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DE10158331A1 - Clip-PNA conjugate for the specific transport of thermally activated nucleic acids - Google Patents

Clip-PNA conjugate for the specific transport of thermally activated nucleic acids

Info

Publication number
DE10158331A1
DE10158331A1 DE10158331A DE10158331A DE10158331A1 DE 10158331 A1 DE10158331 A1 DE 10158331A1 DE 10158331 A DE10158331 A DE 10158331A DE 10158331 A DE10158331 A DE 10158331A DE 10158331 A1 DE10158331 A1 DE 10158331A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
pna
nucleic acid
peptide
conjugate
transport
Prior art date
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Ceased
Application number
DE10158331A
Other languages
German (de)
Inventor
Klaus Braun
Isabell Braun
Heike Corban-Wilhelm
Juergen Debus
Juergen Jenne
Ruediger Pipkorn
Ralf Rastert
Ioannis Simiantonakis
Waldemar Waldeck
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority to DE10158331A priority Critical patent/DE10158331A1/en
Priority to PCT/DE2002/004356 priority patent/WO2003047631A2/en
Priority to AU2002351703A priority patent/AU2002351703A1/en
Publication of DE10158331A1 publication Critical patent/DE10158331A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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Abstract

The invention relates to PNA-conjugates for the specific transport of a nucleic acid sequence in cell compartments, preferably the cell nucleus and thermal activity of the nucleic acid sequence at a desired target location, said conjugate having the following components: (a) a transport peptide module for transporting cell membranes (b) an address protein or address peptide for the importation in cell compartments, preferably the cell nucleus, and (c) a clasp-peptide nucleic acid (clasp-PNA) which can be specifically hybridised with a nucleic acid sequence which is to be transported.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein PNA-Konjugat zum spezifischen Transport einer Nukleinsäuresequenz in die Zellen und thermischen Aktivierbarkeit der Nukleinsäuresequenz am gewünschten Zielort, wobei das Konjugat die folgenden Komponenten aufweist:

  • a) ein Transportpeptidmodul für den Zellmembrantransport,
  • b) ein Adressprotein bzw. -peptid für den Import in Zellkompartimente, vorzugsweise in den Zellkern und
  • c) eine mit der zu transportierenden Nukleinsäuresequenz spezifisch hybridisierbare Klammer-Peptid-Nukleinsäure (Klammer-PNA).
The present invention relates to a PNA conjugate for the specific transport of a nucleic acid sequence into the cells and thermal activation of the nucleic acid sequence at the desired target location, the conjugate having the following components:
  • a) a transport peptide module for cell membrane transport,
  • b) an address protein or peptide for import into cell compartments, preferably into the cell nucleus and
  • c) a clip peptide nucleic acid (clip PNA) which can be specifically hybridized with the nucleic acid sequence to be transported.

Zur Behandlung von Erkrankungen, vor allem von Erkrankungen, die auf der Veränderung eines einzelnen Gens beruhen, wird der Einsatz einer Gentherapie immer öfter als wirksame Maßnahme in Erwägung gezogen. Zur Durchführung einer effizienten Gentherapie müssen allerdings eine ganze Reihe von Voraussetzungen erfüllt sein, z. B. hinsichtlich des effizienten Einschleusens der Nukleinsäure zum Zielort, der effizienten Expression des eingeschleusten Gens - bevorzugt nur in den gewünschten Zellen -, etc. Die meisten Voraussetzungen werden mit den bisherigen Systemen allerdings noch nicht zufriedenstellend erfüllt. So wird zur Zeit bei der Gentherapie z. B. auch der Einsatz von Suizidgenen (die zum Zelltod gewünschter Zielzellen führen) und die Verabreichung von "Prodrugs" wissenschaftlich kontrovers diskutiert. Für den klinischen Einsatz eines Suizidgens wird bereits die Herpes Simplex Virus (HSV-1) Thymidinkinase verwendet. Dieses Enzym überführt ein Nukleosid-Analogon (z. B. Ganciclovir; GCV) in seine mono-phosphorylierte Form. Durch endogene zelluläre Enzyme und den Einbau in die DNA werden die Analoga zu toxischen Triphosphaten modifiziert, was zu einer Blockierung der DNA-Strangsynthese und somit schließlich zum Zelltod führt. For the treatment of diseases, especially diseases, that are based on the modification of a single gene the use of gene therapy more often than effective Measure considered. To carry out a efficient gene therapy, however, must be a number be met by requirements, e.g. B. regarding the efficient introduction of the nucleic acid to the target site, the efficient expression of the introduced gene - preferred only in the desired cells, etc. Most However, the previous systems are a prerequisite not yet met satisfactorily. So is currently at gene therapy z. B. also the use of suicide genes (the lead to cell death of desired target cells) and the Administering "prodrugs" scientifically controversial discussed. For clinical use of a suicide gene already the herpes simplex virus (HSV-1) thymidine kinase used. This enzyme converts a nucleoside analog (e.g. ganciclovir; GCV) in its monophosphorylated form. Through endogenous cellular enzymes and incorporation into the DNA the analogs are modified into toxic triphosphates, resulting in blocking DNA strand synthesis and thus eventually leads to cell death.

Allerdings erweist sich bisher der Mangel eines geeigneten und effizienten Transportsystems als die größte Hürde für eine erfolgreiche Gentherapie. Bisher wurde der zytotoxische Effekt, der in verschiedenen, allerdings nicht in allen Zellen beobachtet werden konnte, wohl durch eine Suizid- Gentherapie in Zellen ohne Effektorgen induziert ("Bystander"-Effekt). Ob dieser Effekt den unzureichenden Transport von genetischen Material in alle gewünschten Zellen hinein auszugleichen vermag, muß allerdings stark bezweifelt werden, zumal das Ausmaß des "Bystander"-Effekts wiederum je nach Zelltyp variiert. Zusammengefaßt weisen die bisherigen in der Gentherapie verwendeten Systeme folgende Nachteile auf:

  • a) ineffizienter DNA-Transport,
  • b) generalisierte, nicht-lokale Wirkung und
  • c) unerwünschte Nebenwirkungen (physikalisch, biologisch), u. a. immunogene Wirkungen (viral bzw. liposomal bedingt).
However, the lack of a suitable and efficient transport system has so far proven to be the greatest hurdle for successful gene therapy. So far, the cytotoxic effect, which could be observed in different, but not in all cells, was probably induced by suicide gene therapy in cells without an effector gene ("bystander" effect). Whether this effect can compensate for the insufficient transport of genetic material into all the desired cells has to be highly doubted, especially since the extent of the "bystander" effect in turn varies depending on the cell type. In summary, the previous systems used in gene therapy have the following disadvantages:
  • a) inefficient DNA transport,
  • b) generalized, non-local effects and
  • c) undesirable side effects (physical, biological), including immunogenic effects (viral or liposomal).

Daher ist die Entwicklung eines effizienten, unter in vivo- Bedingungen einsetzbaren Transportsystems mit lokal begrenzbarer Wirkung erforderlich. Therefore, the development of an efficient, among in vivo Conditions of use transport system with local limited effect required.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, ein Gen-Transportsystem bereitzustellen, das sowohl effizient als auch unabhängig vom gewünschten zu transfizierenden Zelltyp, z. B. einer Tumorzelle, ist und eine auf die Zielzelle/das Zielgewebe begrenzte Wirkung ausübt. The invention is therefore essentially technical Problem of providing a gene transport system that is both efficient and independent of what you want transfecting cell type, e.g. B. a tumor cell, and one has a limited effect on the target cell / tissue.

Die Lösung dieses technischen Problems erfolgte durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen. This technical problem was solved by the Provision of those identified in the claims Embodiments.

Von den Erfindern wurde zum Erzielen der Lösung des technischen Problems ein Konjugat-Gemisch entwickelt, das die folgenden Komponenten umfaßt:

  • a) ein Transportpeptidmodul für den Zellmembrantransport (P),
  • b) ein Adressprotein bzw. -peptid (AP) für den Import in Zellkompartimente, vorzugsweise den Zellkern,
  • c) eine mit der zu transportierenden Nukleinsäuresequenz spezifisch hybridisierbare Klammer-Peptid-Nukleinsäure (Klammer-PNA) und
  • d) die an die Klammer-PNA hybridisierte Nukleinsäuresequenz.
To achieve the solution to the technical problem, the inventors developed a conjugate mixture comprising the following components:
  • a) a transport peptide module for cell membrane transport (P),
  • b) an address protein or peptide (AP) for import into cell compartments, preferably the cell nucleus,
  • c) a clip peptide nucleic acid (clip PNA) that can be specifically hybridized with the nucleic acid sequence to be transported and
  • d) the nucleic acid sequence hybridized to the staple PNA.

Vorzugsweise befindet sich zwischen (a) und (b) eine spaltbare kovalente Disulfid-Kupplung und ein Spacer (z. B. Lysin-Glycin zwischen (b) und (c). There is preferably one between (a) and (b) cleavable covalent disulfide coupling and a spacer (e.g. Lysine-glycine between (b) and (c).

Diese modular aufgebauten Konjugate weisen zwei entscheidende Vorteile auf:

  • a) Die Klammer-PNA wird mit der entsprechenden Nukleinsäure hybridisiert und mittels der Komponenten P und AP wird ein effizienter und gerichteter Transport der Klammer- PNA mit der anhybridisierten Nukleinsäure zu dem Zielort und somit eine Gentherapie ermöglicht (siehe Fig. 1). Diese Komponenten erlauben nicht nur einen schnellen und effektiven Transport der Klammer-PNA durch Zellmembranen lebender Zellen ins Zytoplasma, sondern auch, nach zytoplasmatischer Aktivierung von Adresspeptidsequenzen, einen effizienten Transport in den Zellkern.
  • b) Der Einsatz der protease- und nukleaseresistenten Klammer-Peptid-Nukleinsäuren (Klammer-PNAs), bei denen es sich um zwei Oligonukleotid-Derivate handelt, bei denen das Zuckerphosphat-Rückgrat bevorzugt durch Ethyl- Amin verbundene α-Amino-Ethyl-Glycin-Einheiten substituiert ist und die miteinander kovalent zu einem Dimer verknüpft sind, erlaubt aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen eine stabile und effiziente Blockierung der Aktivitität der anhybridisierten miteingeschleusten Nukleinsäuresequenz. Nach Einschleusen des Konstrukts in die Zielzelle kann durch lokales Erhitzen die an die Klammer-PNA hybridisierte Nukleinsäuresequenz dissoziieren und somit von einer inaktiven in eine gewünschte aktive Form, die z. B. transkribiert und translatiert werden kann, überführt werden und somit steht ein gewünschtes Genprodukt nur in der gewünschten Zielzelle, d. h. der erwärmten Zelle, zur Verfügung. Somit wird eine lokale Gentherapie ermöglicht, die geringe Applikationsdosen erfordert und weitgehend frei von unerwünschten Nebenwirkungen ist.
These modular conjugates have two decisive advantages:
  • a) The clamp PNA is hybridized with the corresponding nucleic acid and by means of components P and AP an efficient and directed transport of the clamp PNA with the hybridized nucleic acid to the target site and thus gene therapy is made possible (see FIG. 1). These components not only allow fast and effective transport of the staple PNA through cell membranes of living cells into the cytoplasm, but also, after cytoplasmic activation of address peptide sequences, an efficient transport into the cell nucleus.
  • b) The use of the protease and nuclease resistant staple peptide nucleic acids (staple PNAs), which are two oligonucleotide derivatives in which the sugar phosphate backbone is preferably linked by ethyl-amine α-amino-ethyl-glycine Units and which are covalently linked to each other to form a dimer allows, due to their physicochemical properties under physiological conditions, a stable and efficient blocking of the activity of the hybridized nucleic acid sequence which has been introduced. After introducing the construct into the target cell, the nucleic acid sequence hybridized to the staple PNA can dissociate by local heating and thus from an inactive to a desired active form, which, for. B. can be transcribed and translated, transferred and thus a desired gene product is only available in the desired target cell, ie the heated cell. This enables local gene therapy that requires low doses of administration and is largely free of undesirable side effects.

Weitere Vorteile der erfindungsgemäßen Klammerkonjugate hinsichtlich einer Therapie sind darin zu sehen, dass bei der Therapie kein viraler Vektor beteiligt ist, somit keine Infektionsgefahr besteht und auch die sonstigen Nebenwirkungen geringer sind. Die Klammerkonjugate zeigen außerdem eine hohe Transfektionseffektivität bei verschiedensten Zelltypen. Die Aktivierungstemperatur ist gezielt (in einem) einstellbar, wobei diese auch entsprechend dem zu behandelnden Organ eingestellt werden kann. Eine Aktivierungstemperatur von 44°C ist z. B. in einem sicheren Bereich weit genug entfernt von im Körper natürlicherweise auftretenden Temperaturen, wie z. B. auch Fieber. Somit kann eine Fehlaktivierung vermieden werden. Vorteilhaft ist auch die Tatsache, dass zur Aktivierung nur relativ kurze Zeiten (1 bis 2 Minuten) erforderlich sind, was etwa 1/20 der bei herkömmlichen hitzeinduzierbaren Promotoren erforderlichen Aktivierungszeit entspricht. Dies führt zu einer zusätzlichen Sicherheit z. B. bei thermischer Aktivierung, da bei langen Aktivierungszeiten eine homogene Erwärmung des Gewebes über den ganzen Zeitraum nicht so leicht möglich ist. Further advantages of the clip conjugates according to the invention Regarding therapy, one can see that in the Therapy no viral vector is involved, therefore none There is a risk of infection and also the others Side effects are less. The bracket conjugates show also a high transfection effectiveness various cell types. The activation temperature is selectively (in one) adjustable, this also correspondingly the organ to be treated can be adjusted. A Activation temperature of 44 ° C is e.g. B. in a safe Area far enough away from the body naturally occurring temperatures, such as. B. also fever. So can incorrect activation can be avoided. It is also advantageous the fact that activation is relatively short (1 to 2 minutes) are required, which is about 1/20 of the conventional heat inducible promoters required Activation time corresponds. This leads to an additional one Security z. B. with thermal activation, since at long Activation times a homogeneous heating of the tissue the whole period is not so easy.

Zusammengefaßt kann festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Klammer-PNA-Konjugate eine neue Art von Pharmaka darstellen, die effektiv an den Zielort transportiert werden und aufgrund ihrer hohen Stabilität und ausgezeichneten Spezifität eine stabile und effiziente Aktivitätskontrolle der miteingeschleusten Nukleinsäure (die ein "Prodrug" darstellt), z. B. Transkriptionskontrolle, ermöglichen. Die erfindungsgemäßen Klammer-PNA-Konjugate sollten selbst bei äußerst niedrigen Verabreichungsdosen (unter 100 pM Endkonzentration) wirksam sein, somit das Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen verhindern oder zumindest stark verringern. In summary it can be said that the clip-PNA conjugates according to the invention a new type of Pharmaceuticals that are effective at the destination be transported and due to their high stability and excellent specificity a stable and efficient Activity control of the nucleic acid (the represents a "prodrug"), e.g. B. transcription control, enable. The clip-PNA conjugates according to the invention should be used even at extremely low doses (below 100 pM final concentration), so that Prevent undesirable side effects from occurring at least greatly decrease.

Zusammengefaßt weisen diese Klammer-PNA-Konjugate somit folgende Vorteile auf: (a) Nicht-invasives Transportsystem, (b) modularer Aufbau, (c) zytoplasmatisch spaltbar, (d) Kernadressierungs-Signal, (e) Klammer-PNA zum Transport der gewünschten Nukleinsäuresequenz, die durch lokale Erwärmung (vorzugsweise durch eine Temperatur über 43°C) freigesetzt und aktiviert werden kann. In summary, these clip-PNA conjugates thus point the following advantages: (a) non-invasive transport system, (b) modular structure, (c) cytoplasmic cleavage, (d) Core addressing signal, (e) bracket PNA to transport the desired nucleic acid sequence by local heating (preferably by a temperature above 43 ° C) released and can be activated.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein PNA-Konjugat zum spezifischen Transport einer Nukleinsäuresequenz in den Zellkern und thermischen Aktivierbarkeit der Nukleinsäuresequenz am gewünschten Zielort, wobei das Konjugat die folgenden Komponenten aufweist:

  • a) ein Transportpeptidmodul für den Zellmembrantransport;
  • b) ein Adressprotein bzw. -peptid für den Import in Zellkompartimente, vorzugsweise den Zellkern; und
  • c) eine mit der zu transportierenden Nukleinsäuresequenz spezifisch hybridisierbare Klammer-Peptid-Nukleinsäure (Klammer-PNA).
The present invention thus relates to a PNA conjugate for the specific transport of a nucleic acid sequence into the cell nucleus and thermal activatability of the nucleic acid sequence at the desired target location, the conjugate having the following components:
  • a) a transport peptide module for cell membrane transport;
  • b) an address protein or peptide for import into cell compartments, preferably the cell nucleus; and
  • c) a clip peptide nucleic acid (clip PNA) which can be specifically hybridized with the nucleic acid sequence to be transported.

Bezüglich Verfahren zur Herstellung der einzelnen Komponenten der Konjugate und zu deren Verknüpfung wird auf die deutsche Patentanmeldung Nr. 199 33 492.7 verwiesen. Die Synthese von PNAs ist dem Fachmann bekannt und z. B. auch in Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500, beschrieben. Die Verknüpfung der Monomere der Klammer-PNA zu dem Dimer kann ebenfalls gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen, z. B. gemäß der in dem nachstehenden Beispiel dargestellten Vorgehensweise. Vorzugsweise sollte sich ein Spacer zwischen der Klammer-PNA und dem Adresspeptid befinden, um eine optimale Umklammerung der Ziel-dsDNA zu erreichen. Regarding processes for manufacturing the individual components the conjugate and its combination is based on the German Patent application No. 199 33 492.7. The synthesis of PNAs is known to the skilled worker and z. B. also in Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500. The Linking the monomers of the bracket PNA to the dimer can likewise take place according to methods known to the person skilled in the art, z. B. according to that shown in the example below Method. A spacer should preferably be between the bracket PNA and the address peptide are one to achieve optimal clasping of the target dsDNA.

Der Aufbau des erfindungsgemäßen Konjugats ist vorzugsweise: Klammer-PNA (einschl. dazu hybridisierte zu transportierende Nukleinsäuresequenz) - Transportmodul - Adressprotein bzw. Adresspeptid. The structure of the conjugate according to the invention is preferably: Bracket PNA (including hybridized to be transported Nucleic acid sequence) - transport module - address protein or Address peptide.

Den Transportvermittler für die Zellmembran stellt vorzugsweise ein Peptid bzw. Protein dar, das die Plasmamembran überwinden kann. Die Länge dieses Peptids bzw. Proteins unterliegt keiner Beschränkung, solange es die obige Eigenschaft aufweist. Beispiele für Transportvermittler stammen vorzugsweise aus der Penetratin-Familie (Derossi et al., Trends Cell Biol. 8 (1988), S. 84-87), sind Transportan bzw. Teile davon (Pooga et al., The Faseb Journal 12 (1998), S. 68 ff.) oder das Transmembranpeptid pAntp(43-58). The transport mediator for the cell membrane preferably a peptide or protein that the Can overcome the plasma membrane. The length of this peptide or Proteins is not restricted as long as it is the above Has property. Examples of transport intermediaries preferably come from the Penetratin family (Derossi et al., Trends Cell Biol. 8 (1988), pp. 84-87) are Transportan or parts thereof (Pooga et al., The Faseb Journal 12 (1998), P. 68 ff.) Or the transmembrane peptide pAntp (43-58).

Weitere Transmembrantransportvermittler wurden aus genomischen Datenbanken, HUSAR, GenBank, SRS und PDB (Proteindatenbank) im FASTA-Algorithmus erhalten:
Transportpeptid-Einheiten (TPU):
Bakteriell (ECo) 1A0P (GeneBank), site specif. Recombinase- (PDB). Further transmembrane transport mediators were obtained from genomic databases, HUSAR, GenBank, SRS and PDB (protein database) in the FASTA algorithm:
Transport peptide units (TPU):
Bacterial (ECo) 1A0P (GeneBank), site specif. Recombinase- (PDB).

Viral (HIV-1/TAT) 1TIV-HIV-1 (Geneßank), transactivator protein fragment (PDB). Viral (HIV-1 / TAT) 1TIV-HIV-1 (Genankank), transactivator protein fragment (PDB).

Human (Hox-Homöoboxgene) HXBS, human homeobox homologon (PDB). Human (Hox homeobox genes) HXBS, human homeobox homologous (PDB).

Sämtliche nachstehend gelisteten Transportpeptideinheiten (Geneßank) wurden identifiziert. Synthetisiert und erfolgreich getestet wurden HXB8, HXB1, HXA4.

All transport peptide units (gene bank) listed below have been identified. HXB8, HXB1, HXA4 were synthesized and successfully tested.

Hergestellt wird der ausgewählte Transportvermittler auf biologischem Weg (Reinigung natürlicher Transportvermittlerproteine oder Klonierung und Expression der Sequenz in einem eukaryotischen oder prokaryotischen Expressionssystem), bevorzugt aber auf synthetischem Weg, z. B. nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149). The selected transport agent is manufactured on biological way (cleaning natural Transport mediator proteins or cloning and expression the sequence in a eukaryotic or prokaryotic Expression system), but preferably by synthetic means, z. B. by the Merrifield method (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963).

Die Auswahl des Adressproteins bzw. -peptids kann der Fachmann anhand der bekannten Aminosäuresequenzen für den Import in den Zellkern steuernde Peptide bzw. Polypeptide auswählen. Prinzipiell unterliegt die Länge dieses Adresspeptids bzw. -proteins keiner Beschränkung, solange es die Eigenschaft aufweist, einen zellkernspezifischen Transport zu gewährleisten. Für die Einbringung der Klammer- PNAs mit der anhybridisierten Nukleinsäure werden im allgemeinen Adressproteine bzw. Adresspeptide ausgewählt, die ein zellkernspezifisches Erkennungssignal enthalten und dadurch die Klammer-PNAs in den Zellkern dirigieren. Grundsätzlich ist für den Transport in den Zellkern die reine Adressequenz ausreichend. Es können aber auch Adressproteine/Adresspeptide ausgewählt werden, die über eine zellkernspezifische Peptidasespaltstelle verfügen. Diese Spaltstelle liegt im günstigsten Fall innerhalb der Signalsequenz, kann aber auch an diese durch zusätzliche Aminosäuren angefügt werden, um nach Erreichen des Zellkerns das Abspalten der Adressequenz sicherzustellen. Hergestellt wird die ausgewählte "AP"-Sequenz auf biologischem Weg (Reinigung natürlicher Transportvermittlerproteine oder Klonierung und Expression der Sequenz in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Expressionssystem), bevorzugt aber auf synthetischem Weg, z. B. nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149). Beispiele für geeignete Adressproteine bzw. - peptide sind: (a) -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val und (b) H3N+-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- (= "Nuclear localisation sequence" (NLS) aus SV40-T-Antigen). The person skilled in the art can select the selection of the address protein or peptide based on the known amino acid sequences for the import into the cell nucleus controlling peptides or polypeptides. In principle, the length of this address peptide or protein is not subject to any restriction, as long as it has the property of ensuring a cell nucleus-specific transport. Address proteins or address peptides that contain a cell nucleus-specific recognition signal and thus direct the clamp PNAs into the cell nucleus are generally selected for the introduction of the clamp PNAs with the hybridized nucleic acid. In principle, the pure address sequence is sufficient for the transport into the cell nucleus. However, address proteins / address peptides can also be selected which have a cell nucleus-specific peptide cleavage site. In the most favorable case, this cleavage site lies within the signal sequence, but can also be added to it by additional amino acids in order to ensure that the address sequence is cleaved off after reaching the cell nucleus. The selected "AP" sequence is produced by biological means (purification of natural transport mediator proteins or cloning and expression of the sequence in a eukaryotic or prokaryotic expression system), but preferably by synthetic means, e.g. B. by the Merrifield method (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149). Examples of suitable address proteins or peptides are: (a) -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val and (b) H 3 N + -Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys- Val- (= "Nuclear localization sequence" (NLS) from SV40-T antigen).

Weiter kann das Konjugat ggf. einen Spacer (vorstehend mit SP abgekürzt) enthalten, der sich vorzugsweise zwischen dem Adressprotein/-peptid und der zu transportierenden Klammer- Peptid-Nukleinsäure befindet. Er kann aber zusätzlich oder alternativ auch zwischen dem Transportvermittler und dem Adressprotein vorliegen. Der Spacer dient dazu, ggf. vorhandene sterische Wechselwirkungen zwischen den Komponenten aufzuheben bzw. günstig zu beeinflussen. Der Spacer kann beispielsweise ausgewählt sein aus Polylysin, Polyethylenglykol (PEG), Derivate der Poly-Methacrylsäure oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Furthermore, the conjugate can optionally be a spacer (above with SP abbreviated) included, which is preferably between the Address protein / peptide and the clip to be transported Peptide nucleic acid is located. But he can also or alternatively also between the transport intermediary and the Address protein is available. The spacer serves to existing steric interactions between the Pick up components or influence them favorably. The Spacer can for example be selected from polylysine, Polyethylene glycol (PEG), derivatives of poly methacrylic acid or polyvinyl pyrrolidone (PVP).

Zwischen dem Transportvermittler und dem Adressprotein/- peptid befindet sich vorzugsweise eine Redoxspaltstelle, z. B. -Cystein-S-S-Cystein-O-N-H-. Die zwischen Transportvermittler und Adressprotein entstehende Bindung ist eine Redoxkopplung (schonende zellimmanente Verknüpfung mittels DMSO Rietsch und Beckwith, Annu. Rev. Genet 32 (1998), 163-84):

Cystein-SH SH-Cystein → Cystin-S-S-Cystin
There is preferably a redox cleavage site between the transport mediator and the address protein / peptide, e.g. B. -Cysteine-SS-Cysteine-ONH-. The bond that is formed between the transport mediator and the address protein is a redox coupling (gentle cell-inherent linkage using DMSO Rietsch and Beckwith, Annu. Rev. Genet 32 (1998), 163-84):

Cysteine-SH SH-cysteine → cystine-SS-cystine

Die Klammer-Peptid-Nukleinsäure (Klammer-PNA) der erfindungsgemäßen Konjugate erlaubt den spezifischen Transport und die gezielte Freisetzung (und damit Aktivierung) der transportierten Nukleinsäuresequenz über lokale Erwärmung. Dabei kann die zu transportierende Nukleinsäuresequenz über die PNA-Klammer im Vergleich zu einer Monomer-PNA effizienter gebunden werden. Dabei besteht die PNA-Klammer aus zwei zu Zielsequenzen komplementären PNAs, die vorzugsweise mit jeweils zwei Glycin-Resten über ε- Amino-und α-Amino-Lysin verbunden sind. Die Sequenzspezifität wird durch die Anzahl der Nukleobasen erreicht, vorzugsweise 18-23 Basen. Die höhere Stabilität der H-Brückenbindungen zwischen den PNA-Nukleobasen und den DNA-Nukleobasen kommt durch die Bildung von Dreifachhelix-Bindungen zustande PNA/DNA/PNA:


The clip peptide nucleic acid (clip PNA) of the conjugates according to the invention allows the specific transport and the targeted release (and thus activation) of the transported nucleic acid sequence via local heating. The nucleic acid sequence to be transported can be bound more efficiently than a monomer PNA using the PNA clamp. The PNA bracket consists of two PNAs complementary to target sequences, which are preferably each linked to two glycine residues via ε-amino and α-amino-lysine. The sequence specificity is achieved by the number of nucleobases, preferably 18-23 bases. The higher stability of the H-bridge bonds between the PNA nucleobases and the DNA nucleobases results from the formation of triple helix bonds PNA / DNA / PNA:


Für die Bindung der zu transportierenden Nukleinsäuresequenz geeignete Bereiche können vom Fachmann leicht bestimmt werden, wobei darauf zu achten ist, dass solche Sequenzen der zu transportierenden Nukleinsäure hybridisieren und damit inaktiviert werden, die z. B. für eine vollständige Transkription/Translation benötigt werden. Dabei kann es sich z. B. um Kontrollsequenzen handeln oder auch um zu transkribierende/translatierende Sequenzbereiche. Die miteinander hybridisierenden Bereiche (Klammer-PNA/zu transportierende Nukleinsäuresequenz) werden entsprechend allgemein bekannten Verfahren so gewählt, dass sie bei Temperaturen unter 37°C stabil ist, bei Temperaturen über 43°C die Hybridisierung aufgelöst wird. Dies kann z. B. durch die Auswahl der Länge der miteinander hybridisierenden Bereiche in Abhängigkeit vom GC-Gehalt bestimmt werden. For binding the nucleic acid sequence to be transported suitable ranges can easily be determined by a person skilled in the art , taking care that such sequences of the hybridize to be transported and thus be deactivated, the z. B. for a complete Transcription / translation are required. It can be z. B. to control sequences or to transcribing / translating sequence areas. The areas hybridizing with each other (bracket PNA / zu transporting nucleic acid sequence) are corresponding generally known methods chosen so that they are Temperatures below 37 ° C is stable at temperatures above The hybridization is dissolved at 43 ° C. This can e.g. B. by the choice of the length of the hybridizing Ranges depending on the GC content can be determined.

Die Mindestlängen der PNAs sind variabel, es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass unter physiologischen Bedingungen bzw. unter erhöhten Temperaturen (z. B. bei Fieber) eine stabile Bindung möglich ist, um eine unkontrollierte Genaktivierung zu vermeiden. Vorzugsweise weisen die Peptid-Nukleinsäure-Monomere der Klammer-PNA eine Länge von mindestens jeweils 18 Basen und mehr bevorzugt mindestens 21 Basen auf, besonders bevorzugt sind Peptid- Nukleinsäuren mit einer Länge von mindestens jeweils 23 Basen. Die Peptid-Nukleinsäure-Klammer kann ggf. auch markiert sein, z. B. radioaktiv, mit einem Farbstoff, mit Biotin/Avidin usw. The minimum lengths of the PNAs are variable, but it should care should be taken that under physiological Conditions or at elevated temperatures (e.g. at Fever) a stable bond is possible to a to avoid uncontrolled gene activation. Preferably the peptide nucleic acid monomers of the clamp PNA Length of at least 18 bases each and more preferred at least 21 bases, particularly preferred are peptide Nucleic acids with a length of at least 23 each Bases. The peptide-nucleic acid clip can also if necessary be marked, e.g. B. radioactive, with a dye, with Biotin / avidin etc.

Die Synthese der Konjugatbestandteile P und AP erfolgt vorzugsweise synthetisch nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149) Die Ankopplung der anderen Bestandteile (z. B. Spacer und/oder PNA) daran erfolgt durch kovalente chemische Bindung. Die Einfügung der Redoxspaltstelle zwischen P und AP erfolgt auf chemischen Wege durch die oben erwähnte Redoxkopplung. Auch zwischen einem ggf. vorhandenen Spacer und der PNA bzw. dem Adressprotein und der PNA liegt eine kovalente Bindung vor, bevorzugt eine Säureamid-Bindung. Mögliche Alternativen sind Ether- oder Ester-Bindungen, je nach den in der zu konjugierenden Substanz vorhandenen funktionellen Gruppe(n). The conjugate constituents P and AP are synthesized preferably synthetically according to the Merrifield method (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149) Die Coupling the other components (e.g. spacers and / or PNA) is done by covalent chemical bonding. The The redox gap between P and AP is inserted chemical pathways through the redox coupling mentioned above. Also between a spacer, if any, and the PNA or the Address protein and the PNA is covalently bound, preferably an acid amide bond. Possible alternatives are Ether or ester linkages, depending on the in the conjugating substance existing functional group (s).

Die Applikation des erfindungsgemäßen Gemischs aus Klammer- PNA-Konjugat und zu transportierender Nukleinsäuresequenz, die mit der Klammer-PNA über Triple-Helix-Bildung hybridisiert, erfolgt vorzugsweise in vitro direkt ins Kulturmedium (vorzugsweise mit einer Endkonzentration von etwa 100 pM) und in vivo intraperitoneal, intravenös oder intratumoral. The application of the mixture of clamps according to the invention PNA conjugate and nucleic acid sequence to be transported, the one with the bracket PNA via triple helix formation hybridized, preferably takes place directly in vitro Culture medium (preferably with a final concentration of about 100 pM) and in vivo intraperitoneally, intravenously or intratumoral.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen PNA-Konjugats umfaßt die Klammer-PNA zwei identische PNA- Moleküle, die über ihre C-Termini kovalent miteinander verknüpft sind. In a preferred embodiment of the invention PNA conjugate, the bracket PNA comprises two identical PNA Molecules that are covalently linked to each other via their C-termini are linked.

In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen PNA-Konjugats ist das Adressprotein bzw. - peptid an den C-Terminus eines PNA-Molekül-Monomers kovalent gebunden. In an even more preferred embodiment of the PNA conjugate according to the invention is the address protein or - peptide covalently to the C-terminus of a PNA molecule monomer bound.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Gemisch aus den vorstehend beschriebenen Klammer-PNA-Konjugaten und einer zu transportierenden, an die Klammer-PNA hybridisierten Nukleinsäuresequenz, wobei es sich vorzugsweise um eine doppelsträngige DNA (dsDNA), dsRNA oder Nukleinsäurederivat (z. B. Morpholinos) handelt, sowie ein dieses erfindungsgemäßes Konjugat, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Träger, enthaltendes Arzneimittel sowie dessen Verwendung zur lokalen, nicht-invasiven Gentherapie, wobei die Aktivierung der Nukleinsäure durch Dissoziation der Klammer-PNA durch lokale Erwärmung erfolgt. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung intraperitoneal, intravenös oder intratumoral. The present invention also relates to a mixture of the clip-PNA conjugates described above and one to transporting hybridized to the staple PNA Nucleic acid sequence, which is preferably a double-stranded DNA (dsDNA), dsRNA or nucleic acid derivative (e.g. Morpholinos), as well as one of these conjugate according to the invention, optionally together with a suitable carrier, medicament containing and its Use for local, non-invasive gene therapy, whereby the activation of the nucleic acid by dissociation of the Bracket PNA is done by local heating. Preferably is administered intraperitoneally, intravenously or intratumoral.

Das erfindungsgemäße Gemisch aus Klammer-PNA-Konjugat und zu transportierender Nukleinsäuresequenz erlaubt die Aktivierung der transportierten Nukleinsäuresequenz am Zielort durch lokale Hyperthermie. Es wird somit eine lokale Gentherapie ermöglicht, die vom Zell- z. B. Tumortyp unabhängig ist, d. h. das von der transportierten Nukleinsäure kodierte Produkt wird nur dann wirksam, wenn es lokal aktiviert wird. Beispiele für geeignete Nukleinsäuresequenzen bzw. davon kodierte Produkte sind eine mit der PNA hybridisierbare DNA mit integrierter VP22HSV-Sequenz (Elliott und O'Hare, Gene Ther. 6 (1999), 149-151; Luft, J. Mol. Med. 77 (1999), 575-576). VP22HSV erleichtert den Zell-Zell-Transport von genetischem Material. Weitere Beispiele sind DNA-Sequenzen, die HSV-Thymidinkinase (Wirkung in Verbindung mit GCV Ganciclovir), Cytosindeaminase (Wirkung in Verbindung mit FU Fluoruracil) sowie den Jodid-Symporter (Wirkung in Verbindung mit Jodid) kodieren. Der Hybridbreich wird vorzugsweise so gewählt, dass die Dissoziation der zu aktivierenden Nukleinsäuresequenz von der Klammer-PNA erst ab Temperaturen über 43°C erfolgt, d. h. der Wirkort und der gewünschte Zeitpunkt der Wirkung wird durch eine lokale Erwärmung des Zielbereichs/Zielgewebes erreicht. Dabei sollte die applizierte Temperatur jedenfalls so bemessen sein, dass es nicht schon allein durch den Temperatureffekt zum Zelltod kommt, der sowohl von der Temperatur als auch der Expositionszeit abhängt (Sapareto und Dewey, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 10 (1984), 787-800). The mixture according to the invention of clip-PNA conjugate and nucleic acid sequence to be transported allows the activated nucleic acid sequence to be activated at the target site by local hyperthermia. Local gene therapy is thus made possible, which depends on the cell z. B. tumor type is independent, ie the product encoded by the transported nucleic acid is only effective if it is locally activated. Examples of suitable nucleic acid sequences or products encoded thereby are a DNA which can be hybridized with the PNA and has an integrated VP22 HSV sequence (Elliott and O'Hare, Gene Ther. 6 (1999), 149-151; Luft, J. Mol. Med. 77 (1999), 575-576). VP22 HSV facilitates the cell-cell transport of genetic material. Further examples are DNA sequences which encode HSV thymidine kinase (action in connection with GCV ganciclovir), cytosine deaminase (action in connection with FU fluorouracil) and the iodide symporter (action in connection with iodide). The hybrid region is preferably chosen such that the dissociation of the nucleic acid sequence to be activated from the staple PNA only takes place from temperatures above 43 ° C., ie the site of action and the desired time of action is achieved by local heating of the target area / target tissue. In any case, the applied temperature should be such that cell death does not result solely from the temperature effect, which depends on both the temperature and the exposure time (Sapareto and Dewey, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 10 (1984), 787-800).

Der Fachmann kennt geeignete Verfahren zur Durchführung einer lokalen Hyperthermie, die für die Freisetzung und Aktivierung der von den erfindungsgemäßen Klammer-PNA-Konjugaten transportierten Nukleinsäure geeignet sind (siehe dazu "Methods of external hyperthermic heating", M. Gauthery (Ed.), 1990, Springer Verlag, Berlin. Dazu zählen u. a. die folgenden Verfahren:

  • a) Laserlicht: Dabei wird Laserlicht durch eine Faser in das Zielgebiet geleitet und durch Absorption des Laserlichts wird das Zielgebiet (z. B. Gewebe) erwärmt.
  • b) Mikrowellen: Dabei gibt es verschiedene Möglichkeiten. Zum einen kann dies durch Antennen außerhalb des Körpers bewirkt werden, wobei durch eine bestimmte Fokussierung ein lokal begrenzter Bereich erwärmt werden kann. Allerdings können dabei komplexe Zielgebiete nur schwer homogen erwärmt werden. Zum anderen können Mikrowellen auch lokal z. B. durch eine in das Zielgebiet eingestochene Mikrowellenantenne appliziert werden.
  • c) Hochfrequenzströme: Hierbei fließt ein Strom durch eine dünne Nadelspitze, die im Zielgebiet positioniert ist, zu einer großflächigen Normalelektrode. Durch die hohe Stromdichte um die i. d. R. feine Nadel wird dort das Gewebe lokal erwärmt.
  • d) Ultraschall: Mittels hochenergetischem, fokussiertem Ultraschall ist es möglich, Gewebe tief im Körperinnern perkutan, nicht-invasiv zu erwärmen. Hierbei wird ein fokussiertes Ultraschallfeld erzeugt und in den Körper eingekoppelt. Im Fokusbereich wird so das Gewebe aufgrund der Ultraschallabsorption erwärmt. Technisch bedingt ist der Fokusbereich normalerweise relativ klein, der Fokus kann jedoch, z. B. durch abscannende Verfahren, vergrößert werden.
The person skilled in the art knows suitable methods for carrying out local hyperthermia which are suitable for the release and activation of the nucleic acid transported by the clip-PNA conjugates according to the invention (see also "Methods of external hyperthermic heating", M. Gauthery (Ed.), 1990 , Springer Verlag, Berlin, including the following processes:
  • a) Laser light: Laser light is guided through a fiber into the target area and the target area (e.g. tissue) is heated by absorption of the laser light.
  • b) Microwaves: There are various options. On the one hand, this can be achieved by antennas outside the body, whereby a locally limited area can be heated by a certain focusing. However, complex target areas can only be heated homogeneously with difficulty. On the other hand, microwaves can also locally z. B. applied by a pierced microwave antenna.
  • c) High-frequency currents: Here, a current flows through a thin needle tip, which is positioned in the target area, to a large-area normal electrode. Due to the high current density around the fine needle, the tissue is locally heated.
  • d) Ultrasound: Using high-energy, focused ultrasound, it is possible to percutaneously heat tissue deep inside the body, non-invasively. Here, a focused ultrasound field is generated and coupled into the body. In the focus area, the tissue is heated due to the ultrasound absorption. For technical reasons, the focus range is usually relatively small. B. by scanning method, be enlarged.

Bei Durchführung dieser lokalen Hyperthermie-Verfahren ist eine Überwachung und Führung äußerst wichtig. Dies kann durch verschiedene bekannte Verfahren erreicht werden, z. B. mittels der in "Thermometry in therapeutic Hyperthermia", M. Gauthery (Herausgeber), 1990, Springer Verlag, Berlin, beschriebenen Verfahren. Als nicht-invasives Verfahren bietet sich z. B. die Magnetresonanztomographie (MRT) an, die eine Temperaturauflösung von ca. 2-5°C erlaubt, alternativ dazu Verfahren mit diagnostischem Ultraschall oder Computer- Tomographie. Für die Applikation des erfindungsgemäßen Komplexes aus Klammer-PNA-Konjugat und zu transprotierender Nukleinsäuresequenz wird die gezielte nicht-invasive lokale Gewebeerwärmung durch fokussierten Ultraschall unter MRT- Kontrolle bevorzugt. When performing this local hyperthermia procedure is monitoring and management are extremely important. This can be done by various known methods can be achieved, e.g. B. means that in "Thermometry in therapeutic Hyperthermia", M. Gauthery (Editor), 1990, Springer Verlag, Berlin Method. As a non-invasive procedure z. B. the Magnetic resonance imaging (MRI), the one Temperature resolution of approx. 2-5 ° C allowed, alternatively Procedures using diagnostic ultrasound or computer Tomography. For the application of the invention Complex of clip-PNA conjugate and to be transprotected Nucleic acid sequence becomes the targeted non-invasive local Tissue heating by focused ultrasound under MRI Control preferred.

Die Klammer-PNA-Konjugate erlauben den Transport therapeutischer Gene (z. B. zur Gensubstitution defekter Gene). Die erfindungsgemäßen Komplexe aus Klammer-PNA- Konjugat und zu transportierender Nukleinsäuresequenz eignen sich u. a. zur gezielten Tumortherapie, z. B. zur Zerstörung solider Tumoren, Tumoren, die gegenüber Chemotherapie resistent sind, inoperablen Tumoren, und z. B. auch zur Gentherapie von Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes oder Hypercholesterinämie etc. Weitere denkbare Anwendungen sind beim Monitoring (z. B. MRI ("Magnet Resonanz Imaging")) und in der Diagnostik (z. B. für Transferrinrezeptorgen (TfR), Iodid- Symportergen oder Galactosidasegen (Gadolinium)). The clip-PNA conjugates allow transport therapeutic genes (e.g. for substituting defective genes Gene). The clip-PNA complexes according to the invention Conjugate and nucleic acid sequence to be transported are suitable yourself u. a. for targeted tumor therapy, e.g. B. for destruction solid tumors, tumors compared to chemotherapy are resistant, inoperable tumors, and e.g. B. also for Gene therapy for metabolic diseases such as diabetes or Hypercholesterolemia etc. Other conceivable applications are in monitoring (e.g. MRI ("Magnet Resonance Imaging")) and in diagnostics (e.g. for transferrin receptor genes (TfR), iodide Symporter gene or galactosidase gene (Gadolinium)).

Legenden zu den FigurenLegends for the figures

Fig. 1 Schematische Darstellung des Protokolls zur Herstellung, Transfektion und Wirkungsweise des erfindungsgemäßen Klammer-PNA-Konjugats Fig. 1 Schematic representation of the protocol for the production, transfection and mode of action of the clip-PNA conjugate according to the invention

Fig. 2 Darstellung der Einschleusung des Konjugats und der Genaktivierung anhand der GFP-Transkription über DIC/CLSM
(A): AT-1-Rattenprostatakrebszellen; Endkonzentration des Konjugats: 100 pM; Inkubationszeit: 1 h (DIC).
(B): AT-1-Rattenprostatakrebszellen; Endkonzentration des Konjugats: 100 pM; Inkubationszeit: 1 h; Aktivierungsdauer: 30 Sek., 44°C; GFP-Fluoreszenz.
(C): AT-1-Rattenprostatakrebszellen; Endkonzentration des Konjugats: 100 pM; Aktivierungsdauer: 30 Sek., 44°C; GFP- Fluoreszenz/DIC. Fig. 2 representation of the introduction of the conjugate and the gene activation based on the GFP transcription via DIC / CLSM
(A): AT-1 rat prostate cancer cells; Final conjugate concentration: 100 pM; Incubation time: 1 h (DIC).
(B): AT-1 rat prostate cancer cells; Final conjugate concentration: 100 pM; Incubation time: 1 h; Activation time: 30 seconds, 44 ° C; GFP fluorescence.
(C): AT-1 rat prostate cancer cells; Final conjugate concentration: 100 pM; Activation time: 30 seconds, 44 ° C; GFP fluorescence / DIC.

Fig. 3 Darstellung der Einschleusung des Konjugats und der Genaktivierung anhand der GFP-Transkription über DIC/CLSM
(A): DU-145, humane Prostatakrebszellen; Endkonzentration des Konjugats: 100 pM; Inkubationszeit: 1 h (DIC).
(B): DU-145, humane Prostatakrebszellen; Endkonzentration des Konjugats: 100 pM; Inkubationszeit: 1 h; Aktivierungsdauer: 30 Sek., 44°C; nukleäre DAPI-Färbung, GFP-Fluoreszenz/DIC.
(C): DU-145, humane Prostatakrebszellen; Endkonzentration des Konjugats: 100 pM; inaktive Kontrolle, CLSM. Fig. 3 representation of the introduction of the conjugate and the gene activation based on the GFP transcription via DIC / CLSM
(A): DU-145, human prostate cancer cells; Final conjugate concentration: 100 pM; Incubation time: 1 h (DIC).
(B): DU-145, human prostate cancer cells; Final conjugate concentration: 100 pM; Incubation time: 1 h; Activation time: 30 seconds, 44 ° C; nuclear DAPI staining, GFP fluorescence / DIC.
(C): DU-145, human prostate cancer cells; Final conjugate concentration: 100 pM; inactive control, CLSM.

Fig. 4 Messung der Genaktivierung anhand der GFP- Fluoreszenz Fig. 4 measurement of gene activation based on GFP fluorescence

Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben. The invention is further illustrated by the following examples described.

Beispiel 1example 1 Synthese eines Klammer-PNA-Konjugats, das pDNA-EGFP-C3 transportieren und durch lokale Erwärmung in der Zielzelle freisetzen und somit aktivieren kannSynthesis of a clip-PNA conjugate, the pDNA-EGFP-C3 transport and by local warming in the target cell release and thus can activate (A) Peptidsynthese(A) Peptide synthesis

Für die Festphasensynthese wurde die Fmoc-Strategie mittels einem vollautomatisierten Synthesegeräts (Syro II (Multisyntech, Witten, Deutschland) verwendet. Die Synthese wurde an einem 0,05 mmol Fmoc-AS-Polystyrenharz (1% quervernetzt) durchgeführt. Als Kopplungsreagenz wurde 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) verwendet. Die Seitenketten schützenden Gruppen waren Lys(Boc), Asp(Obut), Ser(But), Cys(Trt) und Asn(Trt). Das geschützte Peptidylharz wurde mit 20% Piperidin in Dimethylformamid behandelt. Die Spaltung und Abspaltung der Schutzgruppen wurde durch Behandlung mit 90% Trifluoressigsäure, 5% Äthandithiol, 2,5% Thioanisol und 2,5% Phenol (Vol./Vol./Vol.) für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur erzielt. Alle Produkte wurden in Äther präzipitiert und über präparative HPLC (Shimazu LC-8A, Shimazu, Duisburg, Deutschland) auf einer YMC ODS-A 7A S-7 µm Umkehrphasen-HPLC-Säule (20 × 250 mm) unter Verwendung von 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser (A) und 60% Acetonitril in Wasser (B) als Elutionsmittel gereinigt. Die Peptide wurde mit einem linearen Gradienten von 25% B bis 60% B innerhalb von 40 Min. bei einer Durchflußrate von 10 ml/Min. eluiert. Die dem gereinigten Konjugat entsprechenden Fraktionen wurden lyophilisiert. Sequenzen von Einzelmolekülen sowie das vollständige bimodulare Konstrukt wurden über analytische HPLC (Shimadzu LC-10) und Laser- Desorptionsmassenspektroskopie (Finnigan Vision 2000, Finnigan, San Jose CA, USA) wie nachstehend angegeben charakterisiert. Die Sequenz des PNA-Monomers war wie folgt: H2N..TGC CAC CCT CCA GAT ATA TTC..COOH. Dabei handelt es sich um eine Sequenz, die mit dem folgenden Bereich der pDNA-EGFP-C3 (Clontech, Paolo Alto, CA, USA) hybridisieren kann: Pos. 542..ACG GTG GGA GGT CTA TAT AAG..Pos.563 (Bereich des die Expression von EGFP steuernden CMV-Promotors (Gesamtbereich: Pos. 1-589; Enhancer-Bereich: Pos. 59-465; TATA-Box: Pos. 554-560). (B) Peptidreinigung Gradient: analyt. 5% → 80% (in einem Zeitraum von 35 Min.); präparativ: 5% → 80% (in einem Zeitraum von 40 Min.);
Reinheit: > 90%. The Fmoc strategy using a fully automated synthesizer (Syro II (Multisyntech, Witten, Germany) was used for solid-phase synthesis. The synthesis was carried out on a 0.05 mmol Fmoc-AS polystyrene resin (1% cross-linked). The coupling reagent used was 2- (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) The side chain protecting groups were Lys (Boc), Asp (Obut), Ser (But), Cys (Trt) and Asn (Trt.) The protected peptidyl resin was treated with 20% piperidine in dimethylformamide. The cleavage and deprotection was accomplished by treatment with 90% trifluoroacetic acid, 5% ethanedithiol, 2.5% thioanisole and 2.5% phenol (v / v ./Vol.) For 2.5 hours at room temperature All products were precipitated in ether and by preparative HPLC (Shimazu LC-8A, Shimazu, Duisburg, Germany) on a YMC ODS-A 7A S-7 µm reverse phase HPLC Column (20 × 250 mm) using 0.1% trifluoroacetic acid in Purified water (A) and 60% acetonitrile in water (B) as eluent. The peptides were treated with a linear gradient from 25% B to 60% B within 40 minutes at a flow rate of 10 ml / min. eluted. The fractions corresponding to the purified conjugate were lyophilized. Sequences of single molecules as well as the complete bimodular construct were characterized by analytical HPLC (Shimadzu LC-10) and laser desorption mass spectroscopy (Finnigan Vision 2000, Finnigan, San Jose CA, USA) as indicated below. The sequence of the PNA monomer was as follows: H 2 N..TGC CAC CCT CCA GAT ATA TTC..COOH. This is a sequence that can hybridize with the following area of pDNA-EGFP-C3 (Clontech, Paolo Alto, CA, USA): Item 542..ACG GTG GGA GGT CTA TAT AAG..Pos.563 ( Area of the CMV promoter which controls the expression of EGFP (total area: items 1-589; enhancer area: items 59-465; TATA box: items 554-560). (B) Peptide purification gradient: analytical. 5% → 80% (in a period of 35 minutes); preparative: 5% → 80% (in a period of 40 minutes);
Purity:> 90%.

(C) Verknüpfung der PNA-Monomere zu dem Klammer-PNA-Modul(C) Linking the PNA monomers to the bracket PNA module

Die Verknüpfung erfolgte nach den vorstehend beschriebenen Verfahren. Das so synthetisierte Klammer- PNA-Modul weist folgende Struktur auf:


The linking was carried out according to the methods described above. The clamp PNA module thus synthesized has the following structure:


(D) Peptidverknüpfungen(D) peptide linkages

Die Verknüpfung des Klammer-PNA-Moduls mit der kernadressierenden NLS-Sequenz und dem Transportpeptidmodul erfolgte wie in der deutschen Patentanmeldung Nr. 199 33 492.7 beschrieben unter milden oxidativen Bedingungen (DMSO/H2O). Es wurden die folgenden Module getestet: Penetratin, TPU1A0P, TPUhuman, TPUHIV-1/TAT. The linkage of the clamp PNA module with the core-addressing NLS sequence and the transport peptide module was carried out as described in German patent application No. 199 33 492.7 under mild oxidative conditions (DMSO / H 2 O). The following modules were tested: Penetratin, TPU 1A0P , TPU human , TPU HIV-1 / TAT .

Struktur des Klammer-PNA-Moduls mit der kernadressierenden Sequenz und anschließende oxidative Kopplung des Klammer-PNA-Moduls/pDNA-Hybrid (Modul 1) an das Transportmodul (TP oder TPU) (Modul 2)(schematisiert):


Structure of the clip-PNA module with the core-addressing sequence and subsequent oxidative coupling of the clip-PNA module / pDNA hybrid (module 1) to the transport module (TP or TPU) (module 2) (schematic):


Die Aufreinigung erfolgte mittels Umkehrphasen-HPLC, anschließend wurde lyophilisiert. Nach Bestimmung der Masse mittels MS-MS wurde das Lyophilisat in einem definiertem Volumen physiologischer Kochsalzlösung zu einer Stammlösung von 10 µM gelöst. The purification was carried out by reverse phase HPLC, it was then lyophilized. After determining the mass the lyophilizate was defined in a defined manner by means of MS-MS Volume of physiological saline to a stock solution solved from 10 µM.

(E) Anlagerung der pDNA-Sequenz (pDNA-EGFP-C3 (Clontech)) an das Klammer-PNA-Modul(E) Attachment of the pDNA sequence (pDNA-EGFP-C3 (Clontech)) the bracket PNA module

Die Hybridisierung definierter DNA-Bereiche (siehe Schritt (A)) erfolgte gemäß Standard-Verfahren (Britten und Kohne, Science 161 (1968), 3841). The hybridization of defined DNA regions (see step (A)) was carried out according to standard procedures (Britten and Kohne, Science 161 (1968), 3841).

Struktur des Konjugatas mit anhybridisiertem Plasmid:


Structure of the conjugate with hybridized plasmid:


Beispiel 2Example 2 Bestimmung der Einschleusing des Gesamt-Konjugates und der Aktivierung des von pEGFP-C3 über den CMV-Promotor exprimierten Fluoreszenzproteins nach lokaler ErwärmungDetermination of the insertion of the total conjugate and the Activation of pEGFP-C3 via the CMV promoter expressed fluorescent protein after local heating (A) Verabreichung des Gesamt-Konjugats(A) Administration of the total conjugate

Das Konjugat wurde parenteral (i. v.) an verschiedene Tumorzellen (AT-1, Ratten-Prostatakarzinomzellinie; DU-145, humane Prostatakarzinomzellinie; HeLa-Zellen) verabreicht. Die Wirkstoff-Endkonzentration lag im Bereich von 100 pM. The conjugate was administered parenterally (i.v.) to various Tumor cells (AT-1, rat prostate carcinoma cell line; DU-145, human prostate carcinoma cell line; HeLa cells) administered. The final drug concentration was in the range of 100 pM.

(B) Bestimmung der Einschleusing des Gesamt-Konjugates und der Aktivierung des von pEGFP-C3 über den CMV-Promotor exprimierten Fluoreszenzproteins nach lokaler Erwärmung(B) determining the infiltration of the overall conjugate and activation of pEGFP-C3 via the CMV promoter expressed fluorescent protein after local heating

Die Aktivierung erfolgte durch lokale Erwärmung der Tumorzellen auf 37-45°C für 30, 60, 120 und 300 Sek. mittels fokusierter Ultraschallwellen 1, 2 oder 3 Stunden nach erfolgter Applikation des Gesamt-Konjugats. In einem Kontrollexperiment erfolgte keine lokale Erwärmung. Die Bestimmung der Lokalisation des Reportergens und dessen Freisetzung nach lokaler Erwärmung erfolgte über Messung der Konzentration des Fluoreszenzproteins mittels einer Kombination DIC/CLSM (Fig. 2 und 3) oder einer Fluoreszenzmessung (Fig. 4). The activation was carried out by locally heating the tumor cells to 37-45 ° C. for 30, 60, 120 and 300 seconds by means of focused ultrasound waves 1, 2 or 3 hours after the entire conjugate had been applied. There was no local warming in a control experiment. The location of the reporter gene and its release after local heating was determined by measuring the concentration of the fluorescent protein using a combination of DIC / CLSM ( FIGS. 2 and 3) or a fluorescence measurement ( FIG. 4).

Es konnte gezeigt werden, dass das Gesamt-Konjugat bereits nach 60 Sek. Inkubationszeit effizient (100%) aufgenommen wurde. Mittels der GFP-Fluoreszenz konnte gezeigt werden, dass bereits ein Zeitraum von 30 Sek. zur Genaktivierung ausreichte (Fig. 2, 3 und 4). Die Messung von GFP-Aktivität erfolgte nach 24 Stunden (Fig. 2 und 3). Die Fig. 2(B, C) und 3(B) (DIC/CLSM) belegen die effiziente Aufnahme des Konjugats und die effiziente GFP-Transkription, d. h., die Freisetzung der transportierten DNA erfolgt nach lokaler Erwärmung (und nicht im Kontrollexperiment (ohne Ewärmung); siehe Fig. 3(C). GFP ist im Zytoplasma nachweisbar. Fig. 4 zeigt außerdem deutlich die Temperaturabhängigkeit der Aktivierung: Bei 43°C ist noch keine Aktivierung zu beobachten, eine Temperaturerhöhung um lediglich ein 1°C auf 44°C führt zu einer deutlichen Aktivierung. It was shown that the entire conjugate was absorbed efficiently (100%) after just 60 seconds of incubation. GFP fluorescence was able to show that a period of 30 seconds was sufficient for gene activation ( FIGS. 2, 3 and 4). GFP activity was measured after 24 hours ( FIGS. 2 and 3). The Fig. 2 (B, C) and 3 (B) (DIC / CLSM) demonstrate the efficient uptake of the conjugate and the efficient GFP-transcription, that is, the release of the transported DNA is carried out by local heating (and not in the control experiment (without is see Figure 3 (C) GFP in the cytoplasm detectable Figure 4 also clearly shows the temperature dependence of activation; Ewärmung): at 43 ° C no activation is observed, a temperature increase of only a 1 ° C at 44 °.... C leads to a clear activation.

Claims (10)

1. Klammer-PNA-Konjugat zum spezifischen Transport einer Nukleinsäuresequenz in Zellkompartimente und thermischen Aktivierbarkeit der Nukleinsäuresequenz am gewünschten Zielort, wobei das Konjugat die folgenden Komponenten aufweist: a) ein Transportpeptidmodul für den Zellmembrantransport; b) ein Adressprotein bzw. -peptid für den Import in den Zellkern; und c) eine mit der zu transportierenden Nukleinsäuresequenz spezifisch hybridisierbare Klammer-Peptid-Nukleinsäure (Klammer-PNA). 1. Clip-PNA conjugate for the specific transport of a nucleic acid sequence in cell compartments and thermal activation of the nucleic acid sequence at the desired target location, the conjugate having the following components: a) a transport peptide module for cell membrane transport; b) an address protein or peptide for import into the cell nucleus; and c) a clip peptide nucleic acid (clip PNA) which can be specifically hybridized with the nucleic acid sequence to be transported. 2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Klammer-PNA zwei identische PNA-Molekülen umfaßt, die über ihre C-Termini kovalent miteinander verknüpft sind. 2. The conjugate of claim 1, wherein the staple PNA is two includes identical PNA molecules via their C-termini are covalently linked. 3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Adressprotein bzw. -peptid an den C-Terminus eines PNA-Moleküls kovalent gebunden ist. 3. The conjugate according to claim 1 or 2, wherein the address protein or peptide at the C-terminus of a PNA molecule is covalently bound. 4. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Transportpeptidmodul ein humanes, bakterielles oder virales Transmembranpeptid ist. 4. Conjugate according to one of claims 1 to 3, wherein the Transport peptide module a human, bacterial or viral transmembrane peptide. 5. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Adressprotein bzw. -peptid ausgewählt ist aus: -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-; und H3N+-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-. 5. Conjugate according to one of claims 1 to 4, wherein the address protein or peptide is selected from: -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-; and H 3 N + -Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-. 6. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Konjugat folgende Struktur hat: Klammer-PNA- Transportpeptidmodul-Adressprotein bzw. Adresspeptid. 6. Conjugate according to one of claims 1 to 5, wherein the The conjugate has the following structure: Bracket-PNA- Transport peptide module address protein or address peptide. 7. Gemisch, das ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält und eine an die Klammer-PNA hybridisierte Nukleinsäuresequenz. 7. Mixture containing a conjugate according to any one of claims 1 to 6 contains and one hybridized to the staple PNA Nucleic acid sequence. 8. Gemisch nach Anspruch 7, wobei die Nukleinsäure doppelsträngige DNA oder RNA ist. 8. Mixture according to claim 7, wherein the nucleic acid is double-stranded DNA or RNA. 9. Arzneimittel, ein Gemisch nach Anspruch 8 enthaltend. 9. Medicament containing a mixture according to claim 8. 10. Verwendung eines Gemischs nach Anspruch 8 zur lokalen Gentherapie, wobei die Aktivierung der Nukleinsäure durch Dissoziation der Klammer-PNA durch lokale Erwärmung erfolgt. 10. Use of a mixture according to claim 8 for local Gene therapy, whereby the activation of the nucleic acid by dissociation of the bracket PNA by local Warming takes place.
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