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Gebiet der Erfindung.
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Die
Erfindung betrifft einen neuen Efomycin Biosynthesegencluster, neue
Gene oder Genfragmente aus einem solchen Biosynthesegencluster,
Expressionsprodukte dieser Gene oder Genfragmente, Transformationsvehikel
enthaltend solche Gene, Genfragmente oder Gencluster, transformierte
Zellen enthaltend solche Gene, Genfragmente oder Gencluster, Verfahren
zur biotechnologischen Herstellung von Efomycin und Efomycinderivaten,
Verfahren zur kombinatorischen Biosynthese von Efomycinderivaten,
neue Efomycinderivate, Verwendungen solcher neuer Efomycinderivate
und pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend solche Efomycinderivate.
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Hintergrund
der Erfindung und Stand der Technik
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Die
Struktur des Efomycins E (Elaiophylin) ist in der 1 dargestellt.
Efomycine bzw. Elaiophyline sind Makrodiolide, die von verschiedenen
Aktinomyceten erzeugt werden und ein mannigfaltiges Aktivitätsspektrum
aufweisen. Bekannt ist die antiinflammatorische Wirkung von bekannten
Efomycin-Derivaten als potentielles Psoriasis-Therapeutikum (Schön et al. 2002, Nat. Med. 8,
366-72). Aufgrund der Komplexität
der chemischen Struktur des Efomycins ist eine klassisch chemische
Modifikation insbesondere des Grundgerüsts, wenn überhaupt, nur schwer durchführbar.
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Bei
biosynthetisierten Efomycinderivaten handelt es sich prinzipiell
um Sekundärmetabolite
der für
die Synthese eingesetzten Mikroorganismen. Die für die Synthese relevanten Enzyme
bzw. Enzymgruppen werden von den Genen, Genfragmente bzw. Genclustern
der Mikroorganismen exprimiert. Die Kombination solcher Gene, Genfragmente
bzw. Gencluster bestimmt letztendlich die spezifische Struktur des
erzeugten Efomycinderivates. Durch unterschiedliche Kombination
der Gene, Genfragmente bzw. Gencluster (einschließlich modifizierter
Gene) in gentechnologisch modifizierten Mikroorganismen können diese
neue Derivate der natürlicherweise
hergestellten Efomycinderivate herstellen. Durch Kombinatorik der
Gene und/oder Gencluster können
eine Vielzahl von unterschiedlichen Derivaten erzeugt werden, welche
wiederum in Screeningverfahren auf Wirksamkeit, insbesondere erhöhte Wirksamkeit
gegenüber
bekannten Efomycinderivaten, und/oder reduzierte Nebenwirkungen,
getestet werden können.
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Aus
der Literaturstelle
EP
0 360 130 A2 sind Efomycinderivate bekannt, welche durch
chemische Synthese erhältlich
sind. Aus der Literaturstelle
US 6,291,515 B1 sind ebenfalls Efomycinderivate
und deren Verwendung bekannt, welche durch chemische Synthese erhältlich sind.
Diese Herstellungsweise ist extrem aufwändig und teuer.
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Für neue Indikationen
ist es wünschenswert
neue Derivate zu finden, insbesondere solche, die auch chemischen
Wege nicht ohne weiteres synthetisierbar sind. Zudem sind verbesserte
pharmakologische Eigenschaften sowie höhere Selektivität und Spezifität erstrebenswert.
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Technisches
Problem der Erfindung
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Der
Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, Mittel zur
Schaffung von neuen Efomycinderivaten, insbesondere von einer chemischen
Synthese nicht oder nur schwer zugänglichen Efomycinderivaten,
welche zudem verbesserte pharmakologische Eigenschaften aufweisen,
zur Verfügung
zu stellen.
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Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen.
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Zur
Lösung
dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein isoliertes Protein
oder Peptid enthaltend, insbesondere bestehend aus, einer oder mehreren
Aminosäurensequenzen
SEQ-ID 23 bis 43, 45 und 47. Erfindungsgemäße Proteine oder Peptide können in
einer Zelle zur Biosynthese exprimiert werden, es ist jedoch auch
ein Import extern erzeugten Proteins oder Peptids in eine die Biosynthese
ausführende
Zelle möglich.
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Das
Protein oder Peptid ist vorzugsweise für einen Teilsyntheseschritt
der Biosynthese eines Efomycinderivates, insbesondere eines Efomycinderivat-Antibiotikums,
funktional.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin eine isolierte Nukleinsäure, insbesondere
DNA, beispielsweise genomische DNA, cDNA, oder RNA, insbesondere
mRNA, codierend für
ein erfindungsgemäßes Protein
oder Peptid.
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Mit
der Erfindung umfaßt
sind auch Homologe der offenbarten Sequenzen, wobei die Homologie
zumindest 80% Identität,
vorzugsweise mehr als 90% Identität, höchstvorzugsweise mehr als 95%
Identität,
beträgt
(berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in der
zum Anmeldezeitpunkt gültigen
Fassung). Im Falle der Nukleinsäuresequenzen
sind auch komplementäre
oder allelische Varianten mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen
umfaßt,
welche lediglich Teilsequenzen bzw. Genfragmente der explizit offenbarten
Sequenzen oder komplementärer
Sequenzen hierzu darstellen, mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle
der Nukleinsäuren
eine für
eine Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende
Länge,
zumindest 50 oder 150 Basen, aufweisen und im Falle der Proteine
bzw. Peptide, ggf. codiert durch eine Nukleinsäure, mit zumindest gleicher
Affinität
an ein protein- oder peptidspezifisches Zielmolekül binden.
Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäß eingesetzten Nukleinsäuren hybridisierende
Nukleinsäuren
umfasst, nämlich
solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur;
siehe ergänzend
J.M. Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren.
Es versteht sich, daß die
Erfindung auch Expressionskassetten umfasst, i.e. eine oder mehrere
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz. Eine
solche Expressionskassette kann auch eine Sequenz für ein bekanntes
Protein umfassen, wobei im Zuge der Translation ein Fusionsprotein
aus einem bekannten Protein und einem erfindungsgemäßen Protein
oder Peptid entsteht. Ebenso sind auch antisense Sequenzen zu den
vorstehenden Nukleinsäuresequenzen
umfasst. Im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Verwendungen umfassen die
Begriffe der Nukleinsäuren
oder Proteine bzw. Peptide neben den Volllängen der offenbarten Sequenzen
(siehe auch vorstehender Absatz) auch Teilsequenzen bzw. Genfragmente hieraus,
und zwar mit einer Mindestlänge
von 21 Nukleotiden, vorzugsweise einer Mindestlänge von 30 bis 90 Nukleotiden,
im Falle der Nukleinsäuren
und einer Mindestlänge
von 7 Aminosäuren,
vorzugsweise einer Mindestlänge
von 10 bis 30 Aminosäuren,
im Falle der Proteine oder Peptide. Insbesondere zwischen 21 und
90 sowie 7 und 30 ist jeder einzelne Zahlenwert als Mindestlänge möglich. Vorbekannte
Sequenzen und/oder deren Verwendung, welche unter die im Rahmen
dieser Beschreibung verwendeten Definitionen fallen, können durch
einen Disclaimer in Patentansprüchen
ausgeschlossen werden.
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Die
Erfindung umfasst weiterhin ein isoliertes Transformationsvehikel,
insbesondere Plasmid oder Cosmid, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure. Es
kann eine Mehrzahl, insbesondere 1 bis 50, gleicher und/oder verschiedener
erfindungsgemäßer Nukleinsäuren enthalten.
Dabei wird es sich insbesondere empfehlen, wenn durch die Mehrzahl
der Nukleinsäuren
ein Biosynthesegencluster oder ein Teil eines Biosynthesegenclusters
für ein
Efomycinderivat gebildet ist. Das Transformationsvehikel kann zusätzlich zumindest eine
regulatorische Nukleinsäuresequenz
enthalten, wobei die erfindungsgemäße Nukleinsäure unter der Kontrolle der
regulatorischen Nukleinsäuresequenz,
insbesondere eines Promotors, steht. Selbstverständlich können ein oder mehrere regulatorische
Sequenzen mit der Maßgabe
eingerichtet sein, dass eine Mehrzahl von Nukleinsäuren, insbesondere
ein Gencluster oder ein Teil eines Genclusters kontrolliert werden.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle enthaltend eine erfindungsgemäße fremde
Nukleinsäure oder
mehrere verschiedene solcher fremden Nukleinsäuren und/oder ein erfindungsgemäßes fremdes
Protein oder Peptid oder mehrere verschiedene solcher fremden Proteine
oder Peptide, wobei die Zelle optional mit einer erfindungsgemäßen fremden
Nukleinsäure
oder mehreren verschiedenen solcher fremden Nukleinsäuren transformiert
sein kann. Hierbei kann eine gewünschte
Derivatisierung eines natürlicherweise
von der Zelle synthetisierten Efomycinderivates dadurch erreicht
werden, dass in einem Efomycinbiosynthesegencluster der Zelle an
Stelle oder zusätzlich
zu einem natürlichen
korrespondierenden Gen für
einen definierten Teilsyntheseschritt ein hiervon verschiedenes
fremdes Gen für
einen von dem definierten Teilsyntheseschritt verschiedenen anderen
definierten Teilsyntheseschritt eingeführt ist. Dies kann durch Konstruktion
und Einführung
des gesamten fremden bzw. mutierten Efomycinbiosynthesegenclusters
oder Teilen hiervon erfolgen. Es wird gleichsam eine mutierte Biosynthese
maßgeschneidert
nach Maßgabe
der gewünschten
Derivatisierung. Es ist gleichzeitig möglich, ein natürlicherweise
in der Zelle enthaltenes Gen codierend für ein Protein oder Peptid, welches
für einen
Teilsyntheseschritt der Biosynthese des Efomycins oder eines Efomycinderivates
funktional ist, zu inhibieren oder zu mutieren, insbesondere ganz
oder teilweise zu deletieren. Dies kann auch für mehrere natürlicherweise
in der Zelle enthaltene solche Gene erfolgen.
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Mit
der Erfindung wird erreicht, dass neben gezielten molekulargenetischen
Eingriffen auch durch das Einbringen heterologer Modifizierungsgene,
also durch "Kombinatorische
Biosynthese", neue
Efomycinderivate erzeugt werden können.
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Geeignete
Zellen sind vorzugsweise ausgewählt
aus der Gruppe der Actinomyceten, wie z.B. die Streptomyceten, oder
Enterobakterien, wie z.B. E. coli. Es versteht sich, dass eine erfindungsgemäße Zelle eine
mit einem erfindungsgemäßen Transformationsvehikel
erzeugte Mutante bzw. Rekombinante bekannter Stämme ist, und dass das damit
erzeugbare Antibiotikum gegenüber
bekannten Verbindungen derivatisiert ist.
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Die
Erfindung umfasst auch Efomycinderivate, insbesondere Efomycinderivat-Antibiotika,
welche dadurch erhältlich
sind, dass eine erfindungsgemäße Zelle
kultiviert wird, und dass nach Kultivierung das Efomycinderivat
aus der Zelle und/oder aus dem Kultivierungsüberstand isoliert wird. Ein
erfindungsgemäßes Efomycinderivat
ist zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
von bakteriellen oder viralen Infektionen und/oder inflammatorischen
Erkrankungen, wie Psoriasis, geeignet. Dabei kann die Biosynthese
dahingehend mutiert sein, dass das neue Efomycinderivat eine verbesserte
Wirksamkeit gegenüber
bekannten Wirkstoffen aufweist. Es ist aber auch möglich, dass
ein erfindungsgemäßes Efomycinderivat "lediglich" als Ersatztherapie
bei Resistenz gegen einen bekannten Wirkstoff Verwendung findet.
Dann liegt der Vorteil darin, dass mittels des erfindungsgemäßen Wirkstoffes überhaupt
erst wieder eine Therapie möglich ist.
Besonders wünschenwert
sind jedoch auch neue Efomycinderivate mit reduzierten Nebenwirkungen. Schließlich sind
mit der Erfindung auch besonders effektive Herstellungsverfahren,
beispielsweise für
das Aglycon, möglich.
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Die
Erfindung betrifft des Weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung
enthaltend ein erfindungsgemäßes Efomycinderivat
oder mehrere solcher Efomycinderivate in physiologisch wirksamer
Dosis. Zusätzlich
enthalten können
sein galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe. Die galenische Herrichtung
einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung kann in fachüblicher
Weise erfolgen. Als Gegenionen für
ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+,
K+, Li+ oder Cyclohexylammonium
in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen
sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-)
Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen,
Salben, Tropfen oder Lösungen
zur Injektion (i.v., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole),
transdermale Systeme oder sonstige topische Applikation, sowie Präparate mit
protrahierter Wirkstoff-Freigabe,
bei deren Herstellung übliche
Hilfsmittel wie Trägerstoffe,
Spreng-, Binde-, Überzugs-,
Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel
und Lösungsvermittler,
Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose,
Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose
und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-,
Erdnuss- oder Sesamöl,
Polyethylenglycole und Lösungsmittel,
wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise
Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung
ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter
Wirkstoff in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten
und physiologisch verträglichen
Träger
und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit
definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten
Darreichungsform hergerichtet ist. Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung galenisch hergerichtet zur oralen oder parenteralen
Gabe.
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Als
Dosierungen kommen für
einen 75 kg Erwachsenen 0,01 bis 5,0 mg/kg/Tag, insbesondere 0,01
bis 1,0 mg/kg/Tag, (oral), 0,001 bis 2,5 mg/kg/Tag, insbesondere
0,005 bis 1,0 mg/kg/Tag, (i.p.) in Frage. Im Falle der topischen
Anwendung kann die Wirkstoffkonzentration 0,001 bis 1,0 Gew.-%,
insbesondere 0,01 bis 0,1 Gew.-%, der Salbe betragen.
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Im
folgenden wird die Erfindung durch ausführliche Beschreibung der Identifizierung,
Sequenzierung, Annotation des Efomycin-Biosynthesegenclusters und
gezielte Herstellung von Efomycin-Derivate synthetisierenden Mutanten
näher beschrieben.
In diesen Ausführungsformen
können
einzelne Merkmale der Erfindung allein oder in Kombination mit anderen
Merkmalen verwirklicht sein. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen
dienen lediglich zur Erläuterung
und zum besseren Verständnis
der Erfindung und sind in keiner Weise beschränkend zu verstehen.
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Beispiel 1: Identifizierung
eines für
die Kombinatorische Biosynthese geeigneten und ausreichende Efomycin-Mengen
synthetisierenden Produzentenstammes.
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Fünf potentielle
Efomycin-Produzenten wurden untersucht. Die Stämme S. melanosporofaciens CB2923
(DSM40318), S. hygroscopicus subsp hygroscopicus CB2924 (DSM40821),
CB3, CB7 und CB2163 wurden untersucht. Alle Stämme wurden nach folgenden Kriterien,
die für
die erfolgreiche Durchführung
der kombinatorischen Biosynthese wichtig sind, untersucht, nämlich Produktionsmenge,
Diversität
der Produkte, Wachstumsverhalten und Resistenzprofil, Überprüfung eines
möglichen
Plasmidtransfers von integrativen (wie z.B. pSET152; Kieser et al.,
2000, Hopwood Manual, siehe Beispiel 4) und replikativen (wie z.B.
pUWL; Kieser et al., 2000) Plasmiden mit Hilfe der PEG-induzierten
Protoplasten-Transformation bzw. der intergenerischen Konjugation
von E. coli nach Streptomyces unter der Verwendung von Sporen des
jeweiligen Produzentenstammes (Methoden beschrieben in Kieser et
al., 2000). Nach diesen Kriterien wurde der Stamm CB2924 als der
am besten geeignete Stamm ausgewählt,
da nur er in allen Kriterien gute bis sehr gute Ergebnisse bzw.
Eigenschaften zeigte. Er stellt ausreichende Mengen Efomycin her,
die in Efomycin M derivatisiert werden können. Nur für CB2924 war es möglich ein
Gentransfersystem auf Basis der intergenerischen Konjugation zu
etablieren, das den Transfer von Inaktivierungs- und Genaustauschplamiden,
die Integration von Cosmiden in das Genom aber auch die gleichzeitige
Verwendung replikativer Plasmide ermöglicht.
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Beispiel 2: Identifizierung
des Efomycin-Biosynthesegenclusters durch genetisches Screening
und funktionellem Nachweis
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Die
chemische Struktur von Efomycin, aber auch Fütterungsexperimente zeigen
(Martin Gerlitz, 1995, Erkenntnisse- und anwendungsorientierte Untersuchungen
zur Polyketid-Biosynthese,
Dissertation der Universität
Göttingen),
dass das Efomycin-Rückgrat
nach einem, wie für
die Erythromycin-Biosynthese beschriebenen typischen Polyketidsynthase
I Mechanismus, ausgehend von vier Acetat, drei Propionat und einem
Butyrat-Rest aufgebaut wird. Da sich der chemische Aufbau eines
Polyketids in der Regel im Domänenaufbau der
modularen Polyketidsynthasen widerspiegelt ("Kolinearität"), ist davon auszugehen, dass für die Synthese eines
Semi-Efomycin-Oktaketids ein Starter-Modul und sieben Extensions-Module benötigt werden.
Aufgrund dieser Annahme lies sich ein Modell für den Aufbau der Domänen der
Efomycin PKS-Module ableiten, welches in 2 dargestellt
ist. Hierin erkennt man den Ablauf der Efomycin-Aglykonsynthese
und die postulierte Domänenstruktur
einer Efomycin PKS I. Ebenfalls kann für die Biosynthese des Efomycin-Desoxyzuckers L-2-Desoxyfukose
aufgrund von Erkenntnissen zur Biosynthese von Desoxyzuckern ein
Biosyntheseschema in sechs Schritten, ausgehend von D-Glukose, postuliert
werden. Hierzu zeigt 3 einen Vorschlag für die Biosynthese
des Efomycin-Desoxyzuckers L-2 Desoxyfukose. Dieser Zucker würde dann
am Ende der Biosynthese von einer Glykosyltransferase auf das Aglykon übertragen
werden, nämlich
durch terminale Glykosylierung des Efomycin-Aglykons durch eine
Efomycin-Glykosyltransferase
(4).
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2.1:
Die Identifizierung des Efomycin-Biosynthesegenclusters
erfolgte unter Verwendung unterschiedlicher konservierter Gensonden
("reverse Genetik") gegen gespottete
Klone einer Cosmid-Genbank des Stammes CB2924. Die Methode der Genbankherstellung
basiert im Wesentlichen auf Protokollen, die unter Beye et al.,
1998, GENOMICS 49, 317-320 und Burgtorf et al., 1998, GENOMICS 52(2):230-2
beschrieben wurden. Homogenisierte Bakterienkulturen wurden in 0.5% "low melting point
agarose" (SeaPlaque
GTG, Biozym) eingebettet und anschließend mit 2 mg/ml HEW-Lysozym
(Roth) für
14 h bei Raumtemperatur und mit 1 mg/ml Proteinase K (Merck) für 24 h bei
50 °C inkubiert.
Die eingebettete DNA wurde partiell mit Sau3AI gespalten, mit Gelase
(Epicentre) extrahiert und nach beschriebenen Methoden dephosphoryliert.
Die genomische DNA wurde mit 750 ng BamHI gespaltenen Cosmidvektor
pOJ436 (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics, The
John Innes Foundation, Norwich, England.) ligiert, entsalzt, verpackt
(Gigapack III Gold Packaging Extract, Stratagene) und in DH5α (Invitrogen)
transfiziert. Cosmidklone wurden in 384 MTP (Mikrotiterplatten) gepickt
und anschließend
auf Nylonfilter (Amersham) gespottet. Nachdem die Kolonien auf den
Membranen gewachsen waren, wurden diese nach Nizetic et al., 1991,
PNAS 88:3233-7 prozessiert und unter Verwendung der Standard-Methoden
nicht-radioaktiv
hybridisiert (Roche). Zur Identifizierung von PKSI-kodierenden Cosmiden
wurde zunächst
eine homologe Sonde mit Hilfe der genomischen DNA aus CB2924 hergestellt.
Dazu wurden nach Sequenzvergleich folgende konservierten PKSI-Primer
abgeleitet: KSIIFOR: 5'-CTSGGSGACCCSATCGAG-3'; ATIREV: 5'-GCSGCSGCGATCTCSCCCTGSSWGTGSCC-3' (S = G oder C; W
=.A oder T). Der PCR-Ansatz hatte folgende Zusammensetzung: 1,0 μl genomische
DNA von CB2924 (ca. 0,2 μg),
2,5 μl 10 × Puffer,
2,5 μl PCR-DIG
Probe Synthesis Mix (Roche), 5,0 μl
Q-Solution, 0,5 μl
KSIIFOR -Primer (50 pmol), 0,5 μl
ATIREV-Primer (50 pmol), 0,5 μl
Qiagen-Taq-Polymerase (2,5 u), 14,5 μl H2O. Die PCR wurde in einem PCR-Gerät von MJ
Research (PTC-225) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1 × (2 min,
94°C), 30 × (94°C, 1 min;
64°C, 1
min; 72°C,
2 min), 1 × (72°C, 10 min).
PKSI-Amplifikate zeigen eine charakteristische Größe von ca.
850 bp. Der Einsatz der amplifizierten PKSI-Sonde in einer Hybridisierung
gegen die CB2924 Cosmidbibliothek ergab 112 hybridisierende Cosmide
(5). Da diese erstaunlich hohe Anzahl
von hybridisierenden Cosmiden auch in 3 weiteren analysierten Efomycin-Produzenten
zu beobachten war, ist davon auszugehen, dass alle analysierten
Efomycin-Produzenten
ein sehr hohes Potential zur Synthese von weiteren PKSI-Substanzen
aufweisen. Für
einige dieser Produzenten sind weitere PKSI-Produkte beschrieben.
In 5 erkennt man beschriebene PKSI-Produkte
von 4 analysierten Efomycin-Produzenten (5a) und
das Ergebnis der Hybridisierung von 4 entsprechenden Cosmidbibliotheken
gegen eine PKSI-Sonde (5b). Um aus der Vielzahl der
PKSI-hybridisierenden Cosmide solche auszuwählen, die an der Biosynthese
von Efomycin beteiligt sein könnten,
wurden weitere Sonden eingesetzt. Die Verwendung von Sonden, die
gegen 4,6-Dehydratasegene (siehe 3) gerichtet
waren (PCR-Bedingungen und Primer siehe Decker et al., 1996, FEMS Microbiol
Lett.;141:195-201), führte
zur Identifizierung von insgesamt sechs PKSI/4,6-Dehydratasecohybridisierenden
Cosmiden (5c;2,3-DY = 2,3-Dehydratase;
4,6-DH = 4,6-Dehydratase; GT = Glycosyltransferase; TDP-SY = dTDP-Glucose-Synthase).
Hybridisierungen und Spaltungen legten nahe, dass je 3 Cosmide (2C15,
3N12, 5D12 und 3I11, 4D04, 4F09) eine Klasse bilden. Aufgrund weiterer
Hybridisierungen wurde deutlich, dass auf dem Cosmid 3N12 ein für die Biosynthese
des Desoxyzuckers erforderliches dTDP-Glukose Synthasegen (PCR-Bedingungen
und Primer siehe Hyun et al., 2000 FEMS Microbiol Lett.; 183-189)
lokalisiert ist (3). Durch die Verwendung weiterer
Sonden, die zum einen gegen 2,3-Dehydratasegene (PCR-Bedingungen
und Primer siehe Trefzer et al., 2002, Antimicrob Agents Chemother.46(5):
1174-82) und Glykosyltransferasegene (PCR-Bedingungen und Primer
siehe Blanco et al. 2001, Chem Biol.;8(3):253-63) gerichtet waren
und zum anderen von Endsequenzen des Cosmids 5D12 abgeleitet wurden,
konnten letztendlich mit 4L08 und 2F16 zwei weiterere, überlappende
Cosmide identifiziert werden, die zusammen mit 2C15, 3N12 und 5D12
das potentielle Efomycin Cluster abdecken, wozu auf die 6 verwiesen
wird. Hierin erkennt man die relativen Positionen von 5 überlappenden
Cosmiden, die für
potentielle Gene des Efomycin-Genclusters kodieren. Der mit A gekennzeichnete
Strich symbolisiert ein PKSI-kodierendes Fragment auf Cosmid 2924-5D12,
das für
ein Inaktivierungsexperiment eingesetzt wurde.
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2.2:
Der Nachweis, dass die identifizierten, gegen konservierte Sonden
hybridisierenden Cosmide tatsächlich
Gene des Efomycin-Biosynthesegenclusters kodieren, erfolgte durch
ein Geninaktivierungsexperiment. Hierzu wurde 1 PKSI-kodierendes
Fragment des Cosmids 5D12 (siehe 6) in einen
Inaktivierungsvektor kloniert und das daraus entstehende Konstrukt
in den Efomycin-Produzenten transferiert (Beschreibung der Methode
siehe Beispiel 4). Durch homologe Rekombination sollte dieses Plasmid
in das vermeintliche Cluster integrieren und so die entsprechende
Genfunktion inaktivieren ("gene
disruption"). Das
Efomycin Cluster wäre
identifiziert, wenn die entsprechenden Integrationsmutante nicht
mehr in der Lage wäre,
Efomycin zu synthetisieren. Im Folgenden wird die Herstellung und
Analyse der Mutante detailliert beschrieben.
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Ein
ca. 4 kb großes
BamHI-Fragment des Cosmids 5D12, das für ein Fragment der PKSI kodiert
(siehe 6 "A"), wurde in den nichtreplikativen
Vektor p18mob2 (die Konstruktion des Vektors ist in Beispiel 4 beschrieben)
kloniert. Das erhaltene Konstrukt wurde anschließend über intergenerische Konjugation
in den Efomycin-Produzenten transferiert (siehe Beispiel 4). Eine
Selektion auf den Plasmidmarker führte zur Identifizierung von
Rekombinanten, die im Chromosom über
homologe Rekombination integrierte Plasmide tragen. Die Anwesenheit
des Plasmids nach Transfer konnte per PCR nachgewiesen werden. Anschließend wurde
eine der Trankonjuganten auf ihre Fähigkeit zur Efomycin-Produktion
im Vergleich zum Wildtyp analysiert (7 und 8). Die LC-DAD-MS-Analysen (siehe Beispiel
4) ergaben, dass die Transkonjugante 2924-4,0-C kein Efomycin mehr
produziert. Damit war der Nachweis erbracht, dass die identifizierten, überlappenden
Cosmide und insbesondere 5D12 Efomycin-Biosynthesegene kodieren.
Hierzu sieht man in der 7 eine LC-DAD-MS Analyse
des Essigsäureethylester-Extrakts
des Efomycin Wildtyps. 7a zeigt folgende Chromatogramme (von
oben nach unten): Fokussiertes Base Peak Index (BPI) DAD zwischen
245 und 260 nm. Gesamt BPI DAD; Fokussiertes Ionenchromatogramm
für m/z
1020 bis 1025; Gesamt MS Total Ion Current (TIC). Die Chromatogramme
legen nahe, dass im Wildtyp Efomycin (Accurate Mass 1024.59707,
siehe 7c) produziert wird. Das UV-Spektrum 7b untermauert,
dass bei einer Retentionszeit um 5.0 min ein typisches Efomycin-UV-Spektrum nachgewiesen
werden kann. Die aufsummierten Spektren beweisen das Vorliegen des
Efomycins bzw. Efomycin- typischer
Derivate mit einem Massenpeak von 1024 amu (ESI negativ Modus, m/z 1023).
In 8 sieht man eine LC-DAD-MS Analyse
des Essigsäureethylester-Extrakts
der Efomycin-Integrationsmutante 2924-4,0-C. 8a zeigt
folgende Chromatogramme (von oben nach unten): Fokussiertes Base Peak
Index (BPI) DAD zwischen 245 und 260 nm. Gesamt BPI DAD; Fokussiertes
Ionenchromatogramm für m/z
1020 bis 1025; Gesamt MS Total Ion Current (TIC). Die Chromatogramme
legen nahe, dass im Unterschied zum Wildtyp kein Efomycin-Derivat
produziert wird, das mit einem Massepeak von 1024 (ESI negativ Modus,
m/z 1023, siehe 8b und 8c) zu
detektieren wäre.
Darüber
hinaus war kein Efomycin-typisches UV-Spektrum bei der charakteristischen
Retentionszeit von ca 5.0 min nachweisbar. Die aufsummierten Spektren
(unten) beweisen, dass bei einer Retentionszeit um 5.0 min keine
signifikanten Mengen einer Substanz mit dem Efomycin-typischen Massepeak
von 1024 amu (ESI negative Modus: m/z 1023) produziert wird ("Grundrauschen").
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Beispiel 3: Sequenzierung
des kompletten Biosynthesegenclusters, Sequenzannoation und Entwicklung
eines Biosyntheseschemas
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Das
vorstehende Inaktivierungsexperiment zeigte, dass das identifizierte
Cosmid 5D12 Gene des Efomycin-Biosynthesegenclusters
trägt.
Hybridisierungen und Sequenzierungen von Cosmidinserts ergaben, dass
5 Cosmide einen zusammenhängenden,
mit 5D12 überlappenden
Bereich abdecken (Siehe 6). Um die Sequenz des putativen
Efomycin-Biosynthesegenclusters
zu bestimmen, wurden die ca. 35 kb großen Inserts der Cosmide 5D12
und 4L08 komplett shotgun sequenziert. Darüber hinaus wurden zusätzlich ein
ca. 1,5 kb großes
Fragment des Cosmids 3N12 und ein ca. 4.4 kb großes Fragment des Cosmids 2C15,
das die Lücke
zwischen den Cosmiden 5D12 und 4L08 schließt, sequenziert. Insgesamt
wurde eine Sequenz von 77.040 bp doppelsträngig ermittelt, wozu auf die
Sequenzprotokolle verwiesen wird (SEQ.-ID 1). Der GC-Gehalt des
gesamten sequenzierten Bereiches wurde mit für Actinomyceten typischen 73,1
% bestimmt. Zur Identifizierung des Efomycin-Biosynthesegenclusters wurden umfassende
ORF (Open Reading Frame)-Analysen und Datenbankvergleiche durchgeführt. Diese
Analysen ergaben, dass insgesamt 19 bis 21 ORFs, die alle in einer
Transkriptionsrichtung angeordnet sind, an der Efomycin-Biosynthese
beteiligt sind (9a, die Funktion der
einzelnen Gene ist in 9b zusammengefasst). Die relative
Position der Cosmide ist angezeigt (z.B. 2924-5D12)). Diese ORFs
umfassen einen Kodierbereich von ca. 60.6 kb mit einem durchschnittlichen GC-Gehalt
von 73,2 % (9b). Für die Gene efoG und efoR1 konnte
jeweils ein alternatives Startcodon identifiziert werden. Die Wahl
des alternativen Startcodons ist in den Genen/Genprodukten efoG*
bzw. efoR1* berücksichtigt.
Im Folgenden werden die Funktionen der 23 abgeleiteten Genprodukte
detailliert beschrieben. Die Organisation des Clusters ist der 9a und die Charakteristika der einzelnen
Gene/Enzyme ist der 9b zu entnehmen.
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Die
Biosynthese des Polyketid-Rückgrats
erfolgt durch die 5 modularen Polyketidsynthasen EfoA1 bis EfoA5,
die für
ein Loading-Modul und 7 Extensionsmodule kodieren. Eine genauere
Analyse der abgeleiteten Genprodukte macht deutlich, dass EfoA1
für ein
Loading Modul und 2 Extensionsmodule kodiert, EfoA2, EfoA3 und EfoA5
sind jeweils monomodular und EfoA4 ist ein bimodulares Enzym. Die
Analyse der einzelnen Domänen
(KS = β-Ketoacyl-ACP-Synthase;
AT = Acyltransferase; ACP = Acyl-Carrier-Protein); KR = Ketoreduktase; DH
= Dehydratase; DH* = inaktive Dehydratase, KSQ = KS-ähnliche
Starter Domäne;
TE = Thioesterase) führt zu
folgenden Ergebnissen.
-
EfoA1:
EfoA1 (SEQ-ID 1 und 23; NS/AS) ist ein trimodulares Enzym (Loading
und 2 Extension-Module) mit einer Größe von 4442 Aminosäuren (AS).
Das Loading-Modul umfasst die Domänen KSQ, AT, ACP, im Gegensatz
zum AT, ACP Loading-Modul
der Erythromycin-Polyketidsynthase DEBSI. Eine sogenannte KSQ Domäne stellt
eine KS-ähnliche
Domäne
dar, die einen Q-Rest anstelle des konservierten C-Restes aufweist und
dadurch eine Decarboxylierungsaktivität zeigt (Bisang et al. 1999,
Nature 401: 502-505; Long et al. 2002, Mol. Microbiol. 43, 1215-1225).
KSQ Domänen
wurden bei einer Reihe von PKSI-Biosynthesen wie z.B. Niddamycin,
Tylosin, Pikromycin/Methymycin, Spinosyn oder Monensin beschrieben.
Der Vorteil dieses Systems besteht in der Spezifität für den Starter.
Acetat findet sich als Starter im Efomycin wieder (siehe Auch 2), die
KSQ-Domäne
sorgt dafür,
dass nur die Dicarboxylsäure
Malonyl-CoA als Lieferant von Acetat akzeptiert wird. Konservierte
Regionen innerhalb der AT zeigen, ob diese eine Spezifität für Malonyl-CoA
(M), Methylmalonyl-CoA (MM) oder andere ungewöhnliche Carboxylsäuren aufweisen
(Yadav et al. 2003, J. Mol. Biol. 328, 335-363). Die AT des Starter-Moduls
zeigt Sequenzmotive, die auf eine Malonat-spezifische ATM hinweisen. Im
Falle der Efomycin-Biosynthese ist demnach die Sachlage die, dass
die Acyltransferase (AT) eine Spezifität für Malonyl-CoA aufweist, diesen
Rest auf den Phosphopantheteinarm des Loading-ACP überträgt und die KSQ-Domäne anschließend den
Malonat-Rest zu Acetat decarboxyliert. Modul 1 zeigt die Domänenfolge
AT1, DH*, KR1, ACP1. von besonderem Interesse ist die Spezifität der AT1,
da diese aufgrund der Efomycin-Struktur in der Lage sein sollte,
Ethylmalonyl-CoA (EM)als ungewöhnlichen
Extender zu erkennen. Die Existenz von unsymmetrischen Efomycinen
wie Efomycin G lässt
vermuten, dass diese AT auch eine gewisse Affinität zu Methylmalonyl-CoA
aufweisen könnte.
Betrachtet man die zur Bestimmung der Aktivität vorhandenen konservierten
AS (Yadav et al. 2003, J. Mol. Biol. 328, 335-363), so fällt auf,
dass die AS 200 und 201 G und H entsprechen, anstelle von S und
H in typischen Methylmalonyl-CoA spezifischen ATs. G und H finden
sich allerdings ebenfalls in der Niddamycin AT wieder, die ebenfalls
für Ethylmalonyl-CoA
spezifisch ist. Daher ist die AT1 der Efomycin-PKS eine AT mit EM-Spezifität. Dieser
AT folgt überraschenderweise
eine Dehydratase (DH) Domäne,
die aufgrund der Struktur von Efomycin nicht erforderlich wäre. Diese
DH*-Domäne
sollte aber inaktiv sein, da das für eine DH-Aktivität notwendige
konservierte DH-Motiv LxxHxxxGxxxxP (Bevitt et al. 1992, Eur. J.
Biochem. 204, 39-49) zu LxxPxxxDxxxxP mutiert ist. Inaktive DH und
auch KR Domänen
wurden bei mehreren PKSI-Enzymen, wie z.B. die Rifamycin PKS oder
Avermectin-PKS gefunden. Modul 2 zeigt die erwartete Domänenfolge
KS2, AT2M, KR2, ACP2.
-
EfoA2:
EfoA2 (SEQ-ID 3 und 24; NS/AS) ist ein monomodulares Enzym mit einer
Größe von 1673
AS. Das Enzym weist die Domänenfolge
KS3, AT3MM, KR3, ACP3 auf. Hier fällt vor allem die aufgrund
der Struktur nicht erwartete Anwesenheit der KR3-Domäne auf.
Diese KR besitzt sowohl das hochkonservierte NADP(H) Bindungsmotiv
GxGxxGxxxA und ein weiteres konserviertes Motiv SRrG, die bei vielen inaktiven KR-Domänen Mutationen
aufweisen. Eine aktive KR-Domäne
würde eine
Reduktion zur Folge haben, die die Hemiacetalbildung von Efomycin
unterbinden würde
(2). Daher bleibt derzeit fraglich, ob die Domäne aktiv ist
und ein unerwartetes Zwischenprodukt erzeugt, oder ob die Domäne trotz
Anwesenheit der konservierten Motive inaktiv ist.
-
EfoA3:
EfoA3 (SEQ-ID 4 und 25; NS/AS) ist ebenfalls ein monomodulares Enzym
mit einer Größe von 1677
AS. Das Enzym zeigt die erwartete Domänenfolge KS4, AT4MM, KR4, ACP4.
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EfoA4:
EfoA4 (SEQ-ID 5 und 26; NS/AS) ist ein bimodulares Enzym einer Größe von 3389
AS. Modul 5 zeigt die erwartete Domänenfolge KS5, AT5MM, KR5, ACP5.
Bei der Analyse der konservierten Motive fällt allerdings auf, dass das
2. konservierte KR5 Motiv modifiziert ist. Statt SRrG ist in KR5
das Motiv GRrG vorhanden, das ungewöhnlich erscheint. Modul 6 zeigt
die erwartete Domänenfolge
KS6, AT6M, DH6, KR6, ACP6 ohne besondere Sequenzauffälligkeiten.
-
EfoA5:
EfoA5 (SEQ-ID 6 und 27; NS/AS) ist ebenfalls ein monomodulares Enzym
einer Größe von 2088
AS. Die Anordnung der Domänen
ist KS7, AT7M, DH7, KR7, ACP7, TE. AT7 zeigt konservierte Motive, die
für eine
Malonyl-CoA spezifische AT typisch sind. Allerdings sind an den
Positionen 200 und 201 die AS A und H anstelle der typischen Reste
F und H. Die Kombination A und H wurde bisher bei Propionat spezifischen ATs
der Loading Domäne
der Erythromycin und Megalomycin PKS beschrieben. Die letzte Domäne der PKSI stellt,
wie üblich,
eine Thioesterase (TE)-Domäne
dar. Diese ist bei anderen PKSI-Systemen an der Hydrolyse des fertigen
PKSI-Produktes bzw. wie im Falle der Erythromycin PKSI-TE an der
Zyklisierung/Laktonisierung beteiligt. Die durchschnittliche Größe einer
modularen TE-Domäne
beträgt
ca. 212 AS (Yadav et al. 2003, J. Mol. Biol. 328, 335-363). Die
Efomycin-PKS spezifische TE weist eine Größe von ca. 308 AS auf. Innerhalb dieser
Sequenz sind die TE typischen Motive GxSxG und GxH zu finden (Kakavas
et al. 1997, J. Bacteriol. 179, 7515-7522). Ob die etwas vergrößerte Domäne auf eine
potentielle Dimerisierungsfunktion hinweist ist unklar.
-
EfoD:
Efo D (SEQ-ID 9 und 30; NS/AS) zeigt höchste Identität zu einer
sogenannten separaten Thioesterase II (TEII). Diese Art von Thioesterasen
kommt in vielen PKSI-Systemen,
wie Erythromycin, Pikromycin, Tylosin oder auch Rifamycin und auch
in nicht-ribosomalen Peptidsynthetase (NRPS) Systemen vor. Untersuchungen
zeigen, dass diese Enzyme "editierende" Aufgaben erfüllen, in
dem sie falschgebundene Starter/Extender vom ACP entfernen. Während bei
der Erythromycin-PKSI diese Spezifität auf falschgebundene Starter CoAs
beschränkt
zu sein scheint (Hu et al. 2003, Microbiology, 149, 2213-2225),
ist die Spezifität
der Pikromycin TEII auch auf andere Extender ACPs erweitert (Kim
et al. 2002, J Biol Chem 277, 48028-48034). Eine Inaktivierung der
TEII-Funktion führt
in der Regel zu einem verstärkten
Anteil von entsprechenden PKSI-Derivaten,
wobei die Erhöhung
der Diversität
mit einem starken Abfall der Produktmenge einhergeht. Umgekehrt
führt in
der Regel eine Überexpression
des entsprechenden Gens zu einer Erhöhung der Produktmenge.
-
Die
Zuordnung der Gene der
9b zu den Sequenzen ist wie
folgt:
-
Biosynthese
des Desoxyzuckers L-2-Desoxyfukose: Im Efomycin-Biosynthesegencluster
konnten alle (10), für die Biosynthese von 2-L-Desoxyfukose
und dessen Transfer verantwortlichen Gene identifiziert werden (spezifische
Parameter der einzelnen Gene sind der 9b zu
entnehmen). So kodieren efoB und efoC, die stromaufwärts der
PKSI lokalisiert sind, die beiden initialen Gene der Zuckerbiosynthese,
eine dTDP-Glukose-Synthase und eine 4,6-Dehydratase. Stromabwärts der
PKSI sind weitere, in der Biosynthese folgende Gene lokalisiert:
efoK kodiert für
eine 2,3-Dehydratase, efoJ für
eine 2,3-Enoyl-Reduktase, efoF für eine
3,5-Epimerase, efoI für
eine 4-Ketoreduktase und efoF für
eine Glykosyltransferase. Stämme,
die Efomycin A produzieren, die also am Zucker eine zusätzliche
Methoxygruppe aufweisen, benötigen
noch eine entsprechende O-Methyltransferase
(3). Da im Efomycin-Biosynthesegencluster ein solches Gen
nicht identifiziert wurde, liegt die Vermutung nahe, dass CB2924
nicht in der Lage ist, Efomycin A-artige Zucker zu synthetisieren.
-
Biosynthese
von Vorstufen: Die Verwendung eines Ethylmalonyl-CoA Extenders stellt
unter PKSI-Systemen eine Besonderheit dar. Dennoch gibt es einige
Beispiele, wie Monensin, FK520, Tylosin und Niddamycin, die ebenfalls
Ethylmalonyl-CoA-Einheiten einbauen. Die Biosynthese von Ethylmalonyl-CoA
kann in Actinomyceten über
2 verschiedene Stoffwechselwege erfolgen (Liu und Reynolds, 2001
Metabol. Engineer. 3, 40-48). Zum einen über die Isomerisierung des
Valin-Kataboliten Isobutyryl-CoA zu Butyryl-CoA, das abschließend zu
Ethyl-Malonyl-CoA carboxyliert wird. Ein alternativer Weg (12;
die Gene ORF1, ORF2 und EfoL sind im Efomycingencluster vorhanden)
beginnt mit der Kondensation von 2 Acetatresten zu Acetoacetyl-CoA, einer
Reduktion und Wasserabspaltung zu Crotonyl-CoA, das anschließend ebenfalls
zu Butyryl-CoA, dem direkten Ethylmalonyl-CoA Vorläufer reduziert
wird. Für
diese Reduktion ist die Crotonyl CoA-Reduktase (CCR) verantwortlich.
Ein entsprechendes ccr-Gen ist Bestandteil des Tylosin und Niddamycin
Biosynthesegenclusters ist. Auch im Efomycin-Biosynthesegencluster
ist mit efoL ebenfalls ein Gen vorhanden, das für eine CCR kodiert. Dieses
Gen stellt mit großer
Wahrscheinlichkeit eine Randregion des Clusters dar, da stromabwärts 2 ORFs
folgen, die zum einen Ähnlichkeiten
zu einem divergent transkribierten hypothetischen S. coelicolor/S. avermitilis
Enzym aufweisen und zum anderen höchste Homologie zu einer Formamidopyrimidin-DNA
Glycosylase, die an Reparaturprozessen der DNA beteiligt ist, zeigen.
Erstaunlicherweise konnten in der anderen Randregion 2 ORFs identifiziert
werden, die ebenfalls dem Ethylmalonyl-CoA-Biosyntheseweg zuzuordnen sind.
ORF1 kodiert dabei für
eine β-Ketoacyl-ACP-Synthase III,
die innerhalb der Fettsäuresynthese
für die
initiale Kondensation von 2 Acetyl-CoA-Resten verantwortlich ist
(11). Weiterhin wurde mit ORF2 ein Genprodukt identifiziert,
das wahrscheinlich für
eine β-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase
kodiert und somit für den
nächsten
Schritt der Biosynthese, der Reduktion von Acetoacetyl-CoA zu β-Hydroxybutyryl-CoA
verantwortlich sein könnte.
Datenbankvergleiche ergaben, dass ein ähnliches Gen Bestandteil des
Oligomycin-Biosynthese Genclusters aus S. avermitilis und des Phoslactomycin
B Biosynthesegenclusters aus Streptomyces sp. HK803 ist (Palaniappan
et al. 2003, J. Biol. Chem. 278, 35552-35557). Beide PKSI-Produkte
besitzen ebenfalls einen Ethylmalonyl-CoA Extender. Diese Genprodukte
und auch das putative ORF2 Genprodukt, zeigen eine Größe von 571 – 601 AS
und sind damit doppelt so groß,
wie andere Enzyme mit ähnlicher
Funktion. Laut Homologievergleich könnten diese Gene aus einer
Duplikation eines entsprechenden Vorläufer-Gens entstanden sein. Zur Synthese von
Butyryl-CoA würde
lediglich die β-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase
fehlen, wobei es fraglich erscheint, ob diese Funktion nicht ebenfalls
von dem duplizierten ORF2 durchgeführt werden könnte. Offen
bleibt auch, ob beide ORFs im engeren Sinne zum Efomycin-Gencluster
gehören.
Fest steht, dass stromaufwärts
dieser beiden Gene keine weiteren potentiellen Efomycin-Biosynthesegene
lokalisiert sind, da hier ebenfalls divergent organisiert, ein hypothetisches
integrales Membranprotein lokalisiert ist, das sowohl in S. coelicolor
als auch in S. avermitilis gefunden wurde.
-
Regulation
und Resistenz/Transport: Das Efomycin-Biosynthesegencluster kodiert für 3 putative
Regulatoren (EfoR1, EfoR2 und EfoR3). EfoR1 zeigt die höchste Identität zu einer
Gruppe von großen
ATP-bindenden Regulatoren der LuxR-Familie (LAL). Durch das Vorliegen
eines 2. Startcodons muss derzeit von 2 Genprodukten EfoR1 und EfoR1*
mit einer Größe von 971
bzw. 991 AS ausgegangen werden. Das jeweils abgeleitete Enzym besitzt
die typischen N-terminalen ATP-bindenden Walker A und Walker B Motive
und ein C-terminales LuxR-typisches "Helix turn Helix"-Motiv zur DNA-Bindung. Eine Reihe anderer
Biosynthesegencluster für
komplexe Polyketide kodieren für
entsprechende Regulatoren, wie der Rapamycin-Regulator RapH oder
der Pikromycin-Regulator PikD (Wilson et al. 2001, J. Bacteriol.
183, 3468-3475). EfoR1 besitzt als Besonderheit ein in Streptomyceten
seltenes TTA-Codon, das auf eine übergeordnete Regulation in
einem entsprechenden Netzwerk hindeutet. Untersuchungen an PikD
haben gezeigt, dass dieser Regulator ein positiver Regulator ist,
bei dessen Inaktivierung die komplette Biosynthese verloren geht
und dessen Überexpression eine
Steigerung der Biosynthese zur Folge haben kann. Neben efoR1 sind
mit efoR2 und efoR3 zwei weitere potentielle Regulatorgene im Cluster
vorhanden. EfoR2 zeigt mit einer Größe von 420 AS höchste Ähnlichkeiten
zu einer 2-Komponenten-Sensorkinase während EfoR3 mit 222 AS höchste Ähnlichkeiten
zu einem 2-Komponenten-Response-Regulator aufweist. Es liegt nahe,
dass beide Komponenten zu einem Regulationssystem gehören. Die
Existenz unterschiedlicher Regulationssysteme innerhalb einer Antibiotika-Biosynthese
stellt keine Besonderheit dar. So weist das Tylosin-Biosynthesegencluster
mindestens 5 verschiedene Regulatorgene auf (Stratigopoulos and
Cundliffe 2002, Chem Biol 9:71-8). Die letzten beiden Gene efoG
und efoH kodieren Genprodukte, die mit dem Transport des fertigen
Produkts bzw. mit der Resistenzvermittlung zusammenhängen könnten. EfoG
zeigt höchste
Identität
zu ABC (ATP-binding cassette)-Transportern, die im Zusammenhang
von Antibiotika-Biosynthesen für
Resistenz und Transport verantwortlich gemacht werden (Mendez und
Salas, 2001, Res. Microbiol. 152, 341-50). Auch für EfoG gibt
es ein 2. Startcodon, so dass ebenfalls in 9b 2 Gene/Genprodukte
(EfoG und EfoG*) berücksichtigt
sind. Ebenfalls zeigt auch EfoH höchste Ähnlichkeit zu Transportern
bzw. integralen Membranproteinen.
-
Beispiel 4: Herstellung
verschiedener Efomycin-Aglykon synthetisierender Mutanten
-
Das
Efomycin-Aglykon stellt eine geeignete Ausgangssubstanz für weitere
Derivatisierungen dar. Die chemische Abspaltung der 2-L-Desoxyfucosereste
wird aufgrund der beschriebenen Säure/Base-Instabilität des Aglykons
erschwert (s.
EP 0360130 ).
Die Anwendung der säurekatalysierten
Methanolyse führt
lediglich zu Deglycosylierungsprodukten (Elaiolide, Seebach et al.,
1986 J. Liebigs Ann. Chem, 1281), deren Struktur nachträglich als
tetra-O-methyl Derivat des Aglykons bestimmt werden konnte (Bindseil
und Zeeck, 1993, 58, 5487-5492). Nur die Säurehydrolyse in Abwesenheit
von Methanol führte
nach 15 h zu einem Produktgemisch, das unter anderem das echte Aglykon
mit einer nichtsubstituierten OH-Gruppe in Position 13 des Hemiacetals enthält. Aufgrund
der Säurelabilität des Aglykons
können
keine Produktraten >20%
erzielt werden (Bindseil und Zeeck, 1993, 58, 5487-5492).
-
Das
Vorliegen der in diesem Patent beschriebenen Sequenz des Efomycin-Biosynthesegenclusters eröffnet nun
erstmals die Möglichkeit
der "biologischen" Synthese des Aglykons
durch gezieltes Ausschalten bestimmter Zuckerbiosynthesegene. Zur
Unterbrechung der Biosynthese des Desoxyzuckers 2-L-Desoxyfucose
wurden zwei Biosynthesegene efoK, das für eine 2,3-Dehydratase kodiert
und efoF, das für
eine 3,5-Epimerase kodiert (3), gezielt
inaktiviert. Die Inaktivierung beider Gene erfolgte in zwei Schritten,
wie es in vergleichbarer Weise zur Inaktivierung des Halogenasegens
bhaA in Puk et al., 2002, Chem. & Biol.
9, 225-235 bereits beschrieben wurde. Im ersten Schritt wurde ein
Plasmidkonstrukt generiert, das nach einem doppel cross-over die
Entstehung der Genaustauschmutante CB3785 (in efoK) bzw. CB3787
(in efoF) zur Folge hat (12 und 13).
In beiden Genaustauschmutanten ist ein Teil des zu inaktivierenden
efoK bzw efoF Gens durch das Kanamycin-Resistenz vermittelnde aphII-Gen ersetzt.
Im zweiten Schritt wird ein weiteres Plasmidkonstrukt benutzt, um
die zuvor inserierte Resistenzgenkassette gegen eine "in frame" deletierte inaktive
Kopie von efoK bzw. efoF durch doppel cross-over auszutauschen.
Die entstehenden "in
frame" Deletionsmutanten
CB3788 bzw. CB3786 (12 und 13) weisen
keine heterologen Gene auf, so dass ein negativer (polarer) Effekt
auf stromab- bzw. stromaufwärts
im Cluster lokalisierte Gene ausgeschlossen ist. Im Folgenden wird
die Herstellung der entsprechenden Efomycin-Aglykon synthetisierenden
Mutanten detailliert beschrieben.
-
A: Inaktivierung des 2,3-Dehydratasegen
efoK des Efomycin-Biosynthese-Clusters
zur Herstellung von Efomycin-Aglykon
synthetisierenden Mutanten
-
Zur
Herstellung einer efoK-Genaustauschmutante wird ein Plasmidkonstrukt
generiert, das zum einen an efoK stromauf- und abwärts angrenzende
DNA Fragmente enthält
und zum anderen ein efoK-Gen, das eine 780 bp Deletion aufweist,
die durch eine Kanamycin-Resistenzgenkassette aphII ersetzt wurde
(12). Das entsprechende Plasmidinsert wird durch
die Klonierung von 3 PCR-Fragmenten erzeugt, von denen das eine den
5'-Bereich (DH5'-Fragment) vor der
Deletion und das andere den 3'-Bereich
(DH3'-Fragment)
nach der Deletion umfasst (12). Diese
beiden PCR-Fragmente
werden zunächst über eingeführte Restriktionsschnittstellen
gezielt fusioniert und anschließend
wird eine Kanamycin-Resistenzgenkassette aphII so amplifiziert,
dass sie aufgrund eingeführter
Schnittstellen zwischen beide DH-Fragmente inseriert werden kann.
-
1. Klonierung der efoK-Genaustausch-
und in frame Deletionsplasmide:
-
– Klonierung des DH5'-Fragments
-
Alle
Klonierungen und DNA-Modifikationen wurden wie unter Sambrook et
al., 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben, durchgeführt.
-
Primer:
-
- DH5ForEcoRI: 5' – GCCTGTGAATTCTCGGCTCGGTCCACGAGT – 3'
- DH5RevEcoRV: 5' – CATCACGATATCCGGTACGCCGTCGAAGTC – 3'
-
- PCR-Ansatz:
| DNA
Cosmid 2924-4L08 | 0,5 μl (ca. 0,2 μg) |
| Primer
DH5ForEcoRI | 1 μl (25 pmol) |
| Primer
DH5RevEcoRV | 1 μl (25 pmol) |
| Nukleotide
(10 mM pro Nukleotid) | 1 μl |
| 10×Puffer
Qiagen | 2,5 μl |
| Q-Solution | 5 μl |
| Proofstart
Polymerase Qiagen | 2 μl (5u) |
| H2O | 13 μl |
-
PCR-Bedingungen
-
- Gerät: MJ Research,
PTC-225
| 95 °C | 5
min |
| 94 °C | 1
min |
| 60 °C | 1
min, 35× |
| 72 °C | 2
min 30 sec |
| 72 °C | 5
min |
| 10 °C | unbeschränkt |
-
Das
1959 by große
PCR-Fragment wurde EcoRI/EcoRV in den Vektor Litmus28 (Evans et
al., 1995, BioTechniques 19, 130-135) kloniert. Das erhaltene Plasmidkonstrukt
wurde Lit28dh5 bezeichnet.
-
– Klonierung des DH3'-Fragments
-
Primer:
-
- DH3ForEcoRV: 5' – CAGTGCGATATCCGCAACTACACCCATCTG – 3'
- DH3RevXbaI: 5' – AGGAGTTCTAGACGCTCGGCAACCTCAACC – 3'
-
- PCR-Ansatz:
| DNA
Cosmid 2924-4L08 | 0,5 μl (ca. 0,2 μg) |
| Primer
DH3ForEcoRV | 1 μl (25 pmol) |
| Primer
DH3RevXbaI | 1 μl (25 pmol) |
| Nukleotide
(10 mM pro Nukleotid) | 1 μl |
| 10×Puffer
Qiagen | 2,5 μl |
| Q-Solution | 5 μl |
| Proofstart
Polymerase Qiagen | 2 μl (5u) |
| H2O | 12 μl |
-
PCR-Bedingungen s.o.
-
Das
2110 bp große
PCR-Fragment wurde XbaI/EcoRV in Lit28dh5 (s.o.) kloniert. Das entstandene Plasmid
wurde Lit28deltadh bezeichnet.
-
– Klonierung
der Kanamycin-Resistenzgenkassette aphII
-
Primer:
-
- aphIIForEcoRV: 5' – CCACCAGATATCCAGGCGGTAACCGGCCTC – 3'
- aphIIRevEcoRV: 5' – GCATGCGATATCCACGCTGCCGCAAGCAC – 3'
-
- PCR-Ansatz:
| DNA
pGM9 | 0,5 μl (ca. 0,2 μg) |
| Primer
aphIIForEcoRV | 1 μl (25 pmol) |
| Primer
aphIIRevEcoRV | 1 μl (25 pmol) |
| Nukleotide
(10 mM pro Nukleotid) | 1 μl |
| 5× Puffer
Roche | 5 μl |
| Proofstart
Tgo Roche | 1 μl (1u) |
| H2O | 15,5 μl |
-
PCR-Bedingungen
-
- Gerät: MJ Research,
PTC-225
| 60 °C | 1
min 35× |
| 72 °C | 2
min |
| 72 °C | 5
min |
| 10 °C | unbeschränkt |
-
Das
1746 bp große
PCR-Fragment wurde EcoRV gespalten und in das ebenso geschnittene
Plasmid Lit28deltadh kloniert. Dabei entstand das Plasmid Lit28GRdhasense.
-
– Konstruktion eines neuen
Apramycin-Resistenzgen (aacC4)-tragenden, mobilisierbaren Inaktivierungsvektors
-
Der
Transfer genetischer Information nach Actinomyceten ist mit Hilfe
der intergenerischen Konjugation von E. coli möglich (Kieser et al., 2000,
Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England).
Voraussetzung ist hier ein IncP-Plasmid enthaltender E. coli- Donor-Stamm, wie z.B. ET12567(pUB307)
[McNeil et al., 1992, Gene 111, 61-68], der gleichzeitig ein oriT-tragendes
und daher mobilisierbares Plasmid enthält, das im Verlaufe der Konjugation
durch das IncP-Plasmid nach Actinomyceten mobilisiert werden kann.
Ein solcher für
Inaktivierungsexperimente häufig
eingesetzter Grundvektor ist der Vektor pK18mob (Schäfer et al.,
1994, Gene, 145, 69-73). Dieser Vektor enthält das Kanamycin-Resistenzgen
aphII. Zur Erzeugung eines alternativen Vektors wurde das aphII
Resistenzgen gegen das Apramycin-Resistenzgen aacC4 ausgetauscht.
Durch eine BglII/BstBI Spaltung von pK18mob wurde das aphII-Gen
entfernt. Beide Schnittstellen wurden mit Hilfe einer Klenow-Behandlung
aufgefüllt.
In diese "blunt
end"-Schnittstellen
wurde das Apramycin-Resistenzgen aacC4 inseriert. Dazu wurde dieses
Gen zuvor als 1721 bp großes HindIII-Fragment
des Ωaac
Fragments (Blondelet-Rouault et al., 1997, 190, 315-317) isoliert
und Klenow behandelt. Der neu entstandene Inaktivierungsvektor wurde
p18mob2 bezeichnet.
-
– Klonierung der efoK-Genaustausch-
und in frame Deletionsplasmide p18mobGRdh und p18mobdeltadh
-
Die
Inserts aus Lit28GRdhasense und Lit28deltadh wurden mit EcoRI/XbaI
isoliert und in einen ebenso gespaltenen Vektor p18mob2 (s.o.) kloniert.
Das so erhaltene efoK-Genaustauschplasmid
wurde p18mobGRdh und das efoK in frame Deletionsplasmid wurde p18mobdeltadh
bezeichnet (12).
-
2. Transfer der efoK-Genaustausch-
und in frame Deletionsplasmide p18mobGRdh und p18mobdeltadh nach CB2924
und Erzeugung der entsprechenden Mutanten
-
– Herstellung der efoK-Genaustauschmutante
CB3785
-
Das
Genaustauschplasmid pmobGRdh wurde mit Hilfe der intergenerischen
Konjugation von E. coli nach S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus
CB2924 transferiert (Standard-Methode siehe: Kieser et al., 2000,
Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England).
Das eingesetzte Genaustauschplasmid p18mobGRdh ist in Aktinomyceten
nicht replikativ. Es besteht allerdings die Möglichkeit, dass das Plasmid über eine
der beiden chromosomalen DNA-Fragmente (Dh5' bzw. Dh3' Fragment, s.o.) ins Chromosom mit Hilfe
der homologen Rekombination integriert (einfach cross-over). Findet
eine doppeltes Rekombinationsereignis (doppel cross-over) zwischen
beiden homologen Bereichen statt, führt dies zu einem Genaustausch,
was die Insertion der defekten von einem Kanamycin-Resistenzgen
aphII unterbrochenen Kopie des efoK-Gens zur Folge hat (12).
Beide Rekombinationsereignisse (single und doppel cross-over) können durch
den Einsatz der Selektionsmarker unterschieden werden.
-
Zunächst wurde
der Transkonjugationsansatz mit 1 mg Kanamycin (selektioniert auf
Anwesenheit des aphII-Resistenzgens,
das nach single und doppel cross-over vorhanden sein sollte) und
1 mg Phosphomycin (tötet
die im Transkonjugationsansatz vorhandenen unerwünschten E. coli Donoren ab) überschichtet.
Nach 4 – 6
d Inkubation bei 28 °C
wurden Transkonjuganden sichtbar. In zwei unabhängigen Konjugationsansätzen wurden
insgesamt 7 Kanamycin-resistente
(50 μg/ml)
Transkonjuganden erhalten. Durch eine weitere Selektion auf Anwesenheit
des Apramycin-Resistenzgenmarkers
aacC4 (25 μg/ml)
des Genaustauschsplasmids p18mobGRdh kann zwischen den Rekombinationsereignissen "Integration des Genaustauschplasmids über einfach
cross-over (Kanamycin und Apramycin resistent) bzw. Genaustausch über doppel
cross-over (Kanamycin-resistent
und Apramycin sensitiv, 12) unterschieden
werden. von den 7 Transkonjuganden erwies sich ein Klon als Apramycin-sensitiv
und Kanamycin-resistent, was auf ein doppel-over Ereignis hindeutet.
Mit Hilfe der PCR wurde der korrekte Genaustausch nachgewiesen.
Die efoK-Genaustausch-Mutante
wurde mit CB3785 bezeichnet.
-
– Herstellung der efoK in frame
Deletionsmutante CB3786
-
Ausgehend
von der efoK Genaustauschmutante CB3785 wurde mit Hilfe des in frame
Deletionsplasmids p18mobdeltadh die efoK in frame Deletionsmutante
CB3786 hergestellt (12). Dazu wurde p18mobGRdh mittels
intergenerischer Konjugation nach CB3785 transferiert (Methode s.o).
Durch Selektion auf den Plasmidmarker aacC4, der eine Apramycin-Resistenz vermittelt
(25 μg/ml),
wurden 3 Transkonjuganden erhalten, die aufgrund der gleichzeitigen
Anwesenheit der aphII-Resistenzgenkassette in CB3785 auch die entsprechende
Kanamycin-Resistenz aufwiesen. Das Resistenzmuster und auch ein
PCR-Nachweis bestätigten,
dass p18mobdeltadh in diesen Kolonien über ein einfach cross-over in das Efomycin-Biosynthesegencluster
integriert war. Um nun aus dieser p18mobdeltadh-Integrationsmutante
eine efoK in frame-Deletionsmutante zu erzeugen, muss das integrierte
Plasmid über
ein 2. cross-over derart aus dem Chromosom desintgrieren, dass das
durch die aphII-Resistenzgenkassette
unterbrochene efoK Gen aus CB3785 gegen die in frame deletierte
efoK-Kopie ausgetauscht wird. Bei dieser über homologe Rekombination
vermittelten Desintegration besteht allerdings auch die Möglichkeit,
dass das Plasmid p18mobdeltadh über
das Fragment rekombiniert, über
das es ursprünglich
integrierte. Ein solches Ereignis hätte die unerwünschte Widerherstellung der
efoK Genaustauschmutante CB3785 zur Folge, was phänotypisch
durch das Vorhandensein des Kanamycin-Resistenzgenmarkers aphII
nachzuweisen wäre.
Untersuchungen haben gezeigt, dass eine solches Desintegrationsereignis
durch Stressfaktoren wie Hitze und Ultraschall forciert werden kann
(Puk et al., 2002, Chem. & Biol.
9, 225-235). Aus diesem Grund wurde eine p18mobdeltadh-Integrationsmutante
folgendem Stressprotokoll unterzogen:
- – 2 d Anzucht
bei 28 °C
in 50 ml HA-Medium [Zusammensetzung pro 1 H2Obidest: 4g Bacto Yeast Extract (Becton Dickinson),
10 g Malt Extract (Becton Dickinson), 4 g Glucose-Monohydrat (Roth),
pH 7,3] ohne Antibiotikum
- – Überimpfen
von 1 ml Kultur in frisches Medium und 1 d Inkubation bei 37 °C
- – Nochmaliges Überimpfen
und 1 d Inkubation bei 37 °C
- – Abzentrifugieren
der Kultur (10 min, 5000 rpm) und Resuspendieren des Pellets in
10 ml HA
- – 15
min Ultraschallbehandlung
- – 2
h Inkubation bei 37 °C
- – 15
min Ultrschallbehandlung
- – Ausplattieren
von Verdünnungsreihen
(in HA) auf ISP4 [Zusammensetzung pro 1 H2Obidest: 37 g Difco ISP Medium 4 (Becton Dickinson)]
und Inkubation 6 – 8
d bei 28 °C
-
1248
Klone der Verdünnungsreihe
wurden parallel auf HA-Agar
und HA-Agar mit 50 μg/ml
Kanamycin gepickt und 3 – 4
d bei 28 °C
inkubiert. 2 Klone waren sowohl Kanamycin-, als auch Apramycin-sensitiv.
Mit Hilfe eines PCR-Experimentes
konnte bei beiden Kolonien das korrekte Desintegrationsereignis
nachgewiesen werden. Eine der beiden efoK in frame Deletionsmutanten
bekam die Bezeichnung CB3786.
-
3. Charakterisierung der
efoK-Genaustauschmutante CB3785 und efoK in frame Deletionsmutante
CB3786
-
Die
Inaktivierung des 2,3-Dehydratasegens sollte die Unterbrechung der
Biosynthese des Efomycin Desoxyzuckers 2-L-Desoxyfucose und somit
die Bildung des Efomycin-Aglykons
zur Folge haben. Um diese Annahme zu überprüfen, wurden die beiden efoK-Mutanten
unter Produktionsbedingungen fermentiert und nach Extraktion mit
Hilfe der LC-DAD-MS
analysiert.
-
Anzucht:
-
- – Vorkultur:
je 20 ml NL19D-Medium [Zusammensetzung pro 1 Leitungswasser: 20
g D (–)-Mannit,
20 g Soybean Flour TypI (not roasted), pH 7,5] wurden mit der Mutante
CB3785 (Zugabe von 50 μg/ml
Kanamycin) bzw. CB3786 angeimpft und für 72 h bei 28 °C inkubiert
- – Hauptkultur:
je 200 μl
der Vorkultur wurden auf SG-Platten
[Zusammensetzung pro 1 H2Obidest: 20 g Glucose-Monohydrat (Roth),
10 g Bacto Soytone (Becton Dickinson), 2 g CaCO3 (Roth), 1 mg Cobald(II)chlorid (Merck),
15 g Agar, pH 7,2] ausplattiert und für 96 h bei 28 °C inkubiert
-
Extraktion:
-
- – das
Festmedium der Hauptkultur wurde zerkleinert, mit 5ml Essigsäureethylester
extrahiert und die organische Phase zur Trockne eingeengt
- – Der
Rückstand
wurde in 80 μl
McOH aufgenommen und die Produktion potentieller Efomycin Derivate mittels
LC-DAD-MS untersucht. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl.
-
LC-DAD-MS-Analyse Gerätespezifikationen:
-
- HPLC: Waters Alliance 2790, Säule: Grom Sil 120 ODS-4HE,
3μm, Dim.
40×4 mm,
Vor-Säule:
Phenomenex C18 ODS, 4mm L × 3,0
mm ID,
- MS: Micromass Q-TOF 2, ausgestattet mit V-Optic
-
Gradientensystem:
-
Lösungsmittel
-
-
- A:
- Wasser mit 0.1% Ameisensäure
- B:
- Acetonitril
| Säulen Temperatur
(°C) |
30 |
| Säulen Temperatur
Limit (°C) |
10 |
| Proben
Temperatur (°C) |
4 |
| Proben
Temperatur Limit (°C) |
20 |
-
Ein
Lösungsmittel-Splitter
ist in das System integriert, mit dem etwa 1/3 der mobilen Phase
in das Massenspektrometer geleitet wird.
-
LC-DAD-MS-Analyse
der efoK-Genaustauschmutante CB3785 (14):
Die Analyse ergab, dass die Mutante CB3785 kein "Wildtyp"-Efomycin (ESI Masse negativ Modus:
m/z 1023) produziert, sondern als Hauptprodukt ein Efomycin-Derivat mit der Masse
764 amu (ESI negativ Modus: m/z 763), was der Masse des Efomycin
Aglykons mit OH-Gruppen in Position 13 des Hemiacetals entspricht.
Hierzu sieht man in der 14a folgende
Chromatogramme (von oben nach unten): Fokussiertes Base Peak Index
(BPI) DAD zwischen 245 und 260 nm. Gesamt BPI DAD; Fokussiertes
Ionenchromatogramm für
m/z 760-765; Fokussiertes Ionenchromatogramm für m/z 1020 bis 1025; Gesamt
MS Total Ion Current (TIC). Die Chromatogramme zeigen, dass im Unterschied
zum Wildtyp kein Efomycin-Derivat mit einem Massepeak von 1024 (ESI
negativ Modus: m/z 1023) produziert wird (s. z.B. 7),
sondern vielmehr ein Efomycin-Derivat der Masse 764 (ESI negativ
Modus: m/z 763) mit einem Efomycin-typischen UV-Spektrum bei einer
Retentionszeit um 5.0 min. Die aufsummierten Spektren in 14b beweisen ebenfalls, dass bei einer Retentionszeit
um 5.0 min keine signifikanten Mengen einer Substanz mit dem Efomycin-typischen
Massepeak von 1024 (ESI negativ Modus: m/z 1023) sondern ein Efomycin-Derivat
der Masse 764 amu (ESI negativ Modus: m/z 763) produziert wird.
Die Produktion des Efomycin Aglykons mit dem Massenpeak [M-H]– 763
in der efoK-Genaustauschmutante zeigt, dass das 2,3 Dehydratase-kodierende
efoK Gen essentiell für
die Biosynthese des Zuckers ist und dass unter diesen Bedingungen
kein anderes im Wildtyp vorhandenes Dehydratasegenprodukt die efoK-Funktion
ersetzen kann. Weiterhin scheint die Anwesenheit der aphII-Resistenzgenkassette
in efoK die Funktion der anderen Efomycin-Biosynthesegene nicht
zu beeinträchtigen.
-
LC-DAD-MS-Analyse
der efoK in frame Deletionsmutante CB3786 (15):
Auch die Analyse der Mutante CB3786 ergab, dass ebenfalls kein "Wildtyp"-Efomycin (ESI negativ
Modus: m/z 1023) produziert wird, sondern wie in CB3785 als Hauptprodukt
ein Efomycin-Derivat mit der charakteristischen Masse des Efomycin-Aglykons
(ESI negativ Modus: m/z 763 amu). Dementsprechend sieht man in der 15a folgende Chromatogramme (von oben nach unten):
Fokussiertes Base Peak Index (BPI) DAD zwischen 245 und 260 nm.
Gesamt BPI DAD; Fokussiertes Ionenchromatogramm für m/z 760-765;
Fokussiertes Ionenchromatogramm für m/z 1020 bis 1025; Gesamt
MS Total Ion Current (TIC). Die Chromatogramme zeigen, dass im Unterschied
zum Wildtyp kein Efomycin-Derivat mit einem Massepeak von 1024 (ESI
negativ Modus: m/z 1023) produziert wird (s. z.B. 7),
sondern vielmehr ein Efomycin-Derivat der Masse 764 (ESI negativ
Modus: m/z 763) mit einem Efomycin-typischen UV-Spektrum bei einer Retentionszeit um
5.0 min. Die aufsummierten Spektren in 15b beweisen
ebenfalls, dass bei einer Retentionszeit um 5.0 min keine signifikanten
Mengen einer Substanz mit dem Efomycin-typischen Massepeak von 1024
(ESI negativ Modus: m/z 1023), sondern vielmehr ein Efomycin-Derivat
der Masse 764 amu (ESI negativ Modus) produziert wird. Im Unterschied
zur Genaustauschmutante CB3785 besitzt die in frame Deletionsmutante
CB3786 kein heterologes Resistenzgen. Damit ist in dieser Mutante
der aphII-Resistenzmarker für
weitere Experimente erneut einsetzbar.
-
B. Inaktivierung des 3,5-Epimerasegen
efoF des Efomycin-Biosynthese-Clusters
zur Herstellung von Efomycin-Aglykon
synthetisierenden Mutanten
-
Zur
Herstellung alternativer Efomycin-Aglykonproduzierender Mutanten
wurde parallel zur efoK-Inaktivierung
mit dem 3,5-Epimerase kodierenden efoF Gen, ein zweites Desoxyzucker-Biosynthesegen
inaktiviert. Die prinzipielle Klonierungsstrategie und Vorgehensweise
wurde, wie unter A. beschrieben, durchgeführt. Zur Herstellung einer
efoF-Genaustauschmutante wurde ein Plasmidkonstrukt generiert, das
zum einen an efoF stromauf- und
abwärts
angrenzende DNA Fragmente enthält
und zum anderen ein efoF-Gen, das eine 159 bp Deletion aufweist,
die durch eine Kanamycin-Resistenzgenkassette aphII ersetzt wurde
(13). Auch dieses entsprechende Plasmidinsert wird
durch die Klonierung von 3 PCR-Fragmenten erzeugt, von denen das
eine den 5'-Bereich
(Epi5'-Fragment)
vor der Deletion und das andere den 3'-Bereich (Epi3'-Fragment) nach der Deletion umfasst
(13). Diese beiden PCR- Fragmente werden zunächst über eingeführte Restriktionsschnittstellen
gezielt fusioniert und anschließend
wird eine Kanamycin-Resistenzgenkassette aphII so amplifiziert,
dass sie aufgrund eingeführter
Schnittstellen zwischen beide Epi-Fragmente inseriert werden kann.
-
1. Klonierung der efoF-Genaustausch-
und in frame Deletionsplasmide:
-
– Klonierung des Epi5'-Fragments
-
Alle
Klonierungen und DNA-Modifikationen wurden wie unter Sambrook et
al., 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben, durchgeführt.
-
Primer:
-
- Epi5ForEcoRI: 5' – GACATAGAATTCGCGCTGAAGCCGCTCACG – 3'
- Epi5RevHindIII: 5' – GAGGAGAAGCTTGCTGACGCAGGTCACCATC – 3'
-
- PCR-Ansatz:
| DNA
Cosmid 2924-4L08 | 0,5 μ (ca. 0,2 μg) |
| Primer
Epi5ForEcoRI | 1 μl (25 pmol) |
| Primer
Epi5RevHindIII | 1 μl (25 pmol) |
| Nukleotide
(10 mM pro Nukleotid) | 1 μl |
| 10×Puffer
Qiagen | 2,5 μl |
| Q-Solution | 5 μl |
| Proofstart
Polymerase Qiagen | 2 μl (5u) |
| H2O | 12 μl |
-
PCR-Bedingungen
-
- Gerät: s.o.
| 60 °C | 1
min, 35× |
| 72 °C | 2
min 30 sec |
| 72 °C | 5
min |
| 10 °C | unbeschränkt |
-
Das
2068 bp große
PCR-Fragment wurde EcoRI/HindIII in den Vektor Litmus28 (Evans et
al., 1995, BioTechniques 19, 130-135) kloniert. Das erhaltene Plasmidkonstrukt
wurde Lit28epi5 bezeichnet.
-
– Klonierung des Epi3'-Fragments
-
Primer:
-
- Epi3ForHindIII: 5' – GCGGCCAAGCTTAACTCGGAGGAGTACAAC – 3'
- Epi3RevXbaI: 5' – GGCCACTCTAGACACTCCGAGGACGGTCAG – 3'
-
- PCR-Ansatz:
| DNA
Cosmid 2924-4L08 | 0,5 μl (ca. 0,2 μg) |
| Primer
Epi3ForHindIII | 1 μl (25 pmol) |
| Primer
Epi3RevXbaI | 1 μl (25 pmol) |
| Nukleotide
(10 mM pro Nukleotid) | 1 μl |
| 10×Puffer
Qiagen | 2,5 μl |
| Q-Solution | 5 μl |
| Proofstart
Polymerase Qiagen | 2 μl (5u) |
| H2O | 12 μl |
-
PCR-Bedingungen: s. Epi5'-Fragment
-
Das
2024 bp große
PCR-Fragment wurde XbaI/HindIII in Lit28epi5 (s.o.) kloniert. Das
entstandene Plasmid wurde Lit28deltaepi bezeichnet.
-
– Klonierung der Kanamycin-Resistenzgenkassette
aphII
-
Primer:
-
- aphIIForHindIII: 5'-CAGGTCAAGCTTCGGTAACCGGCCTCTTCATCG-3'
- aphIIRevHindIII: 5'-GCATGCAAGCTTCACGCTGCCGCAAGCAC-3'
-
- PCR-Ansatz:
| DNA
pGM9 | 0,5 μl (ca. 0,2 μg) |
| Primer
aphIIForHindIII | 1 μl (25 pmol) |
| Primer
aphIIRevHindIII | 1 μl (25 pmol) |
| Nukleotide
(10 mM pro Nukleotid) | 1 μl |
| 5× Puffer
Roche | 5 μl |
| Proofstart
Tgo Roche | 1 μl (1u) |
| H2O | 15,5 μl |
-
PCR-Bedingungen
-
- Gerät: s.o.
| 94 °C | 2
min |
| 94 °C | 1
min |
| 60 °C | 1
min, 35× |
| 72 °C | 2
min |
| 72 °C | 5
min |
| 10 °C | unbeschränkt |
-
Das
1742 bp große
PCR-Fragment wurde HindIII gespalten und in das ebenso geschnittene
Plasmid Lit28deltaepi kloniert. Dabei entstand das Plasmid Lit28GRepisense.
-
– Klonierung der efoF-Genaustausch-
und in frame Dele tionsplasmide p18mobGRepi und p18mobdeltaepi
-
Die
Inserts aus Lit28GRepisense und Lit28deltaepi wurden mit EcoRI/XbaI
isoliert und in einen ebenso gespaltenen Vektor p18mob2 (s.o.) kloniert.
Das so erhaltene efoF-Genaustauschplasmid
wurde p18mobGRepi und das efoF in frame Deletionsplasmid wurde p18mobdeltaepi
bezeichnet (13).
-
2. Transfer der efoF-Genaustausch-
und in frame Deletionsplasmide p18mobGRepi und p18mobdeltaepi nach CB2924
und Erzeugung der entsprechenden Mutanten
-
– Herstellung der efoF-Genaustauschmutante
CB3787
-
Das
Inaktivierungskonstrukt pKmobGRepisense wurde wie unter A2. beschrieben
nach CB2924 transferiert und selektioniert. In zwei unabhängigen Konjugationsansätzen wurden
insgesamt 4 Kanamycin-resistente Transkonjuganden erhalten. Einer
der Transkonjuganden erwies sich als Apramycinsensitiv und Kanamycin-resistent,
was auf ein doppel cross-over Ereignis hindeutet. Mit Hilfe der
PCR wurde der korrekte Genaustausch nachgewiesen. Die efoF-Genaustausch-Mutante wurde mit
CB3787 bezeichnet (13).
-
– Herstellung der efoF in frame
Deletionsmutante CB3788
-
Ausgehend
von der efoF Genaustauschmutante CB3787 wurde mit Hilfe des in frame
Deletionsplasmids p18mobGRepi die efoF in frame Deletionsmutante
CB3788 hergestellt (13). Dazu wurde das Plasmid
p18mobdeltaepi, wie unter A2. beschrieben, nach CB3787 transferiert
und selektioniert. Es wurde 1 Transkonjugand erhalten, der gleichzeitig
eine Apramycin-Resistenz (vermittelt durch den Plasmidmarker aacC4) und
Kanamycin-Resistenz (aphII-Resistenzgenkassette in CB3787) aufwies.
Das Resistenzmuster und auch ein PCR-Nachweis bestätigten, dass p18mobdeltaepi
in diesen Kolonien über
ein einfach cross-over in das Efomycin-Biosynthesegencluster integriert war.
Um nun aus dieser p18mobdeltaepi-Integrationsmutante eine efoF in
frame-Deletionsmutante
zu erzeugen, muss ebenfalls wie unter A2. beschrieben das integrierte
Plasmid über
ein .2. cross-over derart aus dem Chromosom desintgrieren, dass
das durch die aphII-Resistenzgenkassette unterbrochene efoF Gen
aus CB3787 gegen die in frame deletierte efoF-Kopie ausgetauscht
wird. Um dieses Ereignis zu forcieren, wurde auch diese Integrationsmutante
einem Stressprotokoll ausgesetzt (s. A2.) Insgesamt wurden nach
Stressbehandlung 1920 Klone parallel auf HA-Agar und HA-Agar mit
50 μg/ml Kanamycin
gepickt und 3 – 4
d bei 28 °C
inkubiert. 3 Kolonien waren sowohl Kanamycin-, als auch Apramycin-sensitiv.
Mit Hilfe eines PCR-Experimentes konnte das korrekte Desintegrationsereignis
in einer dieser Mutanten nachgewiesen werden. Diese efoF in frame
Deletionsmutante bekam die Bezeichnung CB3788.
-
3. Charakterisierung der
efoF-Genaustauschmutante CB3787 und efoF in frame Deletionsmutante
CB3788
-
Auch
die Inaktivierung des späten
3,5-Epimerasegens (s. 3) sollte die Unterbrechung
der Biosynthese des Efomycin Desoxyzuckers 2-L-Desoxyfucose und
somit die Bildung des Efomycin-Aglykons zur Folge haben. Um diese
Annahme zu überprüfen, wurden
die beiden efoF-Mutanten unter Produktionsbedingungen fermentiert
und nach Extraktion mit Hilfe der LC-DAD-MS analysiert (Durchführung und
Bedingungen analog zu A3.).
-
LC-DAD-MS-Analyse
der efoF-Genaustauschmutante CB3787 (16):
Die Analyse ergab, dass auch die 3,5-Epimerase-Mutante CB3787, wie
schon zuvor beide 2,3-Dehydratasemutanten CB3585 und CB3586, kein "Wildtyp"-Efomycin (ESI negativ Modus: m/z 1023)
produziert, sondern als Hauptprodukt ein Efomycin-Derivat mit der
Masse 764 amu (ESI negativ Modus: m/z 763). Hierzu sieht man in
der 16a folgende Chromatogramme
(von oben nach unten): Fokussiertes Base Peak Index (BPI) DAD zwischen
245 und 260 nm. Gesamt BPI DAD; Fokussiertes Ionenchromatogramm
für m/z
760-765; Fokussiertes Ionenchromatogramm für m/z 1020 bis 1025; Gesamt
MS Total Ion Current (TIC). Die Chromatogramme zeigen, dass im Unterschied
zum Wildtyp kein Efomycin-Derivat mit einem Massepeak von 1024 (ESI
negativ Modus: m/z 1023) produziert wird (s. z.B. 7),
sondern vielmehr ein Efomycin-Derivat der Masse 763 (ESI negativ
Modus) mit einem Efomycin-typischen UV-Spektrum bei einer Retentionszeit
um 5.0 min. Die aufsummierten Spektren in 16a beweisen
ebenfalls, dass bei einer Retentionszeit um 5.0 min keine signifikanten
Mengen einer Substanz mit dem Efomycin-typischen Massepeak von 1024
(ESI negativ Modus: m/z 1023) sondern ein Efomycin-Derivat der Masse
764 amu (ESI negativ Modus: m/z 763) produziert wird. Die Produktion
des Efomycin Aglykons mit der Masse [M-H]– 763
in der efoF-Genaustauschmutante zeigt, dass auch 3,5 Epimerase-kodierende
efoF Gen essentiell für
die Biosynthese des Zuckers ist und dass unter diesen Bedingungen kein
anderes im Wildtyp vorhandenes Genprodukt die efoF-Funktion ersetzen
kann.
-
LC-DAD-MS-Analyse
der efoF in frame Deletionsmutante CB3788 (17):
Auch die Analyse der Mutante CB3788 ergab, dass ebenfalls kein "Wildtyp"-Efomycin (ESI negativ
Modus: m/z 1023) produziert wird, sondern wie in den Mutanten CB3785,
CB3786 und CB3787 als Hauptprodukt ein Efomycin-Derivat mit der charakteristischen
Masse des Efomycin-Aglykons (ESI negativ Modus: m/z 763). Dementsprechend
sieht man in der 17a folgende Chromatogramme
(von oben nach unten): Fokussiertes Base Peak Index (BPI) DAD zwischen
245 und 260 nm. Gesamt BPI DAD; Fokussiertes Ionenchromatogramm
für m/z
760-765; Fokussiertes Ionenchromatogramm für m/z 1020 bis 1025; Gesamt
MS Total Ion Current (TIC). Die Chromatogramme zeigen, dass im Unterschied
zum Wildtyp kein Efomycin-Derivat mit einem Massepeak von 1024 (ESI
negativ Modus: m/z 1023) produziert wird (s. z.B. 7),
sondern vielmehr ein Efomycin-Derivat der Masse 764 (ESI negativ
Modus: m/z 763) mit einem Efomycin-typischen UV-Spektrum bei einer
Retentionszeit um 5.0 min. Die aufsummierten Spektren in 17a beweisen ebenfalls, dass bei einer Retentionszeit
um 5.0 min keine signifikanten Mengen einer Substanz mit dem Efomycin-typischen
Massepeak von 1024 (ESI negativ Modus: m/z 1023), sondern vielmehr
ein Efomycin-Derivat der Masse 764 amu (ESI negativ Modus: m/z 763)
produziert wird.
-
Alle
generierten efoK und efoF-Mutanten können zur Produktion und Isolierung
des zur weiteren Derivatisierung geeigneten Efomycin-Aglykons eingesetzt
werden.
-
Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.