DE10152994A1

DE10152994A1 - Methode zur gleichzeitigen optischen Bestimmung von pH-Wert und Gelöstsauerstoff

Info

Publication number: DE10152994A1
Application number: DE2001152994
Authority: DE
Inventors: Otto Wolfbeis
Original assignee: Chromeon GmbH
Current assignee: Chromeon GmbH
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2003-08-07
Also published as: WO2003036293A1

Abstract

Es wird ein optisches Verfahren beschrieben, mit dessen Hilfe es möglich ist, den pH-Wert einer Lösung und deren Gehalt an Gelöstsauerstoff zu bestimmen. Es beruht auf der Verwendung von zwei optischen Indikatoren in nur einer Sensormatrix, wobei die beiden Indikatoren zwei voneinander differenzierbare optische Signale liefern, die den jeweiligen Messgrößen zugeordnet werden können. Ebenfalls beschrieben werden entsprechende Materialien und deren Verwendung.

Description

Die Bestimmung des pH-Wertes einer wässrigen Probe und des in der Probe gelösten Sauerstoffs ist von entscheidender analytischer Bedeutung. In diesem Zusammenhang ist der Ausdruck "wässerige Probe" dahingehend zu verstehen, dass sie zu mehr als 50% aus Wasser besteht. Unter dem im Folgenden verwendeten Ausdruck pH/O₂ wird der pH-Wert und der Gehalt an Gelöstsauerstoff verstanden. Der pH-Wert ist definiert als -log [H⁺], wobei [H⁺] die Aktivität (oft auch als "Konzentration" bezeichnet) der Wasserstoff-Ionen ("Protonen") in einer Flüssigkeit ist. Als Gelöstsauerstoff bezeichnet man die Konzentration an Sauerstoff (angegeben meist in mg/Liter oder in Mikromol/Liter) in einer flüssigen Probe.
Der pH/O₂ erlaubt zum einen die Beurteilung wässriger Probenlösungen, z. B. von Abwässern, deren pH-Werte oft ausserhalb tolerierter Grenzen liegen und deren Sauerstoffgehalt oft so niedrig ist, dass man es als "totes Gewässer" bezeichnen muss. Die Kenntnis des pH/O₂ von Blut wiederum zeigt, inwieweit dieses sich im Normbereich bzw. ausserhalb befindet. In der Bioprozesskontrolle und in zellulären Screening wiederum ist es erforderlich, den PH/O₂ kontinuierlich ("sensorisch") zu erfassen, um einerseits einen Prozess optimal zu führen bzw. die Auswirkung externer Einflüsse bzw. von Inhibitoren rasch zu erkennen.
Eine Reihe von optischen Verfahren zur Bestimmung des pH-Wertes oder des Sauerstoffgehaltes einer Lösung wurde bereits beschrieben. Derartige Sensoren besitzen als eigentliches Sensorelement eine mit einem Indikatorfarbstoff versehene Zone, deren optische Eigenschaften sich als Funktion des Analyten (pH-Wert, Sauerstoff) ändern. In den meisten Fällen ist der Indikator in ein Polymer eingebettet. Die optischen Eigenschaften (z. B. Reflexion, Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzabklingzeit) werden mit Hilfe eines entsprechenden optoelektronischen Systems abgetastet. Im Prinzip können je ein pH-Sensor und ein O₂-Sensor verwendet werden, um pH/O₂ zu erfassen. Allerdings erfordert der Einsatz zweier getrennter Sensoren meist getrennte opto-elektronische Systeme. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, mit Hilfe nur eines Sensorelementes und einer optoelektronischen Anordnung den pH-Wert und den Gelöstsauerstoff gleichzeitig zu bestimmen.
Erfindungsgemäß werden dazu Sensorelemente eingesetzt, die zum einen aus einem organischen Polymer bestehen, das sowohl für Protonen (H⁺-Ionen) als auch für Gelöstsauerstoff durchlässig ist, und zum anderen aus mindestens 2 Indikatoren bestehen, deren Farbe oder Fluoreszenz vom pH-Wert bzw. der Konzentration an Gelöstsauerstoff abhängt und deren optische Eigenschaften getrennt erfassbar sind.
Derartige Sensorelemente können in verschiedenen Anordnungen eingesetzt werden. In einer üblichen Variante werden sie als dünner (0.1-20 µm) Film am Boden oder der Wand einer Kavität (wie z. B. einer Durchflusszelle, einem Wegwerfteil mit integrierter Probenkammer, einer Mikrotiterplatte oder in einem Zellzuchtgefäß) aufgebracht und von aussen optisch abgetastet. In anderen Anwendungsformen werden die Elemente an der Spitze oder der Oberfläche von (faseroptischen) Lichtwellenleitern aufgebracht und entweder direkt oder mittels evaneszenter Wellen abgetastet.
Die zur Herstellung derartiger Sensorelemente erforderlichen Materialien werden erhalten, indem man mindestens 2 geeignete Indikatoren in einem geeigneten Polymer löst. Geeignete Polymere sind zum einen für H⁺-Ionen und für Sauerstoff in jede Richtung durchlässig, halten aber die Farb-Indikatoren so gut in der Polymermatrix zurück, dass diese auch bei langer Kontaktzeit (mit dem Medium) nicht ausgewaschen werden. Oft werden Indikatoren über eine chemische Bindung fest an das Polymer geknüpft. Somit sind stark hydrophile Polymere (wie z. B. Polysiloxane, Polyethylene, Polystyrole oder nicht- weichgemachtes Polyvinylchlorid) ungeeignet. Hingegen sind hydrophile Polymere und besonders solche Polymere, die sowohl hydrophile wie auch hydrophobe Domänen enthalten, besonders gut geeignet.
Als Indikatoren für pH-Wert bzw. Sauerstoff kommen vorzugsweise jene in Frage, die mit Hilfe von Halbleiterlichtquellen (Leuchtdioden oder Diodenlasern) abgetastet werden können. Sie werden aber auch aus Kostengründen bevorzugt eingesetzt und weil sie sich besonders gut für zeitaufgelöste Messungen (bis zu Zeitauflösungen von 0.3 ns) eignen. Im allgemeinen wird man versuchen, die Messwellenlängen in den langwelligen Bereich zu verschieben, um die im kurzwelligen starke Eigenabsorption von Polymeren, Gläsern und von biologischem Material zu minimieren, und weil bei kurzwelliger Bestrahlung die Eigenfluoreszenz von Materialien und biologischen Proben besonders stark ist.
Durch Einsatz einer oder zweier Lichtquelle (oder einer Bicolor-Lichtquelle) erhält man somit 2 optische Signale, das eine für den pH-Wert, das andere für Gelöstsauerstoff. Das optische Signal kann in der Intensität des reflektierten oder des emittierten Lichtes bestehen. Das Signal für Gelöstsauerstoff ist immer ein Fluoreszenzsignal.
Eine weitere Möglichkeit der Abtastung besteht darin, anstelle der Fluoreszenzintensität die Abklingzeit (τ) der Fluoreszenz eines oder beider Indikatoren zu bestimmen. Bei pH- Indikatoren kann der pH-Wert in eine Abklingzeitinformation überführt werden, wenn man sich den Effekt des Förster-Energie-Transfers zunutze macht, wie von Kosch et al. gezeigt worden war (U. Kosch, I. Klimant, T. Werner & O. S. Wolfbeis, Anal. Chem. 70 (1998) 3892-3897. Die Sauerstoffindikatoren werden (nach Stern und Volmer) in ihrer Abklingzeit direkt und in definierter Weise von der Konzentration an gelöstem Sauerstoff abhängt (wie von.
Eine dritte Möglichkeit der Abtastung des Doppelsensors besteht in der Messung der Phasenverschiebung der Fluoreszenz der beiden Indikatoren gegenüber der Phase einer sinusförmig modulierten Lichtquelle, gegebenenfalls unter Verwendung von Referenzfarbstoffen, zu deren Fluoreszenzintensität oder Phase das analytische Signal in Bezug gesetzt wird. Ein typisches Beispiel dafür besteht in der Messung von pH-Werten mittels Phasenfluorimetrie (G. Liebsch, I. Klimant, Ch. Krause & O. S. Wolfbeis, Anal. Chem. 73 (2001) 4354-4363.).

Beispiele

Beispiel 1

Herstellung eines optischen Doppelsensors zur reflektometrischen Bestimmung des pH-Wertes und fluorimetrischen Bestimmung des Gelöstsauerstoffes einer wässrigen Probenlösung

Man bereitet eine Lösung von 4 g des Hydrogels D4 (von Tyndall-Plains-Hunter; Ringo; NY) in einem Gemisch aus 72 g Alkohol (100%) und 8 g Wasser. Nun fügt man zu 1 mL dieser Lösung ca. 0.1 mL einer wässrigen Suspension von Polystyrol-Partikeln, die mit dem Sauerstoffindikator Platin-Octaethylporphyrin angefärbt worden sind (Produkt Nr. 20886; von Fa. Molecular Probes, Oregon). Die Mischung wird homogenisiert und und als dünne Schicht (50 µm) auf den Boden eines Glasgefäßes, wie sie in der Zellzucht verwendet werden (siehe Fig. 1), aufgebracht. Alternativ streicht man das Material auf einen optisch transparenten flachen Träger wie z. B. eine Folie aus Polyterephthalat (Mylar™; von Goodfellow, Cambridge; UK). Nach Trocknen des Films erhält man in beiden Fällen eine dünne Polymerschicht mit darin enthaltenen fluoreszierenden Partikeln. Die Fluoreszenz dieses Material kann bei 390 nm angeregt werden und hat ein Maximum bei 650 nm. Ihre Intensität wird durch Sauerstoff reversibel gelöscht. Die Abklingzeit der ungelöschten Lumineszenz liegt bei > 100 Mikrosekunden. Das Material ist somit zwar sauerstoffempfindlich, aber noch nicht pH-empfindlich.
Die so erhaltene Polymerschicht wird nun auf folgende Weise mit dem pH-Indikator N9 angefärbt: Man löst 2 mg des Farbstoffes N9 (Merck, Darmstadt) in 0.1 ml konzentrierter Schwefelsäure und läßt ihn 30 min. bei Raumtemperatur stehen. Danach gießt man in 10 ml Wasser und neutralisiert die gelbe Lösung durch Zugabe von Natronlauge bis zur Grünfärbung. Um den Film am Boden des Glasgefäßes anzufüllen, gießt man die grüne Lösung in das Glasgefäß oder legt die oben beschriebene beschichtete Folie in die grüne Lösung. Danach stellt man die Lösung mit starker Natronlauge auf einen pH-Wert von 13 ein, wodurch sie tiefblau wird. Bei diesem pH-Wert bindet der Farbstoff kovalent an die terminalen Hydroxygruppen des Hydrogels.
Nach 2 h gießt man die blaue Lösung aus dem Glasgefäß (bzw. nimmt die blaue Membran aus der Lösung) und wäscht sie mit viel Wasser. Die Farbe der Sensorschicht schlägt langsam über grün (bei pH 7) nach gelb (pH < 6) um.

Beispiel 2

Optisch-sensorische Messung von Gelöstsauerstoff und pH-Wert

Man hat mehrere Möglichkeiten, die in Beispiel 1 beschriebene Sensorschicht optisch abzutasten. Beleuchtet man sie mit einer blauen Leuchtdiode mit Licht der Wellenlänge 440-460 nm), so ist die Intensität des diffus reflektierten Lichtes proportional dem pH-Wert der Lösung, mit der die Membran in Kontakt steht. Dies resultiert aus dem Umstand, dass der Farbstoff N9 in saurer Lösung gelb (λ_max 440 nm) und in alkalischer Lösung blau ist (λ_max 580 nm).
Eine zweite Abtastmöglichkeit besteht darin, die bei pH-Werten > 6 auftretende Blautönung der Sensormembran mit einer gelben Leuchtdiode (λ_max 580 nm) reflektometrisch zu vermessen. Beide Signale, vorzugsweise auch das Verhältnis der bei 440 bzw. 580 nm erhaltenen Signale, können zum pH-Wert in quantitativen Bezug gesetzt werden.
Um den Gehalt an Gelöstsauerstoff zu bestimmen, regt man die Fluoreszenz des in der Membran enthaltenen Platinkomplexes bei ebenfalls 440 nm an. Die Fluoreszenzintensität der Membran im Wellenlängenbereich bei 650 nm kann über die Stern-Volmer-Gleichung mit der Sauerstoffkonzentration [O₂] der Lösung in Bezug gesetzt werden. Die Stern-Volmer- Gleichung hat folgende Form:

I_O/I = 1 + K_SV[O₂] bzw. τ_O/τ = 1 + K_SV[O₂]
Hier bedeuten I_O bzw. I die gemessenen Fluoreszenzintensitäten in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Sauerstoff in einer Konzentration [O₂]. Im zweiten Teil der Gleichung bedeuten τ_O bzw. τ die gemessenen Abklingzeiten in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Sauerstoff in einer Konzentration [O₂]. Die Stern-Volmer-Konstante K_SV ist charakteristisch für jede Kombination aus Fluoreszenzindikator und Polymermatrix.
Eine weitere Möglichkeit der Abtastung besteht nach Stern-Volmer also darin, anstelle der Fluoreszenzintensität die Abklingzeit (τ) der Fluoreszenz des Indikators zu bestimmen, da diese ebenfalls in definierter Weise von der Konzentration an gelöstem Sauerstoff abhängt.
Eine dritte Möglichkeit besteht in der Messung der Phasenverschiebung der Fluoreszenz gegenüber der Phase einer sinusförmig modulierten Lichtquelle, gegebenenfalls unter Verwendung von Referenzfarbstoffen, zu deren Fluoreszenzintensität oder Phase das analytische Signal in Bezug gesetzt wird.
Eine vierte Möglichkeit der Messung besteht darin, die Fluoreszenzintensität des langsam abklingenden Sauerstoffindikators derart bestimmen, dass man nach einem Anregungspuls mit einer Dauer, die deutlich unter der Abklingzeit des Indikators liegt (also z. B. 5 ns), eine gewisse Zeit verstreichen lässt. Während dieser Zeit kann die Untergrundlumineszenz des Sensors und der Untersuchungslösung abklingen. Erst danach wird die eigentliche Lumineszenz des langsam abklingenden Indikators gemessen und ist somit nicht verfälscht. Diese Messmethode wird in der Literatur als "gated fluorometry" bezeichnet.

Beispiel 3

Herstellung eines optischen Doppelsensors zur fluorimetrischen Bestimmung des pH-Wertes und fluorimetrischen Bestimmung des Gelöstsauerstoffes einer wässrigen Probenlösung

Analog zu Beispiel 1 wurde pH-Indikator 5-Carboxyfluorescein N-succinimidyl ester (Fluka, Produkt-Nr. 21878) in eine amino-modifizierte Hydrogelmembran (von Tyndale-plains- Hunter; Ringo; New Jersey) immobilisiert. Zu dieser Membran wurden Polystyrol-Partikel zugegeben, die mit dem Sauerstoff-Indikator Ruthenium-tris-(diphenylphenanthrolin) (von Fluka, Schweiz) angefärbt worden waren. Die Spektren des so erhaltenen Materials sind in Fig. 2 dargestellt und zeigen, dass die Absorptionsbanden des Sauerstoffindikators (Kurve 1) und des pH-Indikators (Kurve 2) im blauen Spektralbereich liegen und somit mit einer einzigen LED angeregt werden können. Die Emissionsmaxima sind hingegen deutlich getrennt und können somit eindeutig dem pH-Wert bzw. dem Gehalt an Gelöstsauerstoff zugeordnet werden.

Beispiel 4

Weitere pH-Indikatoren und Materialien

Folgende pH-sensitive Materialien können (in Kombination mit Sauerstoffsensitiven Materialien) zur gleichzeitigen Bestimmung von pH-Wert bzw. Gelöstsauerstoff eingesetzt werden:

- 5-Carboxynaphthofluorescein-N-succinimidylester (Fluka; Buchs, Schweiz; Produkt-Nr. 21933); kovalent immobilisiert auf Cellulose oder Hydrogelen; Anregung bei 580-610 nm; Emission gemessen zwischen 650 und 690 nm;
- 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonat ("HPTS"; Produkt H-348 von Molecular Probes; Eugene; Oregon); dieser Farbstoff kann auch bereits in immobilisierter Form in eine Hydrogelmembran eingebaut werden (HPTS-Dextran-Konjugat; Produkt D-7179; von Mol. Probes);
- Der Indikator Carboxy-SNARF-1 (ein SemiNapohtho-rhoda-fluorescein) an ein Dextran konjugiert (Produkte D-3303, D-3304; von Mol. Probes);

Beispiel 5

Weitere Sauerstoff-Indikatoren und Materialien

Folgende sauerstoff-sensitive Materialien können (in Kombination mit pH-sensitiven Materialien) zur gleichzeitigen Bestimmung von pH-Wert bzw. Gelöstsauerstoff eingesetzt werden:

- Palladium-Octaethylporphyrin (von Porphyrin Systems; Lübeck); Produkt-Nr. PO- 890399; Anregung bei 390-410 nm bzw. bei 580-620 nm; Emission bei 660 nm.
- meso-Tetraphenylporphyrin-Pt(II); Produkt-Nr. PO-890048);
- der Indikator Al-Ferron (Ferron: 8-Hydroxy-7-iodo-5-chinolinsulfonsäure) nach Sanz- Medel und Mitarbeitern, Anal. Chim. Acta 360 (1998) Seiten 17-26);
- der Indikator Kampher-Chinon (J. M. Charlesworth, Sensors & Actuators B22 (1994) Seiten 1ff);
- Der Indikator (1,10-Phenanthroline)tris(thenoyltrifluoroacetonato)europium(III) (nach Amao et al; Bull. Chem. Soc. Jpn. 73 (2000) Seiten 2663-2668;
- Der Indikator Aluminium-Phthalocyanin (nach Amao et al., Anal. Chim. Acta 407 (2000), Seiten 41-44.

Beispiel 6

Weitere geeignete Polymere für Sensorfilme

- Poly(Hydroxyethyl-methacrylat) = Poly-HEMA; verschiedene Hersteller;
- organisch modifizierte Sol-Gele, z. B. Poly-(methyl-trimethoxysilan);
- Poly(methacrylamid); auch quervernetzt oder als Copolymer mit Polyacrylnitril
- Polyethylenglycol als Copolymer oder im Gemisch mit Polypropylenglycol; quervernetzt.

Die folgenden Figuren sollen die Erfindung erläutern.
Fig. 1 zeigt typische Reaktionsgefäße mit darin enthaltenen Sensorschichten. Im linken Bild ist sie am Boden aufgebracht, im rechten Bild an der Innenwand. Die Sensorschicht wird mit Licht aus einer (oder mehreren) Lichtquellen L beleuchtet, und das von Sensor S zurückgegebene Licht wird mit einem (oder mehreren) Photodetektoren D nachgewiesen. Bevorzugte Lichtquellen sind Leuchtdioden, bevorzugte Detektoren sind vom Typ der Photodioden. Die Intensität oder Abklingzeit oder Phasenverschiebung des vom Sensor S abgegebenen Lichtes dient als analytische Information über den pH-Wert bzw. den Gehalt an Gelöstsauerstoff in der Probenlösung.
Fig. 2 zeigt die Absorptionsbanden des Sauerstoffindikators Ru(dpp) (Kurve 1) und des pH- Indikators Carboxyfluorescein (Kurve 2) in einer Sensormembran zur simultanen Besatimmung von pH-Wert und Gelöstsauerstoff in einer wässrigen Probe. Da die beiden Absorptionsmaxima im blauen Spektralbereich liegen, können sie mit einer einzigen LED angeregt werden. Die Emissionsmaxima sind hingegen deutlich getrennt und können somit eindeutig dem pH-Wert bzw. dem Gehalt an Gelöstsauerstoff zugeordnet werden.

Claims

1. Verfahren zur gleichzeitigen optischen Bestimmung von pH-Wert und Gelöstsauerstoff einer überwiegend wässrigen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass eine einzige Sensormatrix verwendet wird, die überwiegend aus organischem Polymer besteht und mindestens zwei Indikatorfarbstoffe enthalten, die für die Messgrößen pH-Wert bzw. Gelöstsauerstoff zumindest ein differenzierbares optisches Signal liefern.

2. Verfahren nach (1), dadurch gekennzeichnet, dass die Signale durch optische Indikatorfarbstoffe bewirkt werden, die auf pH-Wert bzw. Gelöstsauerstoff derart ansprechen, dass sie eine Änderung ihrer Eigenfarbe oder ihrer Fluoreszenzeigenschaften erleiden.

3. Verfahren nach (1), dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der Indikatoren mit Hilfe einer fluoreszoptischen Methode abgetastet wird.

4. Verfahren nach (3), dadurch gekennzeichnet, dass das floreszenz-optische Verfahren in der Messung der Fluoreszenzintensität, in der Messung der Abklingzeit nach pulsförmiger Anregung, in der Messung der Phasenverschiebung nach frequenzmodulierter Anregung, in der Messung der Effizient des radiativen oder nicht-radiativen Energietransfers von einem Donorfarbstoff zu einem Akzeptorfarbstoff, oder in der Messung der Fluoreszenzintensität oder -abklingzeit nach einer Verzögerungsphase von mindesten 50 ns ("gated fluorometry") gemessen wird.

5. Sensormaterialien zur optischen Bestimmung von Sauerstoff und pH-Wert in einer überwiegend wässrigen Probe nach Anspruch (1), bestehend aus einem überwiegend organischen Polymer und je einem darin physikalisch oder chemisch immobilisierten pH- Indikator bzw. Sauerstoff-Indikator, wobei die beiden Indikatoren auf den pH-Wert bzw. auf den Gehalt an Gelöstsauerstoff mit einer Änderung ihrer jeweiligen optischen Eigenschaften reagieren.

6. Verwendung der Sensormaterialien nach Anspruch (5) zur optischen Bestimmung von pH- Wertes und Gelöstsauerstoff in einer überwiegend wässrigen Probe.

7. Verwendung der Materialien nach Anspruch (5) zur Bestimmung von pH-Wert und Gelöstsauerstoff in Serum oder Blut, in Bioreaktoren bzw. in Mikrobioreaktoren, in der Zellzucht und in der Zucht organischer Ersatzmaterialien, im toxikologischen und pharmazeutischen Screening, sowie in der Überwachung der Qualität von Wasser.