Verfahren zur quantitativen optischen Registrierung in Ultrazentrifugen
und Elektrophoresegeräten Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen
optischen Registrierung in Ultrazentrifugen und Elektrophoresegeräten. Es ist Aufgabe
einer Ultrazentrifuge oder eines Elektrophoresegerätes, die Teilchen einer in Lösung
befindlichen Substanz durch die Einwirkung eines Schwere- bzw. elektrischen Feldes
zu beschleunigen.Method for quantitative optical registration in ultracentrifuges
and electrophoresis equipment The invention relates to a method for quantitative
optical registration in ultracentrifuges and electrophoresis devices. It's a job
an ultracentrifuge or an electrophoresis machine, the particles are in solution
located substance by the action of a gravity or electric field
to accelerate.
Die Beobachtung und Registrierung der Bewegungsvorgänge liefert unter
anderem wertvolle Aufschlüsse über Molekulargewicht und Ladung der gelösten Teilchen,
ferner können quantitative Beziehungen zwischen einzelnen Komponenten der gelösten
Substanz aufgeklärt werden. Gerade bei der Untersuchung von Eiweißen beispielsweise
stehen meist nur sehr verdünnte Lösungen zur Verfügung. Fast alle im Gebrauch befindlichen
Verfahren benutzen die Differenz des Brechungsindex der gelösten Substanz gegenüber
dem Brechungsindex des Lösungsmittels, um eine Konzentrationsbestimmung durchzuführen.
Diese Brechungsindexdifferenzen werden auf die verschiedenste Art und Weise sichtbar
gemacht. The observation and registration of the movement processes provides under
other valuable information about the molecular weight and charge of the dissolved particles,
Furthermore, there can be quantitative relationships between individual components of the solved
Substance to be clarified. Especially when examining proteins, for example
usually only very dilute solutions are available. Almost all of them in use
Methods use the difference in the index of refraction compared to the solute
the refractive index of the solvent in order to determine the concentration.
These refractive index differences become visible in a wide variety of ways
made.
Da sich nun der Brechungsindex der Eiweiße nur wenig von dem der
üblichen Lösungsmittel unterscheidet und außerdem meist nur sehr verdünnte Lösungen
zur Verfügung stehen, werden relativ große Lösungsschichtdicken erforderlich, um
den Nachweis empfindlich genug zu gestalten. Dies erfordert wiederum eine relativ
große Menge Lösung zur Füllung der Meßküvetten, welche sehr oft gerade bei der Untersuchung
von Eiweißen nicht zur Verfügung steht. Außerdem sind diese Verfahren an die Verwendung
sehr langhrennweitiger Linsen gebunden, welche einen großen Raumbedarf der ganzen
Anlage hedingen. Since the refractive index of the proteins differs only slightly from that of the
common solvents and mostly only very dilute solutions
are available, relatively large solution layer thicknesses are required
to make the detection sensitive enough. Again, this requires a relative
Large amount of solution to fill the measuring cuvettes, which is very often used during the examination
of proteins is not available. Also, these procedures are in need of use
very long-term lenses tied, which take up a lot of space all over
Hedingen the plant.
Die Erfindung nutzt das in der Mikroskopie bereit wohlbekannte Phasenkontrastverfahren
zur quantitativen Konzentrationsmessung in Ultrazentrifugen und Elektrophoresegeräten
aus. In diesen Geräten wird die anfänglich homogene Verteilung der gelösten Substanz
in der Meßküvette durch die Einwirkung eines Kraftfeldes geändert, so daß es nach
Ende des Trennvorganges in der Meßküvette Stellen gibt, an denen die Konzentration
der gelösten Teilchen gegenüber der Ausgangskonzentration erhöht bzw. erniedrigt
ist. An diesen Stellen hat das Meßlicht verschiedene optische Weglängen zu durchlaufen,
das Objekt weist also eine diesen optischen Weglängendifferenzen entsprechende Struktur
auf. Letztere ist dem unbewaffneten Auge nicht sichtbar, sie wird nach dem Phasenkontrastverfahren
nach Zernike in der Weise sichtbar gemacht, daß sie als Hell-Dunkel-Struktur wahrnehmbar
wird. Weicht der Brechungsindex der gelösten Substanz von dem des Lösungsmittels
ab, so ist der optische Weg durch eine bestimmte Stelle der Meß-
küvette proportional
der Konzentration gelöster Teilchen an dieser Stelle, und da mit zunehmender Länge
des optischen Weges eine zunehmende Phasenverschiebung des Meßlichtes erfolgt, so
ist die beobachtete Phasenverschiebung ein direktes Maß für die an jedem Ort befindliche
Menge phasenverschiebender Substanz. The invention uses the phase contrast method which is already well known in microscopy
for quantitative concentration measurement in ultracentrifuges and electrophoresis devices
the end. In these devices, the initially homogeneous distribution of the dissolved substance
changed in the measuring cell by the action of a force field, so that it after
At the end of the separation process there are places in the measuring cuvette where the concentration
of the dissolved particles increased or decreased compared to the initial concentration
is. At these points the measuring light has to pass through different optical path lengths,
the object thus has a structure corresponding to these optical path length differences
on. The latter is not visible to the naked eye, it is made using the phase contrast method
made visible according to Zernike in such a way that they can be perceived as a light-dark structure
will. If the refractive index of the solute differs from that of the solvent
from, then the optical path through a certain point of the measuring
cuvette proportional
the concentration of dissolved particles at this point, and there with increasing length
of the optical path an increasing phase shift of the measuring light takes place, see above
the observed phase shift is a direct measure of that at each location
Amount of phase-shifting substance.
Für geringe Phasenverschiehungen im Objekt von 0 bis 9()0 läßt sich
stets eine eindeutige Kontrastfunktion definieren. Es ist daher möglich, durch eine
Intensitätsmessung in der Hell-Dunkel-Struktur des durch die Phasenkontrastoptik
entworfenen Bildes eine quantitative Konzentrationsbestimmung vorzunehmen. Zu dieser
Messung findet zweckmäßig ein Strahlungsempfänger hoher Unterschi eds empfindl ichi
keit Verwendung. Photoelektrische oder photographische Kontrastmessungen finden
heute in Wissen schaft und Technik allgemeinste Anwendung.For small phase shifts in the object from 0 to 9 () 0 can be
always define a clear contrast function. It is therefore possible through a
Intensity measurement in the light-dark structure of the through the phase contrast optics
to make a quantitative concentration determination of the designed image. To this
It is advisable to use a radiation receiver that is sensitive to high differences in the measurement
use. Find photoelectric or photographic contrast measurements
Most general application today in science and technology.
Die Erfindung erreicht, daß noch außerordentlich stark verdünnte
Lösungen quantitativ untersucht werden können. Sie erlaubt ferner die Verwendung
sehr kleiner Lösungsschichtdicken, so daß nur sehr geringe Lösungsmengen für eine
Untersuchung erforderlich sind. Langwierige und kostspielige Anreicherungsverfahren
entfallen. Der Strahlengang der Optik wird
nicht wesentlich länger
als in jedem gewöhnlichen Mikroskop. The invention achieves that still extremely dilute
Solutions can be examined quantitatively. It also allows use
very small solution layer thicknesses, so that only very small amounts of solution for a
Investigation are required. Lengthy and costly enrichment procedures
omitted. The beam path of the optics is
not much longer
than in any ordinary microscope.