DE10136986A1 - Für Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents

Abstract

Gegenstand der Erfindung sind für die Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen die genannten Gene verstärkt sind, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen zumindest das cysD-Gen, das cysN-Gen, das cysK-Gen, das cysE-Gen und/oder das cysH-Gen verstärkt vorliegt, und die Verwendung von Polynukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen enthalten, als Hybridisierungssonden und ein Verfahren zur Herstellung eines L-Methionin haltigen Tierfuttermittel-Additivs aus Fermentationsbrühen.

Description

Gegenstand der Erfindung sind für die Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen die genannten Gene verstärkt sind.

Stand der Technik

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, L-Cystein und L- Methionin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung, Anwendung.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und Aminosäuren produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt sind L-Lysin und die schwefelhaltigen L-Aminosäuren L-Cystein und L- Methionin.

Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.

Werden im folgenden L-Cystein oder Cystein erwähnt, sind damit auch die Salze wie z. B. Cystein-Hydrochlorid oder Cystein-S-Sulfat gemeint.

Werden im folgenden L-Methionin oder Methionin erwähnt, sind damit auch die Salze wie z. B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat gemeint.

Gegenstand der Erfindung sind isolierte Polynukleotide aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine oder mehrere der für das cysD-Gen, das cysN-Gen, das cysK-Gen, das cysE-Gen oder das cysH-Gen kodierenden Polynukleotidsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe

• a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
• b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
• c) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 5 enthält,
• d) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 6 enthält,
• e) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 8 enthält,
• f) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
• g) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
• h) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 5,
• i) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 6,
• j) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 8,
• k) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c), d), e), f), g), h), i) oder j), und
• l) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d), e), f), g), h), i), j) oder k),

wobei die Polypeptide bevorzugt die entsprechenden Aktivitäten nämlich der Sulfat-Adenylyltransferase, der Cysteinsynthase A, der Serinacetyltransferase, oder der 3'- Phosphoadenylylsulfat-Reduktase, aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die oben genannten Polynukleotide, wobei es sich bevorzugt um replizierbare DNA handelt, enthaltend:

• a) eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, gezeigt in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 beziehungsweise SEQ ID No. 7, oder
• b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
• c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
• d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).

Weitere Gegenstände sind
replizierbare Polynukleotide, insbesondere DNA, enthaltend eine oder mehrere Nukleotidsequenzen wie in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, beziehungsweise SEQ ID No. 7, dargestellt;
Polynukleotide, die für ein oder mehrere Polypeptide kodieren, die die entsprechenden Aminosäuresequenzen, wie in SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, beziehungsweise SEQ ID No. 8 dargestellt, enthalten;
ein Vektor, enthaltend eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide, insbesondere Pendelvektore oder Plasmidvektore, und
coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe von cysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und cysH-Gen verstärkt ist/sind.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Untereinheit II der Sulfat- Adenylyltransferase kodierende cysD-Gen,
• - das für die Untereinheit I der Sulfat- Adenylyltransferase kodierende cysN-Gen,
• - das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK-Cen,
• - das für die Serinacetyltransferase kodierende cysE-Gen,
• - das für die 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase kodierende cysH-Gen

verstärkt wird.

Alle fünf Gene (cysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und cysH-Gen) sind an der Biosynthese der schwefelhaltigen L- Aminosäuren L-Cystein und L-Methionin beteiligt. Das Kohlenstoffgrundgerüst dieser Aminosäuren leitet sich zum überwiegenden Teil von den gleichen metabolischen Intermediaten ab wie das der Aminosäuren der Aspartat- Familie, zu welcher L-Lysin gehört. Durch die Überexpression eines oder mehrerer der genannten Gene kommt es zu Poolverschiebungen in den beteiligten Biosynthesewegen, was sich positiv auf die Bildung von L- Lysin, L-Methionin und L-Cystein auswirkt.

Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums, die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz der erfindungsgemäßen Polynukleotide gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 beziehungsweise SEQ ID No. 7 oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.

Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die für die Sulfat-Adenylyltransferase, die Cysteinsynthase A, die Serinacetyltransferase und/oder die 3'- Phosphoadenylylsulfat-Reduktase kodieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens aufweisen.

Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für die für die Sulfat- Adenylyltransferase, die Cysteinsynthase A, die Serinacetyltransferase und/oder die 3'- Phosphoadenylylsulfat-Reduktase kodieren.

In einem Aspekt dieser Erfindung, kodiert das erfindungsgemäße cysD-Gen für die Untereinheit II der Sulfat-Adenylyltransferase, das erfindungsgemäße cysN-Gen für die Untereinheit I der Sulfat-Adenylyltransferase, das erfindungsgemäße cysK-Gen für die Cystein-Synthase A, das erfindungsgemäße cysE-Gen für die Serinacetyltransferase und das erfindungsgemäße cysH-Gen für die 3'- Phosphoadenylylsulfat-Reduktase.

In einem weiterem Aspekt dieser Erfindung ist es möglich, dass diese erfindungsgemäßen Gene zu zweit oder mit mehreren Genen in Kombination auftreten, wobei sie dann für die kombinierten Aktivitäten kodiern. Das heißt, verstärkt man, zum Beispiel, gleichzeitig a) cysE-Gen und cysK-Gen, oder b) cysK-Gen und cysH-Gen, oder c) cysN-Gen und cysD- Gen und cysE-Gen und cysK-Gen, kodieren diese für a) die Serinacetyltransferase und die Cystein-Synthase A, b) die Cystein-Synthase A und die 3'-Phosphoadenylylsulfat- Reduktase, und c) die Sulfat-Adenylyltransferase und die Serinacetyltransferase und die Cystein-Synthase A.

Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 4 g oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.

"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.

"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.

Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, beziehungsweise SEQ ID No. 7 oder ein daraus hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No.4 beziehungsweise SEQ ID No. 7 oder eines daraus hergestellten Fragments.

Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.

Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen die Polypeptide gemäß SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 und SEQ ID No. 8, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Sulfat-Adenylyltransferase, der Cystein-Synthase A, der Serinacetyltransferase und/oder der 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit den Polypeptiden gemäß SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 oder SEQ ID No. 8 und die genannten Aktivitäten aufweisen.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L- Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L- Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L- Arginin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits Aminosäuren produzieren und in denen die für das cysD-Gen, das cysN-Gen, cysE-Gen, das cysK-Gen und/oder das cysH-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme.

Die neuen, für die Enzyme Sulfat-Adenylyltransferase (EC 2.7.7.4), Cystein-Synthase A (EC 4.2.99.8), Serinacetyltransferase (EC 2.3.1.30) und 3'- Phosphoadenylylsulfat-Reduktase (EC 1.8.99.4) kodierenden Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH von C. glutamicum wurden isoliert.

Zur Isolierung des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens, des cysH-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.

Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326) (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).

Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-547, 1977) beschrieben ist.

Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232 1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.

Die neuen, für die Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierenden DNA-Sequenzen von C. glutamicum wurden erhalten, die als SEQ ID No. I, SEQ ID No. 4, und SEQ ID No. 7 Bestandteile der vorliegenden Erfindung sind.

Weiterhin wurde aus den vorliegenden DNA-Sequenzen mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz der entsprechenden Proteine abgeleitet. In SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 und SEQ ID No. 8 sind die sich ergebenden Aminosäuresequenzen der cysD-, cysN-, cysK-, cysE- und cysH-Genprodukte dargestellt.

Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 7 durch die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 beziehungsweise SEQ ID No. 4 oder Teilen von SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 7 oder Teilen von SEQ ID No. 7 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 und SEQ ID No. 8 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.

In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 beziehungsweise SEQ ID No. 4 oder Teilen von SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 7 oder Teilen von SEQ ID No. 7 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 7 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.

Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C-68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C-68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1x SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1-2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558).

Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).

Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Überexpression eines oder mehrerer Gene ausgewählt aus der Gruppe von CysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und cysH- Gen in verbesserter Weise Aminosäuren produzieren.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Aminosäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Re mscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

Zur Verstärkung wurden die erfindungsgemäßen Gene cysD, cysN, cysK, cysE oder cysH beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden überexprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102: 93-­ 98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.

Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5, 487, 993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach at al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"- Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, neben dem cysD-Gen, dem cysN-Gen, dem cysK-Gen, dem cysE-Gen und/oder dem cysH-Gen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.

So kann für die Herstellung von L-Aminosäuren zusätzlich zur Verstärkung des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK- Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
• - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
• - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086);
• - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
• - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
• - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),
• - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
• - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759),
• - das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
• - das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A 0131171)
• - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-­ 8072)) oder das für eine "feed back resistente" Threonin- Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
• - das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierenden Gen ilvBN (EP-B 0356739),
• - das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),
• - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE 199 59 328.0, DSM 13115)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1; DSM 13047),
• - das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478; DSM 12969),
• - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE 199 51 975.7; DSM 13114),
• - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE 199 59 327.2, DSM 13113)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern. Insbesondere für die Produktion von L-Cystein kann es vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Cystathionin-β-Lyase kodierende aecD-Gen (Accession Number M89931 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
• - das für die Cystathionin-ySynthase kodierende metB-Gen (Accession Number AF1236953 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.

Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren vorteilhaft sein, neben der Überexpression des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro­ organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen­ phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.

Als Schwefelquelle, insbesondere für die Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren, können organische und anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfide, Sulfite, Sulfate und Thiosulfate verwendet werden.

Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur, in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die so erhaltenen, insbesondere L-Methionin enthaltenden Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-% und enthalten L-Methionin. Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf ≧ 0 bis 3 g/l gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird.

Die in dieser Weise hergestellte, insbesondere L-Methionin haltige, Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z. B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Anschließend wird diese mit bekannten Methoden wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration eingedickt beziehungsweise konzentriert. Diese auf konzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise rieselfähigen, feinteiligen Pulver aufgearbeitet werden.

Dieses rieselfähige, feinteilige Pulver kann dann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.

Unter "rieselfähig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen Auslauföffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein, Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

Wie hier beschrieben, ist mit "feinteilig", ein Pulver mit überwiegendem Anteil (< 50%) einer Korngröße von 20 bis 200 µm Durchmesser gemeint. Mit "grobkörnig" sind Produkte mit überwiegendem Anteil (< 50%) einer Korngröße von 200 bis 2000 µm Durchmesser gemeint. In diesem Sinne, bedeuted "staubfrei", daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5%) an Körngrößen unter 20 µm Durchmesser enthält. Die Korngrößenbestimmung kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur "Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch "Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben.

"Lagerbar", im Sinne dieser Erfindung, bedeutet ein Produkt, das bis zu 120 Tagen, bevorzugt bis 52 Wochen, besonders bevorzugt 60 Monate gelagert werden kann ohne das ein wesentlicher Verlust (< 5%) an Methionin auftritt.

Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.

Schließlich kann das Produkt durch Beschichtungsverfahren ("Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonate, Kieselsäuren, Silikate, Alginate, Stearate, Stärken, Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C-41 00 920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen insbesondere dem Magen von Wiederkäuern ist.

Wird die Biomasse während des Verfahrens abgetrennt, werden im allgemeinen weitere, zum Beispiel während der Fermentation zugesetzte anorganische Feststoffe entfernt. Daneben enthält das erfindungsgemäße Tierfuttermitteladditiv zumindest den überwiegenden Teil der in der. Fermentationsbrühe gelöst vorliegenden, weiteren gebildeten oder zugesetzten, insbesondere organische Stoffe, soweit sie nicht durch geeignete Verfahren abgetrennt wurden.

In einem Aspekt der Erfindung kann die Biomasse bis zu 70%, bevorzugt bis zu 80%, bevorzugt bis zu 90%, bevorzugt bis zu 95%, und besonders bevorzugt bis zu 100% abgetrennt werden. In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden bis zu 20% der Biomasse, bevorzugt bis zu 15%, bevorzugt bis zu 10%, bevorzugt bis zu 5%, besonders bevorzugt keine Biomasse abgetrennt.

Zu diesen organischen Stoffen gehören organische Nebenprodukte, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben dem L- Methionin erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Dazu zählen L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L- Lysin, L-Valin, L-Threonin, L-Alanin oder L-Tryptophan. Dazu zählen Vitamine ausgewählt aus der Gruppe Vitamin B1 (Thiamin), Vitamin B2 (Riboflavin), Vitamin B5 (Pantothensäure), Vitamin B6 (Pyridoxin), Vitamin B12 (Cyanocobalamin), Nicotinsäure/Nicotinsäureamid und Vitamin E (Tocopherol). Dazu gehören weiterhin organische Säuren, die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Apfelsäure oder Fumarsäure. Schließlich gehören dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose. Diese Verbindungen sind gegebenenfalls erwünscht, wenn sie die nutritive Wertigkeit des Produktes verbessern.

Diese organischen Stoffe einschließlich des L-Methionins und/oder D-Methionins und/oder des racemischen Gemisches D,L-Methionin können auch je nach Anforderung während eines geeigneten Verfahrensschrittes als Konzentrat oder Reinsubstanz in fester oder flüssiger Form hinzugefügt werden. Diese genannten organischen Stoffe können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden. Es ist gleichfalls möglich einen organischen Stoff oder eine Mischung mehrerer organischen Stoffe zur Fermentationsbrühe und einen weiteren organischen Stoff oder eine weitere Mischung mehrerer organische Stoffe bei einem späteren Verfahrensschritt, beispielsweise der Granulation, hinzuzufügen.

Das oben beschriebene Produkt ist als Futtermittelzusatz, d. h. Futtermittel-Additiv, für die Tierernährung geeignet.

Der L-Methionin-Gehalt des Tierfuttermittel-Additivs beträgt üblicherweise 1 Gew.-% bis 80 Gew.-.%, bevorzugt 2 Gew.-% bis 80 Gew.-%, besonders bevorzugt 4 Gew.-% bis 80 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 8 Gew.-% bis 80 Gew-%, bezogen auf die Trockenmasse des Tierfuttermittel-Additivs. Gehalte von 1 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 2 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 4 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 6 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 1 Gew.-% bis 40 Gew.-%, 2 Gew.-% bis 40 Gew.-% oder 4 Gew.-% bis 40 Gew.-% sind gleichfalls möglich. Der Wassergehalt des Futtermittel-Additivs beträgt üblicherweise bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 2 Gew.-%.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines L-Methionin haltigen Tierfuttermittel-Additivs aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

• a) Kultivierung und Fermentation eines L-Methionin produzierenden Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium;
• b) Entfernung von Wasser aus der L-Methionin haltigen Fermentationsbrühe (Aufkonzentration);
• c) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-%; und
• d) Trocknung der gemäß a) und/oder b) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Tierfuttermittel-Additiv in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten.

Wenn erwünscht, können in dem erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin eine oder mehrere der folgenden Schritte durchgeführt werden:

• a) Zusatz von einem oder mehreren der organischen Stoffe, einschließlich L-Methionin und/oder D-Methionin und/oder des racemischen Gemisches D,L-Methionin, zu dem gemäß a), b) und/oder c) erhaltenen Produkten;
• b) Zugabe von Hilfstoffen zu den nach a) bis d) erhaltenen Stoffen zur Stabilisierung und Erhöhung der Lagerfähigkeit ausgewählt aus der Gruppe Kieselsäuren, Silikate, Stearate, Schrot und Kleie; oder
• c) Überführung der nach a) bis e) erhaltenen Stoffe in eine Tiermagen insbesondere Pansen stabile Form durch Beschichtung ("Coating") mit Filmbildnern.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren.

Folgende Mikroorganismen wurden als Reinkultur am 18. Mai 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:

• - E. coli DH5αmcr/pEC-XK99EcysEb1ex als DSM 14308,
• - E. coli DH5αmcr/pEC-XK99EcysKa1ex als DSM 14310,
• - E. coli DH5αmcr/pEC-XK99EcysDa1ex als DSM 14311,
• - E. coli DH5αmcr/pEC-XK99EcysHa1ex als DSM 14315.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.

Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY- Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.

Beispiel 1 Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.

Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4- DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.

Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.

Beispiel 2 Isolierung und Sequenzierung des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens oder des cysH-Gens

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27- 0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).

Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.

Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy- Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29: 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.

Die erhaltenen Nukleotidsequenzen sind in SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 4 und SEQ ID No. 7 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenzen ergab sechs offene Leseraster von 915 Basenpaaren, 1302 Basenpaaren, 936 Basenpaaren, 567 Basenpaaren und 786 Basenpaaren, welche als cysD-Gen, cysN- Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und cysH-Gen bezeichnet wurden. Das cysD-Gen kodiert für ein Protein von 304 Aminosäuren, das cysN-Gen kodiert für ein Protein von 433 Aminosäuren, das cysK-Gen kodiert für ein Protein von 311 Aminosäuren, das cysE-Gen kodiert für ein Protein von 188 Aminosäuren und das cysH-Gen kodiert für ein Protein von 261 Aminosäuren.

Beispiel 3 Herstellung von Shuttle-Expressionsvektoren auf Basis von pEC-XK99E zur Verstärkung der Gene cysD, cysK, cysE und cysH in C.glutamicum 3.1 Amplifikation der Gene cysD, cysK, cysE und cysH

Aus dem Stamm ATCC 13032 nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C.glutamicum bekannten Sequenzen der Gene cysD, cysK, cysE und cysH wurden die folgenden Oligonukleotide, aufgelistet in Tabelle 1, für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt (siehe SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15 und SEQ ID No. 16). Zusätzlich wurden bei den Primern geeignete Restriktionsschittstellen eingefügt, die das Klonieren in den Zielvektor ermöglichen. Sie sind in Tabelle 1 aufgeführt und in der Nukleotidabfolge durch Unterstreichen gekennzeichnet.

Tabelle 1

Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG-Biotech AG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation eines 1017 bp großen DNA-Fragmentes, welches das cysD-Gen trägt, eines 1005 bp großen DNA- Fragmentes, welches das cysK-Gen trägt, eines 672 bp großen DNA-Fragmentes, welches das cysE-Gen trägt und eines 884 bp großen DNA-Fragmentes, welches das cysH-Gen trägt.

Das cysD-Fragment, das cysK-Fragment, das cysE-Fragment und das cysH-Fragment wurden mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und XbaI gespalten und anschließend aus dem Agarosegel mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany) isoliert.

3.2 Konstruktion des Shuttle - Vektors pEC-XK99E

Nach dem Stand der Technik wurde der E. coli - C. glutamicum Shuttle - Vektor pEC-XK99E konstruiert. Der Vektor enthält die Replikationsregion rep des Plasmids pGA1 einschließlich des Replikationseffectors per (US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), das Kanamycin-Resistenzgen aph(3')-IIa aus Escherichia coli (Beck et al. (1982), Gene 19: 327-­ 336), den Replikationsursprung, den trc-Promotor, die Terminationsregionen T1 und T2, das lacI^q-Gen (Repressor des lac-Operons von E.coli) und eine Mehrfachklonierschnittstelle (multiple cloning site, mcs) (Norrander, J. M. et al. Gene 26, 101-106 (1983)) des Plasmids pTRC99A (Amann et al. (1988), Gene 69: 301-315).

Der konstruierte E. coli - C.glutamicum Shuttle - Vektor pEC-XK99E wurde mittels Elektroporation (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303) in C. glutamicum DSM5715 transferiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.

Plasmid DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), mit der Restriktionsendonuklease HindIII geschnitten und das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft.

Das so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pEC-XK99E bezeichnet und ist in Fig. 1 dargestellt. Der durch Elektroporation des Plasmides pEC-XK99E in den C. glutamicum-Stamm DSM5715 erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-XK99E genannt und als DSM 13455 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.

3.3 Klonierung der Gene cysD, cysK, cysE und cysR in den E. coli-C. glutamicum Shuttle Vektor pEC-XK99E

Als Vektor wurde der in Beispiel 3.1 beschriebene E. coli- C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-XK99E verwendet. DNA dieses Plasmids wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI vollständig gespalten und anschließend mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert.

Die mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI geschnittenen, aus dem Agarosegel isolierten Fragmente cysD, ca. 1000 bp groß, cysK, ca. 990 bp groß, cysE, ca. 660 bp groß und cysH, ca. 870 groß, wurden jeweils mit dem vorbereiteten Vektor pEC-XK99E gemischt und die Ansätze mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Die Ligationsansätze wurden in den E. coli Stamm DH5αmcr (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren der Transformationsansätze auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 50 mg/l Kanamycin. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert. Plasmid DNA wurde aus jeweils einer Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI gespalten, um das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese zu überprüfen. Die erhaltenen Plasmide wurden pEC- XK99EcysDa1ex, pEC-XK99EcysKa1ex, pEC-XK99EcysEb1ex und pEC-XK99EcysHa1ex genannt. Sie sind in den Fig. 2, 3, 4 und 5 dargestellt.

Beispiel 4 Transformation des Stammes DSM5715 mit den Plasmiden pEC­ XK99EcysDa1ex, pEC-XK99EcysKa1ex, pEC-XK99EcysEb1ex beziehungsweise pEC-XK99EcysHa1ex

Der Stamm DSM5715 wurde mit jeweils einem der Plasmide pEC- XK99EcysDa1ex, pEC-XK99EcysKa1ex, pEC-XK99EcysEb1ex und pEC-XK99EcysHa1ex unter Anwendung der von Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsmethode transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.

Plasmid DNA wurde aus jeweils einer Transformante nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927). DNA der Plasmide pEC- XK99EcysDa1ex, pEC-XK99EcysKa1ex, pEC-XK99EcysEb1ex und pEC-XK99EcysHa1ex wurde mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und XbaI geschnitten. Die Plasmide wurden durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Die erhaltenen Stämme wurden DSM5715/pEC-XK99EcysDa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysKa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysEb1ex oder DSM5715/pEC-XK99EcysHa1ex genannt.

Beispiel 5 Herstellung von Lysin

Die in Beispiel 4 erhaltenen C.glutamicum Stämme DSM5715/pEC-XK99EcysDa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysKa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysEb1ex oder DSM5715/pEC-XK99EcysHa1ex wurden in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand jedes Stammes bestimmt.

Dazu wurden die Stämme zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde je eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkulturen wurde das Vollmedium CgIII verwendet.

Medium Cg III

NaCl	2,5 g/l
Bacto-Pepton	10 g/l
Bacto-Yeast-Extrakt	10 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert)	2% (w/v)
AL=L<Der pH-Wert wurde auf pH 7.4 eingestellt

Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkulturen wurden 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von diesen Vorkulturen wurde je eine Hauptkultur angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkulturen 0,1 betrug. Für die Hauptkulturen wurde das Medium mm verwendet.

Medium mm

CSL (Corn Steep Liquor)	5 g/l
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert)	50 g/l
(NH4)2SO4	25 g/l
KH2PO4	0,1 g/l
MgSO4.7 H2O	1,0 g/l
CaCl2.2 H2O	10 mg/l
FeSO4.7 H2O	10 mg/l
MnSO4.H2O	5,0 mg/l
Biotin (sterilfiltriert)	0,3 mg/l
Thiamin.HCl (sterilfiltriert)	0,2 mg/l
L-Leucin (sterilfiltriert)	0,1 g/l
CaCO3	25 g/l

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das trocken autoklavierte CaCO₃.

Die Kultivierung erfolgte in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80% Luftfeuchtigkeit.

Nach 48 Stunden wurde die OD der Kulturen DSM5715, DSM5715/pEC-XK99EcysDa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysKa1ex und DSM5715/pEC-XK99EcysHa1ex und nach 72 Stunden die OD der Kultur DSM5715/pEC-XK99EcysEb1ex bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde jeweils mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf- BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustausch­ chromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In den Tabellen 2 und 3 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.

Tabelle 2

Tabelle 3

Kurze Beschreibung der Figuren:

Fig. 1 Karte des Plasmids pEC-XK99E

Fig. 2 Karte des Plasmids pEC-XK99EcysDa1ex

Fig. 3 Karte des Plasmids pEC-XK99EcysKa1ex

Fig. 4 Karte des Plasmids pEC-XK99EcysEb1ex

Fig. 5: Karte des Plasmids pEC-XK99EcysHa1ex

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
Kan: Kanamycin Resistenz-Gen aph(3')-IIa aus Escherichia coli
HindIII Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
XbaI Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI KpnI Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
Ptrc trc-Promotor
T1 Terminationsregion T1
T2 Terminationsregion T2
per Replikationseffektor per
rep Replikationregion rep des Plasmides pGA1
lacIq lacIq-Repressor des lac-Operons von Escherichia coli
cysD kloniertes cysD-Gen
cysK kloniertes cysK-Gen
cysE kloniertes cysE-Gen
cysH kloniertes cysH-Gen

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (45)

1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine oder mehrere der für das cysD-Gen, das cysN-Gen, das cysK-Gen, das cysE-Gen oder das cysH-Gen kodierenden Polynukleotidsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe

• a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
• b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
• c) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 5 enthält,
• d) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 6 enthält,
• e) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 8 enthält,
• f) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
• g) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
• h) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 5,
• i) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 6,
• j) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 8,
• k) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c), d), e), f), g), h), i), oder j), und
• l) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d), e), f), g), h), i), j) oder k),

wobei die Polypeptide bevorzugt die entsprechenden Aktivitäten nämlich der Sulfat-Adenylyltransferase, der Cysteinsynthase A, der Serinacetyltransferase oder der 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase aufweisen.

2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.

3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine RNA ist.

4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 beziehungsweise SEQ ID No. 7 dargestellt.

5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend

• a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 beziehungsweise SEQ ID No. 7, oder
• b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
• c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
• d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).

6. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung unter einer Stringenz entsprechend höchstens 2x SSC durchgeführt wird.

7. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, die für ein Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 oder SEQ ID No. 8 dargestellten Aminosäuresequenzen enthält.

8. Coryneforme Bakterien, in denen das cysD-Gen, cysN- Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und/oder das cysH-Gen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

9. DSM 14308 hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland.

10. Escherichia coli Stamm DH5αmcr/pEC-XK99EcysKa1ex als DSM 14310 hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland.

11. Escherichia coli Stamm DH5αmcr/pEC-XK99EcysDa1ex als DSM 14311 hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland.

12. Escherichia coli Stamm DHSαmcr/pEC-XK99EcysHa1ex als DSM 14315 hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland.

13. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, L-Cystein und L- Methionin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

• a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das cysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und/oder das cysH-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert;
• b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
• c) Isolierung der L-Aminosäure.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

16. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt, und der Plasmidvektor die für das cysD-Gen, cysN-Gen, cysK- Gen, cysE-Gen und/oder cysH-Gen kodierende Nukleotidsequenz trägt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression der Polynukleotide, die für das cysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und/oder cysH-Gen kodieren verstärkt, insbesondere überexprimiert.

18. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die katalytischen Eigenschaften der Polypetide (Enzymproteine) erhöht, für die die Polynukleotide cysD, cysN, cysK, cysE und/oder cysH kodieren.

19. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• 1. 19.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
• 2. 19.2 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
• 3. 19.3 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi,
• 4. 19.4 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,
• 5. 19.5 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
• 6. 19.6 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
• 7. 19.7 das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
• 8. 19.8 das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
• 9. 19.9 das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
• 10. 19.10 das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom,
• 11. 19.11 das für die Theonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA oder das für eine feed back resistente Threonin-Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr),
• 12. 19.12 das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierende Gen ilvBN,
• 13. 19.13 das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD,
• 14. 19.14 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1, verstärkt bzw. überexprimiert.

20. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• 1. 20.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck,
• 2. 20.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi,
• 3. 20.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB,
• 4. 20.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2, abschwächt.

21. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Cystein, zusätzlich zur Verstärkung des cysD- Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• 1. 21.1 das für die Cystathionin-β-Lyase kodierende aecD-Gen,
• 2. 21.2 das für die Cystathionin-γ-Synthase kodierende metB-Gen,

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.

22. Coryneforme Bakterien, die einen Vektor enthalten, der ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 trägt.

23. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 13-21, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC- XK99EcysDa1ex einsetzt.

25. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC- XK99EcysKa1ex einsetzt.

26. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC- XK99EcysEb1ex einsetzt.

27. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC- XK99EcysHa1ex einsetzt.

28. Verfahren zur Herstellung eines L-Methionin haltigen Tierfuttermittel-Additivs aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

• a) Kultivierung und Fermentation eines L-Methionin produzierenden Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium;
• b) Entfernung von Wasser aus der L-Methionin haltigen Fermentationsbrühe (Aufkonzentration);
• c) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-%; und
• d) Trocknung der gemäß b) und/oder c) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Tierfuttermittel- Additiv in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das man Mikroorganismen einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges von L- Methionin verstärkt.

30. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung L- Methionin verringern.

31. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression der Polynukleotide, die für das cysD-, cysN-, cysK-, cysE oder cysH-Gen kodieren verstärkt, insbesondere überexprimiert.

32. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 28-31, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.

33. Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC- XK99EcysDa1ex einsetzt.

34. Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC- XK99EcysKa1ex einsetzt.

35. Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC- XK99EcysEb1ex einsetzt.

36. Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man den Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC- XK99EcysHa1ex einsetzt.

37. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet dass man zusätzlich noch eine oder mehrere folgender Schritte durchführt:

• a) Zusatz von einem oder mehreren der organischen Stoffe, einschließlich L-Methionin und/oder D- Methionin und/oder des racemischen Gemisches D,L- Methionin, zu dem gemäß b), c) und/oder d) erhaltenen Produkten;
• b) Zugabe von Hilfstoffen zu den nach b) bis e) erhaltenen Stoffen zur Stabilisierung und Erhöhung der Lagerfähigkeit ausgewählt aus der Gruppe Kieselsäuren, Silikate, Stearate, Schrot und Kleie; oder
• c) Überführung der nach b) bis f) erhaltenen Stoffe in eine Tiermagen insbesondere Pansen stabile Form durch Beschichtung ("Coating") mit Filmbildnern.

38. Verfahren gemäß Anspruch 28 oder 37, dadurch gekennzeichnet dass ein Teil der Biomasse entfernt wird.

39. Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet dass bis zu 100% der Biomasse entfernt wird.

40. Verfahren gemäß Anspruch 28 oder 37, dadurch gekennzeichnet dass der Wassergehalt bei bis zu 5 Gew.-% liegt.

41. Verfahren gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet dass der Wassergehalt bei weniger als 2 Gew.-% liegt.

42. Verfahren gemäß Anspruch 37, 38, 39, 40 oder 41, dadurch gekennzeichnet dass die Filmbildner Metallcarbonate, Kieselsäuren, Silikate, Alginate, Stearate, Stärken, Gummis oder Celluloseether sind.

43. Tierfuttermittel-Additiv hergestellt gemäß Ansprüchen 28 bis 42.

44. Tierfuttelmittel-Additv gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass es 1 Gew.-% bis 80 Gew.-% L Methionin, D-Methionin, D,L-Methionin oder einer Mischung davon, bezogen auf die Trockenmasse des Tierfuttermittel-Additivs, enthält.

45. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die für die Sulfat- Adenylyltransferase, die Cysteinsynthase A, die Serinacetyltransferase und/oder die 3'- Phosphoadenylylsulfat-Reduktase kodieren oder eine hohe Ähnlichkeit mit den Sequenzen des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polynukleotid, enthaltend die Polynukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4 als Hybridisierungssonden einsetzt.