DE10163167A1 - Process for the fermentative production of L-amino acids and use of coryneform bacteria - Google Patents
Process for the fermentative production of L-amino acids and use of coryneform bacteriaInfo
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
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Abstract
Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das dctQ-Gen kodierend für ein kleines integrales C4- Dicarboxylat-Membran-Transportprotein und/oder das sodit1- Gen kodierend für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator abgeschwächt ist. The invention relates to a method for fermentative production of L-amino acids, in particular L-lysine, using coryneform bacteria in which encoding the dctQ gene for a small integral C4 Dicarboxylate membrane transport protein and / or the sodit1- Gene coding for the 2-oxoglutarate / malate translocator is weakened.
Stand der TechnikState of the art
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung. L-amino acids, especially L-lysine, can be found in the Human medicine and in the pharmaceutical industry, in the Food industry and especially in the Animal nutrition application.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen. It is known that amino acids are fermented by Strains of coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum can be produced. Because of the great importance is constantly attached to the improvement of the Manufacturing process worked. process improvements can take fermentation measures such as Stirring and supplying oxygen, or the Composition of the nutrient media such as the Sugar concentration during fermentation, or the Refurbishment to the product form by, for example Ion exchange chromatography or the intrinsic Performance characteristics of the microorganism itself affect.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. Lysin- Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren. To improve the performance characteristics of this Microorganisms become methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. This way you get Strains resistant to antimetabolites such as B. Lysine Analog S- (2-aminoethyl) cysteine or auxotroph for regulatory metabolites and L-amino acids to produce.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L- Aminosäure-Produktion untersucht. Methods of recombinant DNA technology for strain improvement L- Amino acid producing strains of Corynebacterium glutamicum by using individual amino acid Biosynthesis genes amplified and the effect on the L- Amino acid production examined.
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen. The inventors set themselves the task of creating new ones Basics for improved fermentative processes Production of L-amino acids, in particular L-lysine, with to provide coryneform bacteria.
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man zumindest die für ein kleines integrales C4-Dicarboxylat- Membran-Transportprotein kodierende Nukleotidsequenz und/oder die für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator kodierende Nukleotidsequenz abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert. Das kleine integrale C4-Dicarboxylat-Membran-Transportprotein und der 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator sind Transporter für Dicarboxylate wie zum Beispiel Malat, Succinat und Fumarat. The invention relates to a method for fermentative production of L-amino acids, under Use of coryneform bacteria in which one at least that for a small integral C4 dicarboxylate Membrane transport protein encoding nucleotide sequence and / or for the 2-oxoglutarate / malate translocator attenuates coding nucleotide sequence, in particular turns off or expressed at a low level. The small integral C4 dicarboxylate membrane transport protein and the 2-oxoglutarate / malate translocator are transporters for dicarboxylates such as malate, succinate and Fumarate.
Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, in dem
folgende Schritte durchführt werden:
- a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für ein kleines integrales C4-Dicarboxylat-Membran- Transportprotein kodierende Nukleotidsequenz und/oder die für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator kodierende Nukleotidsequenz abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird.
- b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und
- c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.
- a) Fermentation of the L-amino acid-producing coryneform bacteria in which at least the nucleotide sequence coding for a small integral C4-dicarboxylate membrane transport protein and / or the nucleotide sequence coding for the 2-oxoglutarate / malate translocator are weakened, in particular switched off or to a low level Level is expressed.
- b) accumulation of the L-amino acids in the medium or in the cells of the bacteria; and
- c) isolation of the desired L-amino acids, components of the fermentation broth and / or the biomass optionally remaining in parts or in their total amounts in the end product.
Die eingesetzten coryneformen Bakterien produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung des für ein kleines integrales C4-Dicarboxylat-Membran-Transportprotein kodierenden dctQ-Gens und/oder des für den 2- Oxoglutarat/Malat-Translokator kodierenden sodit1-Gens L- Aminosäuren, insbesondere L-Lysin. Produce the coryneform bacteria used preferably before weakening the for a small one integral C4 dicarboxylate membrane transport protein coding dctQ gene and / or the for the 2- Oxoglutarate / malate translocator encoding sodit1 gene L- Amino acids, especially L-lysine.
Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Abschwächung des für ein kleines integrales C4- Dicarboxylat-Membran-Transportprotein kodierenden dctQ-Gens und/oder des für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator kodierenden sodit1-Gens in verbesserter Weise L- Aminosäuren, insbesondere L-Lysin produzieren. It has been found that coryneform bacteria follow Weakening the for a small integral C4- DicQ gene encoding dicarboxylate membrane transport protein and / or that for the 2-oxoglutarate / malate translocator encoding sodit1 gene in an improved manner L- Produce amino acids, especially L-lysine.
Die Nukleotidsequenz des für ein kleines integrales C4- Dicarboxylat-Membran-Transportprotein kodierenden dctQ-Gens kann der Patentanmeldung WO 01/00805 unter dem Identification Code AX066981 als SEQ ID No. 563 entnommen werden. The nucleotide sequence of the for a small integral C4 DicQ gene encoding dicarboxylate membrane transport protein can the patent application WO 01/00805 under the Identification code AX066981 as SEQ ID No. Taken 563 become.
Die Nukleotidsequenz des für den 2-Oxoglutarat/Malat- Translokator kodierenden sodit1-Gens kann der Patentanmeldung WO 01/00805 unter dem Identification Code AX066949 als SEQ ID No. 531 entnommen werden. The nucleotide sequence of the for the 2-oxoglutarate / malate The translocator encoding sodit1 gene can Patent application WO 01/00805 under the identification code AX066949 as SEQ ID No. 531 can be removed.
Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Sequenzen kodierend für ein kleines integrales C4-Dicarboxylat- Membran-Transportprotein und den 2-Oxoglutarat/Malat- Translokator, können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des kleinen integralen C4- Dicarboxylat-Membran-Transportproteins und des 2- Oxoglutarat/Malat-Translokators verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Kodes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben. The sequences described in the specified passages coding for a small integral C4 dicarboxylate Membrane transport protein and the 2-oxoglutarate / malate Translocator can be used according to the invention. Furthermore, alleles of the small integral C4- Dicarboxylate membrane transport protein and the 2- Oxoglutarate / malate translocators can be used from the degeneracy of the genetic code or through Functionally neutral sense mutations result.
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Lsoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin. If L-amino acids or amino acids are mentioned below, are one or more amino acids included their salts, selected from the group L-asparagine, L- Threonine, L-serine, L-glutamate, L-glycine, L-alanine, L- Cysteine, L-valine, L-methionine, L-Lsoleucine, L-Leucine, L- Tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan and L-arginine meant. L-lysine is particularly preferred.
Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint. If L-lysine or lysine are mentioned below not only the bases, but also the salts like z. B. lysine monohydrochloride or lysine sulfate.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen. Preferred embodiments can be found in the claims.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. The term "weakening" describes in this Related to reducing or eliminating the intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) in a microorganism caused by the corresponding DNA can be encoded, for example by uses a weak promoter or a gene or allele used that with a corresponding enzyme low activity encoded or the corresponding gene or Enzyme (protein) inactivated and possibly this Combined measures.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt. Through the mitigation measures, the activity or concentration of the corresponding protein in the general to 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10% or 0 to 5% of the activity or concentration of the wild-type Protein, or the activity or concentration of the protein in the starting microorganism.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren. The microorganisms that are the subject of the present Invention, amino acids can be derived from glucose, sucrose, Lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerin and ethanol. It can be Representative of coryneform bacteria, in particular of the genus Act Corynebacterium. In the genus Corynebacterium is especially the species Corynebacterium glutamicum too name that is known in the industry for its ability To produce L-amino acids.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende
Mutanten bzw. Stämme wie beispielsweise die L-Lysin
produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.
Suitable strains of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum, are in particular the known wild-type strains
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
and L-amino acid-producing mutants or strains such as the L-lysine-producing strains
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 and
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des für ein kleines integrales C4-Dicarboxylat- Membran-Transportprotein kodierenden Gens und/oder des für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator kodierenden Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert. To achieve a weakening, either Expression of the for a small integral C4 dicarboxylate Membrane transport protein encoding gene and / or the gene for the gene encoding 2-oxoglutarate / malate translocator or the catalytic properties of the gene products be reduced or switched off. Possibly the two measures are combined.
Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990). The gene expression can by appropriate culture or through genetic modification (mutation) of the Signal structures of gene expression can be reduced. Signal structures of gene expression are, for example Repressor genes, activator genes, operators, promoters, Attenuators, ribosome binding sites, the start codon and Terminators. The expert will find information on this. B. in patent application WO 96/15246, to Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), at Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), by Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) and in well-known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. Knippers' textbook ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or that of Winnacker ("Gene and clones ", VCH publishing company, Weinheim, Germany, 1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden. Mutations that lead to a change or reduction in the lead catalytic properties of enzyme proteins are known from the prior art; as examples are Works by Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) and Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: cancellation of allosteric Regulation and structure of the enzyme ", reports of the Research Center Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Germany, 1994). Summary presentations can be known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. that of Hagemann ("General Genetics ", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) become.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden. Transitions, transversions, Insertions and deletions are considered. In dependence of the effect of amino acid exchange on the Enzyme activity is caused by false sense mutations ("missense mutations ") or nonsense mutations" spoken. Insertions or deletions of at least a base pair in a gene lead to Frame shift mutations, in the result of which incorrect amino acids are incorporated or the Translation terminates prematurely. Deletions of several Codons typically lead to a complete one Loss of enzyme activity. Generation Instructions such mutations belong to the prior art and can be known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. Knippers' textbook ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), that of Winnacker ("Gene and Clones ", VCH publishing company, Weinheim, Germany, 1990) or that of Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement"). A common way to get genes from C. glutamicum mutate is that of Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991)) described method of gene disruption ("gene disruption") and gene exchange ("gene replacement ").
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet. The method of gene disruption becomes a central one Part of the coding region of the gene of interest into one Plasmid vector cloned into a host (typically E. coli), but not in C. glutamicum. As For example, vectors come pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB or pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; U.S. Patent 5,487,993), pCR® Blunt (Invitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) or pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in question. The plasmid vector that contains central part of the coding region of the gene then by conjugation or transformation into the desired strain of C. glutamicum transferred. The method the conjugation is, for example, in Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) described. Methods of transformation are for example in Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). After homologous recombination using a "cross-over" - Event becomes the coding region of the gene in question interrupted by the vector sequence and you get two incomplete alleles to which the 3'- or 5'- The end is missing. This method was developed by Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) for switching off the recA gene from C. glutamicum used.
Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten. In the method of gene exchange a mutation such as B. a deletion, insertion or Base exchange in the gene of interest in vitro manufactured. The allele produced is in turn transformed into one cloned for C. glutamicum non-replicative vector and this then by transformation or conjugation transferred to the desired host by C. glutamicum. To homologous recombination using a first, integration effecting "cross-over" event and a suitable one second, excision-causing "cross-over" event in the target gene or in the target sequence you achieve the incorporation the mutation or the allele. This method was for example by Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) used the C. pyc gene. switch off glutamicum by deletion.
In das für das für ein kleines integrales C4-Dicarboxylat- Membran-Transportprotein kodierende Gen und/oder das für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator kodierende Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden. In that for a small integral C4 dicarboxylate Membrane transport protein coding gene and / or that for gene encoding the 2-oxoglutarate / malate translocator this way a deletion, insertion or a Base exchange can be installed.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des für ein kleines integrales C4-Dicarboxylat-Membran-Transportprotein kodierenden Gens und/oder des für den 2-Oxoglutarat/Malat- Translokator kodierenden Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat- Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren. It can also be used for the production of L-amino acids be beneficial in addition to weakening the for one small integral C4 dicarboxylate membrane transport protein coding gene and / or that for the 2-oxoglutarate / malate Translocator coding gene one or more enzymes of the respective biosynthetic pathway, glycolysis, the Anaplerotic, the citric acid cycle, the pentose phosphate Cycle, of the amino acid export and if necessary to strengthen regulatory proteins, in particular overexpress.
Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. The term "reinforcement" or "reinforcement" describes in in this context the increase in intracellular Activity of one or more enzymes or proteins in one Microorganism encoded by the corresponding DNA by, for example, the number of copies of the gene or the genes increased, a strong promoter or a gene used that for a corresponding enzyme or protein encoded with a high activity and possibly this Combined measures.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht. Through the measures of reinforcement, in particular Overexpression, the activity or concentration of the corresponding protein in general by at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000% based on that of the wild type Protein or the activity or concentration of the protein in the starting microorganism increased.
So kann für die Herstellung von L-Lysin neben der
Abschwächung des für ein kleines integrales C4-
Dicarboxylat-Membran-Transportprotein kodierenden Gens
und/oder des für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator
kodierenden Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus
der Gruppe
- - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- - gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086).
- - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- - das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE 199 59 328.0, DSM 13115),
- - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- the lysC gene coding for a feed-back resistant aspartate kinase (Accession No. P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- at the same time the lysE gene coding for lysine export (DE-A-195 48 222),
- - the gene gap coding for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086).
- the pyc gene coding for the pyruvate carboxylase (DE-A-198 31 609),
- the gene coding for the glucose-6-phosphate dehydrogenase zwf (JP-A-09224661),
- the mqo gene coding for the malate: quinone oxidoreductase (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- the gene coding for the Zwa1 protein zwa1 (DE 199 59 328.0, DSM 13115),
- the gene tpi coding for the triose phosphate isomerase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- the gene pgk coding for the 3-phosphoglycerate kinase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- the gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase (EP-B 0 197 335),
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur
Abschwächung des für ein kleines integrales C4-
Dicarboxylat-Membran-Transportprotein kodierenden Gens
und/oder des für den 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator
kodierenden Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene,
ausgewählt aus der Gruppe
- - das für ein Katabolit-Kontroll-Protein A kodierende Gen ccpA1 (DE: 100 42 054.0),
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- - das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE 199 51 975.7, DSM 13114),
- - das für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodierende Gen fda (Mol. Microbiol. 3 (11), 1625-1637 (1989); ACCESSION Number X17313),
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE 199 59 327.2, DSM 13113),
- the gene coding for a catabolite control protein A ccpA1 (DE: 100 42 054.0),
- the gene pck coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- the pgi gene coding for glucose-6-phosphate isomerase (US 09 / 396,478, DSM 12969),
- the poxB gene coding for pyruvate oxidase (DE 199 51 975.7, DSM 13114),
- the gene fda coding for fructose bisphosphate aldolase (Mol. Microbiol. 3 (11), 1625-1637 (1989); ACCESSION Number X17313),
- the gene coding for the Zwa2 protein, zwa2 (DE 199 59 327.2, DSM 13113),
Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des für ein kleines integrales C4-Dicarboxylat-Membran-Transportprotein kodierenden Gens und/oder des für den 2-Oxoglutarat/Malat- Translokator kodierenden Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). Finally, it can be used for the production of amino acids, be beneficial in addition to weakening the for one small integral C4 dicarboxylate membrane transport protein coding gene and / or that for the 2-oxoglutarate / malate Translocator-encoding gene undesirable side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms ", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben. The microorganisms produced according to the invention are also subject of the invention and can continuously or discontinuously in a batch process (Set cultivation) or in fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) cultivated for the production of L-amino acids become. A summary of known ones Cultivation methods is in Chmiel's textbook (Bioprocess engineering 1. Introduction to Bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. The culture medium to be used must be suitable meet the requirements of the respective tribes. Descriptions of cultural media from various Microorganisms are described in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology "of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Sugar and carbohydrates such as z. B. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, Molasses, starch and cellulose, oils and fats such as B. Soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as B. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, Alcohols such as B. Glycerin and ethanol and organic Acids such as B. acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Organic nitrogenous substances can be used as the nitrogen source Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium salts are used. The culture medium must continue to salts of metals contain such. B. magnesium sulfate or iron sulfate, the are necessary for growth. Finally, you can essential growth substances such as amino acids and vitamins in addition to the substances mentioned above. Suitable precursors can also be used in the culture medium be added. The feedstocks mentioned can be used for Culture added in the form of a unique approach or appropriately fed during cultivation become.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Basic compounds are used to control the pH of the culture such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner. to Antifoam agents such as z. B. fatty acid polyglycol esters. to Maintaining the stability of plasmids can do that Medium suitable selectively acting substances such. B. Antibiotics are added. To aerobic conditions will maintain oxygen or Oxygen-containing gas mixtures such as B. Air into culture entered. The temperature of the culture is usually at 20 ° C to 45 ° C and preferably at 25 ° C to 40 ° C. The Culture continues until a maximum of desired product. That goal will usually within 10 hours to 160 hours reached.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben. Methods for determining L-amino acids are from the State of the art known. The analysis can be done like Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) described by anion exchange chromatography with subsequent ninhydrin derivatization, or they can be done by reversed phase HPLC, as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) described.
Folgende Mikroorganismen werden als Reinkultur am 26.
September 2001 bei der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Escherichia coli Top10/pCR2.1dctQint als DSM 14532,
- - Escherichia coli Top10/pCR2.1sodit1int als DSM 14533.
- - Escherichia coli Top10 / pCR2.1dctQint as DSM 14532,
- - Escherichia coli Top10 / pCR2.1sodit1int as DSM 14533.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. The present invention is described below with reference to Embodiments explained in more detail.
Aus dem Stamm ATCC 13032 wird nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. The ATCC 13032 strain becomes Eikmanns' method et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomal DNA isolated.
Aufgrund der aus für C. glutamicum bekannten Sequenz der
Gene dctQ und sodit1 werden die folgenden Oligonukleotide
für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt:
Based on the sequence of the genes dctQ and sodit1 known for C. glutamicum, the following oligonucleotides are selected for the polymerase chain reaction:
Die dargestellten Primer werden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) mit der Taq-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim (Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA Polymerase, Product No. 1 146 165) die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation eines 299 bp großen internen Fragmentes des dctQ-Gens und eines 296 bp großen internen Fragmentes des sodit1-Gens. Die so amplifizierten Produkte werden in einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch geprüft. The primers shown are from MWG Biotech (Ebersberg, Germany) synthesized and after the Standard PCR method by Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) with the Taq polymerase from Boehringer Mannheim (Germany, product description Taq DNA Polymerase, Product No. 1 146 165) the PCR reaction was carried out. With The primers enable the polymerase chain reaction amplification of a 299 bp internal fragment of the dctQ gene and a 296 bp internal fragment of the sodit1 gene. The products amplified in this way are in tested electrophoretically using a 0.8% agarose gel.
Die amplifizierten DNA-Fragmente werden mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) jeweils in den Vektor pCR2.1- TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663) ligiert. The amplified DNA fragments are with the TOPO TA Cloning kit from Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, UNITED STATES; Catalog number K4500-01) each in the vector pCR2.1- TOPO (Mead at al. (1991) Bio / Technology 9: 657-663).
Anschließend wird der E. coli Stamm TOP10 mit den Ligationsansätzen (Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist. Plasmid-DNA wird aus jeweils einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Die Plasmide werden pCR2.1dctQint und pCR2.1sodit1int genannt und sind in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt. The E. coli strain TOP10 is then electroporated using the ligation batches (Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). The selection of plasmid-carrying cells is made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989..) Connected to 50 mg / l kanamycin has been supplemented. Plasmid DNA is isolated from each transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction with the restriction enzyme EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis (0.8%). The plasmids are named pCR2.1dctQint and pCR2.1sodit1int and are shown in FIG. 1 and FIGS. 2.
Der in Beispiel 1 genannte Vektor pCR2.1dctQint wird nach der Elektroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten Lysin-Produzenten, der Stammist in der EP-B-0435132 beschrieben. Der Vektor pCR2.1dctQint kann in DSM 5715 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1dctQint erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist. The vector pCR2.1dctQint mentioned in Example 1 is used according to the electroporation method of Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) electroporated in Corynebacterium glutamicum DSM 5715. The strain DSM 5715 is an AEC-resistant lysine producer, the strain is described in EP-B-0435132. The vector pCR2.1dctQint cannot replicate independently in DSM 5715 and only remains in the cell if it has integrated into the chromosome of DSM 5715. The selection of clones with integrated into the chromosome pCR2.1dctQint is carried out by plating out the electroporation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY..), which has been supplemented with 15 mg / l kanamycin.
Ein aus gewählter kanamycinresistenter Klon, der das in Beispiel 1 genannte Plasmid pCR2.1dctQint innerhalb des chromosomalen dctQ-Gens von DSM 5715 inseriert hat, wurde als DSM 5715::pCR2.1dctQint bezeichnet. A selected from kanamycin resistant clone, which in Example 1 called plasmid pCR2.1dctQint within the chromosomal dctQ gene from DSM 5715 has been inserted referred to as DSM 5715 :: pCR2.1dctQint.
Der in Beispiel 1 genannte Vektor pCR2.1sodit1int wird nach der Elektroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten Lysin-Produzenten, der Stamm ist in der EP-B-0435132 beschrieben. Der Vektor pCR2.1sodit1int kann in DSM 5715 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1sodit1int erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist. The vector pCR2.1sodit1int mentioned in Example 1 is used according to the electroporation method of Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) electroporated in Corynebacterium glutamicum DSM 5715. The strain DSM 5715 is an AEC-resistant lysine producer, the strain is described in EP-B-0435132. The vector pCR2.1sodit1int cannot replicate independently in DSM 5715 and only remains in the cell if it has integrated into the chromosome of DSM 5715. The selection of clones with integrated into the chromosome pCR2.1sodit1int is carried out by plating out the electroporation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY..), which has been supplemented with 15 mg / l kanamycin.
Ein aus gewählter kanamycinresistenter Klon, der das in Beispiel 1 genannte Plasmid pCR2.1sodit1int innerhalb des chromosomalen sodit1-Gens von DSM 5715 inseriert hat, wurde als DSM 5715::pCR2.1sodit1int bezeichnet. A selected from kanamycin resistant clone, which in Example 1 called plasmid pCR2.1sodit1int within the chromosomal sodit1 gene from DSM 5715 has been inserted referred to as DSM 5715 :: pCR2.1sodit1int.
Die in Beispiel 2 und Beispiel 3 erhaltenen C. glutamicum Stämme DSM 5715::pCR2.1dctQint und DSM 5715::pCR2.1sodit1int werden in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt. The C. glutamicum obtained in Example 2 and Example 3 Strains DSM 5715 :: pCR2.1dctQint and DSM 5715 :: pCR2.1sodit1int are used in a suitable for the production of lysine Culture medium cultivated and the lysine content in Culture supernatant determined.
Dazu werden die Stämme zunächst auf Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin
(25 mg/l) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von
dieser Agarplattenkultur wird je eine Vorkultur angeimpft
(10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für
die Vorkultur wird das Vollmedium Cg III verwendet.
Der pH-Wert wird auf pH 7.4 eingestellt The pH will be adjusted to pH 7.4 adjusted
Diesem wird Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkulturen
werden 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von diesen Vorkulturen wird je eine Hauptkultur
angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der
Hauptkulturen 0,1 OD beträgt. Für die Hauptkultur wird das
Medium MM verwendet
CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt. CSL, MOPS and the salt solution are adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. The sterile substrate and vitamin solutions are then added, and the dry autoclaved CaCO 3 is added.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgt bei 33°C und 80% Luftfeuchtigkeit. The cultivation takes place in a volume of 10 ml in 100 ml Erlenmeyer flasks with baffles. Kanamycin (25 mg / l) added. Cultivation takes place at 33 ° C and 80% Humidity.
Nach 72 Stunden wird die OD bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wird jeweils mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf- BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt. After 72 hours the OD is at a measuring wavelength of 660 nm with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) determined. The amount of lysine formed is in each case with an amino acid analyzer from Eppendorf- BioTronik (Hamburg, Germany) by Ion exchange chromatography and post column derivatization with Ninhydrin detection determined.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Tabelle 1
Table 1 shows the result of the experiment. Table 1
Fig. 1 Karte des Plasmids pCR2.1dctQint, Fig. 1 Map of plasmid pCR2.1dctQint,
Fig. 2 Karte des Plasmids pCR2.1sodit1int. Fig. 2 Map of the plasmid pCR2.1sodit1int.
Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden. The base pair numbers are Approximate values that are within the reproducibility of Measurements are obtained.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung:
KmR: Kanamycin Resistenz-Gen
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
NcoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NcoI
dctQint: internes Fragment des dctQ-Gens
sodit1int: internes Fragment des sodit1-Gens
ColE1: Replikationsursprung des Plasmides ColE1
The abbreviations and designations used have the following meaning:
KmR: Kanamycin resistance gene
EcoRI: Interface of the restriction enzyme EcoRI
PstI: interface of the restriction enzyme PstI
NcoI: Interface of the restriction enzyme NcoI
dctQint: internal fragment of the dctQ gene
sodit1int: internal fragment of the sodit1 gene
ColE1: origin of replication of the plasmid ColE1
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