformis, sollten aufgrund zu erwartender Homologien aber auch für andere Spezies, insbesondere der Gattung Bacillus geeignet sein.
Die beiden amplifizierten Bereiche werden geeigneterweise unmittelbar hintereinander auf einem für diese Arbeiten gebräuchlichen Vektor zwischenkloniert, zum Beispiel dem Vektor pUC18, der sich für Klonierungssschritte in E. coli. eignet.
Im nächsten Schritt erfolgt eine Umklonierung in den zur Deletion ausgewählten Vektor pE194 und dessen Transformation in B. subtilis DB104, etwa nach der Methode der Protoplasten-Transformation nach Chang & Cohen (1979; „High Frequency Transformation of Bacillus subtilis Protoplasts by Plasmid DNA"; Molec. Gen. Genet. (1979), Band 168, Seiten 111-115). Alle Arbeitsschritte müssen bei 33°C durchgeführt werden um eine Replikation des Vektors zu gewährleisten.
In einem nächsten Schritt wird der zwischenklonierte Vektor ebenfalls mittels der Methode der Protoplastentransformation in den gewünschten Wirtsstamm, hier B. licheniformis, transformiert. Die solcherart erhaltenen und mit üblichen Methoden (Selektion über den Resistenzmarker des Plasmids; Kontrolle über Plasmidpräparation und PCR für das Insert) als positiv identifizierten Transformanten werden anschließend bei 42°C unter Selektionsdruck durch Zugabe von Erythromycin auf Anwesenheit des Plasmids kultiviert. Bei dieser Temperatur kann der Deletionsvektor nicht mehr replizieren und es überleben nur solche Zellen, bei denen der Vektor in das Chromosom integriert ist, wobei diese Integration mit höchster Wahrscheinlichkeit in homologen oder identischen Bereichen stattfindet. Durch Kultivierung bei 33°C ohne Erythromycin-Selektionsdruck kann dann nachfolgend die Excision des Deletionsvektors induziert werden, wobei das chromosomal codierte Gen vollständig aus dem Chromosom entfernt wird. Der Erfolg der Deletion wird anschließend über Southern-Blot nach Restriktion der chromosomalen DNA mit geeigneten Enzymen oder mit Hilfe der PCR-Technik überprüft.
Solche Transformanten, bei denen ein erfindungsgemäßes Gen deletiert ist, zeichnen sich zudem durch die Unfähigkeit zur Bildung des betreffenden sekretierten Proteins aus. Dies kann beispielsweise über einen Test mit hierauf spezifischen Antikörpern (Western-Blot) oder über einen auf der betreffenden Aktivität beruhenden enzymatischen Test überprüft werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines periplasmatischen D-Xylose-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 58% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 91 bis 1065 gemäß SEQ ID NO. 1 entspricht.
Vorläufer eines periplasmatischen D-Xylose-Bindungsproteins oder matures periplasmatisches D-Xylose-Bindungsprotein mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 52% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 31 bis 354 gemäß SEQ ID NO. 2 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer zellwandassoziierten Protease, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 91 bis 3144 gemäß SEQ ID NO. 3 entspricht.
Vorläufer einer zellwandassoziierten Protease oder mature zellwandassoziierte Protease mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 51% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 31 bis 1047 gemäß SEQ ID NO. 4 entspricht.
Nukleinsäure yxeB, codierend für den Vorläufer eines wahrscheinlichen ABC-Transporter-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 5 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 58% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 957 gemäß SEQ ID NO. 5 entspricht.
Vorläufer eines wahrscheinlichen ABC-Transporter-Bindungsproteins YxeB oder matures wahrscheinliches ABC-Transporter-Bindungsprotein YxeB mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 40% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 318 gemäß SEQ ID NO. 6 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Levanase (E.C. 3.2.1.65), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 2034 gemäß SEQ ID NO. 7 entspricht.
Vorläufer einer Levanase (E.C. 3.2.1.65) oder mature Levanase (E.C. 3.2.1.65) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 8 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 677 gemäß SEQ ID NO. 8 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Bacillopeptidase F (EC 3.4.21.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 94 bis 4299 gemäß SEQ ID NO. 9 entspricht.
Vorläufer einer Bacillopeptidase F (EC 3.4.21.-) oder mature Bacillopeptidase F (EC 3.4.21.-) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 63% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 32 bis 1432 gemäß SEQ ID NO. 10 entspricht.
Nukleinsäure ywmC, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 72% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 70 bis 687 gemäß SEQ ID NO. 11 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YwmC oder matures Protein YwmC mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 24 bis 228 gemäß SEQ ID NO. 12 entspricht.
Nukleinsäure ywmD, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 13 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 65% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 52 bis 672 gemäß SEQ ID NO. 13 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YwmD oder matures Protein YwmD mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 14 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 51 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 18 bis 223 gemäß SEQ ID NO. 14 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer D-alanyl-D-Alanin-Carboxypeptidase (E.C. 3.4.16.4), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 15 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 94 bis 1326 gemäß SEQ ID NO. 15 entspricht.
Vorläufer einer D-alanyl-D-Alanin-Carboxypeptidase (E.C. 3.4.16.4) oder mature D-alanyl-D-Alanin-Carboxypeptidase (E.C. 3.4.16.4) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 16 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 32 bis 441 gemäß SEQ ID NO. 16 entspricht.
Nukleinsäure yxiA, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins (einer vermutlichen Arabinase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 17 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 71 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 112 bis 987 gemäß SEQ ID NO. 17 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YxiA (einer vermutlichen Arabinase) oder matures Protein YxiA (vermutliche Arabinase) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 18 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 38 bis 328 gemäß SEQ ID NO. 18 entspricht.
Nukleinsäure appA, codierend für den Vorläufer eines Oligopeptid-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 19 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 72% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 85 bis 1644 gemäß SEQ ID NO. 19 entspricht.
Vorläufer des Oligopeptid-Bindungsproteins AppA oder matures Oligopeptid-Bindungsprotein AppA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 20 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 29 bis 547 gemäß SEQ ID NO. 20 entspricht.
Nukleinsäure dppE, codierend für den Vorläufer eines Dipeptid-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 21 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 1626 gemäß SEQ ID NO. 21 entspricht.
Vorläufer des Dipeptid-Bindungsproteins DppE oder matures Dipeptid-Bindungsprotein DppE mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 22 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 75% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 541 gemäß SEQ ID NO. 22 entspricht.
Nukleinsäure yojM, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Superoxiddismutase-ähnlichen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 23 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 58 bis 594 gemäß SEQ ID NO. 23 entspricht.
Vorläufer des hypothetischen Superoxiddismutase-ähnlichen Proteins YojM oder matures Superoxiddismutase-ähnliches Protein YojM mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 24 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 59% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 20 bis 197 gemäß SEQ ID NO. 24 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Mannan-endo-1,4-beta-Mannosidase (E.C. 3.2.1.78), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 25 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 1083 gemäß SEQ ID NO. 25 entspricht.
Vorläufer einer Mannan-endo-1,4-beta-Mannosidase (E.C. 3.2.1.78) oder mature Mannan-endo-1,4-beta-Mannosidase (E.C. 3.2.1.78), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 26 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 360 gemäß SEQ ID NO. 26 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Pectatlyase (E.C. 4.2.2.2), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 27 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 1308 gemäß SEQ ID NO. 27 entspricht.
Vorläufer einer Pectatlyase (E.C. 4.2.2.2) oder mature Pectatlyase (E.C. 4.2.2.2), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 28 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 55% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 435 gemäß SEQ ID NO. 28 entspricht.
Nukleinsäure dacF, codierend für den Vorläufer eines Penicillin-Bindungsproteins (E.C. 3.4.16.4), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 29 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 70 bis 1173 gemäß SEQ ID NO. 29 entspricht.
Vorläufer eines Penicillin-Bindungsproteins DacF (E.C. 3.4.16.4) oder matures Penicillin-Bindungsprotein DacF (E.C. 3.4.16.4), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 30 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 24 bis 390 gemäß SEQ ID NO. 30 entspricht.
Nukleinsäure ywaD, codierend für den Vorläufer einer hypothetischen Peptidase (E.C. 3.4.11.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 96% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 91 bis 1350 gemäß SEQ ID NO. 31 entspricht.
Vorläufer einer hypothetischen Peptidase YwaD (E.C. 3.4.11.-) oder mature hypothetische Peptidase YwaD (E.C. 3.4.11.-), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 32 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 31 bis 449 gemäß SEQ ID NO. 32 entspricht.
Nukleinsäure gerD, codierend für den Vorläufer eines Sporenkeimungs-Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 33 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 76% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 582 gemäß SEQ ID NO. 33 entspricht.
Vorläufer eines Sporenkeimungs-Proteins GerD oder matures Sporenkeimungs-Protein GerD, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 34 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 70% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 193 gemäß SEQ ID NO. 34 entspricht.
Nukleinsäure ybaN, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 35 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 145 bis 765 gemäß SEQ ID NO. 35 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YbaN oder matures Protein YbaN, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 36 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 49 bis 254 gemäß SEQ ID NO. 36 entspricht.
Nukleinsäure ybbC, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 37 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 72% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 1230 gemäß SEQ ID NO. 37 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YbbC oder matures Protein YbbC, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 38 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 66% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 409 gemäß SEQ ID NO. 38 entspricht.
Nukleinsäure ybbD, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins (einer vermutlichen Zucker-Hydrolase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 39 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 71 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 85 bis 1932 gemäß SEQ ID NO. 39 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YbbD (einer vermutlichen Zucker-Hydrolase) oder matures Protein YbbD (vermutliche Zucker-Hydrolase), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 40 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 67% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 29 bis 643 gemäß SEQ ID NO. 40 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines zu Pal verwandten Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 41 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 64 bis 378 gemäß SEQ ID NO. 41 entspricht.
Vorläufer eines zu Pal verwandten Lipoproteins oder matures zu Pal verwandtes Lipoprotein, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 42 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 46% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 22 bis 125 gemäß SEQ ID NO. 42 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Alkalischen Phosphatase D (E.C. 3.1.3.1), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 43 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 139 bis 1722 gemäß SEQ ID NO. 43 entspricht.
Vorläufer einer Alkalischen Phosphatase D (E.C. 3.1.3.1) oder mature Alkalische Phosphatase D (E.C. 3.1.3.1), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 44 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 47 bis 573 gemäß SEQ ID NO. 44 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Beta-Lactamase (E.C. 3.5.2.6), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 45 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 90% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 103 bis 924 gemäß SEQ ID NO. 45 entspricht.
Vorläufer einer Beta-Lactamase (E.C. 3.5.2.6) oder mature Beta-Lactamase (E.C. 3.5.2.6), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 46 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 92% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 35 bis 307 gemäß SEQ ID NO. 46 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Beta-N-Acetylglucosaminidase (E.C. 3.2.1.96), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 47 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92,5%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 70 bis 2631 gemäß SEQ ID NO. 47 entspricht.
Vorläufer einer Beta-N-Acetylglucosaminidase (E.C. 3.2.1.96) oder mature Beta-N-Acetylglucosaminidase (E.C. 3.2.1.96), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 48 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 48% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 24 bis 876 gemäß SEQ ID NO. 48 entspricht.
Nukleinsäure tagB, codierend für den Vorläufer eines Teichonsäure-Biosynthese-Proteins B (Homolog zu TagB), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 49 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 61 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92,5%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 130 bis 1164 gemäß SEQ ID NO. 49 entspricht.
Vorläufer eines Teichonsäure-Biosynthese-Proteins B TagB (Homolog zu TagB) oder matures Teichonsäure-Biosynthese-Proteins B TagB (Homolog zu TagB), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 50 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 53% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 44 bis 387 gemäß SEQ ID NO. 50 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines periplasmatischen Spermidin/-Putrescin-Bindungsproteins 2, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 51 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 51 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92,5%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 1083 gemäß SEQ ID NO. 51 entspricht.
Vorläufer eines periplasmatischen Spermidin/Putrescin-Bindungsproteins 2 oder matures periplasmatisches Spermidin/Putrescin-Bindungsprotein 2, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 52 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 31% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 360 gemäß SEQ ID NO. 52 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines Chinol-Oxidase-Polypeptids II (E.C. 1.9.3.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 53 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 969 gemäß SEQ ID NO. 53 entspricht.
Vorläufer eines Chinol-Oxidase-Polypeptids II (E.C. 1.9.3.-) oder matures Chinol-Oxidase-Polypeptids II (E.C. 1.9.3.-), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 54 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 322 gemäß SEQ ID NO. 54 entspricht.
Nukleinsäure yggU, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 55 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 58% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 1110 gemäß SEQ ID NO. 55 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins YggU oder matures hypothetisches Lipoprotein YggU, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 56 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 35% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 369 gemäß SEQ ID NO. 56 entspricht.
Nukleinsäure yurl, codierend für den Vorläufer einer extrazellulären Ribonuclease (E.C. 3.1.-.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 57 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 76 bis 813 gemäß SEQ ID NO. 57 entspricht.
Vorläufer einer extrazellulären Ribonuclease Yurl (E.C. 3.1.-.-) oder mature extrazelluläre Ribonuclease Yurl, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 58 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 26 bis 270 gemäß SEQ ID NO. 58 entspricht.
Nukleinsäure bofC, codierend für den Vorläufer eines Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 59 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 522 gemäß SEQ ID NO. 59 entspricht.
Vorläufer eines Proteins BofC oder matures Protein BofC, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 60 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 173 gemäß SEQ ID NO. 60 entspricht.
Nukleinsäure fliZ, codierend für den Vorläufer eines flagellären Biosyntheseproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 61 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 67% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 675 gemäß SEQ ID NO. 61 entspricht.
Vorläufer eines flagellären Biosyntheseproteins FliZ oder matures flagelläres Biosyntheseprotein FliZ, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 62 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 59% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 224 gemäß SEQ ID NO. 62 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für einen Vorläufer einer Gamma-glutamyl-Transpeptidase, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 63 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 76 bis 1758 gemäß SEQ ID NO. 63 entspricht.
Vorläufer einer Gamma-glutamyl-Transpeptidase oder mature Gamma-glutamyl-Transpeptidase, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 64 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 71 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 26 bis 585 gemäß SEQ ID NO. 64 entspricht.
Nukleinsäure yqiX, codierend für den Vorläufer eines wahrscheinlichen extrazellulären Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 65 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 76 bis 540 gemäß SEQ ID NO. 65 entspricht.
Vorläufer eines wahrscheinlichen extrazellulären Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsproteins YqiX oder matures wahrscheinliches extrazelluläres Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsprotein YqiX, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 66 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 53% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 26 bis 179 gemäß SEQ ID NO. 66 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Chitinase (E.C. 3.2.1.14), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 67 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 2082 gemäß SEQ ID NO. 67 entspricht.
Vorläufer einer Chitinase (E.C. 3.2.1.14) oder mature Chitinase (E.C. 3.2.1.14), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 68 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 52% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 693 gemäß SEQ ID NO. 68 entspricht.
Nukleinsäure yckB, codierend für den Vorläufer eines wahrscheinlichen extrazellulären Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 69 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 106 bis 876 gemäß SEQ ID NO. 69 entspricht.
Vorläufer eines wahrscheinlichen extrazellulären Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsproteins YckB oder matures wahrscheinliches extrazelluläres Aminosäure-ABC-Transporter-Bindungsprotein YckB, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 70 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 36 bis 291 gemäß SEQ ID NO. 70 entspricht.
Nukleinsäure lytA, codierend für den Vorläufer eines membrangebundenen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 71 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 56% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 70 bis 321 gemäß SEQ ID NO. 71 entspricht.
Vorläufer eines membrangebundenen Proteins LytA oder matures membrangebundenes Protein LytA, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 72 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 38% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 24 bis 106 gemäß SEQ ID NO. 72 entspricht.
Nukleinsäure lytE, codierend für den Vorläufer einer vermutlichen Endopeptidase, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 73 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 65% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 831 gemäß SEQ ID NO. 73 entspricht.
Vorläufer einer vermutlichen Endopeptidase LytE oder mature vermutliche Endopeptidase LytE, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 74 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 60% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 277 gemäß SEQ ID NO. 74 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Lipase (E.C. 3.1.1.3), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 75 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 64 bis 1461 gemäß SEQ ID NO. 75 entspricht.
Vorläufer einer Lipase (E.C. 3.1.1.3) oder mature Lipase (E.C. 3.1.1.3), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 76 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 42% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 22 bis 487 gemäß SEQ ID NO. 76 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines D-Ribose-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 77 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 915 gemäß SEQ ID NO. 77 entspricht.
Vorläufer eines D-Ribose-Bindungsproteins oder matures D-Ribose-Bindungsprotein, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 78 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 304 gemäß SEQ ID NO. 78 entspricht.
Nukleinsäure epr, codierend für den Vorläufer einer kleineren extrazellulären Protease (E.C. 3.4.21.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 79 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 1776 gemäß SEQ ID NO. 79 entspricht.
Vorläufer einer kleineren extrazellulären Protease Epr (E.C. 3.4.21.-) oder mature kleinere extrazelluläre Protease Epr (E.C. 3.4.21.-), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 80 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 56% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 591 gemäß SEQ ID NO. 80 entspricht.
Nukleinsäure mntA, codierend für den Vorläufer eines Mangan-bindenden Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 81 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 65% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 930 gemäß SEQ ID NO. 81 entspricht.
Vorläufer eines Mangan-bindenden Lipoproteins MntA oder matures Mangan-bindendes Lipoprotein MntA, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 82 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 309 gemäß SEQ ID NO. 82 entspricht.
Nukleinsäure yhcR, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 83 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 66% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 100 bis 3621 gemäß SEQ ID NO. 83 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YhcR oder matures Protein YhcR, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 84 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 60% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 34 bis 1206 gemäß SEQ ID NO. 84 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Alpha-Amylase (E.C. 3.2.1.1), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 85 angegebenen Nukleotidsequenz in mindestens 1537 Positionen, bevorzugt in 1538 und besonders bevorzugt in 1539 Positionen der codierenden Sequenz (CDS, umfassend die Positionen 1 bis 1539) übereinstimmt, insbesondere in mindestens 1450 Positionen, bevorzugt in 1451 und ganz besonders bevorzugt 1452 Positionen des 1452 Positionen umfassenden Teilbereichs, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 1539 gemäß SEQ ID NO. 85 entspricht.
Vorläufer einer Alpha-Amylase (E.C. 3.2.1.1) oder mature Alpha-Amylase (E.C. 3.2.1.1), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 86 angegebenen Aminosäuresequenz in mindestens 510 Positionen, vorzugsweise in 511 und besonders bevorzugt in 512 Positionen übereinstimmt, insbesondere in mindestens 481, vorzugsweise 482, besonders bevorzugt 483 Positionen des 483 Positionen umfassenden Teilbereichs, der den Aminosäurepositionen 30 bis 512 gemäß SEQ ID NO. 86 entspricht.
Nukleinsäure lplA, codierend für den Vorläufer eines Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 87 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 75% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 1506 gemäß SEQ ID NO. 87 entspricht.
Vorläufer eines Lipoproteins LplA oder matures Lipoprotein LplA, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 88 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 75% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 501 gemäß SEQ ID NO. 88 entspricht.
Nukleinsäure yqeF, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 89 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 70% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 732 gemäß SEQ ID NO. 89 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YqeF oder matures Protein YqeF, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 90 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 66% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 243 gemäß SEQ ID NO. 90 entspricht.
Nukleinsäure yxeB, codierend für den Vorläufer eines wahrscheinlichen ABC-Transporter-Bindungsproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 91 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 103 bis 960 gemäß SEQ ID NO. 91 entspricht.
Vorläufer eines wahrscheinlichen ABC-Transporter-Bindungsproteins YxeB oder matures wahrscheinliches ABC-Transporter-Bindungsprotein YxeB, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 92 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 35 bis 319 gemäß SEQ ID NO. 92 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer eines Cellulase-ähnlichen Proteins (E.C. 3.2.1.4), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 93 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 55% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 1683 gemäß SEQ ID NO. 93 entspricht.
Vorläufer eines Cellulase-ähnlichen Proteins (E.C. 3.2.1.4) oder matures Cellulase-ähnliches Protein (E.C. 3.2.1.4), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 94 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 34% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 560 gemäß SEQ ID NO. 94 entspricht.
Nukleinsäure prsA, codierend für den Vorläufer eines Proteinexport-Proteins (E.C. 5.2.1.8), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 95 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 861 gemäß SEQ ID NO. 95 entspricht.
Vorläufer eines Proteinexport-Proteins PrsA (E.C. 5.2.1.8) oder matures Proteinexport-Protein PrsA (E.C. 5.2.1.8), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 96 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 68% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 286 gemäß SEQ ID NO. 96 entspricht.
Nukleinsäure yhcN, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 97 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 63% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 88 bis 561 gemäß SEQ ID NO. 97 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins YhcN oder matures hypothetisches Lipoprotein YhcN, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 98 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 53% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 30 bis 186 gemäß SEQ ID NO. 98 entspricht.
Nukleinsäure yhcJ, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 99 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 61 % Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 79 bis 819 gemäß SEQ ID NO. 99 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Lipoproteins YhcJ oder matures hypothetisches Lipoprotein YhcJ, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 100 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 52% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 27 bis 272 gemäß SEQ ID NO. 100 entspricht.
Nukleinsäure c-551, codierend für den Vorläufer eines Cytochroms C551, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 101 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 82 bis 327 gemäß SEQ ID NO. 101 entspricht.
Vorläufer eines Cytochroms C551 oder matures Cytochrom C551, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 102 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 56% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 28 bis 108 gemäß SEQ ID NO. 102 entspricht.
Nukleinsäure ypjB, codierend für den Vorläufer eines hypothetischen Proteins, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 103 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 67% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 67 bis 801 gemäß SEQ ID NO. 103 entspricht.
Vorläufer eines hypothetischen Proteins YpjB oder matures Protein YpjB, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 104 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 64% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 23 bis 266 gemäß SEQ ID NO. 104 entspricht.
Nukleinsäure, codierend für den Vorläufer einer Sporulations-spezifischen extrazellulären Nuclease (E.C. 3.-.-.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 105 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Nukleinsäurepositionen 73 bis 429 gemäß SEQ ID NO. 105 entspricht.
Vorläufer einer Sporulations-spezifischen extrazellulären Nuclease (E.C. 3.-.-.-) oder mature Sporulations-spezifische extrazelluläre Nuclease (E.C. 3.-.-.-), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 106 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 69% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist, insbesondere über den Teilbereich, der den Aminosäurepositionen 25 bis 142 gemäß SEQ ID NO. 106 entspricht.
Sekretiertes Protein nach einem der Ansprüche 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104 oder 106, welches natürlicherweise von einem Mikroorganismus gebildet wird, vorzugsweise von einem Bakterium, besonders bevorzugt von einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt von einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt von einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders bevorzugt von B. licheniformis DSM13.
Nukleinsäure, codierend für ein sekretiertes Protein, nach einem der Ansprüche 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 oder 105, natürlicherweise enthalten in einem Mikroorganismus, vorzugsweise einem Bakterium, besonders bevorzugt einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders bevorzugt B. licheniformis DSM13.
Nukleinsäure, codierend für ein sekretiertes Protein nach einem der Ansprüche 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 204, 106 und/oder 107.
Vektor, der eine der in den Ansprüchen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 108 und/oder 109 bezeichneten Nukleinsäuren enthält.
Klonierungsvektor nach Anspruch 110.
Expressionsvektor nach Anspruch 110.
Zelle, die nach gentechnischer Modifizierung eine der in den Ansprüchen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 108 und/oder 109 bezeichneten Nukleinsäuren enthält.
Zelle nach Anspruch 113, wobei die genannte Nukleinsäure Teil eines Vektors ist, insbesondere eines Vektors nach einem der Ansprüche 110 bis 112.
Zelle nach einem der Ansprüche 113 oder 114, bei der es sich um ein Bakterium handelt.
Zelle nach Anspruch 115, wobei es sich um ein gramnegatives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Zelle nach Anspruch 115, wobei es sich um ein grampositives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum, und hierunter wiederum ganz besonders bevorzugt um ein Derivat von B. licheniformis DSM 13.
Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts (Proteins) nach einem der Ansprüche 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 und/oder 107.
Verfahren nach Anspruch 118 unter Einsatz einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 108 und/oder 109, vorzugsweise unter Einsatz eines Vektors nach einem der Ansprüche 110 bis 112, besonders bevorzugt unter Einsatz einer Zelle nach einem der Ansprüche 113 bis 117.
Verfahren nach Anspruch 118 oder 119, wobei die Nukleotidsequenz in einem, vorzugsweise mehreren und besonders bevorzugt allen Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepaßt worden ist.
Verwendung eines in den Ansprüchen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 und/oder 107 bezeichneten Proteins entsprechend seiner darin angegebenen biochemischen Eigenschaften.
Verwendung nach Anspruch 121, wobei es sich um eine hydrolytische Aktivität handelt, und vorzugsweise das betreffende hydrolytische Enzym im Rahmen einer Wasch- und/oder Reinigungsanwendung zur Entfernung von Anschmutzungen eingesetzt wird.
Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 108 und/oder 109 oder Teilen davon zur funktionellen Inaktivierung des jeweils zugehörigen Gens in einem Mikroorganismus.
Verwendung nach Anspruch 123, wobei die funktionelle Inaktivierung dazu führt, daß das betreffende Protein nicht vollständig, vorzugsweise überhaupt nicht sekretiert wird und besonders bevorzugt gar nicht synthetisiert wird.
Verwendung nach Anspruch 123 oder 124, wobei die funktionelle Inaktivierung während der Fermentation des Mikroorganismus erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 123 bis 125, wobei die eindeutig auf die betreffenden inaktivierten Enzyme oder Proteine zurückzuführenden Aktivitäten beziehungsweise Proteingehalte, vorzugsweise auf 50%, besonders bevorzugt auf weniger als 20%, ganz besonders bevorzugt auf weniger als 5% der ohne die Inaktivierung auftretenden Aktivitäts- beziehungsweise Konzentrationswerte reduziert werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 123 bis 126, wobei zunehmend bevorzugt 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 und besonders bevorzugt alle der genannten Gene funktionell inaktiviert werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 123 bis 127, wobei für die Inaktivierung jeweils eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 123 bis 128, wobei für die Inaktivierung jeweils eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt wird, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.
Verwendung nach einem der Ansprüche 123 bis 129, wobei für die Inaktivierung eine Nukleinsäure eingesetzt wird, die mit der 5'-terminalen Sequenz, insbesondere der Signalsequenz des zugehörigen Gens oder Teilen davon identisch ist oder interferiert.
Verwendung nach Anspruch 130, wobei es sich um eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 1, Positionen 1 bis 90, SEQ ID NO. 3, Positionen 1 bis 90, SEQ ID NO. 5, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 7, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 9, Positionen 1 bis 93, SEQ ID NO. 11, Positionen 1 bis 69, SEQ ID NO. 13, Positionen 1 bis 51, SEQ ID NO. 15, Positionen 1 bis 93, SEQ ID NO. 17, Positionen 1 bis 111, SEQ ID NO. 19, Positionen 1 bis 84, SEQ ID NO. 21, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 23, Positionen 1 bis 57, SEQ ID NO. 25, Positionen 1 bis 72, SEQ ID NO. 27, Positionen 1 bis 72, SEQ ID NO. 29, Positionen 1 bis 69, SEQ ID NO. 31, Positionen 1 bis 90, SEQ ID NO. 33, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 35, Positionen 1 bis 144, SEQ ID NO. 37, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 39, Positionen 1 bis 84, SEQ ID NO. 41, Positionen 1 bis 63, SEQ ID NO. 43, Positionen 1 bis 138, SEQ ID NO. 45, Positionen 1 bis 102, SEQ ID NO. 47, Positionen 1 bis 69, SEQ ID NO. 49, Positionen 1 bis 129, SEQ ID NO. 51, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 53, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 55, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 57, Positionen 1 bis 75, SEQ ID NO. 59, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 61, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 63, Positionen 1 bis 75, SEQ ID NO. 65, Positionen 1 bis 75, SEQ ID NO. 67, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 69, Positionen 1 bis 105, SEQ ID NO. 71, Positionen 1 bis 69, SEQ ID NO. 73, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 75, Positionen 1 bis 63, SEQ ID NO. 77, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 79, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 81, Positionen 1 bis 72, SEQ ID NO. 83, Positionen 1 bis 99, SEQ ID NO. 85, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 87, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 89, Positionen 1 bis 72, SEQ ID NO. 91, Positionen 1 bis 102, SEQ ID NO. 93, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 95, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 97, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 99, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 101, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 103, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 105, Positionen 1 bis 72 oder einer Consensus-Sequenz daraus oder einen für die Inaktivierung ausreichenden Teil davon handelt.
Mikroorganismus, bei dem mindestens eines der mit den Ansprüchen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 108 und/oder 109 bezeichneten Gene funktionell inaktiviert ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 132, bei dem zunehmend bevorzugt 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 und besonders bevorzugt alle der genannten Gene funktionell inaktiviert werden, vorzugsweise über eine Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der mehreren der Ansprüche 123 bis 131.
Mikroorganismus nach Anspruch 132 oder 133, bei dem es sich um ein Bakterium handelt.
Mikroorganismus nach Anspruch 134, wobei es sich um ein gramnegatives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Mikroorganismus nach Anspruch 134, wobei es sich um ein grampositives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis,
amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum und hierunter ganz besonders um B. licheniformis DSM 13.
Verfahren zur Fermentation eines Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 132 bis 136.
Verfahren nach Anspruch 137 zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.
Verfahren nach Anspruch 138, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
Verfahren nach Anspruch 138, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
Signalpeptid gemäß SEQ ID NO. 2, Positionen 1 bis 30, SEQ ID NO. 4, Positionen 1 bis 30, SEQ ID NO. 6, Positionen 1 bis 29, SEQ ID NO. 8, Positionen 1 bis 22, SEQ ID NO. 10, Positionen 1 bis 31, SEQ ID NO. 12, Positionen 1 bis 23, SEQ ID NO. 14, Positionen 1 bis 17, SEQ ID NO. 16, Positionen 1 bis 31, SEQ ID NO. 18, Positionen 1 bis 37, SEQ ID NO. 20, Positionen 1 bis 28, SEQ ID NO. 22, Positionen 1 bis 26, SEQ ID NO. 24, Positionen 1 bis 19, SEQ ID NO. 26, Positionen 1 bis 24, SEQ ID NO. 28, Positionen 1 bis 24, SEQ ID NO. 30, Positionen 1 bis 23, SEQ ID NO. 32, Positionen 1 bis 30, SEQ ID NO. 34, Positionen 1 bis 26, SEQ ID NO. 36, Positionen 1 bis 48, SEQ ID NO. 38, Positionen 1 bis 22, SEQ ID NO. 40, Positionen 1 bis 28, SEQ ID NO. 42, Positionen 1 bis 21, SEQ ID NO. 44, Positionen 1 bis 46, SEQ ID NO. 46, Positionen 1 bis 34, SEQ ID NO. 48, Positionen 1 bis 23, SEQ ID NO. 50, Positionen 1 bis 43, SEQ ID NO. 52, Positionen 1 bis 26, SEQ ID NO. 54, Positionen 1 bis 29, SEQ ID NO. 56, Positionen 1 bis 22, SEQ ID NO. 58, Positionen 1 bis 25, SEQ ID NO. 60, Positionen 1 bis 29, SEQ ID NO. 62, Positionen 1 bis 27, SEQ ID NO. 64, Positionen 1 bis 25, SEQ ID NO. 66, Positionen 1 bis 25, SEQ ID NO. 68, Positionen 1 bis 26, SEQ ID NO. 70, Positionen 1 bis 35, SEQ ID NO. 72, Positionen 1 bis 23, SEQ ID NO. 74, Positionen 1 bis 22, SEQ ID NO. 76, Positionen 1 bis 21, SEQ ID NO. 78, Positionen 1 bis 27, SEQ ID NO. 80, Positionen 1 bis 26, SEQ ID NO. 82, Positionen 1 bis 24, SEQ ID NO. 84, Positionen 1 bis 33, SEQ ID NO. 86, Positionen 1 bis 29, SEQ ID NO. 88, Positionen 1 bis 27, SEQ ID NO. 90, Positionen 1 bis 24, SEQ ID NO. 92, Positionen 1 bis 34, SEQ ID NO. 94, Positionen 1 bis 27, SEQ ID NO. 96, Positionen 1 bis 29, SEQ ID NO. 98, Positionen 1 bis 29, SEQ ID NO. 100, Positionen 1 bis 26, SEQ ID NO. 102, Positionen 1 bis 27, SEQ ID NO. 104, Positionen 1 bis 22, SEQ ID NO. 106, Positionen 1 bis 24 oder einer Consensus-Sequenz daraus.
Für ein Signalpeptid codierende Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 1, Positionen 1 bis 90, SEQ ID NO. 3, Positionen 1 bis 90, SEQ ID NO. 5, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 7, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 9, Positionen 1 bis 93, SEQ ID NO. 11, Positionen 1 bis 69, SEQ ID NO. 13, Positionen 1 bis 51, SEQ ID NO. 15, Positionen 1 bis 93, SEQ ID NO. 17, Positionen 1 bis 111, SEQ ID NO. 19, Positionen 1 bis 84, SEQ ID NO. 21, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 23, Positionen 1 bis 57, SEQ ID NO. 25, Positionen 1 bis 72, SEQ ID NO. 27, Positionen 1 bis 72, SEQ ID NO. 29, Positionen 1 bis 69, SEQ ID NO. 31, Positionen 1 bis 90, SEQ ID NO. 33, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 35, Positionen 1 bis 144, SEQ ID NO. 37, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 39, Positionen 1 bis 84, SEQ ID NO. 41, Positionen 1 bis 63, SEQ ID NO. 43, Positionen 1 bis 138, SEQ ID NO. 45, Positionen 1 bis 102, SEQ ID NO. 47, Positionen 1 bis 69, SEQ ID NO. 49, Positionen 1 bis 129, SEQ ID NO. 51, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 53, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 55, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 57, Positionen 1 bis 75, SEQ ID NO. 59, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 61, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 63, Positionen 1 bis 75, SEQ ID NO. 65, Positionen 1 bis 75, SEQ ID NO. 67, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 69, Positionen 1 bis 105, SEQ ID NO. 71, Positionen 1 bis 69, SEQ ID NO. 73, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 75, Positionen 1 bis 63, SEQ ID NO. 77, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 79, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 81, Positionen 1 bis 72, SEQ ID NO. 83, Positionen 1 bis 99, SEQ ID NO. 85, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 87, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 89, Positionen 1 bis 72, SEQ ID NO. 91, Positionen 1 bis 102, SEQ ID NO. 93, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 95, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 97, Positionen 1 bis 87, SEQ ID NO. 99, Positionen 1 bis 78, SEQ ID NO. 101, Positionen 1 bis 81, SEQ ID NO. 103, Positionen 1 bis 66, SEQ ID NO. 105, Positionen 1 bis 72 oder einer Consensus-Sequenz daraus.
Fusionsprotein aus einem N-terminal gelegenen Signalpeptid gemäß Anspruch 141 mit einem maturen Protein.
Nukleinsäure, codierend für ein Fusionsprotein gemäß Anspruch 143, vorzugsweise erhalten durch Fusion einer für ein Signalpeptid gemäß Anspruch 142 codierenden Nukleotidsequenz mit einer für das betreffende mature Protein codierenden Nukleinsäure.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins in Form eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 143.
Verfahren nach Anspruch 145, wobei eine Nukleinsäure nach Anspruch 144 eingesetzt wird.