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DE10148624A1 - Oxidierte Proteine - ihre biologische Wirkung, sowie therapeutische und diagnostische Maßnahmen, die sich aus dem Wirkmechanismus, dem Einsatz dieser Proteine oder deren Inhibierung ableiten - Google Patents

Oxidierte Proteine - ihre biologische Wirkung, sowie therapeutische und diagnostische Maßnahmen, die sich aus dem Wirkmechanismus, dem Einsatz dieser Proteine oder deren Inhibierung ableiten

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DE10148624A1
DE10148624A1 DE2001148624 DE10148624A DE10148624A1 DE 10148624 A1 DE10148624 A1 DE 10148624A1 DE 2001148624 DE2001148624 DE 2001148624 DE 10148624 A DE10148624 A DE 10148624A DE 10148624 A1 DE10148624 A1 DE 10148624A1
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DE
Germany
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oxidized
proteins
binding
substances according
protein
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE2001148624
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English (en)
Inventor
Beate Kehrel
Martin Brodde
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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Priority to AT01983562T priority patent/ATE406908T1/de
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Priority to EP01983562A priority patent/EP1328289B1/de
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Priority to AP2009004857A priority patent/AP2781A/xx
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Priority to CY20081101332T priority patent/CY1110418T1/el
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel und ihre Verwendung zur Inhibierung der pathogenen Wirkung oxidierter Proteine über deren Reaktion mit CD36.

Description

  • Die oxidative Modifikation von Proteinen wird als kritischer Schritt für die Pathogenese von verschiedenen Erkrankungen, die von Atherosklerose (Arteriosklerose), über neurodegenerative Erkrankungen bis hin zum Alterungsprozeß selbst reichen, angesehen (Holvoet and Collen, 1997 Curr Opin Lipidol, Witztum and Steinberg 1991, J Clin Invest 88, 1785-92, Smith MA et al., 1996, Nature, Oxidative damage in Alzheimers, Stadtmann ER, Protein Oxidation and Aging, 1992, Science 257: 1220-24). Hohe LDL-Konzentrationen im Blut gelten als Hauptrisikofaktor für die Entwicklung von arteriosklerotischen (atherosklerotischen) Gefäßerkrankungen (Brown MS, Goldstein IL, 1986, Science 232: 34-37).
  • Jedoch besteht heute überwältigende Evidenz zu glauben, dass nicht LDL selber, sondern seine oxidierte Form der entscheidende Trigger für die krankheitserregenden Veränderungen, die zur Arteriosklerose führen, ist (Steinberg D, Circulation 95: 1062-71, 1997). Das US Patent No 5,756,067 beschreibt, daß die Messung von Cholesterin, Triglyzeriden und Lipoproteinen als Risikomarker für eine sich entwickelnde Atherosklerose noch nicht ausreichend ist, da etwa die Hälfte aller Herzerkrankungen aufgrund von Atherosklerose in Patienten vorkommt, welche normale Plasma Triglyzerid- und normale Cholesterinwerte haben und weil der angiographische Nachweis von Atherosklerose auch in Patienten mit normalen Lipidwerten geführt werden kann. Weitere noch nicht publizierte Vorgänge müssen also an der Entstehung der Arteriosklerose ursächlich beteiligt sein.
  • Die Oxidation der Lipide im LDL, entweder in vitro z. B. durch Kupferinduzierte Oxidation, oder in vivo, führt zur Bildung von reaktiven Aldehyden (WO 98/59248). Die Aufnahme von oxLDL durch Makrophagen führt zur Bildung von sogenannten Schaumzellen, ein Vorgang, welcher als initiierender Schritt bei der Entwicklung der Arteriosklerose angesehen wird (WO 98/59248).
  • Als für diesen Prozeß verantwortlich wird die Oxidation des Lipidanteils im LDL angesehen. Daher wird oxLDL für Untersuchungen zur Entstehung der Arteriosklerose von fast allen Wissenschaftlern durch CuSO4-Zusatz oder mit Malondialdehyd, ein Endprodukt der Lipidperoxidation, durchgeführt. Die Konzentration an oxLDL im Plasma von Patienten mit koronarer, primärer Herzkrankheit oder Transplantationsassoziierter koronarer Herzkrankheit korreliert stark mit dem Fortschreiten der Erkrankung, während in gesunden Kontrollpersonen keine erhöhten oxLDL-Spiegel gemessen werden können (Holvoet et al. Circulation 98: 1487-94, 1998). Auch chronische Nierenerkrankungen und Transplantatabstoßungen sind mit hohen oxLDL-Spiegeln assoziiert (Holvoet, Collen Thromb Haemost 76(5): 663-9, 1996 + ATVB 18(1) 100-7, 1998).
  • Auch die Oxidation des Proteinanteils im LDL kann physiologische/pathophysiologische Veränderungen hervorrufen. So führte delipidiertes HOCl-oxLDL zur Induktion des oxidativen Burst in Makrophagen (Nguyen-Khoa et al., BBRC 263: 804-9, 1999) und HOCl-oxLDL rief Thrombozytenaggregation hervor (Volfet al. ATVB 20(8): 2011-18, 2000).
  • Reaktive Oxidantien werden vom Körper durch Phagocyten freigesetzt und spielen eine bedeutende Rolle bei der Abwehr gegen Krankheitserreger, bei der Tumorüberwachung und bei allen Entzündungsprozessen (Bablor, NEJMed 298: 659-663, 1978, Weiss J, NEJMed 320: 365-376, 1989). Neben "professionellen" Phagocyten, wie Granulozyten und Monozyten, können auch andere Zellen, wie z. B. Endothelzellen oder glatte Muskelzellen, reaktive Oxidantien produzieren und abgeben.
  • Zu diesen oxidierenden Substanzen gehören O2, Superoxid, Hydrogenperoxid, Peroxynitrite, OH-Radikale, hypochlorige Säure HOCl, Cl2-Gas und Chloramine. Welche Prozesse im Detail an der Entstehung dieser oxidativen Substanzen beteiligt sind, ist noch unklar. Ceruloplasmin, 15-Lipoxygenase, Myeloperoxidase (MPO) und Nitric oxid-Synthase (NO-S) wurden in arteriosklerotischen Läsionen im Tier und Mensch gefunden und könnten zur Oxidierung von LDL beitragen (Carr et al., ATVB 20: 1716-23, 2000). Ein möglicher Oxidierungsweg involviert die MPO. MPO, ein Häm-Protein Enzym, kann halogenieren und peroxidieren (Carr et al.). Das am besten beschriebene Produkt der Myeloperoxidase ist hypochlorige Säure HOCl-, Cl- + H2O2 + H+ → HOCl + H2O. Hypochlorit modifizierte Proteine, insbesondere HOCl-oxLDL, werden in arteriosklerotischen Läsionen gefunden (Hazell et al., J Clin Invest). HOCl-Modifikation von Proteinen spielt auch eine Rolle bei anderen Erkrankungen, wie z. B. entzündliche Gelenkerkrankungen (Davies et al., Free-Radical-Biol-Med 15(6): 637-43, 1993), Gerinnungsstörungen (Oxidation von Thrombomodulin) (Glaser et al., J Clin Invest 90(6): 2565-73, 1992), Gewebszerstörung durch Granulozyten bei Entzündungsreaktionen allgemein (Schraufstatter et al., J Clin Invest 85(2): 554-62, 1290), Ischämie, Reperfusionsschaden (Samanta et al., Free Radic Res Commun 7(2): 73-82, 1989), Glomerulonephritis (Shah et al., J Clin Invest 79(1): 25-31, 1987), Immunregulation (NK-cell-Apoptose) (Hansson et al., J Immunol 156(1): 42-7, 1996).
  • CD36, auch Glykoprotein IIIb (GPIIIb) oder Glykoprotein IV (GP IV) genannt, ist ein Hauptglykoprotein der Plättchen, Endothelzellen, Monozyten, Erythroblasten, Epithelzellen und einiger Tumorzelllinien, wie Melanomzellen und Osteosarkomzellen (Asch et al 1987, Knowles et al. 1984, Kieffer et al 1989). Es gehört zur Familie der Klasse B "scavenger" Rezeptoren. Mitglieder der Familie sind das integrale lysosomale Membranprotein LIMP-II (lysosomal integral membrane protein II, Vega et al 1991) das CLA-1 (CD36 and LIMP-II analogous, Calvo und Vega 1993), das FAT-Protein der Adipozytenmembran (Abumrad et al 1993), PAS IV aus Brustepithelzellen (Greenwalt et al 1990 und 1992) und das SR-B1 (Acton et al 1994).
  • Das FAT-Protein der Adipozyten ist an der Bindung und dem Transport langkettiger Fettsäuren beteiligt. Das PAS IV-Protein ist ein integrales Membranprotein laktierender Brustepithelzellen und wird im apikalen Plasmalemma konzentriert. Mit der Sekretion von Triglyceriden gelangt es in die Milch und wird in der MFGM (milk-fat globule membrane)-Fraktion gefunden. Die Sequenz von PAS IV ist fast identisch mit CD36, es liegen aber Unterschiede in der Glykosilierung vor.
  • SR-B1 ist ein "scavenger receptor" für LDL (Acton et al 1994). CD36 besteht aus einer einzigen stark glykosilierten Polypeptidkette mit einem aparenten Molekulargewicht von 88000 im reduzierten und nicht reduzierten Zustand und einem isoelektrischen Bereich zwischen 4,4 und 6,3 (McGregor et al 1980, Clemetson 1987). Daß sich kein klar definierter isoelektrischer Punkt bestimmen lässt, liegt am variablen Gehalt an Sialinsäure (McGregor et al 1981). Der Kohlenhydratanteil von 26% und eine starke Hydrophobie gibt dem CD36 eine hohe Resistenz gegenüber Abbau durch Proteasen, solange das Protein sich in der Membran befindet (Greenwalt et al 1992). Dies bewirkt, dass das Protein in Regionen, an denen Entzündungsprozesse stattfinden, vor "Angriffen" geschützt ist. CD36 hat N- und O-glykosidische Bindungen. Die aus plazentarer cDNA für CD36 abgeleitete Aminosäuresequenz (Oquendo et al 1989) zeigt mehrere hydrophobe Bereiche und vermutlich zwei transmembranäre Bereiche.
  • Einige Funktionen sind für CD36 postuliert worden.
  • So wurde es als Rezeptor für Kollagen beschrieben (Tandon et al 1989). Gereinigtes CD36 bindet an Fibrillen von Kollagen Typ I, und Fab-Fragmente eines polyklonalen Antikörpers gegen CD36 hemmen die Kollagen-induzierte Aggregation.
  • Analysen von Plättchen, denen das CD36 fehlt, zeigen aber, dass CD36 für die Aktivierung von Plättchen mit Kollagen nicht unbedingt notwendig ist. Unsere gemeinsamen Untersuchungen mit Kollegen der Arbeitsgruppe von J. J. Sixma (Utrecht) zeigten keine Unterschiede in der Adhäsion von CD36-defizienten Plättchen und Kontrollplättchen an bovine oder humane Kollagene Typ I oder III im statischen System und unter Einfluß von geringen, mittleren und hohen Scherraten in der Perfusionskammer bei Verwendung von Heparinblut und bei physiologischen Ca2+-Konzentrationen (Saelman et al 1994).
  • CD36-defiziente Plättchen aggregieren normal mit Horm-Kollagen, einem Gemisch aus equinem Typ I und III Kollagen, und mit gereinigtem bovinen und humanen Kollagen Typ I und III (Kehrel et al 1991 und 1993). Die Sekretion der α-Granula und dichten Granula induziert durch Typ I oder III Kollagen unterscheidet sich nicht bei CD36-defizienten Plättchen und Kontrollplättchen (Kehrel et al 1993). Daniel und Mitarbeiter zeigten, daß die Signalübertragung nach Aktivierung mit Kollagen Typ I in CD36-defizienten Plättchen und Kontrollplättchen gleich verläuft (Daniel et al 1993).
  • CD36 ist ein Rezeptor für Thrombospondin-1 (TSP-1) (Asch et al 1987, McGregor et al 1989). Auf ruhenden Thrombozyten ist CD36 Threonin (92) phosphoryliert. Dephosphorylierung ermöglicht das Anbinden von Thrombospondin (Asch, Science 1993). Gereinigtes CD36 bindet spezifisch an Thrombospondin. Diese Bindung ist Ca2+-abhängig und kann durch RGD-Peptide nicht gehemmt werden. Der monoklonale Antikörper OKM5, der gegen CD36 gerichtet ist, hemmt die Bindung von Thrombospondin an mit Thrombin aktivierte Plättchen (Asch et al 1989). Leung und Mitarbeiter beschrieben, daß auf dem CD36 zwei Peptidbereiche die Bindung von Thrombospondin beeinflussen. Peptid 139-155 verstärkt die Plättchenaggregation im Plättchen-reichen Plasma, die durch ADP oder Kollagen induziert wurde. Peptid 93-110 hingegen hemmt die Kollagen-induzierte Aggregation teilweise und blockiert auch die Bindung von CD36 an immobilisiertes Thrombospondin. Dieses Peptid kann das Thrombospondin allein nicht binden, aber in Gegenwart des Peptids 139-155 (Leung et al 1992, Pearce et al 1993). Die Sequenz SVTCG des Thrombospondins bindet mit hoher Affinität an CD36 (Li et al 1993). Silverstein et al (1992) belegten durch Experimente mit "sense" und "antisense" transfizierten Melanomzellen die Bedeutung von CD36 für die Thrombospondinbindung. Die Bindungsstelle auf CD36 für Thrombospondin liegt zwischen Aminosäure 93-120 (Frieda et al 1995).
  • CD36 wird auch als Bindungsvermittler zwischen Plättchen, Endothelzellen, Monozyten oder C32-Melanomzellen einerseits und mit dem Malariaparasiten Plasmodium falciparum befallenen Erythrozyten andererseits, beschrieben (Barnwell et al 1989). Die Bindung infizierter Erythrozyten an Kapillarendothelzellen, Sequestration genannt, ist von entscheidender Bedeutung für den oft tödlichen Ausgang der Malaria tropica, wenn die Sequestration im Gehirn stattfindet (zelebrale Malaria). Infizierte Erythrozyten binden an immobilisiertes, gereinigtes CD36 (Ockenhouse et al 1989). COS-Zellen, in denen die cDNA für CD36 exprimiert wurde, erlangen die Fähigkeit, Malaria-infizierte Erythrozyten zu binden (Oquendo et al 1989). Mit Hilfe von anti-Idiotyp-Antikörpern gegen den monoklonalen anti CD36-Antikörper OKM5 wurde ein Bindungspartner auf infizierten Erythrozyten, das Sequestrin, gefunden (Ockenhouse et al 1991). Durch den Kontakt mit infizierten Erythrozyten werden Plättchen und Monozyten aktiviert (Ockenhouse et al 1989). CD36-defiziente Plättchen zeigen in den Händen von Tandon et al (1991) keine Bindungsfähigkeit für infizierte Erythrozyten. Wir beobachteten dagegen, daß die Bindung nur in Gegenwart von EDTA gestört ist. In Gegenwart von Ca2+ und Mg2+ konnten wir klar Rosetting von Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten und CD36-defizienten Plättchen beobachten (Kronenberg et al 1992). Es sind neben CD36 noch andere Bindungsvermittler für Malaria-infizierte Erythrozyten beschrieben worden, darunter Thrombospondin, welches für diese Funktion zweiwertige Kationen benötigt (Berendt et al 1989, Roberts et al 1985). Thrombospondin könnte die von uns beobachtete Bindung von CD36-defizienten Plättchen an infizierte Erythrozyten vermitteln. Die Bindung von Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten an CD36 wird durch die CD36 Peptide 145-171 und 156-184 inhibiert (Baruch et al 1999). Auch eine Rolle des CD36 bei der Signalübertragung wird häufig diskutiert (Shattil und Brugge 19919). Bei der Immunpräzipitation von CD36 aus ruhenden Plättchen werden die Tyrosinkinasen der src-Genfamilie pp60fyn, pp62yes und pp54/58lyn mitpräzipitiert, was für eine enge Assoziation mit dem CD36 spricht (Huang et al 1991). Die Bedeutung dieser Entdeckung ist noch unklar. Einige Antikörper gegen CD36 aktivieren Plättchen und Monozyten (Aiken et al 1990, Schüepp et al 19919). Der IgM-Antikörper NLO7 aktiviert Plättchen mit Hilfe des Komplementsystems (Alessio et al 1993). Als weitere Funktion von CD36 wird eine Rolle bei der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura (TTP) beschrieben (Lian et al 1991). Ein Protein (p37), welches im Plasma von TTP-Patienten vorkommt, agglutiniert Plättchen, vermittelt über CD36. Die Bedeutung dieses Befundes ist noch unbekannt. Das Peptid VTCG aus dem Thrombospondin hemmt die phosphatidylinositol (3.4) biphosphat-Synthese in mit Thrombin aktivierten Plättchen. CD36 ist einer der Thrombospondin-Rezeptoren, welche eine späte Aktivierung der PI-3-Kinase und der Phospholipase C vermitteln (Trumel, Payrastre, Mazarguil, Chap, Plantavid, persönliche Mitteilung).
  • CD36 ist beteiligt am Transport von langkettigen Fettsäuren in Muskelgewebszellen.
  • Eine Überexpression von CD36 in Muskelzellen von transgenen Mäusen führte zu verstärkter zellulärer Aufnahme von Fettsäuren, verstärkte die Fettsäureoxidation durch kontraktile Muskeln und reduzierte die Konzentration von Triglyceriden und freien Fettsäuren im Plasma. Die Mäuse hatten ein geringeres Körpergewicht, insbesondere geringeres Körperfett, als ihre Kontrollverwandten.
  • Fehlen von CD36 beim Menschen führt zum Verlust der Aufnahme von langkettigen Fettsäuren, die Hauptenergiequelle für den Herzmuskel, in die Herzmuskelzellen und konsequent zu erhöhtem Auftreten von angeborenen hypertrophen Kardiomyopathien (Fuse et al 1998). Auch CD36 defiziente Mäuse zeigen einen defekten Transport von Fettsäuren in die Zellen und einen gestörten Lipoproteinstoffwechsel (Febbraio et al 1999).
  • CD36 vermittelt die Arachidonsäure vermittelte Plättchenaggregation (Dutta-Roy et al 1996) und bindet an negativ geladene Phospholipide in Zellmembranen (Ryeom et al 1996). Insbesondere Phosphatidylserine (PS) und Phosphatidylinositol (PI) werden von CD36 spezifisch mit hoher Affinität gebunden (Rigotti et al 1995). Da apoptotische Zellen Phosphatidylserine an ihrer Oberfläche exponieren, kann über CD36 ein Kontakt zu phagozytotischen Zellen vermittelt werden (Fadok et al 1998, Alberts et al 1998). Phosphatidylserin bindet vermutlich an die CD36-Sequenz 162-183 (Yamaguchi et al 2000). CD36 bindet an Cholesteryl-hemisuccinat und kann über diese Reaktion leicht gereinigt werden (Kronenberg et al 1998).
  • Die Hauptfunktion von CD36 ist wohl seine Rolle als Rezeptor für oxidiertes LDL. Diese Rolle wurde von Endemann et al 1993 zuerst beschrieben. Transfektionsexperimente mit einem cDNA-Klon, der für CD36 codiert, in der humanen Makrophagen ähnlichen THP-Zelllinie führten zu einer neu erlangten Bindungsfähigkeit der Zelle für Cu2+-oxidiertes LDL. Der monoklonale CD36-spezifische Antikörper OKM5 hemmt die Bindung von Cu2+-oxLDL an Plättchen um 54%. Die Bindungsstelle für Cu2+-oxLDL liegt im Bereich der CD36 Sequenz 155-183 (Puente-Navazo et al 1996).
  • Nicholson et al beschrieben, dass Cu2+-oxLDL vermutlich über seinen Lipidanteil an CD36 bindet (Nicholson et al 1995). Makrophagen von Blutspendern, denen das CD36 auf den Monozyten fehlt, haben im Vergleich zu Kontrollen eine deutlich reduzierte (-40%) Aufnahme von oxLDL (Nozaki et al 1995).
  • Vitamin E (alpha-Tocopherol) hemmt die Aufnahme von Cu2+-oxLDL in glatte Muskelzellen der Aorta, indem es CD36 inhibiert (Ricciarelli et al 2000). Die Bindung von oxLDL an Maus CD36 wird teilweise durch oxidierte Phospholipide übernommen, die mit Lipid und Proteinanteil assoziiert sind (Boullier et al 2000). Kürzlich wurde festgestellt, daß CD36 nicht nur der Rezeptor für Cu2+-oxLDL ist, sondern auch für NO2-LDL und daß CD36 für die NOz-LDL mediierte Schaumzellbildung verantwortlich ist (Podrez et al 2000).
  • Diese Bindung wird durch Lipid-Oxidationsprodukte von 1-Palmitoyl-2-arachidonyl-sn-glycero-3-phosphocholinekompetitivinhibiert. Die Autoren spekulieren daher, dass die Myeloperoxidase katalysierte Peroxidation von Lipiden dazu dient, phospholipidhaltige Angriffsziele für die Phagozytose durch CD36-haltige Zellen zu markieren. Im Einklang mit seiner Rolle als Rezeptor für oxLDL wird CD36 auf mit Lipiden beladenen Makrophagen in arteriosklerotischen Plaques gefunden (Nakata et al 1999) und glatte Muskelzellen können durch Expression von CD36 in vivo zu Schaumzellen werden (Ohya et al 2000).
  • Fehlen von CD36 scheint ein Schutz gegen Arteriosklerose zu sein. So entwickeln Mäuse, denen das ApoE-Protein fehlt, bei entsprechender Diät arteriosklerotische Plaques. Wird diesen Mäusen zusätzlich das CD36 Gen ausgeknockt, so entwickeln die Mäuse unter gleichen Bedingungen wie ihre CD36 haltigen Kontrollverwandten 76% weniger arteriosklerotische Läsionen im Aortenbaum unter fettreicher Diät und 45% weniger Plaques im Aortensinus bei normaler Diät.
  • Makrophagen von CD36 und ApoE doppel knockout Mäusen internalisierten mehr als 60% weniger Kupfer-oxidiertes LDL und NO2-LDL (Febbraio et al 2000).
  • Eine Blockade der thrombotischen und arteriosklerotischen Funktionen von CD36 bei gleichzeitiger Nichtbeeinflussung der wichtigen CD36 vermittelten Aufnahme von langkettigen Fettsäuren in die Zelle wäre ein wichtiger Schritt vorwärts zur Bekämpfung von Gefäßerkrankungen.
  • Diese Aufgabe wurde durch die vorliegende Erfindung gelöst. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass Zellfunktionen, die oxLDL über CD36 auslöst, auch von anderen Substanzen ausgelöst werden können. Überraschenderweise handelt es sich bei diesen anderen Substanzen um oxidierte Proteine, die keinen Lipidanteil haben müssen. Im Körper werden Proteine bei der Infektabwehr, bzw. in arteriosklerotischen Plaques, oder bei akuten und chronischen Entzündungen oxidiert.
  • Im folgenden seien beispielhaft einige Reaktionen aufgeführt, die nicht nur von oxLDL, sondern auch von anderen oxidierten Proteinen über CD36 ausgelöst werden:
    • 1. Aktivierung von Thrombozyten
      • - einerseits Thrombosen, Herzinfarkt, Schlaganfall, aber andererseits auch Blutstillung
    • 2. Schädigung von Endothelzellen
      • - Ischämie, Entzündungsreaktionen, Ödembildung, Störung der Prostacyclin-Freisetzung
    • 3. Aktivierung von Leukozyten, z. B.
      • a) Erhöhte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen
      • b) Förderung der Transmigration von Leukozyten durch Endothel und Epithelien
      • c) "Homing" von Leukozyten in arteriosklerotische Plaques
      • d) "Priming" und Auslösen des oxidativen Burst in Phagozyten
      • e) Tissue Faktor Expression auf Monozyten, insbesondere Verstärkung der durch Lipopolysaccharid (LPS) ausgelösten Reaktion
      • - Schäden durch Entzündungsreaktion, Thrombosen, etc.
    • 4. Aktivierung von glatten Muskelzellen (SMC's)
      • a) Proliferation von SMC's
      • b) Intimaverdickung in arteriosklerotischen Plaques
      • - Reocclusion nach Bypass, Stent, PTCA; Fortschreiten von Arteriosklerose
    • 5. Stimulation der Renin-Freisetzung aus juxta-glomerulären Zellen
      • - Renin-abhängiger Bluthochdruck bei Nierenerkrankungen
    • 6. Bildung von Schaumzellen über Stimulation der Aufnahme von co-inkubiertem LDL durch Makropinozytose
      • - Entwicklung/Verstärkung von Arteriosklerose
    • 7. Apoptose von Gefäßzellen im Zentrum von arteriosklerotischen Läsionen
      • - Nekrose, Plaque-Ruptur
    • 8. Stimulierung der Expression von Matrix-Metalloproteinasen in Endothelzellen
      • - Stimulation der Ruptur von arteriosklerotischen Plaques.
  • Daneben wurde in dieser Erfindung festgestellt, dass nicht nur IDAAT (immune defense activated antithrombin, Patentanmeldung Nr. DE 100 45 047.4) an HIV GP120 und an CD4 bindet, sondern auch andere oxidierte Proteine.
  • Es wurde in dieser Erfindung auch festgestellt, dass nicht nur IDAAT, sondern auch andere oxidierte Proteine die Bindung von Thrombospondin an Zellen wie Thrombozyten, Monozyten, Endothelzellen und T-Zellen bewirken. Es ist daher zwingend anzunehmen, dass oxidierte Proteine allgemein Thrombospondin vermittelte Zellreaktionen induzieren, wie die Inhibierung der Angiogenese, die Abwehr von HIV-Infektionen, die Regulation von Entzündungsprozessen durch z. B. "Downregulation" von IL-12 in Monozyten und "Upregulation" von IL-10. Damit können auch oxidierte Proteine selber bei bestimmten Krankheitsprozessen therapeutisch nutzbare Wirkung haben.
  • Des weiteren wurde im Rahmen dieser Erfindung festgestellt, dass die durch oxidierte Proteine hervorgerufenen pathologischen Zellfunktionen durch Substanzen, die die Interaktion zwischen CD36 und oxidierten Proteinen hemmen oder die mit an CD36 gebundenem TSP konkurrieren können, inhibiert werden können.
  • Als Beispiele für solche Substanzen sei hier lösliches Thombospondin-1 und die von uns hergestellten monoklonalen anti CD36 Antikörper Klon 37, 13 und 7 beschrieben.
    • Beispiele 1. Isolierung von humanem Thrombospondin-1
  • Die Isolierung von humanem Thrombospondin-1 aus Thrombozyten erfolgte wie in Kehrel et al 1991 beschrieben. Abweichend davon wurden die Plättchen aber mit Thrombin aktiviert und EDTA im Waschpuffer durch Na-Citrat (0.08 M) ersetzt. Zusätzlich wurde dem Aggregationspuffer und allen Puffern für die nachfolgenden Reinigungsschritte Ca2+ in einer Konzentration von 2 mM zugesetzt.
    • 2. Hybridomkultur zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
  • Die monoklonalen Antikörper gegen CD36 wurden weitgehend nach den Anleitungen von Peters und Baumgartner (1990) durchgeführt.
  • 8-12 Wochen alte Balb/c Mausweibchen wurden mit gereinigtem CD36 (50 µg/Boost) immunisiert. Zur Immunisierung wurde das lange Immunisierungsschema (4 Monate) nach Baumgartner et al 1990 benutzt. Etwa 14 Tage vor dem geplanten Fusionstermin wurde den Tieren Blut entnommen und der lgM und lgG-Titer gegen CD36 im Serum der Mäuse bestimmt. Unterschied sich der lgG-Titer noch bei einer Verdünnung von 1 : 100.000 deutlich von der Kontrolle, so wurden die Milzzellen mit Ag 8.653 Zellen fusioniert. Die Ag 8.653 Zellen wurden mit 0.13 M 8-Azaguanin im Kulturmedium selektioniert. Lymphozyten aus der Milz wurden präpariert und mit Ag 8.653 fusioniert. Fusionierte Zellen (1.106 Milzzellen/ml) wurden direkt nach der Fusion für 24 Stunden in Selektionsmedium (Kulturmedium mit Zusatz von Hypoxanthin, 27.2 µg/ml und Azaserin (50 µg/ml)) in einer Zellkulturflasche (75 ml) inkubiert. Dabei haften die Makrophagen aus der Milz an die Kunststoffoberfläche und stören nicht mehr die eigentliche Kultur der Hybridome in einer 96-Well-Platte.
  • Die Klonierungsschritte wurden durch das Verdünnungsverfahren ("limited-dilution-cloning") mit einer Aussaatwahrscheinlichkeit von 0.5 Zellen pro Loch der 96-Well-Platte nach Würzner 1990 vorgenommen. Überstände von Hybridomen wurden im ELISA-Verfahren auf die Produktion von IgG, bzw. lgM getestet. IgG-positive Zellkulturüberstände wurden mit mehreren Verfahren auf ihre Spezifität gegen CD36 getestet:
    19 Klone spezifisch für CD36 wurden erhalten, welche nicht mit CD36 defizienten Plättchen (Beschreibung: Kehrel et al 1993, Saelman et al 1994, Kehrel et al 1995) reagierten, aber eine deutliche Anbindung an Kontrollplättchen zeigten. Dieses wurde sowohl mittels Durchflußzytometrie, als auch mit dem Dot-Blot-Verfahren und Immunpräzipitation bewiesen. Alle Antikörper erkannten gereinigtes CD36.
  • Drei dieser Klone (Klon 37, 13 und 7) hemmten die Reaktion von oxidierten Proteinen mit humanen Zellen (s.u.).
    • Isolierung von CD36
  • Die Isolierung von CD36 erfolgte, wie von unserer Arbeitsgruppe beschrieben (Kronenberg et al 1998), über Phasentrennung der Membranproteine mit Triton X-114 und anschließender Affinitätschromatographie an Cholesteryl-Hemisuccinat-Agarose.
    • Beispiele für die Herstellung von oxidierten Proteinen
  • 348 pg Protein (handelsübliches Fibrinogen, Humanalbumin, Rinderserumalbumin (BSA) oder Antithrombin) wurden mit 832 µg NaOCl (Natriumhypochlorit) in 1 ml Phosphat-gepufferte Saline mit EDTA-Zusatz (0.1 mM) für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Protein und Oxidanz wurden sofort nach Reaktionsende durch eine Gelfiltration bei 4°C über Sepharose G25-Coarse (PD-10 Säule, Amersham Pharmacia) getrennt.
    • Beispiele für die Wirkung der Erfindung
    • 1. Oxidierte Proteine (oxFibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) binden spezifisch an immobilisiertes CD36.
    • 2. Oxidierte Proteine aktivieren Thrombozyten. Diese Aktivierung wird durch Substanzen, die die Interaktion von CD36 mit oxidierten Proteinen hemmen oder mit an CD36 gebundenem Thrombospondin konkurrieren, inhibiert
      • 1. Oxidierte Proteine (oxFibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) verstärken dosisabhängig die Adhäsion von Thrombozyten an Adhäsionsproteine, wie Thrombospondin, Vitronectin, Fibrinogen, Fibrin, Fibronectin und Kollagen (siehe Abb. 2a).
        Diese Adhäsionsverstärkung wird durch lösliches Thrombospondin-1 inhibiert (siehe Abb. 2b). Diese Adhäsionsverstärkung wird durch die monoklonalen anti CD36 Antikörper Klon 37, 13 und 7 inhibiert (siehe Abb. 2c/d), während das VCTG-Peptid, welches die Bindung von Thrombospondin an CD36 hemmt, keinen Einfluß hat (siehe Abb. 2e). Der kommerzielle anti CD36 Antikörper FA6/152 zeigt keine Hemmwirkung (siehe Abb 2f).
      • 2. Oxidierte Proteine (oxFibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) induzieren in Gegenwart von Thrombospondin-1 (10 µg/ml) dosisabhängig die Fibrinogenanbindung an Thrombozyten (siehe Abb. 3a). Diese Aktivierung wird durch lösliches Thrombospondin-1 in einer Konzentration von > 20 µg/ml inhibiert (siehe Abb. 3b).
        Diese Aktivierung wird durch die monoklonalen Antikörper gegen CD 36, Klon 37, 13 und 7, inhibiert (siehe Abb. 3c-e).
      • 3. Oxidierte Proteine (oxEibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) lösen in Gegenwart von Thrombospondin-1 (10 µg/ml) die Plättchenaggregation aus (siehe Abb. 4a). Diese Aggregation wird durch die monoklonalen Antikörper gegen CD 36, Klon 37,13 und 7, dosisabhängig inhibiert (siehe Abb. 4b).
      • 4. Oxidierte Proteine (oxEibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) lösen in Gegenwart von Thrombospondin-1 (10 µg/ml) den prokoagulanten Zustand der Plättchen aus (siehe Abb. 5a-c) und führen zur Mikropartikelbildung (siehe Abb. 5d). Diese Aktivierung wird durch lösliches Thrombospondin-1 in Konzentrationen von ≥ (20 µg/ml) inhibiert (siehe Abb. 5e).
        Diese Aktivierung wird durch die monoklonalen Antikörper gegen CD 36, Klon 37, 13 und 7, dosisabhängig inhibiert (siehe Abb. 5f und g).
    • 3. Oxidierte Proteine (z. B. oxFibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) aktivieren Monozyten. Diese Aktivierung wird durch Substanzen wie z. B. lösliches Thrombospondin oder monoklonale Antikörper gegen CD36, die die Interaktion zwischen CD36 und oxidierten Proteinen hemmen oder mit an CD36 gebundenem Thrombospondin konkurrieren, dosisabhängig gehemmt.
      • a) Oxidierte Proteine (z. B. oxFibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) induzieren in Monozyten ein Ca2+-Signal (siehe Abb. 6).
      • b) Oxidierte Proteine (z. B. oxFibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) induzieren in PMNL den oxidativen Burst (siehe Abb. 7).
      • c) Oxidierte Proteine (z. B. oxFibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) induzieren eine erhöhte Transmigration von Monozyten, PMNL und Lymphozyten durch Endothelmonolayer (siehe Abb. 8a). Diese Reaktion wird durch Substanzen, die die Bindung von CD36 an oxidierte Proteine inhibieren, wie lösliches Thrombospondin oder monoklonale Antikörper gegen CD36, Klone 37, 13 und 7, inhibiert (siehe Abb. 8b).
    • 4. Oxidierte Proteine (z. B. oxFibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) sind ursächlich an der Entstehung von Arteriosklerose beteiligt.
      • a) Oxidierte Proteine (z. B. oxEibrinogen, oxAntithrombin III, oxBSA, oxHumanalbumin) induzieren ein "Homing" von Makrophagen in arteriosklerotische Plaques. Das "Homing" wurde nach Patel et al (Circulation 1998; 97, 75-81) durchgeführt. C57BL/6 Mäusen wurde durch intraperitoneale Injektion von Thioglycolat die Wanderung von Monozyten/Makrophagen ins Peritoneum angeregt. Nach 4 Tagen wurde das Peritoneum gewaschen und aktivierte Peritonealmakrophagen gewonnen. In den Proben wurden die Erythrozyten lysiert. Makrophagen wurden in RPMI 1640-Medium aufgenommen und in Zellkulturplatten überführt, um ihnen die Adhäsion zu ermöglichen. Fluoreszenz markierte Mikrosphären (2 µm yellow-green fluorescent latex microspheres, Molecular Probes) wurden zur besseren Aufnahme durch die Phagozyten für 30 Minuten mit 50% Mausserum opsoniert und dann zu den platierten Makrophagen gegeben. Die adhärenten Makrophagen phagozytierten die Mikrosphären. Nicht adhärierte Zellen und Mikrosphären wurden durch Waschen der Platte entfernt. Markierte Makrophagen wurden auf Eis von der Platte abgelöst und in "Hanks balanced salt solution" resuspendiert. 50 Wochen alten ApoE-defiziente Mäuse wurde je 3 mal je 50 µg oxidiertes Protein, hier oxidiertes Antithrombin III, bzw. Placebo (nur HBSS), intraperitoneal injiziert; 6 Stunden vor intravenöser Injektion von markierten Makrophagen, 2 Stunden nach Makrophageninjektion und 10 Stunden nach Makrophageninjektion. Es wurden 10 × 106 Makrophagen in 0.2 bis 0.3 ml HBSS suspendiert und in die Schwanzvene gespritzt. 24 Stunden nach Makrophageninjektion wurden die Tiere getötet. Die Herzbasis und die Aorta ascendens wurde in OCT eingebettet, bei -80°C gelagert und 7 µm dicke Kryoschnitte angefertigt. Die fluoreszenzmarkierten Makrophagen von 140 Serienschnitten per Maus, aus einem 1 mm umfassenden Bereich der Aorta ascendens auf der Ebene des Sinus Valsalva wurden gezählt. Im Vergleich zu den Placebo behandelten ApoE-/- Kontrollmäusen stieg die Wanderung von markierten Makrophagen in die arteriosklerotischen Plaques in mit oxidiertem Antithrombin III behandelten Mäusen von 100 ± 15% (n = 14) auf 156 ± 9.2% (n = 5) signifikant (p = 0.008) ("alternate welch test") an. Da diese Einwanderung mit der Entstehung, dem Fortschreiten und der Rupturgefahr des arteriosklerotischen Plaques ursächlich verbunden ist, verdeutlicht dieses Ergebnis die Gefährlichkeit von oxidierten Proteinen in Hinblick auf die Arteriosklerose (Abb. 9).
      • b) Substanzen, die die Interaktion zwischen CD36 und oxidierten Proteinen hemmen oder mit an CD36 gebundenem Thrombospondin konkurrieren, verhindern/reduzieren die proarteriosklerotische Wirkung von oxidierten Proteinen. Lösliches Thrombospondin hemmt die Adhäsion von Makrophagen an arteriosklerotisch veränderte Endothelzellen. Dies ist die Voraussetzung für das Einwandern von Makrophagen in arteriosklerotische Plaques. Murine immortalisierte Endothelzellen wurden mit β-VLDL (50 µg Protein/ml)aus Plasma von ApoE-defizienten Mäusen für 6 Stunden stimuliert und dann mit 2 × 105 peritonealen Monozyten/Makrophagen pro ml bei einer Scherrate von 400 s-1 in einer Durchflusskammer superfundiert. β-VLDL induzierte einen signifikanten relativen Anstieg der rollenden Leukozyten um 224 ± 44% im Vergleich zur Kontrolle. Zusatz von 10 µg/ml lösliches Thrombospondin hemmte diesen Adhäsionszuwachs komplett und inhibierte zusätzlich teilweise die Grundadhäsion der Makrophagen an das Endothel (75 ± 37% Adhäsion im Vergleich zur Kontrolle, n = 4-7; p < 0.01) (siehe Abb. 10a). Die durch das β-VLDL deutlich induzierte permanente Adhäsion der Makrophagen nach einer 5-minütigen Waschperiode wurde durch Thrombospondin-1 ebenfalls reduziert (100 ± 21% Kontrolle vs 300 ± 119% β-VLDL vs 157 ± 70% β-VLDL + TSP-1; n = 4-7; p < 0.01) (Abb. 10b).
    • 5. Lösliches Thrombospondin-1 inhibiert Entzündungsreaktionen in vivo. Im Ohr von Balb/c-Mäusen wurde durch lokale Injektion von anti-BSA zum Zeitpunkt 0 und gleichzeitiger Injektion von FITC gekoppeltem BSA ins Peritoneum eine Arthus-Reaktion ausgelöst. Kontrolltieren (Negativkontrollen) wurde nur FITC (ohne BSA) ins Peritoneum injiziert. Nach ca. 6 Stunden zeigte sich eine deutlich ausgeprägte Entzündungsreaktion mit Anschwellung des Ohrs (Oedem), FITC-Einlagerung, Einwanderung von PMNL und petechialen Einblutungen ins Gewebe bei den mit anti-BSA und BSA-FITC behandelten Tieren. 18 Mäuse wurden zusätzlich zum Zeitpunkt 0 und nach 0 + 3 Stunden je 50 µg Thrombospondin-1 in Puffer (PBS) intraperitoneal injiziert. 16 Kontrollmäuse erhielten zum Zeitpunkt 0 + 3 Stunden nur PBS. Die Arthus-Reaktion wurde durch Thrombospondin fast vollständig verhindert. Mit Thrombospondin behandelte Mäuse zeigten signifikant geringere FITC-Einlagerungen, signifikant geringere Ohrdicken (weniger Oedeme) und fast keine Petechien im Vergleich zu PBS behandelten Kontrolltieren (siehe Abb. 11a-c).
    • 6. Beispiele für die Quantifizierung von oxidierten Proteinen Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die durch Oxidierungsprozesse direkt oder indirekt veränderte Epitope auf Proteinen oder Peptiden erkennen. Humanalbumin, Antithrombin III und Fibrinogen wurden, wie in dieser Erfindungsmeldung beschrieben, mit HOCl oxidiert und 8-12 Wochen alte Balb/c Mausweibchen damit immunisiert. Die Hybridomherstellung und -kultur erfolgte nach klassischem Verfahren. Überstände von Hybridomen wurden auf die Produktion von IgG bzw. IgM getestet. IgG-positive Zellkulturüberstände wurden auf positive Reaktion mit oxidiertem Protein, bei gleichzeitig negativer Reaktion mit dem nicht veränderten Ausgangsprotein getestet. Klone, die Antikörper gegen oxidiertes Protein (oxHumanalbumin, oxAntithrombin III, oxFibrinogen) produzierten und gleichzeitig nicht mit nicht oxidiertem Mutterprotein reagierten, wurden auf Kreuzreaktion mit oxidierten anderen Proteinen und Peptiden getestet.
      Quantifizierung oxidierter Proteine mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern, wie oben beschrieben:
      Eine solche Quantifizierung ist leicht mit Verfahren wie ELISA, RIA, quantitativer Durchflußzytometrie auf Zelloberflächen und ähnlichen Routineverfahren möglich.
      z. B.: Quantifizierung von oxidiertem Humanalbumin mittels ELISA. Ein polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen gegen Humanalbumin (Herstellung - Routineverfahren) wurde als Fängerantikörper an den Boden einer ELISA-Platte (Nung-Maxisorb) gebunden. Die Platte wurde mit PBS pH 7,4, 0,5% Tween 20 gründlich gewaschen und Plätze auf der Plastikoberfläche mit 3% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) geblockt. Die Platte wurde wieder gewaschen und anschließend mit unterschiedlich verdünnten Plasmen, Seren, Überstanden aus Blutprodukten (z. B. Thrombozytenkonzentraten, Erythrozytenkonzentraten, FFP) oder Pufferlösungen, denen oxHumanalbumin in definierter Menge zugesetzt wurde, für 1 Stunde bei RT inkubiert. Probenmaterial bzw. Standardlösungen wurden entfernt, die Platte gründlich gewaschen und mit dem oben beschriebenen monoklonalen Antikörper, der oxidiertes Humanalbumin erkennt und der mit Biotin markiert worden war, in einer Verdünnung von 1 : 15000 in PBS, 1% NGS (normal goat serum) inkubiert. Die Platte wurde wiederum mehrfach gründlich gewaschen und mit Streptavidin-Peroxidase inkubiert (1 Stunde, RT). Nach erneutem Waschen der Platte wurde diese mit Substratlösung (100 µl/well) (20 mg ortho-Phenyldiamin, 5% H2O2 in einem Puffer aus 12,15 ml 0,1 M Zitronensäure und 12,85 ml 0,2 M Na2HPO4 plus 25 ml H2O dest.) versetzt. Die Extinktion bei 405 nm gemessen im ELISA-Photometer spiegelt die Menge an oxidiertem Humanalbumin wieder. Die Reaktion wurde mit 50 µl/well 4n H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei 490 nm gemessen.
      HOCl oxidiertes Humanalbumin in der Messprobe wurde über die Eichreihe quantifiziert. Für HOCl-modifiziertes Fibrinogen und HOCl-modifiziertes Antithrombin III wurde analog verfahren.
    • 7. Beispiel für die Erfassung des Aktivierungszustands des Rezeptors für oxidierte Proteine, CD36
      Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen Threonin (92) phosphoryliertes CD36.
      Die Peptide (15 AS) (1) Lys, Gln, Arg, Gly, Pro, Tyr, Thr, Tyr, Arg, Val, Arg, Phe, Leu, Ala, Lys und (2) Lys, Gln, Arg, Gly, Pro, Tyr, PhosphoThr, Tyr, Arg, Val, Arg, Phe, Leu, Ala, Lys (wie Peptid (1), aber am Threonin phosphoryliert) wurden synthetisiert und an KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) gekoppelt. Polyklonale Antikörper aus dem Kaninchen wurden mit diesen gekoppelten Peptiden nach Standardverfahren hergestellt. Dazu wurden Kaninchen (New Zealand, white) mit 250 pg Peptid 1-KLH, bzw. Peptid 2-KLH plus Zusatz von komplettem Freund'schem Adjuvanz s.c. grundimmunisiert und mit 250 pg Peptid 1-KLH, bzw. Peptid 2-KLH mit Zusatz von Alu-Gel-S (1.3% Aluminiumhydroxid in Wasser, SIGMA) 3 mal "geboostert". Den Tieren wurde aus der Ohrvene Blut entnommen, Serum hergestellt und dieses auf Antikörper gegen die zur Immunisierung verwandten Peptide getestet. Der Antikörper gegen das phosphorylierte CD36-Peptid wurde an einer Affinitätssäule mit nicht-phosphoryliertem CD36-Peptid kreuzabsorbiert, so dass das erhaltene Antikörpergemisch nur noch Antikörper enthielt, die spezifisch phosphoryliertes, nichtaktiviertes CD36 erkennen (AK CD36P).
      (Die Herstellung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen Threonin-phosphoryliertes/-dephosphoryliertes CD36 ist mit diesen Peptiden analog zur beschriebenen Herstellung von anti-CD36-Protein AK möglich).
      Beide polyklonalen Antiseren reagierten mit CD36 auf der Plättchenoberfläche in der Durchflußzytometrie. Während Antikörper CD36P gegen phosphoryliertes CD36 das CD36 bevorzugt auf nicht aktivierten Thrombozyten erkennt, erkennt Antikörper "CD36 gesamt" nicht-phosphoryliertes CD36 und phosphoryliertes CD36. Bei Aktivierung der Thrombozyten wird CD36 dephosphoryliert und die Bindungsfähigkeit für Antikörper "CD36P" nimmt ab. Durch quantitative Durchflußzytometrie mit beiden Antikörpern ist eine Berechnung des Anteils an aktiviertem CD36 möglich.
    • 8. Der Organismus von Patienten mit Typ I Diabetes ist besonders empfindlich für oxidierte Proteine:
      z. B.: Thrombozyten von Patienten mit Diabetes Typ I reagieren sensitiver auf oxidiertes Protein als Agonist als Thrombozyten von gesunden Kontrollprobanden. Die aktivierungsabhängige Fibrinogenbindung lässt sich auf Thrombozyten von Diabetikern mit geringeren Konzentrationen an ox. Protein auslösen, als auf Thrombozyten von Kontrollprobanden (siehe Abb. 13).
    • 9. Oxidierte Proteine (getestet wurden oxAntithrombin III und oxHumanalbumin) binden mit hoher Affinität sowohl an HIV-GP120, als auch an seinen Rezeptor CD4.
      z. B.: Die Bindung von oxidiertem Antithrombin III und oxidiertem Humanalbumin an HIV-GP120 und an CD4 wurde im BIACORE 2000 System nachgewiesen. Laufpuffer: 25 mM Tris; 100 mM NaCl pH 7,4; 1 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 0,005% Surfactant P-20.
      Protein HIV-GP120: c = 100 µg/ml, 200 µl
      Lagerungspuffer: Tris/HCl, NaCl pH 7,6
      Protein CD4: c = 63 µg/ml, 318 µl
      Lagerungspuffer: 10 mM Tris; 300 mM NaCl pH 8
      Protein ox-Antithrombin III: c = 1 mg/ml, 120 µl
      Protein ox-Humanalbumin: c = 1 mg/ml, 120 µl
      C1-Chip (BIACORRE AB)
      Aminkopplungskit (BIACORE AB)
      HIV-GP120 und CD4 wurden auf der C1-Sensoroberfläche immobilisiert. Dabei wurden 10 mM NaAc pH 4 als Kopplungspuffer verwendet.
      Kopplungsbedingungen: HIV-GP120: 20 µl; 10 µg/ml GP120 in 10 mM NaAc pH 4; immobilisierte Menge: 1158 RU, 300 pg
      CD4: 30 µl; 6,3 µg/ml CD4 in 10 mM NaAc pH 4; immobilisierte Menge: 568 RU, 148p.
      Die Chip-Oberfläche wurde mit BSA abgesättigt und die Anbindung der oxidierten Proteine untersucht. Dazu wurden z. B. 50 µl oxidiertes Antithrombin III in unterschiedlichen Konzentrationen bei einer Flussrate von 20 µl/min injiziert. Die Proteinlösungen wurden mit dem Ladepuffer verdünnt. Mit zunehmender Konzentration an oxidiertem Antithrombin III nehmen die resultierenden Signale zu.
      14a) Overlay-Plot von 12 Sensorgrammen, welche die Anbindung von oxidiertem Antithrombin III an immobilisiertes HIV-GP120 und die Dissoziation zeigen.
      14b) Overlay-Plot von 12 Sensorgrammen, welche die Anbindung von oxidiertem Antithrombin III an immobilisiertes CD4 und die Dissoziation zeigen.
      Die quantitative Auswertung ergab für die Bindung von
      • 1. oxidiertem Antithrombin III an HIV-GP120:
        Kon (1/Ms): 6,38 × 105
        Koff (1/s): 4,44 × 10-4
        und eine KD[M] von 7,01 × 10-10,
      • 2. oxidiertem Antithrombin III an CD4:
        Kon (1/Ms): 7,13 × 105
        Koff (1/s): 1,12 × 10-3
        und eine KD[M] von 1,63 × 10-9,
      • 3. nicht modifiziertes Antithrombin III band weder an HIV-GP120, noch an CD4. Oxidiertes Humanalbumin band mit noch höher Affinität an HIV-GP120 und CD4 als ox. Antithrombin III. Nicht oxidiertes Humanalbumin band weder an HIV-GP120, noch an CD4.
    • 10. Oxidierte Proteine induzieren die TSP-Bindung an Zellen Oxidierte Proteine (hier als Beispiel verwendet oxHumanalbumin, oxAntithrombin III und oxFibrinogen) induzieren spezifisch und dosisabhängig die Bindung von TSP-1 an CD36 haltige Zellen (siehe Abb. 15a-d).
    • 11. Da oxidierte Proteine die TSP-Bindung induzieren, induzieren Medikamente nach Anspruch 21-24 zwangsläufig damit indirekt Wirkungen von an Zelloberflächen gebundenem TSP, wie z. B. die Hemmung der Angiogenese (siehe Abb. 16a) oder die Hemmung einer HIV-Infektion. Auf der anderen Seite bewirkt eine Hemmung der Interaktion zwischen oxidierten Proteinen und CD36 damit folgerichtig eine Unterdrückung der Funktionen, die durch die Reaktionskette oxProtein-CD36-zellgebundenes TSP ausgelöst werden. Hemmstoffe nach Patentanspruch 1-4 hemmen damit auch TSP-vermittelte Prozesse, wie die Inhibition der Angiogenese und wirken somit proangiogenetisch (siehe Abb. 16b).
    Legenden zu den Abbildungen Abb. 2 Oxidierte Proteine wirken blutstillend/prothrombotisch - Steigerung der Thrombozyten-Adhäsion/Inhibition dieser Reaktion
  • 2a) Oxidierte Proteine steigern die Plättchenadhäsion an Kollagen Typ I. Die Adhäsion der Thrombozyten wurde nach Santoro et al. 1994 durchgeführt. Eine 96-Well-Zellkulturplatte wurde mit Kollagen Typ I (25 µg/ml; 100 µl/well) über Nacht bei 4°C gecoatet und die Platten mit BSA geblockt. Humane Thrombozyten wurden durch Gelfiltration in HEPES-Tyrode-Puffer pH 7.4 mit Zusatz von 2 mM Mg2+, 1 mM Mn2+, 0.9% Glukose und 0.35% BSA von Plasmaproteinen gereinigt. 100 µl gelfiltrierte Plättchen (300000/µl) wurden mit und ohne oxidierten Proteinen für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer in den Wells inkubiert. Nicht adhärierte Thrombozyten wurden gründlich ausgewaschen. Die Anzahl der adhärierten Plättchen wurde durch Lyse der Plättchen mit Triton X-100 und Nachweis des lysosomalen Enzyms Hexosaminidase bestimmt. Zur Kalibrierung des Adhäsions-Assays wurde auf der Mikrotiterplatte eine Eichreihe bekannter ansteigender Plättchenanzahl gegeben und die Extinktion des umgesetzten Substrates P-Nitrophenyl-N-Acetyl-β-D-Glucosaminid im Verhältnis zur Plättchenzahl bestimmt. Oxidiertes Antithrombin III steigerte dosisabhängig die Thrombozytenadhäsion.
  • 2b) Thrombozyten wurden im oben beschriebenen Adhäsions-Assay eingesetzt und mit 50 µg/ml oxidiertem ATIII aktiviert. Zusatz von löslichem gereinigtem Thrombospondin inhibierte die durch oxidiertes ATIII gesteigerte Thrombozytenadhäsion dosisabhängig.
  • 2c) Thrombozyten wurden im oben beschriebenen Adhäsionsassay eingesetzt und mit oxidiertem ATIII aktiviert. Monoklonale Antikörper, die die Bindung von oxidierten Proteinen an CD36 hemmen wie die Klone 37, 13 und 7, hemmen die Wirkung von oxidiertem ATIII. Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.
  • 2d) Dieser Effekt ist dosisabhängig.
  • 2e) Die Inhibition der Thrombozytenadhäsion durch lösliches Thrombospondin-1 wird nicht über dessen Bindungsstelle an CD36 direkt (Peptid VTCG) vermittelt. VTCG zeigt keinen Einfluß auf die Steigerung der Thrombozytenadhäsion durch oxidierte Proteine (hier oxidiertes ATIII).
  • 2f) Antikörper gegen CD36, die die Bindung von CD36 an oxidierte Proteine nicht inhibieren, wie der Klon FA6/152, rufen dagegen keine signifikante Hemmung hervor. Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.
    • Abb. 3 Oxidierte Proteine wirken blutstillend/prothrombotisch - Steigerung der Fibrinogenanbindung an Thrombozyten/Inhibition dieser Reaktion
  • Gelfiltrierten Plättchen (50000/µl) in HEPES-Tyrode-BSA-Puffer wurde FITC konjugiertes Fibrinogen und 10 µg/ml Thrombospondin zugesetzt. Ein Teil der Proben wurde mit oxidierten Proteinen in aufsteigenden Konzentrationen versetzt. Nach Inkubation für 30 Minuten bei RT wurde die Fibrinogenanbindung im Durchflußzytometer bestimmt.
  • 3a) Oxidierte Proteine (hier als Beispiel oxidiertes Fibrinogen, oxidiertes Humanalbumin und oxidiertes Antithrombin III) verstärken die Fibrinogenanbindung an Thrombozyten.
  • 3b) Lösliches Thrombospondin-1 hemmt dosisabhängig die durch ox.
  • Protein ausgelöste Fibrinogenbindung.
  • 3c) Antikörper, die die Bindung von oxidierten Proteinen an CD36 hemmen, inhibieren dosisabhängig die durch oxidierte Proteine induzierte Fibrinogenanbindung an Thrombozyten
    oxidiertes Protein: oxidiertes ATIII;
    Antikörper: anti CD36 AK, Klon 37.
  • 3d) oxidiertes Protein: oxidiertes Fibrinogen;
    Antikörper: anti CD36 AK, Klon 37.
  • 3e) oxidiertes Protein: oxidiertes Humanalbumin
    Antikörper: anti CD36 AK, Klon 37.
  • Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.
    • Abb. 4 Oxidierte Proteine wirken blutstillend/prothrombotisch/Induktion der Thrombozytenagareaation/Inhibition dieser Reaktion
  • 4a) Oxidierte Proteine induzieren die Thrombozytenaggregation. Die Thrombozytenaggregation wurde nach Born 1962 durchgeführt. Zu gelfiltrierten Plättchen (200000/µl) in HEPES-Tyrode Puffer pH 7.4 mit 100 µg/ml Fibrinogen wurde in einer Aggregationsküvette TSP-1 (25 µg/ml) pipettiert. Lösliches TSP-1 löste alleine keine Aggregation aus. Gleichzeitige Gabe von oxidierten Proteinen (hier oxidiertes Fibrinogen oder oxidiertes Antithrombin III) führte zu einer starken Aggregatbildung.
    Lösliches Thrombospondin hemmte in hohen Konzentrationen > 50 µg/ml die durch oxidierte Proteine ausgelöste Aggregation.
  • 4b) Antikörper, welche die Bindung von oxidierten Proteinen an CD36 hemmen, inhibieren dosisabhängig die durch oxidierte Proteine induzierte Plättchenaggregation. Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.
    • Abb. 5 Oxidierte Proteine wirken blutstillend/prothrombotisch - Induktion des prokoaaulanten Zustands der Thrombozyten und der Mikropartikelbildung/Inhibition dieser Reaktion
  • 5a) Oxidierte Proteine (hier als Beispiel oxidiertes Fibrinogen) induzieren eine Bindung von Faktor V/Va an Thrombozyten. Die Faktor V/Va-Bindung wurde wie in Dörmann et al. 1998 beschrieben durchgeführt.
  • 5b) Oxidierte Proteine (hier als Beispiel oxidiertes Fibrinogen) induzieren die Bindung von Faktor X/Xa an Thrombozyten. Die Faktor X/Xa-Bindung wurde wie in Dörmann et al. 1998 von uns beschrieben durchgeführt.
  • 5c) Oxidierte Proteine (hier als Beispiel oxidiertes Fibrinogen) induzieren den Phospholipid Flip-Flop in der Membran und damit die Bindung von Annexin V an Thrombozyten. Die Annexin V-Bindung wurde wie in Dörmann et al. 1998 von uns beschrieben durchgeführt.
  • 5d) Oxidierte Proteine (hier als Beispiel oxidiertes Fibrinogen) induzieren die Mikropartikelbildung von Thrombozyten. Gelfiltrierte Plättchen (50000/µl) wurden mit oxidiertem Protein für 30 Minuten bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert. Danach wurden die Plättchen und aus Plättchen entstandene Mikropartikel für 30 Minuten mit dem anti GPIX-PE Antikörper inkubiert und die Zahl der entstandenen Mikropartikel im Verhältnis zu 5000 gezählten Partikeln im Durchflußzytometer gemessen.
  • 5e) Lösliches Thrombospondin hemmt die durch oxidierte Proteine ausgelöste Mikropartikelbildung. In diesem Versuchsbeispiel wurde die Mikropartikelbildung aus Thrombozyten durch oxidiertes Humanalbumin induziert. Gelfiltrierte Plättchen in Hepes-Tyrode Puffer pH 7.4 wurden mit je 50 µg/ml oxidiertem Humanalbumin für 1 h bei RT aktiviert. Die Plättchensuspension wurde vor Aktivierung mit löslichem TSP in den angegebenen Konzentrationen versetzt. Die Mikropartikelbildung wurde wie in 5d) beschrieben analysiert. Lösliches Thrombospondin inhibierte dosisabhängig die Bildung der Mikropartikel.
  • 5f) Anti CD36 Klon 37 hemmt die oxProtein induzierte Ausbildung des prokoagulanten Zustands der Plättchen. Die AnnexinV-Bindung, als Indikator für die Ausbildung einer prokoagulanten Membranoberfläche der Thrombozyten, wurde wie unter 5c) beschrieben gemessen. Vorinkubation der Plättchen mit anti CD36 Antikörpern (30 Minuten, RT), welche die Bindung von ox. Proteinen an CD36 hemmen, inhibierte die nachfolgende Aktivierung dieser Plättchen durch oxidierte Proteine (hier als Beispiel oxidiertes Fibrinogen). Alle Experimente zum Einfluß von Antikörpern auf Thrombozytenfunktionen wurden in Gegenwart sättigender, komplett blockierender Konzentrationen von Fab-Fragmenten eines Antikörpers gegen den FcRIIA-Rezeptor (Klon IV.3) durchgeführt, um Fc-Rezeptoreffekte auszuschließen.
  • 5g) Anti CD36 AK 37 hemmt die durch oxidierte Proteine ausgelöste Mikropartikelbildung von Thrombozyten. Die Mikropartikelbildung wurde wie unter 5d) beschrieben bestimmt. Vorinkubation der Plättchen mit anti CD36 Antikörpern (30 Minuten, RT), welche die Bindung von oxidierten Proteinen an CD36 hemmen, vor Aktivierung mit oxidierten Proteinen (hier als Beispiel oxidiertes Fibrinogen) hemmt die Mikropartikelbildung.
    • Abb. 6 Oxidierte Proteine aktivieren Leukozyten - Ca2+-Signal
  • Oxidierte Proteine (hier gezeigt oxidiertes Antithrombin III) induzieren in Monozyten ein Ca2+-Signal. Die Ca2+-Messungen wurden nach Sozzani et al. 1993 durchgeführt. Elutriierte Monozyten (5 × 106/ml) wurden bei RT mit HEPES-Tyrode Puffer pH 7.4 gewaschen und anschließend 15 Minuten mit 1 µM Fura2/AM bei 37°C markiert, zweimal mit HEPES-Tyrode Puffer ohne Ca2+ gewaschen und dann in HEPES-Tyrode mit 1 mM Ca2+ aufgenommen. Ca2+-Signal, induziert durch oxidierte Proteine und als Positiv- oder Negativkontrollen wirksame Substanzen, wurden fluorimetrisch im Hitachi F-2000 bestimmt. Oxidiertes Antithrombin III (100 µg/ml) aktiviert Monozyten und ruft ein deutliches Ca2+-Signal hervor.
    • Abb. 7 Oxidierte Proteine aktivieren Leukozyten - oxidativer Burst
  • Oxidierte Proteine verstärken dosisabhängig die aktivierende Wirkung von fMLF auf den oxidativen Burst von PMNL und lösen ihn sogar als selbständige, unabhängige Agonisten auch aus. Die Induktion des oxidativen Burst wurde im wesentlichen gemäß Anleitung des Herstellers mit dem Phagotest/Burst-Test der Firma Orpegen (Heidelberg) am Durchflußzytometer durchgeführt, jedoch zuerst die PMNL mit dem Substrat DHR123 inkubiert und anschließend die PMNL aktiviert. Oxidiertes Antithrombin III steigerte dabei die aktivierende Wirkung von fLMF und rief selbst eine ox. Burst-Reaktion hervor.
    • Abb. 8 Oxidierte Proteine aktivieren Leukozyten - Transmigration durch das Endothel/Inhibition dieser Reaktion
  • 8a) In "Transwell"-Zellkulturkammern (Costar, Bodenheim) wurde je ein mit einer mikroporösen Polycarbonat-Membran bespannter "Transwell"-Einsatz pro einer der 24 Vertiefungen platziert. Die Polycarbonat-Membran mit einer Porengröße von 5 µm wurde mit Fibronectin beschichtet und darauf humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) bis zur Konfluenz kultiviert. Durch Dichtegradientenzentrifugation isolierte humane Monozyten (200 µl mit 2 × 107 Zellen/ml in DMEM aus dem periphären Blut) wurden bei 37°C, 7% CO2 mit dem HMEC-1 Monolayer inkubiert. Als Maß für die Transmigrationsrate wurde die Anzahl der Monozyten im unteren "Transwell"-Kompartiment unter dem "Transwell"-Einsatz bestimmt. Um den Einfluß von verschiedenen oxidierten Proteinen, von Thrombospondin oder von anti CD36 Antikörpern zu untersuchen, wurden die Testsubstanzen dem Medium in der oberen "Transwell"-Kammer zugesetzt oder die Endothelzellen für 10 Minuten mit den Testsubstanzen vorinkubiert und gewaschen. Nach 4-7 Stunden Transmigrationsdauer wurden die Einsätze vorsichtig entfernt, die Zellkulturplatte für 30 Minuten zur Ablösung der adhärierten Monozyten auf Eis gestellt und die Zahl der transmigrierten Monozyten ausgezählt. Oxidiertes Protein (hier oxidiertes ATIII) förderte die Transmigration von Monozyten durch ein HMEC-1 Monolayer, während das nicht oxidierte Ausgangsprotein diese Reaktion nicht zeigte (Transmigrationsdauer 4 h).
  • 8b) Durch Vorinkubation des Endothellayers für 10 Minuten mit TSP-1, bzw. Zusatz von TSP-1 zum Kulturmedium während des Transmigrationsversuchs konnte die Transmigration der Monozyten signifikant gehemmt werden (Transmigrationsdauer 7 h).
    • Abb. 9 Oxidierte Proteine induzieren Prozesse, welche die Arteriosklerose fördern
  • Oxidiertes Antithrombin III steigerte das "Homing" von Makrophagen in arteriosklerotische Plaques. Die Durchführung des Versuchs wurde in der Beschreibung des Beispiels im Detail beschrieben.
    • Abb. 10 Thrombospondin hemmt proarteriosklerotische Prozesse
  • Thrombospondin hemmt die Adhäsion von Makrophagen an arteriosklerotisch veränderte Endothelzellen. Die Versuchsdurchführung ist in der Beschreibung des Beispiels im Detail erläutert.
  • 10a) Thrombospondin-1 hemmt die transiente, durch Rollen von Makrophagen gekennzeichnete Adhäsion, an arteriosklerotisch verändertes Endothel.
  • 10b) Thrombospondin hemmt die permanente, stabile Adhäsion von Makrophagen an arteriosklerotisch verändertes Endothel.
    • Abb. 11 Thrombospondin hemmt Entzündungsprozesse in vivo
  • Lösliches Thrombospondin-1 inhibiert die Arthus-Reaktion im Ohr von Balb/c Mäusen
  • 11a) Zweimal zum Zeitpunkt 0 und 0 + 3 Stunden je 50 µg TSP-1 i.p. behandelte Maus - verhinderte Arthus-Reaktion im linken Ohr
  • 11b) Zweimal zum Zeitpunkt 0 und 0 + 3 Stunden mit dem Kontrollpuffer i.p. behandelte Maus - Arthus-Reaktion im linken Ohr
  • 11c) In den Ohren eingelagertes BSA-FITC als Maß für die Arthus-Reaktion in mit TSP-1 und Kontrollpuffer behandelten Mäusen - Arthus-Reaktion im linken Ohr.
    • Abb. 13
  • Patienten mit Diabetes mellitus Typ I und Kontrollprobanden wurde Blut entnommen und dieses mit Citrat antikoaguliert. Durch Zentrifugation wurde Plättchen-reiches Plasma (PRP) hergestellt. Das PRP von Patienten und gesunden Kontrollprobanden wurde mit Fibrinogen [150 µg/ml], welches an FITC gekoppelt worden war, versetzt und die Thrombozyten mit oxidiertem Protein (hier oxidiertes Humanalbumin) in aufsteigenden Konzentrationen für 30 Minuten aktiviert. Die Fibrinogenbindung wurde wie oben im Detail beschrieben im Durchflußzytometer gemessen. Die Abbildung zeigt ein charakteristisches Beispiel für die gleichzeitig durchgeführten Aktivierbarkeitsbestimmungen mit PRP von Patienten mit Diabetes mellitus Typ I im Vergleich zu Kontrollen. Thrombozyten von Patienten mit Diabetes mellitus Typ I sind besonders sensitiv für die Aktivierung mit oxidierten Proteinen.
    • Abb. 14
  • Die Interaktion zwischen oxidierten Proteinen und HIV-GP120 bzw. CD4 wurde, wie in der Beschreibung des Beispiels im Detail erläutert, mittels Plasmon Resonanz-Technik im BIACORE-System 2000 bestimmt.
    • a) Overlay-Plot von 12 Sensorgrammen, welche die Anbindung von oxidiertem Antithrombin III an immobilisiertes HIV-GP120 und die Dissoziation von oxidiertem Antithrombin III zeigen. HIV-GP120 ist immobilisiert (300 pg); die Konzentration an oxidiertem Antithrombin III wurde variiert (von unten nach oben: 0 nM; 1 nM; 5.1 nM; 10.2 nM; 17 nM; 20.4 nM; 23 nM; 34 nM; 40.8 nM; 51 nM; 85 nM; 119 nM). Mit steigender Konzentration an oxidiertem AT III nimmt das resultierende Signal zu.
      Die Interaktion zwischen oxidierten Proteinen und HIV-GP120 bzw. CD4 wurde wie in der Beschreibung des Beispiels im Detail erläutert mittels Plasmon Resonanz-Technik im BIACORE-System 2000 bestimmt.
    • b) Overlay-Plot von 12 Sensorgrammen, welche die Anbindung von oxidiertem Antithrombin III an immobilisiertes CD4 und die Dissoziation von oxidiertem Antithrombin III zeigen. CD4 ist immobilisiert (148 pg); die Konzentration an oxidiertem Antithrombin III wurde variiert (von unten nach oben: 0 nM; 1 nM; 5.1 nM; 10.2 nM; 17 nM; 20.4 nM; 23 nM; 34 nM; 40.8 nM; 51 nM; 85 nM; 119 nM). Mit steigender Konzentration an oxidiertem AT III nimmt das resultierende Signal zu.
    Abb. 15
  • 15a) Oxidiertes Protein vermittelt die TSP-1 Bindung an Thrombozyten Gelfiltrierte humane Thrombozyten wurden mit Hepes-Tyrode Puffer pH 7,4 auf 50000/µl verdünnt und FITC konjugiertes, gereinigtes Thrombospondin-1 (50 µg/ml) zugesetzt. Die Thrombozyten wurden 1 h bei RT mit oxidiertem Protein (hier oxidiertes Fibrinogen) inkubiert und die TSP-1 Bindung an die Thrombozyten im Durchflußzytometer gemessen.
    Oxidierte Proteine induzieren die TSP-1 Bindung an Thrombozyten.
  • 15b) Oxidiertes Protein (hier oxidiertes Antithrombin III) induziert die Bindung von Thrombospondin an Endothelzellen. Humane, mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) wurden nach Standardverfahren von der Zellkulturplatte abgelöst, vereinzelt und die Suspension für 1 h bei RT mit oxidiertem Protein bzw. oxidiertem Protein plus TSP-1 Zusatz inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und gebundenes TSP-1 mit mAK anti TSP-1 (Klon P10), gekoppelt an Phycoerythrin (PE), markiert und im Durchflußzytometer quantifiziert. Oxidiertes Protein induziert die TSP-1 Bindung an Endothelzellen.
  • 15c) Während ohne Zusatz von gereinigtem TSP-1 und ohne Zusatz von oxidiertem Antithrombin III nur ca. 1% der elutriierten Monozyten durch eine Antikörper (Klon P10), der TSP-1 auf der Zelloberfläche erkennt, im Durchflußzytometer detektiert werden, steigt die Anzahl durch Zusatz von gereinigtem TSP-1 (10 µg/ml) auf ca. 5%. Zusatz von oxidiertem AT III (ohne Zusatz von exogenem TSP-1) vermittelt die Bindung von endogenem TSP-1 an die Monozyten. Ca. 18% der Monozyten wurden TSP-1 positiv. Durch gleichzeitige Gabe von TSP-1 und oxidiertem AT III wurden nahezu alle der verwendeten periphären Blutmonozyten stark positiv für TSP-1.
  • 15d) Oxidiertes Protein induziert die Bindung von TSP-1 an T-Zellen. Kultivierte humane T-Zellen (Jurkat-Zellen) wurden für 1 h bei RT mit oxidiertem Protein (hier oxidiertes Antithrombin III) oder oxidiertem Protein plus TSP-1 Zusatz (25 µg/ml) inkubiert. An die T-Zellen gebundenes TSP-1 wurde durch den monoklonalen PE-konjugierten anti TSP Antikörper (Klon P10) markiert und im Durchflußzytometer gemessen. Oxidierte Proteine induzieren die Bindung von endogen vorhandenem und exogen zugesetztem TSP an T-Zellen.
    • Abb. 16
  • Diese Abbildung verdeutlicht den Mechanismus, über den Medikamente nach Anspruch 1-4 und nach Anspruch 21-24 Funktionen inhibieren oder vermitteln, die durch die Reaktion von Thrombospondin mit CD36 ausgelöst werden (Beispiel Angiogenese). Die Arbeitsgruppe um N. Bouck identifizierte das Thrombospondin-1 und Derivate davon als einen potenten endogenen Inhibitor der Tumor-Angiogenese (Good et al. 1990 PNAS 87 6624) und klärte auf, dass diese Reaktion über CD36 vermittelt wird (Dawson et al. 1997 J. Cell. Biol. 13813) 701-717; Jimenez et al. 2000 Nat. Med. 6(1) 41-8).
  • 16a) In dieser Erfindung wurde nachgewiesen, daß oxidierte Proteine die Bindung von Thrombospondin an CD36 vermitteln. Medikamente nach Anspruch 21-24 induzieren damit Reaktionen, die durch diese Bindung ausgelöst werden, wie z. B. die Inhibierung der Angiogenese, ein Prozeß, der therapeutisch zur Bekämpfung von Tumoren eingesetzt werden kann.
  • 16b) In dieser Erfindung wurden Substanzen vorgestellt, welche die Wechselwirkung von oxidierten Proteinen mit CD36 hemmen und damit die Prozesse, die im Körper durch oxidierte Proteine über CD36 ausgelöst werden. Medikamente nach Anspruch 1-4 hemmen diese Reaktionen und treten der Angiogenesehemmung, die durch die Reaktionskette oxidierte Proteine(CD36-Konformationsänderung-Thrombospondinbindung an CD36-CD36 → Signal) für Angiogenesehemmung ausgelöst wird, entgegen. Diese Reaktion kann bei erwünschter Angiogenese, z. B. im Herzmuskel bei Infarkt, therapeutisch genutzt werden. Referenzliste 1. Abumrad N, Coburn C, Ibrahimi A: Membrane proteins implicated in long-chain fatty acid uptake by mammalian cells: CD36, FATP and FABPm. Biochim. Biophys. Acta 1441: 4-13, 1999
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Claims (29)

1. Substanzen, die die Bindung von oxidierten Proteinen an CD36 oder die durch Interaktion von CD36 mit oxidierten Proteinen induzierten Funktionen von CD36 hemmen als Arzneimittel für Menschen und Tiere.
2. Substanzen nach Anspruch 1, insbesondere Antikörper, die die Bindung von oxidierten Protein an CD36 hemmen; ganz besonders monoklonale Antikörper, incl. Fragmente F(ab)2, F(ab), Antigen-Erkennungsregion.
3. Substanzen nach Anspruch 1, insbesondere Peptide aus CD36, Peptidmimetika, -analoga, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Bindung von CD36 an oxidierte Proteine hemmen (diese können z. B. dadurch identifiziert werden, dass sie mit den in der Erfindung erwähnten monoklonalen anti CD36 Antikörpern Klon 37, 13 oder 7 reagieren).
4. Substanzen nach Anspruch 1, insbesondere Proteine, die die Bindung von CD36 an oxidierte Proteine hemmen oder mit an CD36 gebundenem Thrombospondin konkurrieren; ganz besonders lösliches Thrombospondin.
5. Substanzen nach Anspruch 1, insbesondere Peptide und Peptidmimetika, dadurch gekennzeichnet, dass sie an CD36 binden und so die Interaktion von CD36 mit oxidierten Proteinen hemmen (diese können leicht, z. B. mit dem Phage Display Verfahren identifiziert werden).
6. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 als Medikament zur Prophylaxe von Thrombosen, insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen.
7. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Unterstützung einer antithrombotischen Therapie.
8. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verhinderung einer Transplantatabstoßung.
9. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verhinderung einer transplantationsbedingten Arteriosklerose.
10. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verhinderung eines Bluthochdrucks bei Nierenerkrankungen, insbesondere eines Renin-bedingten Bluthochdrucks.
11. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verhinderung der Entwicklung und des Fortschreitens von arteriosklerotischen (atherosklerotische) Erkrankungen.
12. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Behandlung von chronischen Entzündungsreaktionen.
13. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verhinderung einer frühen Gefäß-Reocclusion nach Bypass-Operation, Stent, PTCA, oder ähnlichem.
14. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verhinderung einer Gefäß-Restenose nach Bypass-Operation, Stent, PTCA, oder ähnlichem.
15. Substanzen nach einem der Anprüche 1-5 als Medikament zur Verhinderung von Reperfusionsschäden, wie, aber nicht beschränkt auf, bei Myokardischämie, Organtransplantation, Schlaganfall, peripherer Verschlusskrankheit, nach operativen Eingriffen, Multiorganversagen nach erfolgreicher Wiederbelebung.
16. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 als Medikament zur Verhinderung von Gefäßschädigungen, insbesondere bei Patienten mit Diabetes mellitus.
17. Substanzen nach einem der Anprüche 1-5 als Medikament zur Verhinderung einer durch oxidierte Proteine über CD36/TSP-1 ausgelösten Hemmung der Endothelproliferation und Angiogenese.
18. Substanzen nach einem der Ansprüche 1-5 als Medikamente zur Unterstützung der Wundheilung.
19. Quantifizierung von ox. Proteinen (insbesondere oxHumanalbumin, oxFibrinogen), einzeln oder gesamt für die Evaluierung der individuellen Indikation der Therapie mit Medikamenten nach einem der Ansprüche 1-5, zur Diagnostik von Erkrankungen, bei denen Entzündungsreaktionen eine Rolle spielen, wie, aber nicht beschränkt auf, Arteriosklerose, diabetische Vasculopathie, rheumatische Arthritis, Goodpasture Syndrom, Sepsis, Colitis ulcerosa, Graft-versus-Host Erkrankungen, Pemphigus, Krebs, Neurodermitis, HIV-Infektion, Glomerulonephritis, Reperfusionsschäden und zur Qualitätskontrolle von Blutprodukten.
20. Charakterisierung des Aktivierungszustandes von CD36, des Rezeptors für oxidierte Proteine, als Diagnostikum für Erkrankungen, bei denen Entzündungsreaktionen eine Rolle spielen, wie, aber nicht beschränkt auf, Arteriosklerose, diabetische Vasculopathie, rheumatische Arthritis, Goodpasture Syndrom, Sepsis, Colitis ulcerosa, Graft-versus-Host Erkrankungen, Pemphigus, Krebs, Neurodermitis, HIV-Infektion, Glomerulonephritis, Reperfusionsschäden, oder zur Überwachung einer CD36/oxProtein lnhibitionstherapie mit Medikamenten nach einem der Ansprüche 1-5 durch Erfassung des Phosphorylierungszustandes von CD36.
21. Arzneimittel enthaltend oxidiertes Protein/ oxidierte Proteine, oxidiertes Peptid, Struktur-Analoga oder -Mimetika.
22. Arzneimittel nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es weitere pharmazeutisch akzeptable Hilfs- und/oder Trägersubstanzen enthält.
23. Arzneimittel nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es zur lokalen, intradermalen, oberflächlichen, intraperitonealen, intravenösen, oralen oder intramuskulären Verabreichung formuliert ist oder über Vesikel verabreicht wird.
24. Arzneimittel nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es weitere Substanzen, wie z. B. Antibiotika, Immunsuppressiva oder Interaktionspartner von oxidierten Proteinen im Körper enthält.
25. Verfahren zur Herstellung von oxidiertem Protein/Peptid durch Reaktion mit HOCl oder Peroxynitriten.
26. Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 21-24 zur Prophylaxe oder Therapie von akuten Infektionen, zur Inhibierung der Angiogenese und zur Verbesserung der Blutstillung.
27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass als akute Infektion eine HIV-Infektion verhindert oder behandelt wird.
28. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass durch oxidiertes Protein, über Induktion der TSP-Bindung an CD36, eine Tumorangiogenese inhibiert wird.
29. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Blutstillung, insbesondere bei Patienten mit angeborenen oder erworbenen Blutgerinnungsstörungen, oder angeborenen oder erworbenen Thrombozytopathien, unter Antikoagulationstherapie oder Thromboseprophylaxe, oder bei Operationen unter Herzlungenmaschine eingesetzt wird.
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