Polymorphismen
in Genen des Arzneimittelmetabolismus stehen mit dem Fortschritt
bei der Erforschung der Beziehungen zwischen genetischer Diversität und Arzneimittelunverträglichkeiten
im Mittelpunkt des Interesses. Das gilt im besonderen für bestimmte
Einzelnukleotidpolymorphismen („single nucleotide polymorphisms"-SNP's)
an Genen des sogenannten Biotransformationssystems. Ein großer Teil
der heute verwendeten Medikamente, vor allem solche mit lipophilem
Charakter, werden von den Enzymen der Phase I des Biotransformationssystems,
den Cytochrom P450 Enzymen, metabolisiert [Gonzales, F. J., Pharmacological Reviews
40, (1989) 243-288;
Guengerich et al., Journal of Biological Chemistry 266 (1991) 10019-10022].
Als Folge dieser enzymatischen Reaktionen werden je nach chemischer
Struktur des Medikaments, nach Art und Genotyp des Cytochrom P450
Isoenzyms oder infolge nachgeschalteter sogenannter Phase II Enzyme
(NAT I u. II, GSTM u. a.) [Brockmüller et al. Toxicology Letters
102-103 (1998) 173-183] die Medikamente entweder physiologisch aktiviert,
oder sie werden inaktiviert und zur Ausscheidung vorbereitet. Polymorphismen
an diesen Genen sind in der Bevölkerung
relativ weit verbreitet und führen
zu erheblichen individuellen Unterschieden in den Umsatzraten der
betroffenen Arzneimittel. In der Konsequenz können je nach Medikament und
Allel individuelle Über-
oder Unterdosierungen die Folge sein. Es können sich unerwünschte Nebenwirkungen
einstellen, oder aber eine Wirkung kann ganz ausbleiben [Wormhoudt
et al. Critical Reviews in Toxicology 29 (1999) 59-124; Ingelman-Sundberg M. Toxicology
Letters 102-103 (1998) 155-160]. Die genaue Kenntnis der genetischen
Prädisposition
eines Patienten zu solcherart verändertem Arzneimittelstoffwechsel
ist dementsprechend für
seine individuelle Arzneimitteltherapie von entscheidender Bedeutung.
Als Folge konsequenter Genotypisierung von Patienten mit erhöhtem Risiko
(z.B. von chronisch kranken Patienten, oder von solchen mit einer
entsprechenden Familienanamnese) sind erheblich verminderte Nebenwirkungsrisiken,
Kosteneinsparungen, aber auch völlig
neuartige Medikationsstrategien denkbar. Praktische Voraussetzung
für eine
konsequente Genotypisierung vieler einzelner Patienten ist jedoch
ein kostengünstiges
und zuverlässiges
Genotypisierungsverfahren.
Die
Cytochrom P450 Enzyme werden artübergreifend
anhand ihrer Aminosäuresequenzhomologie
in Familien (Homologie >40% – bezeichnet
mit einer arabischen Ziffer) und Subfamilien (Homologie >55% – bezeichnet
mit einem Großbuchstaben)
unterteilt. Zum Beispiel ist CYP2C9 ein Cytochrom der Familie 2,
Subfamilie C, Isoform Nr. 9 [Nelson et al. Pharmacogenetics 6 (1996)
1-42]. Die zum Teil extrem hohe Sequenzhomologie bei Genen einer
Subfamilie muß bei
der Entwicklung von Genotypisierungsverfahren, die auf einer Amplifikation
von Genteilsequenzen beruhen, denn auch vorrangig berücksichtigt
werden. So sind die Pseudogene CYP2D7 und CYP2D8 zu >90% identisch mit CYP2D6.
Ein sicherer Nachweis einzelner Allele setzt somit eine sichere
Differenzierung der homologen Gene (Isoformen) voraus. Technisch
ist dies durch diskriminierende PCR Amplifikationsverfahren möglich.
Zu
den am besten charakterisierten und für den Arzneimittelmetabolismus
bedeutendsten Cytochromen gehören
CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 und CYP3A4 mit ihren diversen Allelvarianten.
[Zu Übersicht
und neuestem Stand der bekannten Polymorphismen menschlicher Cytochrom
P450 Enzyme siehe [http://www.imm.ki.se/CYPalleles/]. Diese vier
Isoenzyme zusammen setzen nach Schätzungen von Experten mehr als
zwei Drittel aller wirksamen Bestandteile der heute gängigen Medikamente
um. [Eine übersichtliche Zusammenstellung
der umgesetzten Pharmazeutika findet sich unter [http://medicine.iupui.edu/flockhart/].
Wie in Tabelle 1 dargestellt ist, sind in der kaukasischen Bevölkerung
die Allele CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4, 2D6*5,
2D6*6 sowie weitere, weniger gut untersuchte Allele von CYP2D6 von
größter Bedeutung
[Wormhoudt et al. Critical Reviews in Toxicolgy 29 (1999) 59-124;
Ingelman-Sundberg M. Toxicology Letters 102-103 (1998) 155-160;
Marez et al. Pharmacogenetics 7 (1997) 193-202; De Morais et al.
Mol. Pharmacol. 46 (1994) 594-598; Sachse et al. Am. J. Hum. Genet.
60 (1997) 284-295; Wrighton SA and Stevens JC. Crit. Rev. Toxicol.
22 (1992) 1-21; Cholerton et al. Trends Pharmacol. Sci. 13 (1992)
434-439; Saxena et al. Hum. Mol. Genet. 3 (1994) 923-926; Steen
et al. Hum. Mol. Genet. 4 (1995) 2251-2257].
Tabelle
1 Wichtige
allele Varianten humaner Cytochrom P450 Isoenzyme, ihre Enzymaktivität und ihre
Häufigkeit
(%) in der kaukasischen Bevölkerung
Die
klinische Relevanz der allelen Varianten von CYP3A4 ist zur Zeit
Gegenstand intensiver Forschung [Eiselt et al. Pharmacogenetics
11 (2001) 447-458; Kuehl et al. Nature Genetics 27 (2001) 383-391; Westlind
et al. Biochem. Biophys. Res. Comun. 259 (1999) 201-205].
Der
Nachweis alleler Varianten der am Arzneimittelmetabolismus beteiligten
Cytochrom P450 Isoenzyme erfolgte anfänglich mit Hilfe des Sequenzvergleichs
entsprechender isolierter cDNA's,
oder durch direkte Sequenzierung von aus genomischer DNA gewonnenen
PCR Fragmenten [Sullivan-Klose et al. Pharmacogenetics 6 (1996)
341-349 ; Wang et al. Pharmacogenetics 5 (1995) 37-42; Inoue et
al. Jpn. J. Hum. Genet. 39 (1994) 337-343]. Durch heterologe Expression
vorsequenzierter oder modifizierter cDNA's in geeigneten Systemen und anschließende in
vitro Charakterisierung konnte dann oft ein Zusammenhang zum Arzneimittelmetabolismus
belegt werden [Haining et al. Arch. Biochem. Biophys. 333 (1996)
447-458]. Ein weiteres Verfahren zur Identifikation neuer SNP's – das SSCP
(„single
strand conformational polymorphisms") Verfahren – nutzt die sequenzabhängig unterschiedliche
Mobilität
von einzelsträngigen
PCR Produkten in Harnstoff-Polyacrylamidgelen
zum Nachweis von Mutationen [Stubbins et al. Pharmacogenetics 6
(1996) 429-439; Daly et al. Methods Enzymol. 272 (1996) 199-210].
Das
zur Zeit neben der Sequenzierung am häufigsten genutzte Verfahren
zum Nachweis von SNP's ist
die „Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus" (RFLP) Analyse [Sullivan
et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 341-349; Wang et al. Pharmacogenetics
5 (1995) 37-42]. Durch Einführung
der MADGE (microplate array diagonal gel electrophoresis) Technologie
[Day and Humphries Anal. Biochem. 222 (1994) 389-395] wurde es möglich, RFLP
oder ARMS (amplification refractory mutation system) [Newton et
al. Nucleic Acid Res. 17 (1989) 2503-2516) im 96 Kammer (96 well)
Format durchzuführen.
Ein in der Vergangenheit oft eingesetztes Verfahren für den Nachweis
von SNP's ist der
sogenannte „Southern
blot". Eine Weiterentwicklung
dieses Prinzips sind die zur Zeit noch in der Entwicklung befindlichen „Microarray" Gen Chip Verfahren.
Beide Verfahren beruhen auf einer allelspezifischen Hybridisierungsreaktion
an immobilisierten PCR Fragmenten, oder Detektionssonden. Im Falle
des „Microarray" Verfahrens sind
die Areale der Hybridisierung durch spezielle Belegungsverfahren
zum Teil nur wenige nm im Durchmesser. Ein anderes, zunehmend eingesetztes,
Verfahren zum Nachweis von SNP's
macht von der „matrix-assisted
laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry" (MALDI/TOF-MS) Gebrauch.
Dieses Verfahren setzt jedoch ebenfalls eine isoformspezifische
PCR, eine anschließende
Aufreinigung und den Allelnachweis mittels z.B. hybridisierter,
synthetischer Oligonukleotide und den nachfolgenden, allelspezifischen
Einbau zusätzlicher
Nukleotide durch eine DNA Polymerase voraus. Das Sequenzierverfahren
ist vergleichsweise sehr aufwendig und insbesondere für die Identifizierung neuer
SNP's geeignet.
Es erfaßt
aber weder Duplikationen noch Deletionen kompletter Gene. Das SSCP
Verfahren kann zwar beides erfassen und ist daher für die frühe Identifikation
von SNP's das Verfahren
der Wahl, erfordert jedoch ebenfalls einen hohen Arbeitsaufwand,
bzw. einen hohen Automatisierungsgrad und verursacht somit hohe
Kosten. Das RFLP Verfahren macht oft mangels geeigneter Restriktionsorte
den Austausch zusätzlicher
Nukleotide in der Umgebung der alleldeterminierenden Position mittels
PCR nötig.
Auch ist der Verdau in einigen Fällen
nur unvollständig
und erfordert eine zusätzliche
Validierung mittels Positivkontrolle bzw. Kreuzvergleich mit anderen
Allelen. Die auf der allelspezifischen Hybridisierung aufbauenden
Verfahren (TagManTM; DashTM;
GeneChip®;
Code LinkTM) stellen eine echte Alternative
für den
Nachweis bekannter SNP's dar.
Im Falle der „Microarray" (GeneChip®;
Code LinkTM) Technologie entsteht jedoch
ein besonderes Problem aus dem Anspruch dieser Technologieplattform,
große
Mengen an Sequenzdaten von nur einem Chip zu erhalten. Mit der Menge
steigt die Schwierigkeit, ein gemeinsames Regime für alle auf
dem Chip nachzuweisenden Allele zu etablieren. Es werden umfangreiche
Kontrollen sowie aufwendige und komplizierte Auswertesysteme erforderlich
und somit steigen die Kosten. Für
die klinische Diagnostik, sowie für klinische Studien mit vordefinierten,
eingegrenzten, objektspezifischen Allelen bietet sich somit eher
ein sogenannter „low
density Chip" in
Form eines Glasobjekträgers
mit 32 bis maximal 384 möglichen
spezifischen Arealen (spots) an.
Zur
Zeit werden Komplettlösungen
für den
Nachweis von SNP's
in Arzneimittel metabolisierenden Genen nur von wenigen Firmen angeboten:
- • TagMan
Technologie (Applied Biosystems) – Prinzip: Fluoreszenzdetektion
mittels mittelständiger
Hybridisierungssonde. Der Nachweis des Allels geschieht über die
5'-3' Exonucleaseaktivität einer
DNA Polymerase, welche an perfekt passenden Primern gequenchte 5'endständige Fluorophore
(FAM und VICTM) freisetzt. Fehlgepaarte
Primer werden von der DNA Polymerase unter den gewählten Bedingungen
vollständig intakt
(also gequencht) freigesetzt, während
richtig gepaarte Primer im ungequenchten, fluoreszierenden Zustand
freigesetzt werden. Für
CYP2C9*2 und *3; CYP2C19*2 und *3; CYP2D6 *3, *4, *6, *7 und *8
wird je ein kompletter Kit angeboten. Voraussetzung für den Einsatz
dieser Technologie ist jedoch die Anschaffung eines TagMan Gerätes, sowie
der dazugehörigen
Zusatzausrüstung.
- • Der
GeneChip CYP450 Assay (Affimetrix) beruht auf einer Hybridisierungsreaktion
von allelspezifischen, endständig
auf einem „Microarray
Chip" immobilisierten
Sonden mit Fluorophor markierten Amplikons. Das markierte Amplikon
leitet sich aus einer vorgeschalteten Multiplex PCR ab, die über intronlokalisierte
Primer eine isoformspezifische Amplifikation gewährleisten soll. Angeboten werden
CYP2C9 *2 und *3, sowie 10 Allele des Gens CYP2D6 (von Exon 1-9)
als Komplettansätze.
Voraussetzung für
den Einsatz dieser Technologie ist jedoch die Anschaffung des sehr
kostenintensiven GeneChip Instrument Systems, sowie der dazugehörigen GeneChips,
Reagenzien – und
Primer Kits.
- • Das
Code LinkTM P450 Verfahren (Motorola) basiert
auf demselben Nachweisprinzip wie der Affimetrix Chip, setzt jedoch
den Nachweis von 75 CYP450 SNPs (CYP2D6, -2C19, -1A1,1-A2, -2E1,
-3A4 und -1B1) auf einem Glasobjektträger um. Es erfordert ebenfalls
die zusätzliche
Anschaffung der sehr kostenintensiven Instrumentierung sowie natürlich der
dazugehörigen
Reagenzien und Primer Kits.
- • Der
Pharm-O-Kin Chip von GenScan Diagnostics ist ein Genchip auf der
Basis eines Glasobjektträgers und
weist 36 SNP's verschiedene
P450 Isoenzyme sowie andere für
den Arzneimitteltransport relevante Gene nach (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19,
sowie NAT2 und MDR1).
Andere
Systeme sind prinzipiell ebenfalls geeignet, Polymorphismen an Arzneimittel
metabolisierenden Genen nachzuweisen. Die Oligonukleotidprimer für die PCR
und/oder die Alleldetektion mit den dazugehörigen Reportersystemen müssen jedoch
vom Anwender gesondert entwickelt werden. Solche Systeme sind:
- • das
DASHTM System von Hybaid, beruhend auf der
Immobilisierung einzelsträngiger
Amplikons auf SA-MTP und anschließender kinetischer Analyse
der Schmelzpunkterniedrigung allelspezifischer Hybridisierungssonden.
Als Reportersystem wird dabei der interkalierende Fluorophor SYBR
GreenTM verwendet. Voraussetzung ist die
Anschaffung eines relativ kostenintensiven DASHTM Gerätes,
- • das
Pyrosequencing System von Pyrosequencing. Bei diesem Verfahren werden
in einzelsträngig
vorgelegte PCR Produkte, beginnend an einem spezifischen Primer,
Einzelnukleotide sequentiell eingebaut. Der erfolgreiche Einbau
eines Nukleotides wird dabei über
eine Sulfurylase – Luciferase
vermittelte Lichtemissionsreaktion detektiert. Überschüssiges Nukleotid wird vor der
Zugabe eines weiteren Nukleotids durch Apyraseaktivität abgebaut.
Durch sequentiellen Durchlauf aller Nukleotide wird somit ein kurzes
bis mittel langes Sequenzieren in 96 well Platten realisiert. Die
Technologie setzt die Anschaffung eines eigens für diesen Zweck entwickelten
Gerätes,
sowie der benötigten
Reagenziencocktails voraus und ist daher vergleichsweise kostenintensiv
und nur beschränkt
einsetzbar,
- • das
SNP-IT System von Orchid stellt ein Gerätesystem dar, daß explizit
für den
Mittel- bis Hochdurchsatz von SNP-Nachweisen an PCR Amplikons entwickelt
wurde. Es besteht im wesentlichen aus einem Roboter, welcher automatisch
die Aufarbeitung der Proben, den Nachweis der Allele (dafür sind unterschiedlichste Technologien
wie Gene Chip Hybridisierungsassay, Sequenzierung etc. integrierbar)
und die Datenanalyse (nebst Statistik) leisten soll. Für diese
aufwendigen Geräte
sind die Anschaffungskosten entsprechend hoch.
- • das
SureScoreTM System von Invitrogen ist ein
auf 96 well Platten basierendes SNP Nachweissystem. Basistechnologie
ist der spezifische Einbau markierter (Biotin bzw. FITC) Didesoxynukleotide
an einer einzelstängigen,
komplementären
PCR Produktmatrix durch eine DNA Polymerase an der SNP Position.
Der anschließende
Nachweis geschieht durch einen markerspezifischen Antikörper, der über eine
gekoppeltes Enzym eine Farbreaktion katalysiert.
Die
Entwicklung von zuverlässigen
Genotypisierungsverfahren, die durch geringen Zeit- und Geräteaufwand
und relativ niedrige Kosten gekennzeichnet sind, ist dringend geboten,
um eine intensivere klinische Erforschung der Zusammenhänge zwischen
Arzneimittelstoffwechsel und Genotyp der beteiligter Enzyme und die
Entwicklung hochgradig zuverlässiger
und zugleich kostengünstiger,
diagnostischer Verfahren zu ermöglichen.
Aus
der Erfindung DE 102 37 691.3-41 ergab sich nach weiterer Entwicklung
der Multiplexverfahren das Problem der relativ geringen Diskriminierung
bestimmter SNP spezifischer Basenfehlpaarungen in Abhängigkeit
zum umliegenden Sequenzkontext. Bei einigen Allelnachweisen war
daher eine Multiplex-Detektionsreaktion (der paralelle Nachweis
mehrerer Allele in einem Ansatz unter einem Regime) nur mit entsprechend schlechtem
Signal/Rauschverhältnis
realisierbar, was zu einer diagnostischen Unsicherheit beim Nachweis des
betreffenden Allels führte.
Zu diesem Zwecke wurde die bereits mehrfach aufgrund ihrer hohen
Diskriminierung und gleichzeitigen Unabhängikeit vom Sequenzkontext
beschriebene Ligase Detektions Reaktion (LDR) mittels thermostabiler
Taq Ligase [Barani, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, (1991)189-193]
für den
CYP SNP Nachweis angepaßt.
Gleichzeitig konnte dieser Nachweisschritt mit einer allelspezifischen
5' Markierung des
3' FITC markierten
Ligationsprodukts gekoppelt werden. Die so entstehenden, mit einer
allspezifischen, am 5' Ende
liegenden, ZIP Code Sequenz von 24 Basenpaaren ausgestatteten, Ligationsprodukte
konnten in der Folge erfolgreich in einem Regime und Ansatz an 3'-Biotin markierte, revers komplementäre Oligonukleotide
hybridisiert werden. Diese waren vorher definiert an Steptavidin
vorbeschichtete PC-Chips immobilisiert worden und erlauben somit
durch nachgeschaltete Waschung und Fluoreszenz bzw. gekoppelte kolorimetrische
Detektion eine eindeutige und hochgradig diskriminierende Identifikation
der nachzuweisenden CYP Allele.
Der
Erfindung liegt demzufolge die Aufgabe zugrunde, ein solches Verfahren
zu entwickeln und gleichzeitig ein Testkit zur Durchführung des
Verfahrens zur Verfügung
zu stellen
Die
Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Sie betrifft ein vereinfachtes Verfahren zum Nachweis von SNP in
CYP-Genen des Menschen und einen Test Kit mit folgenden Komponenten:
- 1. Neu entwickelte synthetische Oligonukleotide,
vorzugsweise Oligonukleotide der Anlage 1, die geeignet sind, Genabschnitte
in Genen des Arzneimittelmetabolismus mit Hilfe der „DNA Polymerase
chain reaction" Technologie
(PCR) isoformspezifisch (IS-PCR) aus genomischer Leukozyten-DNA
zu amplifizieren,
- 2. Komponenten, die es ermöglichen,
einzelsträngig
biotinierte IS-PCR Produkte auf Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten
(SA-MTP) selektiv, thermostabil und einzelsträngig zu immobilisieren,
- 3. testoptimierte, allelspezifische, Fluoresceinisothiocyanat
(FITC) markierte, synthetische Oligonukleotide, vorzugsweise Oligonukleotide
der Anlage 1, die entweder durch Hybridisierung, oder alternativ
dazu durch diskriminierende Verlängerung
einzelsträngiger
PCR Produkte mittels Taq-Polymeraseaktivität, nachfolgende
stringente Waschung und anschließende Detektion mittels Fluorometrie
bzw. Photometrie eine sichere Genotypisierung der hybridisierten
Amplikons gewährleisten,
oder
- 4. alternativ zu SA-MTP's – aus Streptavidin
beschichteten Glasobjektträgern
(SA-Chip) auf denen biotinierte, isoformspezifische, synthetische
Oligonukleotide immobilisiert sind, welche mit partiell einzelsträngigen PCR
Produkten hybridisiert werden, die durch diskriminierende Verlängerung eines
allelspezifischen, endständig
FITC markierten Oligonukleotides mittels Taq DNA Polymerase erzeugt
wurden und durch nachfolgende stringente Waschung und anschließende Detektion
mittels Fluorometrie bzw. Photometrie eine sichere Genotypisierung
der hybridisierten Amplikons gewährleisten,
- 5. neu entwickelte synthetische Oligonukleotide, die geeignet
sind, an PCR amplifizierten CYP Genabschnitten, mit Hilfe der „Taq DNA
Ligase detection reaction" Technologie
(LDR) SNP spezifische, mit einer synthetischen Erkennungssequenz
(ZIP Code) versehene, Oligonukleotide diskriminierend mit daran
anschließenden
3' FITC bzw. 3' Cy5 markierten Oligonukleotiden
zu ligieren,
- 6. 3' Biotin
markierte, auf Streptavidin beschichteten PC-Chips immobilisierte,
revers komplementäre,
synthetische Oligonukleotide, die es ermöglichen, die Ligationsprodukte
anhand ihrer ZIP Code Sequenz allespezifisch zu hybridisieren und
anschließend
mittels Fluorometrie bzw. Photometrie zu detektieren und so eine
sichere Genotypisierung der hybridisierten Amplikons auch bei paralellem
Nachweis von multiplen SNP's
in einem Ansatz gewährleisten
(Multiplex Ansatz).
Durch
zusätzliche
positive Nachweise der Deletion des CYP2D6 Gens (Allel: CYP2D6*5)
und der zum Teil mehrfachen Duplikation desselben Gens (Allel: CYP2D6*2XN)
mittels „long
distance" PCR mit
biotinierten Sense – und
FITC markierten Antisense Primern und anschließendem Nachweis, des auf SA-MTP
gebundenen Duplexes, wird somit eine Abschätzung des phänotypisch
relevanten Genotyps bezüglich
der wichtigsten Arzneimittel metabolisierenden Cytochrom P450 Enzyme
ermöglicht.
Im
Unterschied zu den bekannten „high-throughput"-Verfahren ermöglicht es
die hier beschriebene Erfindung, auch an wenigen Einzelpatienten
bei niedrigen Personal- und Sachkosten die therapeutisch wichtigen Befunde
zur individuellen Ausstattung mit den verschiedenen CYP Allelen
zu erheben.
Die
Erfindung nutzt hochgradig genspezifische Oligonukleotidprimer,
vorzugsweise Oligonukleotide der Anlage 1, für flankierende Regionen der
allelbestimmenden Genabschnitte, um diese aus einem Hintergrund
von sehr stark homologen Cytochromen der gleichen Subfamilie mittels
diskriminierender PCR bzw. Multiplex-PCR zu amplifizieren. Der folgende Allelnachweis
kann mit zum Teil unterschiedlichen Verfahren erfolgen:
- 1. durch Markierung eines Primers pro alleltragendem Genfragment
mit Biotin; Amplifikation allelbestimmender Genabschnitte mit Oligonukleotidprimern
gemäß Anlage
1 mittels diskiminierender PCR; anschließende Kopplung der markierten
Amplikons an eine thermostabile Streptavidin-Mikrotiterplatte (SA-MTP), vorzugsweise
eine SA-MTP der Firma BioTeZ (Patentnummer: DE100 20 885 A ). Die verunreinigende
genomische DNA sowie die Komplementärstränge werden anschließend durch
stringentes Waschen entfernt; die dann einzelsträngig vorliegenden Amplikons
mit allelspezifischen, FITC markierten Oligonukleotiden hybridisiert
und danach erneut einer stringenten Waschung unterzogen.
- 2. durch asymmetrische PCR zur Erzeugung überschüssiger ssDNA Amplikons, anschließende Hybridisierung
mit einem 5'-FITC
markiertem Primer, dessen 3'-Ende
mit der Position der Mutation korrespondiert, und nachfolgende,
allelspezifische Verlängerung
des markierten Primers durch diskriminierende Taq-Polymeraseaktivität mit dNTP's zu partiell einzelsträngigen Duplexen.
Biotinierte genspezifische Oligonukleotide werden auf definierten
Spots eines mit Streptavidin beschichteten Glasobjektträgers immobilisiert.
Die partiell einzelsträngigen
Duplexe werden nachfolgend mit den immobilisierten, genspezifischen
Oligonukleotiden hybridisiert und durch stringente Waschung von
nicht verlängerten,
5'-FITC markierten
Oligonukleotidprimer befreit.
- 3. durch Überführen eines
Aliquots des entstandenen, unmarkierten PCR Produkts in einen Multiplex
LDR Ansatz bestehend aus:
a.) neu entwickelten, mit synthetischen
Erkennungssequenzen von 24 Basenpaaren Länge am 5' Ende markierten, allespezifischen SNP
Oligonukleotidsonden, bevorzugt Oligonukleotiden aus Anlage 2,
b.)
isoformspezifischen, 5' phosphorylierten,
3' Fluoreszenz markierten,
synthetischen Oligonukleotiden, deren 5' Ende unmittelbar dem nachzuweisenden,
isoformspezifischen SNP folgt,
c.) rekombinante DNA Ligase
aus Thermophilus aquaticus in einem Nikotinamid Adenin Dinukleotid
(NAD) haltigem Puffer,
nachfolgende LDR in einem handelsüblichen
Thermcycler,
Hybridisierung der entstandenen, 3' Fluoreszenz markierten
LDR Produkte an, zu den Erkennungssequenzen revers komplementären, 3' Biotin markierten,
synthetischen Oligonukleotiden, welche zuvor an Streptavidin beschichteten
PC-Chips immobilisiert worden waren in einer abgedichteten, temperierten
und die Lösung
bewegenden Inkubationskammer über
dem Chip,
Nachweis der allelrepräsentierenden 3'-FITC markierten
Oligonukleotide in Lösung über dem
PC-Chip durch anschließende
Anti-FITC-Ak-HRP Kopplung, Waschung und kalorimetrischen Nachweis
mittels eingefüllter
TMB Reagenz. Besagte TMB Reagenz fällt in Ruhe in den die Anti-FITC-Ak-HRP tragenden
Spots aus. Alternativ dazu durch direkte Laser enhanced Fluorometrie
bei Einsatz einer 3' Cy5
Fluoreszenzmarkierung.
Der
Nachweis der allelrepräsentierenden
5'-FITC markierten
Oligonukleotide geschieht in den Verfahren 1 und 2 durch anschließenden Anti-FITC-Ak-HRP
Elisa.
Im
Verfahren gemäß Punkt
3 wird als interne Kontrolle eine Probe bestehend aus gentechnisch
gewonnener Plasmid DNA (pDNA), vorzugsweise der Plasmid DNA-Sequenz aus Anlage
2, welche allelspezifische Fragmente von pUC 19 Genabschnitten enthält, mitgeführt.
Dieses
hochempfindliche Verfahren erlaubt den sicheren Nachweis der im
Anhang und in den Ausführungsbeispielen
aufgeführten
Allele unter Einsatz von Laborstandardgeräten und/oder handelsüblichen
Durchlichtscannern.
Die
erfindungsgemäße Vereinfachung
in dem hier beschriebenen Verfahren besteht darin, daß
- 1. die erfindungsgemäß eingesetzten Primer und Sonden
einen hochselektiven Allel-Nachweis an genomischer DNA innerhalb
weniger Stunden ermöglichen,
und
- 2. der Test als multipler Assay durchgeführt wird, in dem eine Mehrzahl
von einzelnen Allelen in einem speziell angepaßten Protokolldurchlauf auf
einer MTP, bzw. mehreren Glasobjekträgern, gleichzeitig erfaßt werden,
und
- 3. für
den Fall des Nachweises auf einer MTP nur solche Geräte zum Einsatz
kommen, die zur Standardausrüstung
eines mit PCR bzw. Elisa Methoden befaßten Labors gehören, und
- 4. im Falle des Nachweises auf Glasobjekträgern, durch Vorschaltung einer
automatisierten Übertragung der
IS-PCR Produkte, eine wesentliche Verringerung des personellen und
zeitlichen Aufwands, des einzusetzenden Probenmaterials, sowie die
Minimierung möglicher
Belegungsfehler erzielt werden, und
- 5. die erfindungsgemäß eingesetzten
synthetischen Oligonukleotide des LDR Verfahrens einen hochselektiven
Nachweis multipler CYP Allele eines Probanden aus genomischer DNA
innerhalb weniger Stunden aus drei aufeinander folgenden Ansätzen ermöglichen,
und
- 6. die Hybridisierung der LDR Produkte zum Nachweis der getesteten
Allele in einem „ein
Kammer" System durchgeführt werden
kann und dadurch Materialbedarf, Pipettieraufwand und damit verbunden
auch die Fehlerrate im Vergleich mit DE 102 37 691.3-41 weitergehend
deutlich herabsetzt werden, und
- 7. die Alleldifferenzierung im LDR Verfahren mit einem z.T.
erheblich gesteigerten Signal/Rausch Verhältnis erfolgen kann und somit
die diagnostische Sicherheit in diesem Multiplex Assay ebenfalls
deutlich verbessert wird, und
- 8. die entwickelten synthetischen Erkennungssequenzen (ZIP Code
Sequenzen), sowie deren revers komplemtäre Pendants einen universell
anwendbaren durch Sequenzvergleich mit der humanen Genomdatenbank
in ihrer nicht vorhandenen Interaktion mit dem menschlichen Genom
abgesicherten Code darstellen, der zur Identifizierung auch anderer
humaner SNP's mittels
der LDR bzw. Ligase Ketten Reaktion (LCR) geeignet ist und eine
universelle Platform für
den multiplen SNP Nachweis darstellt.
Als
interne Kontrollen können
Proben bestehend aus gentechnisch gewonnener Plasmid DNA (pDNA),
vorzugsweise der Plasmid DNA-Sequenzen der Anlage 1, welche allelspezifische
Fragmente von CYP-Genabschnitten enthalten, mitgeführt werden.
Die
Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Beispiel 1
Isoformspezifische Amplifikation
eines Genabschnitts von CYP2C9 aus genomischer Leukozyten DNA mittels PCR
a) Isolation der genomischen
DNA (gDNA)
Genomische
DNA kann nach bereits beschriebenen Standardverfahren aus Leukozyten
des menschlichen Blutes isoliert werden (Vogelstein B. and Gillespie
D. PNAS, (1979) 76: 615-9). Hierbei sollte eine gDNA Konzentration
von 5-50 ng/μl
angestrebt werden, um bei Einsatz von 0,5-1 μl gDNA/PCR Ansatz eine ausreichende
Kopienzahl vorzulegen. Der Qualität der gDNA kann bei der Effektivität des gesamten
Assay eine entscheidende Bedeutung zukommen und es sollte daher
eine möglichst
gleichbleibende Qualität
und Konzentration angestrebt werden.
b) Ansatz und Durchführung der
PCR mit Probanden gDNA
Für je 25 μl Gesamtvolumen/PCR
Ansatz werden 2,5 μl
eines 10 fach konzentrierten Polymerasepuffers (z.B. 100 mM Tris-HCl
(pH 8.0), 500 mM KCl, 15 mM MgCl); 0,08 μl dNTP (62,5 mM jedes); jeweils
0,5 μl der
50 μM Primer
SP2C9201 (SEQ ID NO 1) und dem 5' biotiniertem
Primer RP2C9201 (SEQ ID NO 2); 0,5 μl Taq-DNA Polymerase (5U/μl), 1 μl gDNA ;
sowie 16,34 μl
für die
PCR geeignetes Bidest im Doppelansatz in PCR Gefäße pipettiert. Anschließend werden
die Gefäße in ein
handelsübliches
PCR Gerät überführt und nachfolgendem
PCR-Regime unterworfen:
Gleichzeitig
wurden Proben bestehend aus gentechnisch gewonnener Plasmid DNA
(pDNA), welche allelspezifische Fragmente des Genabschnitts CYP2C9*2
(SEQ ID NO 38) und den entsprechenden Abschnitt des Wildtypgens
CYP2C9*1 (SEQ ID NO 37) enthalten, als interne Kontrollen ebenfalls
im Doppelansatz mitgeführt.
Die
entstandenen Amplifikationsprodukte können mittels Agarosegelelektrophorese
in 3,5% Agarosegelen bei 5-10 V/cm Gelbreite 1-1½ Stunden aufgetrennt und
mittels DNA Marker und Ethidiumbromid Färbung unter UV Licht visualisiert
und dokumentiert werden.
Beispiel 2
Hybridisierung und allelspezifischer
Nachweis der PCR Produkte aus Beispiel 1 an SA-MTP durch stringente Waschung
FITC markierter Oligonukleotidsonden
Lösungen
| TE-NaCl: | 10
mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl |
| HP: | 6×SSC; 0,1%
SDS; 2 × Denhardtsche
Lösung
(DHL) |
| SDS-WP: | 0,1 × SSC; 0,1
% SDS |
| TE-Lysin: | 10
mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% Lysin (w/v) |
| TE-RSA: | 10
mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,05% Rinderserum
Albumin (w/v) |
| TE-Tween: |
10
mM Tris-NCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,1 % Tween (w/v) |
| TMB: |
stabilisierte
3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidin/H2O2 Lösung der
Firma DRG Diagnostics (TMBIue) |
Durchführung
Jeweils
2 × 5 μl der in
Beispiel 1 entstandenen Amplifikationsprodukte werden im Doppelansatz
in eine mit 45 μl
TE-NaCl vorbeschickte SA-MTP pipettiert, 20 Minuten bei 37°C unter Schütteln inkubiert
und dann abgesaugt. Zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA
werden je 50 μl
0,2N NaOH zugegeben, 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) geschüttelt und
danach abgesaugt. Dann werden je 50 μl TE-NaCl zugesetzt, über 1 Min. bei RT geschüttelt und
nachfolgend abgesaugt. Anschließend
werden 50 μl
nachfolgend bezeichneter, in HP (Hybridisierungspuffer) vorverdünnter Hybridisierungssonden
(Endkonzentration – 0,5 – bzw. 1
nM) zu jeweils einem der Doppelansätze zugegeben, 20 Minuten bei
37°C hybridisiert
und anschließend
abgesaugt.
Hybridisierungssonden
CYP2C9*2:
CYP2C9*1
(WT) – FITC-5'-GAGGACCGTGTTCAAGAG
-3' (SEQ ID NO 17)
CYP2C9*2
(MT) – FITC-5'-TGAGGACTGTGTTCAAGAG
-3' (SEQ ID NO 18)
Durch
dreifach wiederholte Zugabe von 50 μl SDS-WP je Well, Inkubation
bei 45°C
für 11
Minuten und anschließendes
Absaugen werden nicht 100% passende Hybridisierungssonden abgewaschen.
Nach dem Blocken überschüssiger,
unspezifischer Bindungsstellen für
Anti-FITC-IgG-POD Konjugate durch 5 Minuten Inkubation in TE-Lysin
bei RT werden 50 μl
des Anti-FITC-IgG-POD Konjugates in einer Konzentration von 50 ng/ml
in TE-RSA zugesetzt, 20 Minuten abgedunkelt bei RT geschüttelt und
anschließend
abgesaugt. Nach 2 facher Waschung der Wells mit je 50 μl TE-Tween
werden 50 μl/well
TMB Lösung
zugegeben, 12 Minuten bei RT, abgedunkelt geschüttelt, unmittelbar anschließend mit
50 μl 5M
H
2SO
4 versetzt und
sofort danach in einem handelsüblichen
MTP Reader bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 620 bzw. 630 nm vermessen. Tabelle
2 Gemessene
Optische Dichte bei 450 nm (OD
450 nm) ausgewählter CYP2C9
Allele aus pDNA bzw. gDNA (vortypisiert durch RFLP) nach Hybridisierung
mit FITC-Sonden und Behandlung entsprechend Beispiel 2
Legende:
CYP2C9*1 (pDNA) ist gentechnisch hergestellte, doppelsträngige Plasmid
DNA mit der enthaltenen Sequenz für CYP2C9 WT (SEQ ID NO 37)
und entsprechend für
CYP2C9*2 (SEQ ID NO 38); CYP2C9*2/*2 bzw. -*1/*1 oder – *1/*2
gDNA sind mittels RFLP genotypisierte, genomische DNA Proben der Allele
*1 (WT), *2 (MUT) bzw. *1/*2 (heterozygot); WT = FITC markiertes
Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend Wildtypallel und MUT = FITC
markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend CYP2C9*2; OD450 nm = Optische Dichte bei einer Wellenlänge von
450 nm gegen 620 nm; Match/Mismatch = der Quotient der OD450 nm aus 100% komplementärem zu nicht
komplementärem
Allel-Sonden Hybriden.
Beispiel 3
IS-PCR von CYP2C19*3 aus
pDNA mittels asymmetrischer PCR gefolgt von allelspezifischer Verlängerung FITC
markierter Oligonukleotide durch Taq DNA Polymerase
Ansatz
und Durchführung
der PCR mit gentechnisch hergestellter pDNA:
Die pDNA enthält allespezifische
Fragmente des Genabschnitts CYP2C19*3 (SEQ ID NO 44) bzw. des entsprechenden
Abschnitt des Wildtypgens CYP2C19*1 (SEQ ID NO 43). Für je 25 μl Gesamtvolumen/PCR
Ansatz werden 2,5 μl
eines 10 fach konzentrierten Polymerasepuffers (z.B. 100 mM Tris-HCl
(pH 8.0), 500 mM KCl, 15 mM MgCl); 0,2 μl dNTP (62,5 mM jedes); jeweils
0,5 μl des
5 μM Primers
SP2C1932 (SEQ ID NO 7) und des 50 μM Primers RP2C9201 (SEQ ID NO
8); 0,25 μl
Taq-DNA Polymerase (5U/μl),
1 μl pDNA
(50 pg); sowie 20,05 μl
für die
PCR geeignetes Bidest im Doppelansatz in PCR Gefäße pipettiert. Anschließend werden die
Gefäße in ein
handelsübliches
PCR Gerät überführt und
nachfolgendem PCR-Regime unterworfen:
und nach Zusatz von 0,5 μl/PCR Gefäß eines
der 50 μM,
5' FITC markierten,
allelspezifischen Primer 2C1931AS (SEQ ID NO 56) bzw. 2C1933AS (SEQ
ID NO 57) erneut
einer allelspezifischen
Primerverlängerung
unterworfen, anschließend
kurzfristig bei 4°C
aufbewahrt und nachfolgend weiterverarbeitet.
Beispiel 4
Hybridisierung und allelspezifischer
Nachweis der PCR Produkte aus Beispiel 3 an Streptavidin beschichtete Glasobjekträgern (SA-Chips)
durch stringente Waschung FITC markierter Primerverlängerungsprodukte
Lösungen
| TE-NaCl: | 10
mM Tris-HCl (pH 7.5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl |
| 6 × SSC: | 0,09
M Na-Citrat-HCl (pH 7.0); 0,9 M NaCl |
| SDS-WP: | 0,1 × SSC; 0,1
% SDS |
| TE-Lysin: | 10
mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% Lysin (w/v) |
| TE-RSA: | 10
mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,05% Rinderserum
Albumin (w/v) |
| TE-Tween: | 10
mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,1 % Tween (w/v) |
| TMB
(p): | präzipitierende,
stabilisierte 3, 3',
5, 5'-Tetramethylbenzidin/H2O2 Lösung der
Firma Seramun |
Durchführung
Ein
mit 32-64 Reaktionsarealen (Spots) ausgestatteter SA-Chip wird mit
jeweils 3 μl/Spot
eines 5' biotinierten,
in TE-NaCl gelösten
500 pM Oligos mit der Bezeichnung B2C193_F (SEQ ID NO 58) versehen,
15 Min. bei RT in einer Humiditätskammer
inkubiert, anschließend
abgesaugt mit 1 mal mit 6 × SSC
bei RT gewaschen. Jeweils 0,25 μl
der in Beispiel 3 entstandenen Amplifikationsprodukte werden mit
1,5 μl 12 × SSC versetzt,
mit ddH2O auf 3 μl Gesamtvolumen aufgefüllt, nach
Absaugen des 6 × SSC
Puffers im Dreifachansatz auf einzelne Spots pipettiert, 30 Minuten
bei RT bei gesättigter
Humidität
hybridisiert und anschließend
abgesaugt. Durch 3 fache, stringente Waschung des SA-Chips mit 20
ml SDS-WP für
jeweils 5 Min. bei 46°C
werden nicht verlängerte,
FITC markierte Mismatch Extensionprimer abgewaschen, während korrekt
gepaarte, in der Extensionreaktion verlängerte Match 5' FITC-Primer/Template Kombinationen
auf dem SA-Chip verbleiben. Nach dem Blocken überschüssiger, unspezifischer Bindungsstellen
für Anti-FITC-IgG-POD
Konjugate durch 5 Min. Inkubation in TE-Lysin bei RT werden 2 μl eines Anti-FITC-IgG-POD
Konjugates in TE-RSA (1 μg/ml)
zugesetzt und abgedunkelt 20 Minuten in gesättigter Humidität bei RT
inkubiert. Nach 2 facher Waschung des SA-Chips mit 5 ml TE-Tween
werden 2 μl/Spot
der TMB (p) Fertiglösung
zugegeben und abgedunkelt in gesättigter
Humidität über 15 Minuten
bei RT inkubiert. Die sofort anschließende Vermessung der auftretenden
Violettfärbung
erfolgt in einem handelsüblichen
Durchlichtscanner (Agfa Scanwise) bei einer Auflösung von 250 dpi. Die Auswertung
der gescannten Bilder erfolgt mit Hilfe einer neuentwickelten, speziell
auf das SA-Chip Design und das verwendete farbgebende Reagenz abgestimmten
Analysesoftware und wird als auf 100% normierte Wertetabelle im
Excel Format als Score Werte ausgegeben.
Tabelle
3 Ergebnisse
der Messung der CYP2C19*1 bzw. – *3
pDNA Allele entsprechend Beispiel 4
Legende:
CYP2C19*1 ist gentechnisch hergestellte, doppelsträngige Plasmid
DNA mit der enthaltenen Sequenz für CYP2C19 WT (SEQ ID NO 43)
und entsprechend für
CYP2C19*3 (SEQ ID NO 44); FITC-Sonde = 5' Fluoroescein markiertes Oligonukleotid;
WT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend Wildtypallel
und MUT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend
CYP2C19*3; Score (Mw ± Stdw, n = 3) = Mittelwerte
von auf 100% normierten Scorewerten ± Standardabweichung bei Dreifachansatz;
Match/Mismatch (Mw) = Quotient der mittleren
Scorewerte aus 100% komplementärem
und nicht komplementärem
Allel – Sonden
Hybrid; n × PE
= Zahl (n) der durchgeführten
FITC-Primer extension Zyklen.
Beispiel 5
Isoformspezifische Amplifikation
von Genabschnitten aus CYP2C9, CYP2C19 und CYP2D6 aus genomischer Leukozyten
DNA mittels Multiplex-PCR
a) Isolation der genomischen
DNA (gDNA)
b) Ansatz und Durchführung der
PCR mit Probanden gDNA
Für je 25 μL Gesamtvolumen/PCR
Ansatz werden 12,5 μL
eines 2 fach konzentrierten PCR Ready Mixes (enthält: 1,25
U Taq Polymerase, Tris-HCl (pH 8.7), KCl, (NH
4)
2SO
4, 3 mM MgCl,
400 μM jeden
dNTP's); jeweils
0,1 μL der
Primer SP2C9201 (50 μM),
RP2C9201 (50 μM),
SP2C9301 (25 μM),
RP2C9302 (25 μM), SP2C1921
(100 μM),
RP2C1921 (100 μM),
SP2C1932 (75 μM),
RP2C1931 (75 μM),
SP2D6322 (100 μM), RP2D6301
(100 μM),
SPPUC01 (25 μM),
RPPUC01 (25 μM)
[DE 102 37 691.3-41 SEQ ID NO 1-10; Anhang 1 SEQ ID No 1 und 2],
2 μL gDNA,
0,5 μL pDNA
pUC 19 (10 pg/μL)
[SEQ ID NO 61] sowie 8,8 μL
für die
PCR geeignetes Bidest in PCR Gefäße pipettiert.
Anschließend
werden die Gefäße in ein
handelsübliches
PCR Gerät überführt und
nachfolgendem PCR-Regime unterworfen:
Die
entstandenen Amplifikationsprodukte können mittels Agarosegelelektrophorese
in 3,5% Agorosegelen bei 5-10 V/cm Gelbreite 1-1½ Stunden aufgetrennt und
mittels DNA Marker und Ethidiumbromid Färbung unter UV Licht visualisiert
und dokumentiert werden.
Beispiel 6
Allelspezifische Ligation
der PCR Produkte aus Beispiel 5 durch Taq DNA Ligase Detektions
Reaktion im Multiplexansatz
2 μL des in
Beispiel 1 entstandenen PCR Produkts werden mit 4 μL 10 × Taq Ligationspuffer
(200 mM Tris-HCl (pH 7.6), 250 mM Kalium-Acetat, 100 mM Magnesium-Acetat,
100 mM Dithiothreitol, 10 mM NAD, 1% Triton X 100), 15 U Taq DNA
Ligase (New England Biolabs), je 4 pmole eines jeden Zip Code Alleloligonukleotids
[SEQ ID NO 62 – 71;
76 u. 77], je 2 pmole eines jeden 5' phosphorylierten, 3' FITC markierten Ligationsoligonukleotids
[SEQ ID NO 78 – 83
u. 88] versetzt und mit sterilem Bidest auf ein Gesamtvolumen von
40 μL aufgefüllt. Danach
wird der Ansatz in einen handelsüblichen
Thermocycler bei nachfolgendem Regime prozessiert:
Beispiel 7
Zip Code spezifische Hybridisierung
der LDR Produkte aus Beispiel 6 an vorbelegte Polycarbonatobjekträger und
anschließende
Detektion durch nachgeschalteten anti-FITC-Ak-HRP Elisa
40 μL Ansatz
aus Beispiel 5 werden in ein Gesamtvolumen von 450 μL zu 6 × SSC, 2 × DHL, 100 μg/mL Lachs
DNA Hybridisierungslösung
verdünnt.
Ein PC-Chip mit insgesamt 24 durch Siebdruckverfahren erzeugten
Kavitäten,
die mit Streptavidin vorbeschichtet wurden, wird mit jeweils 1,5
pmole aller nachfolgend über
ihre Sequenz ID benannten 3' biotinierten
24 bp Oligonukleotide im Zweierreplika belegt [SEQ ID NO 89 – 98; 103
u. 104]. Diese sind jeweils revers komplimentär zu den mit jeweils einem
Allel assoziierten ZIP Codes der Ligationsprodukte und gewährleisten
so eine effiziente und spezifische Hybridisierung auf den PC-Chip. Der
Chip wird in eine dichtende Polycarbonatkammer eingelegt, über ein
Septum mit der Hybridisierungslösung überschichtet
und bei 37°C
1 Stunde über
Kopf rotierend inkubiert. Nach Abschluß der Hybridisierung wird der
Chip mit 2 × 650 μL 1 × SSC, 0.1%
SDS jeweils 15 Minuten bei 37°C
rotierend gewaschen und anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur
mit 650 μL
anti-FITC-Ak-HRP (75 ng/mL) rotierend inkubiert. Nach 2 facher Waschung
des SA-Chips mit 650 μL
TE-Tween werden 700 μL
TMB Färblösung zugegeben
und 15 Minuten bei RT inkubiert. Die sofort anschließende Vermessung
der auftretenden Violettfärbung
erfolgt in einem handelsüblichen
Durchlichtscanner (Agfa Scanwise) bei einer Auflösung von 250 dpi. Die Auswertung
der gescannten Bilder erfolgt mit Hilfe einer neuentwickelten, speziell
auf das SA-Chip Design und das verwendete farbgebende Reagenz abgestimmten
Analysesoftware und wird als auf 100% normierte Wertetabelle im
Excel Format als Score Werte ausgegeben. Tabelle
4 Ergebnisse
der Messung einer gDNA Probe entsprechend Beispiel 7
Legende:
S/N = signal noise ratio (Signal/Rausch Verhältnis); Mw = Mittelwert; Stdw
= Standardabweichung; Pos. = Postivkontrolle; Neg. = Negativkontrolle
Anlage 1:
Künstliche
Oligonukleotide und Plasmid DNA Teilsequenzen
Anlage 2:
Künstliche
Oligonukleotide und Plasmid DNA Teilsequenzen