DE10123041A1

DE10123041A1 - Humane hochaffine Antikörperfragmente gegen essentielle Proteine von Hepatitis-C-Virus

Info

Publication number: DE10123041A1
Application number: DE10123041A
Authority: DE
Inventors: Tobias Heintges; Kathi Tessmann; Dieter Haeussinger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2002-11-28
Also published as: WO2002093519A3; AU2002342858A1; WO2002093519A2

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft humane Antikörperfragmente, die die Vermehrung von Hepatitis-C-Virus hemmen und die die variablen Bereiche der leichten Kette (V¶L¶) und der schweren Kette (V¶H¶) von Antikörpern gegen ein oder mehrere essentielle Proteine von Hepatitis-C-Virus umfassen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Antikörperfragmente zur Behandlung und Diagnose von Hepatitis C, DNA-Sequenzen, die für diese Antikörperfragmente kodieren sowie die Verwendung dieser DNA-Sequenzen in Vektorkonstrukten zur Gentherapie von Hepatitis C.

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft humane Antikörperfragmente, die die Vermehrung von Hepatitis-C-Virus hemmen und die die variablen Bereiche der leichten Kette (V_L) und der schweren Kette (V_H) von Antikörpern gegen ein oder mehrere essentielle Proteine von Hepatitis-C-Virus umfassen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Antikörperfragmente zur Behandlung und Diagnose von Hepatitis C, DNA-Sequenzen, die für diese Antikörperfragmente kodieren sowie die Verwendung dieser DNA-Sequenzen in Vektorkonstrukten zur Gentherapie von Hepatitis C.

Hintergrund der Erfindung

Die Behandlung von Hepatitis C ist eine der momentan größten Herausforderun gen der pharmazeutischen Forschung. Zwar sind Antikörper bekannt, die an Hepatitis-C-Virus(HCV)-Antigene binden (so z. B. aus WO 93/04084 und WO 00/05266), diese Antikörper besitzen jedoch keine hinreichend große Bindungs affinität, um die Vermehrung der HCV in vivo zu hemmen. Darüber hinaus handelt es sich um murine, d. h. nicht-humane Antikörper, und es sind vollstän dige, intakte Antikörper, die aufgrund ihrer Disulfidbrücken instabil bei den im Zytoplasma herrschenden reduzierenden Bedingungen sind. Diese Antikörper sind daher für gentherapeutische Zwecke am Menschen ungeeignet.

HCV hat ein (+)-strängiges RNA-Genom, das für ein einziges Polyprotein mit etwa 3000 Aminosäuren codiert. Dieses einzige Polyprotein wird durch Proteasen des Wirtes oder des Virus co- oder posttranslational in funktionelle virale Proteine gespalten (Grakoui A. et al., J. Virol., 67: 1385-95 (1993); Bartenschlager R. et al., J. Virol., 68: 5045-55 (1994); Hijikata M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 10773-7 (1993)). Zu den vermuteten strukturellen Proteinen gehören das Kernprotein (C) und zwei Hüllproteine (E1 und E2), während die nichtstrukturel len Proteine (NS2, NS3, NS4, NS5) vermutlich Komponenten eines Komplexes sind, der für die virale RNA-Replikation verantwortlich ist (Bartenschlager R. et al., J. Virol., 68: 5045-55 (1994); Suzich J. A. et al., J. Virol., 67: 6152-8 (1993);

Steinkuhler C. et al., J. Virol., 70: 6694-700 (1996); Tomei L. et al., J. Virol., 67: 4017-26 (1993)).

Das HCV-NS3-Protein (s. SEQ ID NO: 18) ist ein bifunktionelles Enzym, das Protease-Aktivität im N-terminalen Drittel und RNA-Helicase-Aktivität in der C- terminalen Position aufweist (Bartenschlager R. et al., J. Virol., 68: 5045-55 (1994); Tomei L. et al., J. Virol., 67: 4017-26 (1993)). Es wurde berichtet, dass HCV-NS3 wahrscheinlich durch zelluläre Proteasen prozessiert wird (Shoji I. et al., Virology, 254: 315-23 (1999)). Die Protease- und die Helicase-Domäne von NS3 sind in vitro in Abwesenheit der jeweils anderen Domäne aktiv (Wardell A. D. et al., J. Gen. Virol., 80: 701-9 (1999); Kim D. W. et al., J. Virol., 71: 9400-9 (1997); Kolykhalov A. A. et al., J. Virol., 68: 7525-33 (1994)). NS3-Protease gehört zur Serin-Protease-Familie und ist für die Prozessierung des HCV-Poly proteins an den Verknüpfungsstellen NS3/NS4A (cis-Spaltung), NS4A/NS4B, NS4B/NS5A und NS5A/NS5B (trans-Spaltung) verantwortlich (Tomei L. et al., J. Virol., 67: 4017-26 (1993); Hahm B. et al., J. Virol., 69: 2534-9 (1995); Bar tenschlager R. et al., J. Virol., 68: 5045-55 (1994); Bartenschlager R. et al., J. Virol., 67: 3835-44 (1993); Tomei L. et al., J. Virol., 67: 4017-26 (1993)). Die enzymatische Aktivität der NS3-Protease hängt zum Teil von der Komplexbildung mit NS4A ab (Hahm B. et al., J. Virol., 69: 2534-9 (1995); Failla C. et al., J. Virol., 68: 3753-60 (1994); Bartenschlager R. et al., J. Virol., 69: 7519-28 (1995); Koch J. O. et al., Virology, 221: 54-66 (1996); Lin C., Rice C. M., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 7622-6 (1995)).

Die Struktur der NS3-Protease zeigt eine flache Substratbindungstasche, was es schwierig macht, effektive Protease-Inhibitoren zu entwerfen (Kim J. L. et al., Cell, 87: 343-55 (1996); Yan Y. et al., Protein Sci. 7: 837-47 (1998)). Die Helicase-Aktivität besteht aus einer Polynucleotid-stimulierten NTPase-Aktivität, einer 3'→5'-Entspiralisierungsaktivität und einer Bindungsaktivität für einzel strängige Nucleotide (Wardell A. D. et al., J. Gen. Virol., 80: 701-9 (1999); Gwack Y. et al., Eur. J. Biochem., 250: 47-54 (1997); Preugschat F. et al., J. Biol. Chem., 271: 24449-57 (1996)). Die Kristallstruktur von NS3-Helicase wurde beschrieben (Yao N. et al., Nat. Struct. Biol., 4: 463-7 (1997); Cho H. S. et al., J. Biol. Chem., 273: 15045-52 (1998); Kim J. L. et al., Structure, 6: 89-100 (1998)).

Die Helicase-Aktivität scheint notwendig zu sein, um die einzelsträngige RNA während der Duplikation des viralen Genoms zu entspiralisieren (Wardell A. D. et al., J. Gen. Virol., 80: 701-9 (1999); Gwack Y. et al., Eur. J. Biochem., 250: 47-54 (1997)). Daher ist HCV-NS3-Helicase ein vielversprechender antivi raler Angriffspunkt, der für die virale Replikation essentiell ist.

Einzelkettige variable Fragmente (sFv) von Antikörpern enthalten variable Do mänen der schweren (V_H) und der leichten Kette (V_L), die durch einen Polypep tidlinker miteinander verbunden sind, der sie zu einer voll funktionellen antigen spezifischen Bindungseinheit macht (Marasco W. A., Gene Ther., 4: 11-5 (1997; Chen S. Y. et al., Hum. Gene Ther., 5: 595-601 (1994)). Beide variablen Domä nen werden auf einer Proteinkette exprimiert, was die sFv-Fragmente stabil gegenüber der reduzierenden Umgebung macht, die man im Cytoplasma findet. Die intrazellulären sFv können direkt innerhalb von Zellen exprimiert werden, wodurch ein aktives Molekül für die Gentherapie auf Proteinbasis entsteht. Die Expression von Human-sFv sollte die Immunreaktion gegen das fremde Transgen minimieren (Marasco W. A., Gene Ther., 4: 11-5 (1997; Chen S. Y. et al., Hum. Gene Ther., 5: 595-601 (1994); Rader C., Barbas Cr., Curr. Opin. Biotechnol., 8: 503-8 (1997)).

Es ist im Stand der Technik bekannt, dass die intrazelluläre Expression von sFv- Fragmenten als "Intrakörper" verschiedene intrazelluläre Proteine wirksam hemmen kann. So zeigt die intrazelluläre Expression von Anti-tat-Intrakörpern nach der retroviralen Transduktion eine Hemmung der HIV-Replikation (Marasco W. A. et al., J. Immunol. Methods, 231: 223-38 (1999); Mhashilkar A. M. et al., Hum. Gene Ther., 10: 1453-67 (1999); Poznansky M. C. et al., Hum Gene Ther., 9: 487-96 (1998)). Die Hemmung der HIV-Integrase durch sFv-Intrakörper führte zur Resistenz kultivierter Zellen gegen HIV-Infektion (Kitamura Y. et al., 20: 105- 14 (1999)). Diese konnte auch nach der retroviralen Transduktion von Zellen mit einem sFv-exprimierenden Vektor beobachtet werden (Bouhamdan M. et al., Gene Ther., 6: 660-6 (1999)). Der phänotypische Knockout von Interleukin-2- Rezeptoren wurde durch Transduktion primärer T-Zellen mit einem lentiviralen Vektor erreicht, der IL-2-Rezeptor-bindende sFv-Fragmente im ER exprimierte (Richardson J. H. et al., Gene Ther., 5: 635-44 (1998)). Die Hemmung von CREB und des aktivierenden Transcriptionsfaktors 1 (ATF-1) reduzierte das Malignität spotential von Melanomzellen erheblich (Jean D. et al., Oncogene, 19: 2721-30 (2000)). Die Hemmung des Oncogens erB-2 durch adenovirale Vektoren, die Anti-erB-2-sFv exprimieren, führte zur Rückbildung des malignen Phänotyps von Eierstocktumorzellen (Deshane J. et al., J. Clin. Invest., 96: 2980- 9 (1995)).

Darüber hinaus werden klinischen Studien mit Patientinnen, die unter Eierstock krebs leiden, durchgeführt. Dabei werden adenovirale Vektoren verwendet, um Anti-erB-2-Intrakörper zu exprimieren (Deshane J. et al., J. Clin. Invest., 96: 2980-9 (1995)). Andere Gruppen verwenden einen retroviralen MuLV-Vektor, um Anti-gp120-Intrakörper in T-Helferzellen bei HIV-infizierten Patienten zu exprimieren (Marasco W. A. et al., J. Immunol. Methods, 231: 223-38 (1999); Chen S. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5932-6 (1994)).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, spezielle Antikörperderi vate bereitzustellen, die die Vermehrung von Hepatitis C wirksam hemmen und die intrazellulär eingesetzt werden können, sodass sie für gentherapeutische Anwendungen geeignet sind. Es wurde gefunden, dass spezielle einzelkettige Antikörperfragmente gegen essentielle Proteine von Hepatitis-C-Virus (HCV), insbesondere hochaffine humane einzelkettige (sFv) Antikörperfragmente gegen HCV-NS3, die aus einer großen Bibliothek von rekombinanten Antikörperfrag mente selektiert wurden, diese Anforderungen erfüllen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft somit

1. ein einzelkettiges Fragment von einem humanen Antikörper, das die Ver mehrung von Hepatitis-C-Virus (nachfolgend auch kurz "HCV") hemmt und das die variablen Bereiche der leichten Kette (V_L) und der schweren Kette (V_H) eines Antikörpers gegen ein oder mehrere essentielle Proteine von HCV umfasst;
2. in einer bevorzugten Ausführungsform von (1) hemmt das einzelkettige Fragment ein HCV-NS3-Protein, insbesondere NS3-Protease und/oder NS3- Helicase, besonders bevorzugt NS3-Helicase;
3. eine DNA-Sequenz, die für ein Antikörperfragment gemäß (1) oder (2) kodiert;
4. einen Vektor oder Gentransfervektor, umfassend eine DNA-Sequenz gemäß (3);
5. ein Verfahren zur Identifizierung von Antikörperfragmenten, die die Ver mehrung von HCV hemmen, gemäß (1) oder (2), umfassend
- a) Klonierung einer DNA-Bibliothek, die Antikörperfragmente gegen ein oder mehrere essentielle Proteine von HCV kodiert;
- b) Expression genannter Antikörperfragmente auf der Oberfläche von Bakterio phagen mit anschließender Anreicherung der Phagen, die Antikörperfragmente mit hoher Affinität für das essentielle Protein tragen, durch mehrere Zyklen der Selektion und Reamplifikation (Panning); und gegebenenfalls weiterhin
- c) Vermehrung genannter Antikörperfragmente mit hoher Affinität durch lösliche Expression in Bakterienzellen und Isolierung der Antikörperfragmente aus dem Periplasma dieser Zellen;
6. eine Wirtszelle, insbesondere eine prokaryontische Wirtszelle, die mit einem Vektor gemäß (4) transformiert ist und/oder eine DNA-Sequenz gemäß (3) enthält;
7. ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörperfragments gemäß (1) oder (2), umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß (6);
8. eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung, die einen oder mehrere Antikörperfragmente gemäß (1) oder (2) enthält;
9. die Verwendung der Antikörperfragmente gemäß (1) oder (2) als Vakzine insbesondere zur passiven Immunisierung;
10. eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen oder mehrere Gentransfervektoren gemäß (4);
11. die Verwendung des Gentransfervektors gemäß (4) zur Gentherapie, insbesondere zur Gentherapie von HCV-Infektionen beim Menschen; und
12. ein Gentherapieverfahren, insbesondere ein Verfahren zur Behandlung von HCV-Infektionen, umfassend das Verabreichen des Gentransfervektors gemäß (4) an einen Patienten.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Serumantikörpertiter von 4 Patienten mit chronischer HCV- Infektion gegen rekombinantes NS3-Protein, die durch EIA bestimmt wurden.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer Gel-Elektrophorese von sFv-cDNA-Fragmenten, die durch immunglobulinspezifische PCR erzeugt wurden.

Fig. 3 zeigt die Anreicherung von Phagen mit sFv-Fragmenten, die Bindungsaffinität gegen rekombinantes NS3 zeigen, während verschiedener Durchgänge der Affinitätsselektion (Panning).

Fig. 4 zeigt die Identifikation von monoklonalen Phagen, die sFv mit Bindungs aktivität gegen NS3-Protein tragen, durch Phagen-EIA.

Fig. 5 zeigt EIA von gereinigten löslichen sFv-Fragmenten gegen NS3.

Fig. 6 zeigt die Immunoblot-Analyse von bakteriell exprimierten rekombinanten sFv-Fragmenten.

Fig. 7 zeigt die Aminosäuresequenz der variablen Bereiche der H- und L-Kette von selektierten humanen sFv.

Fig. 8 zeigt die Aktivität bakteriell exprimierter sFv, die durch Ni-NTA-Säulen bis zur Homogenität gereinigt wurden, im Kompetitions-EIA.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das einzelkettige Fragment von einem humanem Antikörper gemäß Ausfüh rungsform (1) der Erfindung (nachfolgend auch kurz "Antikörperfragment") hemmt vorzugsweise wenigstens ein essentielles Protein des HCV, kann jedoch auch mehrere hemmen. Vorzugsweise weist das Antikörperfragment eine Affinität K_D ≦ 10^-6 M und besonders bevorzugt ≦ 10^-7M (bestimmt durch ein Kompetitions-ELISA wie z. B. unter "Materialien und Methoden" beschrieben) für wenigstens ein essentielles Virusprotein auf. "Essentielle Virusproteine" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen dabei Oberflächenproteine (Envelope), Strukturproteine (Core) und Nichtstrukturproteine (NS) und sind vorzugsweise ausgewählt aus Envelope 1 (E1), Envelope 2 (E2), Core, NS3-Protease, NS3- Helicase, NS4A-Kofaktor, NS5B-RNA-Polymerase usw.

Gemäß Ausführungsform (2) hemmt das erfindungsgemäße Fragment NS3- Protease oder -Helicase, insbesondere NS3-Helicase. Dabei sind insbesondere solche Antikörperfragmente bevorzugt, in denen der variable Bereich der leichten Kette (V_L) eine oder mehrere der in Fig. 7A gezeigten Sequenzen der komple mentaritätsbestimmenden Regionen (CDR), nämlich eine oder mehrere der Sequenzen CDR-L1, CDR-L2 oder CDR-L3, aufweist und besonders bevorzugt eines der in SEQ ID NOs: 1 bis 8 gezeigten Peptide oder ein Derivat desselben umfasst, und/oder in denen der variable Bereich der schweren Kette (V_H) eine oder mehrere der in Fig. 7B gezeigten CDR-Sequenzen, nämlich eine oder mehrere der Sequenzen CDR-H1, CDR-H2 oder CDR-H3, aufweist und besonders bevorzugt eines der in SEQ ID NOs: 9 bis 16 gezeigten Peptide oder ein Derivat desselben umfasst. Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen dabei trunkierte Formen des Ausgangspeptids (C- und/oder N-terminal trunkiert), deletierte Formen des Ausgangspeptids (einzelne Aminosäurereste oder Se quenzabschnitte im Ausgangspeptid sind deletiert), substituierte Formen des Ausgangspeptids (einzelne Aminosäurereste oder Sequenzabschnitte im Aus gangspeptid sind durch andere Aminosäurereste oder Sequenzabschnitte ersetzt) und Kombinationen hiervon.

In dem Antikörperfragment gemäß Ausführungsform (1) und (2) der Erfindung ist es bevorzugt, dass die Fragmente V_L und V_H durch eine kovalente Bindung oder durch ein Linkermolekül, insbesondere durch ein Linkerpeptid miteinander verknüpft sind. Daneben ist auch eine Verknüpfung mittels non-proteinogener polymerer Verbindungen (wie z. B. Polycarbonate, Polyamide, Polyethylenglykol derivate, Polyaminderivate usw.) und niedermolekularer Verbindungen (wie Diamine usw.) möglich. Für einige Anwendungen des erfindungsgemäßen Antikörperfragments, in denen die Stabilität unter reduktiven Bedingungen nicht kritisch ist (so z. B. in der Diagnostik) können V_L und V_H auch durch eine Disulfid brüche verknüpft sein. Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es jedoch, dass V_L und V_H über ein Linkerpeptid, vorzugsweise über ein hydrophiles und flexibles Linkerpeptid, besonders bevorzugt über ein Peptid mit der Aminosäuresequenz (Gly_aSer_b)_x (wobei a eine ganze Zahl von 1 bis 7, vorzugsweise von 2 bis 5 ist, b eine ganze Zahl von 1 bis 4, vorzugsweise 1 oder 2 ist und x eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 7 ist) miteinan der verknüpft sind. Dabei ist insbesondere ein Linkerpeptid mit der Aminosäure sequenz (Gly₄Ser)_x, wobei x die vorstehend angegebenen Werte aufweisen kann.

Die am meisten bevorzugten Antikörperfragmente im Sinne der vorliegenden Erfindung weisen eine der folgenden Peptidsequenzen oder ein Derivat derselben auf (wobei "Derivate" die vorstehend angegebene Bedutung hat):
Peptid (SEQ ID NO: 1)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 9)
Peptid (SEQ ID NO: 2)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 10)
Peptid (SEQ ID NO: 3)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 11)
Peptid (SEQ ID NO: 4)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 12)
Peptid (SEQ ID NO: 5)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 13)
Peptid (SEQ ID NO: 6)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 14)
Peptid (SEQ ID NO: 7)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 15)
Peptid (SEQ ID NO: 8)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 16),
wobei x 3, 4 oder 5 ist und insbesondere 4 ist.

Die vorstehend definierten Antikörperfragmente sind auf verschiedene Wege zugänglich. Da eine klassische chemische Synthese aufgrund der Größe der Antikörperfragmente nicht das Verfahren der Wahl ist, ist es bevorzugt, dass rekombinante Techniken (z. B. die Expression in Prokaryonten, insbesondere Expression in E. coli) zur Herstellung dieser Antikörperfragmente eingesetzt werden. Hierdurch wird eine hohe Homogenität des Antikörperproduktes erzielt. Für die Synthese von Verbindungen, die eine Verknüpfung mittels non-proteino gener polymerer Verbindungen oder niedermolekularer Verbindungen aufweisen, sind jedoch zusätzliche chemische Reaktionsschritte unumgänglich.

Das Herstellungsverfahren der erfindungsgemäßen Fragmente ist nachfolgend anhand der Fragmente gegen NS3-Helikase und -Protease näher erläutert.

Das nichtstrukturelle Protein 3 (NS3) von Hepatitis-C-Virus (HCV) (s. SEQ ID NO: 18) zeigt Protease- und Helicase-Aktivität, die für den Lebenscyclus des HCV essentiell sind. Für die Isolation von Antikörperfragmenten, die NS3 auf der Proteinebene hemmen, wurde zunächst eine Klonierung von Antikörperfragmen ten, die an NS3 binden, für eine stabile intrazelluläre Expression durchgeführt. Um eine Immunreaktion nach der intrazellulären Expression (intrazelluläre Immunisierung) zu verhindern, wurden Antikörperfragmente menschlicher Herkunft gewählt. Zum Isolieren von Human-sFv-Fragmenten gegen NS3 wurde ein Phagen-Display-System eingesetzt, das auf der Expression von sFv-Frag menten auf der Oberfläche von filamentösen Phagen beruhte. Eine große Phagemid-Bibliothek mit 2 × 10⁶ Vertretern wurde aus Plasmazellen von 5 Patienten kloniert, die mit HCV infiziert waren. Phagen, die Human-sFv-Frag mente mit Bindungsaktivität gegen NS3 exprimierten, wurden während der Affinitätsselektion in hohem Maße angereichert. Selektierte lösliche sFv-Anti körperfragmente, die in E. coli exprimiert wurden, zeigten eine hohe Affinität zu NS3-Protein, was durch Immunoblot nachgewiesen und in einem EIA gemessen wurde. K_D-Werte, die die Affinität von sFv zu NS3 beschreiben, wurden durch kompetitiven EIA gemessen und auf zwischen 10^-6 und 10^-7 M geschätzt. Antikörperfragmente konnten als vollständige Human-IgG-Antikörper umkloniert werden, wodurch 5 coli als unbedenkliche und billige Quelle für rekombinante humane hochaffine Antikörper für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden kann.

K_D-Werte zwischen 10^-6 und 10^-7 M (d. h. ≦ 10^-6 M) oder kleiner als 10^-7 M bezüglich der Affinität von sFv zu NS3 im kompetitiven EIA bedeuten, dass die Antikörperfragmente Inhibitoraktivität gegen NS3-Protease/Helicase aufweisen. Der Einsatz von Vektoren, die eine für diese inhibierenden Antikörperfragmente codierenden cDNA enthalten, für die Transduktion in infizierte Zellen eröffnet eine neue gentherapeutische Strategie für die intrazelluläre Immunisierung gegen chronische HCV-Infektion.

Die Phagen-Display-Technik ermöglicht eine Affinitätsselektion von Proteinen in mehreren Größenordnungen aus kombinatorischen Bibliotheken (Rader C., Barbas Cr., Curr. Opin. Biotechnol., 8: 503-8 (1997); Gram H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-80 (1992); Hoogenboom H. R., Winter G. J. Mol. Biol., 227: 381-8 (1992); Winter G. et al., Annu. Rev. Immunol., 12: 433-55 (1994)). Eine Bibliothek von Human-Antikörper-Fragmenten wurde durch Immunglobulin spezifische PCR aus Plasmazellen von mit HCV infizierten Patienten kloniert. Antikörperfragmente werden durch Fusion mit einem kleineren Hüllprotein (Gen- III-Protein; gIIIp) an der Spitze der Phagen auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen exprimiert (Phagen-Display) (Marks J. D. et al., J. Mol. Biol., 222: 581-97 (1991); Pope A. R. et al., New York: IRL Press, 1-40 (1996); McCafferty J. et al., Nature, 348: 552-4 (1990)).

Anschließend können Phagen, die Antikörper mit hoher Affinität gegen das Ziel- Antigen tragen, in mehreren Cyclen der Selektion und Reamplifikation (Panning) dramatisch angereichert werden.

Eine intrazelluläre Expression von humanen monoklonalen Antikörperfragmenten in Patienten sollte nicht von einer Immunreaktion gegen das Transgen begleitet sein. Daher wurden humane monoklonale Antikörper gegen das essentielle HCV- Protein NS3 (s. SEQ ID NO: 18) für eine mögliche Verwendung als Intrakörper für die intrazelluläre Immunisierung kloniert. Knochenmarkaspirate von mit HCV infizierten Patienten wurden verwendet, um die codierenden Bereiche von variablen Immunglobulindomänen zu amplifizieren. Diese PCR- Produkte wurden verwendet, um eine große humane sFv-Phagemid-Bibliothek zu klonieren. Ein EIA gegen rekombinantes NS3 wurde verwendet, um hohe Serum- Antikörpertiter gegen NS3 zu gewährleisten. Unter Verwendung von Phagen- Display und mehreren Cyclen von Affinitätsselektion wurden Phagen selektiert, die hochaffine sFv-Fragmente gegen NS3 trugen. Monoklonale Phagen wurden isoliert und auf Bindungsaktivität gegen NS3 getestet. Die meisten Antikörper waren gegen NS3-Helicase und nicht gegen NS3-Protease gerichtet, wie es bereits beschrieben wurde (Chen M. et al., Hepatology, 28: 219-24 (1998)). Lösliche rekombinante sFv-Fragmente wurden exprimiert, gereinigt und wieder um auf ihre Fähigkeit zur Bindung an NS3-Protein getestet. Die codierende cDNA von bindenden sFv wurde isoliert und sequenziert. Die variablen Domänen von sechs sFv-Fragmenten wurden charakterisiert. Die Sequenz zeigte κ-leichte- Ketten und λ-leichte-Ketten. VDJ-Keimliniensegmente wurden identifiziert. Die Affinität von sFv-Fragmenten wurde durch kompetitiven EIA bestimmt. Die sFv- Fragmente zeigten die vorstehend beschriebene hohe Bindungsaffinitäten, die auf eine Hemmung der NS3-Protease/Helicase schließen lassen.

Nach der Klonierung der sFv-Fragmente, ist auch eine Klonierung von vollständi gen humanen IgG-, IgA- oder IgM-Antikörpern möglich (Boel E. et al., J. Immu nol. Methods, 239: 153-66 (2000)). Die rekombinante Expression von vollständi gen humanen Antikörpern ist einfach und billig im Vergleich zur Isolation von Antikörpern aus dem Serum von HCV infizierten Patienten. Überdies besteht bei der Verwendung rekombinanter hochaffiner Antikörper keine Gefahr einer Infektion mit HCV oder anderen humanen Pathogenen. Diese Antikörper sind für diagnostische und therapeutische Zwecke einsetzbar.

So können die Antikörperfragmente gemäß Ausführungsform (8) der Erfindung Bestandteil von pharmazeutischen Zusammensetzungen (wie z. B. Vakzine u. ä.) und von diagnostischen Zusammensetzungen (auch "diagnostische Kits" ge nannt) sein. Neben den Antikörperfragmenten enthalten diese Zusammensetzun gen noch übliche Zusatzstoffe, Hilfsmittel usw. In den diagnosti schen Kits können die erfindungsgemäßen Antikörperfragmente z. B. in einem Zellkultursystem zur Bewertung der NS3-Proteasefunktion (Heintges T. et al., J. Med. Virol., (2000)), in Assays zum Testen auf NS3-Helicasefunktion (Hsu C. C. et al., Biocem. Biophys. Res. Commun., 253: 594-9 (1998)) in einem Replikon system zur Bewertung der Funktion von nichtstrukturellen HCV-Proteinen (Lohmann V. et al., Science, 285: 110-3 (1999)) usw. eingesetzt werden.

Gemäß Ausführungsform (4) betrifft die vorliegende Erfindung einen Gentrans fervektor, der eine DNA-Sequenz, die für ein erfindungsgemäßes Antikörper fragment kodiert, umfasst. Dieser Gentransfervektor kann neben der genannten DNA-Sequenz noch weitere funktionelle DNA-Sequenzen (wie z. B. Promotorse quenzen, Erkennungssequenzen, virale Sequenzen Spleißdonor und -akzeptorse quenzen, usw.) enthalten. So muss, um antivirale Wirkungen in Hepatocyten zu erreichen, die codierende cDNA für Antikörperfragmente, die die HCV-Replikation hemmen, durch Vektoren transduziert werden. Die zur Zeit vielversprechendsten Vektoren für die Gentherapie der Leber sind Lentiviren oder "entbeinte" Adeno viren (Richardson J. H. et al., Gene Ther., 5: 635-44 (1998); Naldini L. et al., Science, 272: 263-7 (1996); Zufferey R. et al., Nat. Biotechnol., 15: 871-5 (1997); Ferry N., Heard J. M., Hum. Gene Ther., 9: 1975-81 (1998)). Eine effiziente Expression von Human-Antikörper-Fragmenten in Hepatocyten ist Vorraussetzung für die intrazelluläre Immunisierung mit Intrakörpern, was als ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung einer chronischen HCV- Infektion erachtet wird.

Die Sequenz und Struktur der erfindungsgemäßen Antikörperfragmente sind weiterhin hilfreich für das Design von Inhibitoren der NS3-Protease oder - Helicase in Form von kleinen Molekülen. Ausgehend von der Struktur der Antikörperfragmente werden niedermolekulare Verbindungen abgeleitet, die diese essentiellen viralen Proteine des HCV hemmen.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgend beschriebenen Experi mente und der detaillierten Beschreibung der Figuren näher erläutert.

Experimente Materialien und Methoden Patienten

Von fünf Patienten mit chronischer Hepatitis C wurde Knochenmark aspirat gewonnen. Alle Patienten hatten eine serologisch dokumentierte HCV- Infektion (HCV-Antikörper positiv im enzyme-linked immunoassay der dritten Generation und Serum-HCV-RNA durch RT-PCR nachweisbar). Von allen Patien ten wurde Knochenmarkaspirat während Prozeduren gewonnen, die aus ver schiedenen medizinischen Gründen indiziert waren. Alle Patienten unterzeichne ten eine schriftliche Einverständniserklärung für die Entnahme von weiteren 5 ml Aspirat und 10 ml Serum gemäß einer Begutachtung durch das lokale Ethikko mitee. Von 4 der 5 Patienten war Serum verfügbar.

HCV-NS3-ELISA

Eine ELISA-Platte (Nung, Gibco BRL, Karlsruhe) wurde über Nacht bei 4°C mit 0,5 µg NS3 in PBS beschichtet und dann 1 h lang bei RT mit 3% BSA/PBS blockiert. Patientenseren wurden 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 4000, 1 : 8000 bzw. 1 : 16 000 verdünnt und dann in die Näpfe gegeben. Nach 1 h Inkubation bei RT wurde die Platte zehnmal mit TBST/0,1% Tween®-20 gewaschen. Anschlie ßend wurde ein Konjugat von Alkalischer Phosphatase (AP) und Ziegen-Anti- Human-(Fab)₂-IgG (Boehringer, Mannheim) in einer Verdünnung von 1 : 5000 in jeden Napf gegeben, und es wurde 1 h lang inkubiert. Nach zehnmal Waschen wurde p-Nitrophenylphosphat (Sigma, Aldrich, Taufkirchen) hinzugefügt, und es wurde 20 min lang inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte bei 405 nm unter Verwendung eines EIA Reader (Anthos Labtec, Salzburg, Österreich) gemessen. Ein Signal-Rausch-Verhältnis von über 2,4 wurde als positiv angese hen.

Klonierung einer kombinatorischen Human-sFv-Bibliothek

Knochenmarkaspirat wurde verwendet, um Gesamt-RNA zu präparieren. RNA wurde unter Verwen dung von Tri-reagent (Gibco BRL, Karlsruhe) extrahiert und unter Verwendung von Oligo(dT)-Primern (Gibco BRL, Karlsruhe) in cDNA transkribiert. Die V_H- und V_L-Gene wurden durch PCR getrennt mit V_H- und V_L-spezifischen Primern amplifiziert. Weiterhin wurde der reverse Primer von V_L durch Einbau eines Flag tag am 5'-Ende modifiziert (Knappik, Plückthun, 1994). Der V_H-Antisense-Primer und der V_L-Sense-Primer enthalten Sequenzen, die einen flexiblen Aminosäure linker (Gly₄Ser)₄ codieren, der zwischen den variablen Domänen der schweren und der leichten Kette eingesetzt ist. Dies ermöglicht eine rekombi nante Hybridisierung zwischen V_H- und V_L-Produkten bei der folgenden Overlap- PCR-Reaktion. Die Cyclusparameter waren wie folgt: 30 Cyclen, 94°C 1 min, 57°C 2 min, 72°C 1 min. Für die Extension-Overlap-PCR wurden gelgereinigte V_H- und V_L-PCR-Fragmente (Größe ungefähr 300 bp) in äquimolaren Verhältnis sen miteinander gemischt und zur Bildung einer Matrize in Abwesenheit von Primern verwendet (2 ×: 92°C 1 min, 63°C 30 s, 58°C 50 s, 72°C 1 min). Anschließend wurden fünf Cyclen (92°C 1 min, 63°C 30 s, 58°C 50 s, 72°C 1 min) und 23 Cyclen (92°C 1 min, 63°C min, 72°C 1 min) in Anwesenheit von spezifischen äußeren sFv-Primern, die SfiI-Restriktionsstellen am 5'-Ende enthielten, durchgeführt. Die verwendeten Primer waren:

Lambda-(λ)-Sense-Primer

Lambda-(λ)-Antisense-Primer

Kappa-(κ)-Sense-Primer

Kappa-(κ)-Antisense-Primer

VH-Sense-Primer

VH-Antisense-Primer

äußere sFv-Primer (pull through)

Unterstrichen sind Flag-tag-Sequenzen innerhalb jedes V_L-back-Primers (Kappa; κ und Lambda; λ).

Nach dem Abbau mit dem Restriktionsenzym SfiI wurden die sFv-Fragmente (ca. 750 bp) entweder gelgereinigt (Qiaquik; Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden) oder elektroeluiert (Schleicher & Schüll, Dassel) und dann in den Phagemid-Vektor pAK100 (Krebber, A. et al., J. Immunol. Methods, 201: 35-55 (1997)) ligasiert. Dieser Vektor ermöglicht die Expression von sFv als Gen-III-Fusionsprotein auf der Oberfläche von Bakteriophagen (Phagen-Display) unter Einführung eines C- terminalen c-myc-Tags.

Die resultierenden Plasmide aller 5 Patienten wurden verwendet, um elektrokompetente E. coli XL₁-Blue (Stratagene, Amsterdam Zuidoost, Nieder lande) zu transformieren und so eine große Bibliothek von rekombinanten humanen sFv-Fragmenten im pAK100-Expressionsvektor zu schaffen (Krebber A. et al., J. Immunol. Methods, 201: 35-55 (1997)). Transformanten wurden in 2 × YT-Medium, das 25 µg/µl Chloramphenicol und 1% Glucose enthielt, bis zu einer OD₅₅₀ von 0,5 hochgezogen. Zu diesem Zeitpunkt wurde die aufgebaute Phage mid-Bibliothek als koloniebildende Einheiten (cfu) titriert. Die Größe der Biblio thek von allen 5 Patienten betrug 2 × 10⁶. Die Bibliothek wurde dann mit 10^11-12 VCSM13-Helferphagen (Amersham Pharmacia, Freiburg) infiziert, um sFv- tragende Phagen zu erzielen. Die Expression wurde durch die Zugabe von 0,5 mM IPTG (Roth, Karlsruhe) induziert und 2 h lang bei 24°C durchgeführt. Nach 3-4 Stunden Inkubation wurde Kanamycin (30 µg/µl; Fluka, Neu-Ulm) hinzugefügt, und die rekombinante Phagenkultur wuchs über Nacht bei 24°C. Die Phagenpartikel wurden durch Fällung mit 20% PEG/15% NaCl (Sambrook et al., 1989) geerntet, in PBS gelöst und bei 4°C gelagert oder direkt für weitere Experimente verwendet.

Affinitätsselektion (Panning)

Rekombinante Phagen, die humane sFv-Fragmente trugen, wurden durch Panning anhand ihrer Affinität zur Bindung an NS3 selektiert. Eine Mikrotiterplatte (Nung, Gibco BRL, Karlsruhe) wurde über Nacht bei 4°C mit 1 µg rekombinantem NS3-Protein/Napf (Mikrogen, München) be schichtet. Nach Blockierung mit 3% BSA während 1 h bei RT wurde eine Phagen suspension (ungefähr 10% verdünnt in 3% BSA) hinzugefügt, und es wurde 2 h bei RT inkubiert. Die Mikrotiterplatte wurde gründlich (20 ×) mit PBS/0,1% Tween-20 gewaschen, um unspezifisch gebundene Phagen zu eliminieren. Anschließend wurden die mit hoher Affinität an NS3 gebundenen Phagen mit 0,1 M Glycin/HCl, pH 2,2, eluiert. Die Phagenlösung wurde mit 2 M Tris neutrali siert, und die Phagen (typischerweise 10^3-4) wurden zur Reinfektion von E. coli XL1-Blue verwendet, das sich im exponentiellen Wachstum befand. Dieser Panning-Vorgang wurde 4-mal wiederholt. Die selektierte Phagenpopulation wurde verdünnt und ausgestrichen, um einzelne monoklonale Kolonien zu erhalten.

Phagen-EIA

Ausgewählte Einzelkolonien wurden getrennt in 8 ml 2 × YT- Medium, das Chloramphenicol (25 µg/µl) und Glucose (1%) enthielt, bei 37°C unter Schütteln gezüchtet und dann mit 10¹¹ VCSM13-Helferphagen infiziert. Die Expression von Human-sFv wurde mit 0,5 mM IPTG induziert. Nach Inkubation über Nacht wurden monoklonale Phagen mit 20% PEG/15% NaCl präzipitiert und in 200 µl PBS gelöst. Der Phagentiter wurde als cfu/ml abgeschätzt, und die Phagenlösung wurde wie folgt in einem EIA-Assay verwendet. Eine EIA-Platte wurde zunächst über Nacht bei 4°C mit 0,3 µg NS3 (Mikrogen) beschichtet und dann 1 h bei RT mit 3% BSA blockiert. Dann wurden 50 µl einer Phagenlösung (ungefähr 109 Phagen) hinzugefügt. Nach 1 h Inkubation bei RT und dreimaligem Waschen mit PBS/0,05% Tween-20 wurde in 3% BSA 1/5000 verdünnter HRP- konjugierter Anti-M13-Antikörper (Amersham Pharmacia, Freiburg) hinzugefügt und 1 h lang inkubiert. Zur Detektion erfolgte eine Inkubation mit ABTS-Substrat nach den Angaben des Herstellers (Boehringer, Mannheim). Nach 15 min Inkubation wurde die Extinktion bei 405 nm mit einem EIA Reader (Anthos Labtec, Salzburg, Österreich) gemessen. Alle Assays wurden vierfach in 3 unabhängigen Experimenten durchgeführt.

Seguenzierung

Sequenzierungsreaktionen wurden mit einem automatischen ABI-310-Sequencer (Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim) durchgeführt, wobei Standardsequenzierungsvorschriften und spezifische Vektoroligonucleotide verwendet wurden. Dann wurden die abgeleiteten Aminosäuresequenzen durch Computerrecherche mit BLAST (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast) und DNAPLOT (http:/ / www.genetik.uni-koeln.de/dnaplot) und der Kabat-Datenbank (http:/ / immuno.bme.nwu.edu) (Kabat E. A. et al., 5th ed. Bethesda, MD (1991); Martin A. C. R., Proteins: Structure, Function and Genetics, 25: 130-133 (1996)) analysiert.

Lösliche Expression von humanen sFv-Fragmenten in E. coli

Zur löslichen Expression wurden sFv-Fragmente zunächst in pQE-70 (Quiagen, Hilden) umkloniert. Dieser Vektor ermöglicht eine starke induzierbare Expression in E. coli und führt ein His-tag ein, das für die Proteinreinigung nützlich ist. Einzelne Kolonien wurden über Nacht bei 37°C in 30 ml 2 × YT-Medium (Chlorampheni col, 25 µg/µl, und Glucose, 1%) inkubiert. Bei einer OD₅₅₀ = 0,8 wurde die Expression der humanen sFv-Fragmente mit 1 mM IPTG induziert und die Bakterien 4 h lang bei 24°C unter Schütteln gezüchtet. Nach dem Sedimentieren wurden Bakterienzellen 0,5 h lang bei 4°C in Spheroblasten- Puffer (200 mM Tris/HCl, pH 8,0, 0,5 M Saccharose) inkubiert. In das Periplasma sezernierte lösliche sFv-Fragmente wurden durch Lysozymbehandlung (0,8 mg/ml, wobei nur die äußere Membran von E. coli zerstört wurde) und milden osmotischen Schock gewonnen, wobei die Spheroblasten intakt blieben (Skerra, 1989). Das Zellsediment aus 10 ml Expressionskultur wurde in 200 µl eiskaltem Spheroblastenpuffer resuspendiert, und 790 µl eiskalter 50%iger (v/v) Spheroblastenpuffer wurde sofort hinzugefügt. Die Lyse wurde 30 min lang auf Eis zu Ende geführt. Es wurde ein Standardverfahren für die Reinigung von mit einem His-Tag ausgestattetem sFv gewählt, das aus einem Ni-NTA-Affinitäts reinigungsschritt (HisTrap-Säulen, Amersham Pharmacia, Freiburg) mit einem Elutionsschritt unter nativen Bedingungen unter Verwendung von Imidazol (100- 150 mM) bestand. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung eines FPLC- Systems nach den Angaben des Herstellers (Amersham Pharmacia, Freiburg) durchgeführt.

Immunoblot-Analyse

Für eine weitere Immunoblot-Analyse wurde 1/100 gereinigte sFv-Fraktion verwendet. Im Einzelnen wurde ein 20-µl-Aliquot jeder Probe auf ein 0,1% SDS/12% PAGE geladen. Nach Transfer auf eine Nitrozellu losemembran (Protran, Schleicher & Schüll, Dassel) unter Verwendung von Standardvorschriften wurden die sFv-Fragmente durch Immunoblot nachgewie sen. Die Membran wurde zuerst 1 h lang bei RT mit 3% BSA in TBS blockiert, um eine unspezifische Adsorption zu verhindern, und dann zweimal mit TBS gewa schen. Anschließend erfolgte eine Inkubation entweder mit Anti-Flag-mAB M1 (Sigma Aldrich, Taufkirchen) oder mit Anti-Tetra-His-Antikörpern (1 : 2000 in 3% BSA/TBS) (Qiagen, Hilden) während 30 min unter Verwendung von 10 µg/ml in TBS/1 mM CaCl₂. Nach Waschen mit TBST (2mal) für den Anti-His-Nachweis oder mit TBS + 1 mM CaCl₂ für den Anti-Flag-Nachweis wurde in TBS auf 1 : 5000 verdünntes Konjugat von Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Kaninchen-Anti- Maus-Ab (Biorad, München) hinzugefügt. Die Detektion erfolgte durch Chemilu mineszenz über das ECL™-System (Amersham Pharmacia, Freiburg).

sFv-EIA

Die Bindungsaktivität löslicher sFv-Fragmente wurde durch EIA getes tet. Die Näpfe wurden über Nacht bei 4°C mit 0,5 µg rekombinantem NS3- Protein in PBS beschichtet und anschließeßend 1 h lang bei RT mit 3% BSA blockiert. Dann wurde periplasmatischer Extrakt, der lösliche monoklonale sFv-Fragmente enthielt, zugegeben (1, 0,1 bzw. 0,01 µg in PBS/Napf) und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 5 Waschschritten mit TBST/0,5% Tween®-20 wurde der Anti-His-Ab (1 : 2000 in 3% BSA; Qiagen, Hilden) zugege ben, und es wurde 1 h lang bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Näpfe gewaschen und 1 h lang mit HRP-konjugiertem Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Ab (1 : 5000 in 10% Milchpulver) inkubiert. Zum Nachweis wurde ABTS-Substrat hinzugefügt, und A₄₀₅ wurde gemessen, wie es oben beschrieben ist.

Affinitätsmessungen

Die Bestimmung der Affinität der Antikörperfragmente erfolgte mit Hilfe eines kompetitiven EIA, der zuerst von Friguet et al. beschrie ben wurde (Friguet B. et al., J. Immunol. Methods, 77: 305-19 (1985)). Der zu testende Antikörper wurde mit verschiedenen Konzentrationen des Antigens inkubiert, bis ein Assoziations-Dissoziations-Gleichgewicht erreicht wurde. Dann wurde ein Festphasen-EIA mit immobilisiertem Antigen verwendet, um die Konzentration des freien Antikörpers zu bestimmen, der nicht an lösliches Antigen gebunden ist (Friguet B. et al., J. Immunol. Methods, 77: 305-19 (1985)). Die EIA-Bedingungen wurden so gewählt, dass nur ein kleiner Anteil des im Gleichgewicht befindlichen ungesättigten Antikörpers durch das immobilisierte Antigen abgefangen wird. Dadurch ist sichergestellt, dass das Gleichgewicht in Lösung durch die EIA Bedingungen nicht wesentlich beeinträchtigt wird (Goldberg M. E., Djavadi-Ohaniance L., Curr. Opin. Immunol., 5: 278-81 (1993)).

Verschiedene Konzentrationen der humanen sFv Fragmente wurden getestet, um den linearen Bereich der Sättigungskurve zu bestimmen. Hierzu wurden serielle Verdünnungsreihen der Antikörper mit anschließender Bestimmung der OD durchgeführt. Die Verdünnung der sFv-Fragmente, die zu einem Abfall der OD um mindestens 40% führte, wurde für weitere kompetitive EIA-Experimente gewählt. sFv-Fragmente in dieser Konzentration wurden 2 h lang bei 4°C mit löslichem rekombinantem NS3-Protein inkubiert, um ein Gleichgewicht zu erreichen. Anschließend wurde die Konzentration der freien sFv-Fragmente in sFv-EIA bestimmt, wie es oben beschrieben ist, wobei mit 0,3 µg NS3 beschich tete Platten verwendet wurden, die zuvor mit 10% Milchpulver blockiert worden waren. Die Bestimmung der Affinität erfolgte für jedes einzelne Antikör perfragment in Korrelation zum linearen Teil der Kompetitionskurve.

Resultate

Seren von 4 Patienten wurden im Immunoassay auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen NS3-Protein analysiert. Aus diesem Antikörper-Screening erhaltene Daten zeigten, dass 3 von 4 Patienten hohe Titer von 1 : 16 000 gegen NS3 aufwiesen. Der Titer von einem Patienten (Patient 3) war niedrig und ähnlich wie bei den negativen Kontrollen (kein erster Antikörper oder irrelevante rekom binante sFv-Fragmente). Die individuellen Titer der Patienten sind in Fig. 1 gezeigt.

Um eine rekombinante humane Phagen-Display-Bibliothek zu schaffen, setzten wir den sFv-exprimierenden Phagemidvektor pAK100 ein. Anfangs entstanden durch Overlap-Extension-PCR einzelkettige Fragmente, die aus rekombinierten variablen Domänen der schweren (V_H) und der leichten Kette (V_L) mit einem eingeschobenen flexiblen Polypeptid-(Gly₄Ser)₄-Linker bestanden (Fig. 2).

Anschließend wurden sFv-Fragmente in den pAK100-Expressionsvektor einklo niert (Krebber A. et al., J. Immunol. Methods, 201: 35-55 (1997)), der TH- Terminator, lacI-Gen und lac-Promotorbereich enthielt, wodurch optimale Wachstumsbedingungen für transformiertes E. coli XL1-Blue geschaffen wurden, das in 2 × TY-Medium inkubiert wird, dem 1% Glucose zugesetzt ist (siehe Abschnitt "Materialien und Methoden"). Unter diesen Bedingungen kann eine unerwünschte toxische Wirkung sowie eine Hintergrundexpression vollständig ausgeschlossen werden, bevor eine weitere Induktion mit IPTG erfolgt (Krebber A. et al., J. Immunol. Methods, 201: 35-55 (1997)). Eine optimale Produktion von gIII-fusioniertem sFv wurde durch 4 h Inkubation bei RT erzielt.

Die auf der Oberfläche von filamentösen Phagen exprimierten rekombinanten sFv wurden in einer Panning-Reaktion mit an eine feste Phase gebundenem NS3 selektiert. Polyklonale Phagen wurden in 4 Cyclen Phagen-Panning verwendet, um funktionelle bindende Phagen anzureichern und nichtbindende Phagen zu eliminieren (siehe die nachfolgende Tabelle 1 und Fig. 3).

Tabelle 1

Tabelle 1 zeigt die relative Anreicherung von Phagen, die monoklonales sFv tragen, gegen NS3-Protein (SEQ ID NO: 18) vor der Verwendung beim Panning und nach dem ersten, zweiten, dritten und vierten Durchgang der Affinitätsse lektion. Der Phagentiter wurde als cfu/ml gemessen. Die Anzahl der sFv-tragen den Phagen während des Panning wurde durch Verdünnungsreihen als cfu/ml bestimmt. Vor jedem Durchgang des Panning wurde die Phagenpopulation auf 10^10-12 amplifiziert und dann einer Affinitätsselektion gegen rekombinantes HCV- NS3 unterzogen. Nach dem Waschen wurden an NS3 gebundene Phagen mit 0,1 M Glycin/HCl, pH 2,2, eluiert, wie es im Abschnitt "Materialien und Methoden" beschrieben ist. Der Prozentsatz der nach dem Panning eluierten Phagen nimmt stetig zu, was darauf hindeutet, dass gegen HCV-NS3 bindende Phagen angerei chert werden.

Nach der Neuinfektion von E. coli XL₁-Blue mit sFv-tragenden Phagen gegen NS3 wurden Zellen ausgestrichen, um einzelne Kolonien zu bilden. Nur im Falle einer EIA-Reaktion (Signal-Rausch-Verhältnis) von wenigstens 2,4 oder darüber im Vergleich zur negativen Kontrolle (neg. Ctrl) wurden die sFv-Klone als spezifisch an HCV-NS3 bindend angesehen, wie es in Fig. 4 gezeigt ist. Monoklonale Kolonien wurden selektiert und sequenziert. Während der Sequenzierung er wiesen sich einige der selektierten Klone als mehrfach repräsentiert.

Für eine Expression von löslichem sFv in E. coli auf hohem Niveau und Einfüh rung eines Hexa-His-Tags wurden alle sFv-Fragmente in pQE-70 (Qiagen, Hilden) umkloniert. Nach der Induktion mit IPTG und Inkubation bei RT während 4 h wurden lösliche sFv-Moleküle unter Verwendung der Methode des kalten osmo tischen Schocks aus dem periplasmatischen Raum geerntet. Ein Immunoblot- Verfahren wurde durchgeführt, um die korrekte Expression und Größe der in E. coli exprimierten klonierten sFv-Fragmente gegen NS3 zu bestimmen. Eine starke und deutliche Bande von 32 kDa wurde mit Anti-Flag sowie mit Anti- Tetra-His-Antikörpern sichtbar gemacht (Fig. 6).

Die weitere Reinigung des rekombinanten sFv erfolgte unter Verwendung des Ni- NTA-Säulenreinigungssystems und FPLC, wie es im Abschnitt "Materialien und Methoden" beschrieben ist. Nach der Reinigung waren keine unspezifischen Banden zu sehen, wenn sFv auf 12% PAGE geladen, auf eine Nylonmembran übertragen und mit Ponceaus Rot oder Coomassie Brilliant Blue gefärbt wurde.

Die Reaktivität löslicher gereinigter rekombinanter sFv-Fragmente gegen NS3 wurde durch EIA getestet (Fig. 6). Bei sechs verschiedenen Klonen wurden im Vergleich zu verschiedenen Kontrollen starke und spezifische Signale erhalten.

Die codierende Sequenz von Phagemid-DNA wurde bestimmt, und die Amino säuresequenz der variablen Domänen der Antikörperfragmente wurde abgeleitet (siehe Fig. 7). Die Positionen von Gerüstregionen (FR) und komplementaritäts bestimmenden Regionen (CDR) wurden gemäß dem Nummerierungssystem von Kabat et al. (Kabat E. A. et al., 5th ed. Bethesda, MD (1991)) lokalisiert. Fig. 7 zeigt einen Vergleich der sFv-Sequenzen.

Fünf Antikörper weisen λ-leichte-Ketten auf, und ein Antikörper weist κ-leichte- Ketten auf (siehe Tabelle 2A (leichte Kette) und 2B (schwere Kette)). Eine weitere Analyse durch DNA-Plot (http:/ / www.genetik.uni-koeln.de/dnaplot) oder Blast (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast) enthüllte die Keimlinien-V(D)J- Segmente (Tabelle 2). Weitere Merkmale der Antikörper sind in Tabelle 2 gezeigt. V(D)J-Keimliniensegmente, die die größte Ähnlichkeit mit der Sequenz des Antikörpers zeigten, sind genannt.

Messungen der Affinität von Antikörperfragmenten erfolgten unter Verwendung von kompetitivem EIA. Alle Antikörper zeigten hohe Affinitäten gegen NS3. Die Affinitätskonstanten K_D lagen in der Größenordnung von 10^-6 bis 10^-7 M (Fig. 8).

Tabelle 2A (leichte Kette (V_L))

Tabelle 2B (schwere Kette (V_H))

In Tabellen 2A und B sind die Klassifikation und Keimliniensegmente variabler Domänen von klonierten Antikörperfragmenten zusammengefasst. V_λ-, J_λ-, V_κ-, J_κ-, V_H-, D- und J_H-Segmente werden gemäß der Nomenklatur der bei den Methoden genannten Autoren benannt. Die Bestimmung der Familie und der Untergruppe erfolgte nach Kabat et al. (Kabat E. A. et al., 5th ed. Bethesda, MD (1991); Martin A. et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 25: 130-133 (1996)) (n. k. = nicht klassifiziert).

Detaillierte Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Serumantikörpertiter von 4 Patienten mit chronischer HCV-Infektion gegen rekombinantes NS3-Protein wurden durch EIA bestimmt. Eine Verdün nungsreihe von Seren wurde in Näpfen inkubiert, die mit rekombinantem NS3- O/N beschichtet waren, und mit Konjugaten von Alkalischer Phosphatase (AP) und Ziegen-Anti-Human-(Fab)₂-IgG (verdünnt 1 : 5000, Boehringer Mannheim) detektiert. Die EIA-Reaktivität wurde in vier Parallelver suchen als OD bei 405 nm gemessen, nachdem p-Nitrophenylphosphat als Chromogen hinzugefügt worden war. Drei Patienten (Patient Nr. 1, 2 und 4) zeigen einen sehr hohen Ab-Titer von 1 : 16 000. Ein Patient zeigt keinen signifi kanten Titer gegenüber HCV-NS3.

Fig. 2 Gel-Elektrophorese von sFv-cDNA-Fragmenten, die durch immunglobu linspezifische PCR erzeugt wurden. Anfangs wurden VL und VH durch 6 bis 7 verschiedene Primerpaare getrennt amplifiziert (Einzelheiten siehe "Materialien und Methoden"). PCR-Produkte der Kappa-Ketten κ₁-κ₆ (Bild A), der Lambda- Ketten λ₁-λ₇ (Bild B) und der schweren Ketten H1-H6 (Bild C) sind gezeigt, geladen auf ein 1,5% Agarose-Gel. Anschließend wurde eine Overlap-Extension- PCR unter Verwendung von pull-through-Primern (äußeren Primern) eingesetzt, die SfiI-Restriktionsstellen enthielten, so dass sFv-Fragmente entstanden, die aus VL- und VH-Domänen bestanden, die durch einen flexiblen Aminosäurelinker miteinander verbunden waren. Bild D zeigt sFv-PCR-Produkte einschließlich der leichten Ketten V_L _κ (K + H, Bahn 2) oder V_L _λ (λ + H, Bahn 3), die getrennt amplifi ziert wurden. Verschiedene Untergruppen von V_L oder V_H sind bei einzelnen Patienten stärker als andere repräsentiert. Zum Beispiel zeigt der hier gezeigte Patient stärkere Signale für λ₂ und λ₆ als für λ₄ und λ₅. Andere Patienten zeigten andere Muster der Untergruppenrepräsentation (Daten nicht im Einzelnen gezeigt).
St = Standard-kb-Marker (Gibco BRL, Karlsruhe).

Fig. 3 Anreicherung von Phagen mit sFv-Fragmenten, die Bindungsaffinität gegen rekombinantes NS3 zeigen, während verschiedener Durchgänge der Affinitätsselektion (Panning). HRP-konjugierter Anti-M13-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1 : 5000 verwendet, und dann wurde ABTS-Substrat hinzugefügt, wie es im Abschnitt "Materialien und Methoden" beschrieben ist. Die OD wurde bei 405 nm gemessen. Die OD nimmt mit weiteren Durchgängen des Panning stetig zu, was darauf hinweist, dass der Prozentsatz von Phagen mit Bindungsaffinität gegen NS3 zunimmt. BSA: mit 3% BSA beschichtete Näpfe; neg. Ctrl: mit NS3-Protein beschichtete und mit nichtbindendem Helfer phagen inkubierte Näpfe.

Fig. 4 Identifikation von monoklonalen Phagen, die sFv mit Bindungsaktivität gegen NS3-Protein tragen, durch Phagen-EIA. Die Phagenpopulation nach 3 Panning-Durchgängen wurde verdünnt, und monoklonale Phagen wurden amplifiziert. Ungefähr 10⁸ monoklonale Phagen wurden in einem Phagen-EIA gegen NS3 eingesetzt, um positiv bindende gegen NS3 zu selektieren. Nach Inkubation mit 1 : 5000 verdünntem HRP-konjugiertem Anti-M13-Antikörper und Zugabe von ABTS-Substrat wurde die OD bei 405 nm gemessen. Die Klone Nr. 3, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16 wurden aufgrund ihrer bindenden Eigenschaften gegen NS3 identifiziert und für die weitere Analyse selektiert.

Fig. 5 EIA von gereinigten löslichen sFv-Fragmenten gegen NS3. sFv-Frag mente wurden aus periplasmatischen Extrakten von E. coli durch Ni-NTA-Säulen bis zur Homogenität gereinigt. Nach der Beschichtung von Näpfen mit NS3-O/N werden gereinigte sFv inkubiert. Anschließend wurden Anti-Tetra-His-Antikörper und anschließend HRP-konjugierter Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper verwendet, und unter Verwendung des ECL-Substratsystems wurde eine Chemilumineszenz durchgeführt. Alle Klone zeigen eine starke Affinität zu NS3 im Vergleich zu BSA (negative Kontrolle).

Fig. 6 Immunoblot-Analyse von bakteriell exprimierten rekombinanten sFv- Fragmenten. Um die Größe und Anwesenheit von bakteriell exprimierten sFv- Fragmenten zu demonstrieren wurden 50 µl Ganzzellfraktion von E. coli auf 12% SDS-PAGE-Gel geladen und mit Anti-Flag-(α-Flag-) und Anti-Tetra-His-(α-His)- Antikörpern nachgewiesen. Der Nachweis erfolgte unter Verwendung von HRP- konjugierten Kaninchen-Anti-Maus-Antikörpern und des ECL-Substratsystems. Wie erwartet, wurde eine deutliche Bande bei ungefähr 31 kDa nachgewiesen, die mit löslichen sFv-Fragmenten im Einklang stand.

Fig. 7 Aminosäuresequenz der variablen Bereiche der L-Kette (Fig. 7A) und H- Kette (Fig. 7B) von selektierten humanen sFv. Die codierende cDNA von mono klonalem sFv, das in Phagen-EIA und sFv-EIA positiv gegen NS3 ist, wurde isoliert. Eine automatische Sequenzierung in beiden Richtungen wurde zweimal durchgeführt, um die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von V_L und V_H zu bestimmen. Gerüstregionen (FR) und komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR) gemäß der Nomenklatur von Kabat et al. (Kabat E. A. et al., 5th ed. Bethesda, MD (1991); Martin A. et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 25: 130-133 (1996)) sind angegeben. Zwei Cysteinreste in den variab len Bereichen von V_L und V_H, die an strukturell konservierten Disulfidbrücken zwischen den Ketten beteiligt sind, sind halbfett gedruckt. Sequenzen, die durch die eingesetzten Primer beeinflusst sind, sind kursiv gedruckt.

Fig. 8 Bakteriell exprimierte sFv wurden durch Ni-NTA-Säulen bis zur Homoge nität gereinigt. Bei der Färbung mit Ponceau-Rot und Coomassie Brilliant Blue nach der Reinigung wurden keine unspezifischen Banden nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Gereinigte sFv-Fragmente wurden für einen kompetitiven EIA verwendet, um die Antikörperaffinität zu bestimmen. Anfangs wurden sEv- Konzentrationen des linearen Bereichs der Dosis-Bindungs-Kurve gewählt (Daten nicht im Einzelnen gezeigt). sFv wurden 2 h lang bei 4°C mit unterschiedlichen Konzentrationen von löslichem NS3 inkubiert, um ein stabiles Assoziations- Dissoziations-Gleichgewicht zu erreichen. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Konzentration an freiem sFv in Lösung mittels NS3-EIA. Die Figur zeigt eine abnehmende OD mit zunehmenden Konzentrationen an löslichem Antigen auf einer logarithmischen Skala. Die Affinitäten der gezeigten sFv liegen in der Größenordnung von 10^-6 bis 10^-7 M.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Einzelkettiges Fragment von einem humanen Antikörper, das die Vermehrung von Hepatitis-C-Virus (HCV) hemmt und das die variablen Bereiche der leichten Kette (V_L) und der schweren Kette (V_H) eines Antikörpers gegen ein oder meh rere essentielle Proteine von HCV umfasst.

2. Antikörperfragment nach Anspruch 1, das ein oder mehrere essentielle Proteine von HCV hemmt, vorzugsweise eine Affinität K_D ≦ 10^-6 M, besonders bevorzugt K_D ≦ 10^-7 M, für wenigstens ein essentielles Virusprotein aufweist.

3. Antikörperfragment nach Anspruch 1 oder 2, wobei die essentiellen Viruspro teine ausgewählt sind aus Oberflächenproteinen (Envelope), Strukturproteinen (Core) und Nichtstrukturproteinen (NS) und vorzugsweise ausgewählt ist aus Envelop 1 (E1), Envelope 2 (E2), Core, NS3-Protease, NS3-Helicase, NS4A- Kofaktor und NS5B-RNA-Polymerase.

4. Antikörperfragment nach Anspruch 3, das NS3-Protease und/oder NS3- Helicase, vorzugsweise NS3-Helicase hemmt.

5. Antikörperfragment nach Anspruch 4, wobei der variable Bereich der leichten Kette (V_L) das in SEQ ID NOs: 1 bis 8 gezeigte Peptid oder ein Derivat desselben umfasst, und/oder wobei der variable Bereich der schweren Kette (V_H) das in SEQ ID NOs: 9 bis 16 gezeigte Peptid oder ein Derivat desselben umfasst.

6. Antikörperfragment nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Fragmente V_L und V_H durch eine kovalente Bindung oder durch ein Linker molekül, insbesondere ein Linkerpeptid, miteinander verknüpft sind.

7. Antikörperfragment nach Anspruch 6, wobei V_L und V_H über ein Linkerpeptid, vorzugsweise über ein hydrophiles und/oder flexibles Linkerpeptid, besonders bevorzugt über ein Peptid mit der Aminosäuresequenz (Gly_aSer_b)_x (wobei a eine ganze Zahl von 1 bis 7, vorzugsweise von 2 bis 5 ist, b eine ganze Zahl von 1 bis 4, vorzugsweise 1 oder 2 ist und x eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 7 ist) miteinander verknüpft sind.

8. Antikörperfragment nach Anspruch 7, das eine der folgenden Peptidsequenzen oder ein Derivat derselben aufweist:
Peptid (SEQ ID NO: 1)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 9)
Peptid (SEQ ID NO: 2)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 10)
Peptid (SEQ ID NO: 3)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 11)
Peptid (SEQ ID NO: 4)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 12)
Peptid (SEQ ID NO: 5)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 13)
Peptid (SEQ ID NO: 6)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 14)
Peptid (SEQ ID NO: 7)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 15)
Peptid (SEQ ID NO: 8)-(Gly₄Ser)_x-Peptid (SEQ ID NO: 16),
wobei x 3, 4 oder 5, vorzugsweise 4 ist.

9. Antikörperfragment nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, die durch Expression in Prokaryonten, insbesondere durch Expression in E. coli erhältlich sind.

10. DNA-Sequenz, die für ein Antikörperfragment gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.

11. Vektor oder Gentransfervektor, umfassend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 10.

12. Verfahren zur Identifizierung von Antikörperfragmenten, die die Vermehrung von HCV hemmen, gemäß Ansprüchen 1 bis 8, umfassend

a) Klonierung einer DNA-Bibliothek, die Antikörperfragmente gegen ein oder mehrere essentielle Proteine von HCV kodiert;
b) Expression genannter Antikörperfragmente auf der Oberfläche von Bakterio phagen mit anschließender Anreicherung der Phagen, die Antikörperfragmente mit hoher Affinität für das essentielle Protein tragen, durch mehrere Zyklen der Selektion und Reamplifikation (Panning); und gegebenenfalls weiterhin
c) Vermehrung genannter Antikörperfragmente mit hoher Affinität durch lösliche Expression in Bakterienzellen und Isolierung der Antikörperfragmente aus dem Periplasma dieser Zellen.

13. Wirtszelle, insbesondere prokaryontische Wirtszelle, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 11 transformiert ist und/oder eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 10 enthält.

14. Verfahren zur Herstellung eines Antikörperfragments nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, umfassend Kultivieren einer Wirtszellen gemäß Anspruch 13.

15. Pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung, die einen oder mehrere Antikörperfragmente nach den Ansprüchen 1 bis 9 enthält.

16. Verwendung des Antikörperfragments nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 als Vakzine, insbesondere zur passiven Immunisierung.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen oder mehrere Gentransfervektoren, wie in Anspruch 11 definiert.

18. Verwendung des Gentransfervektors gemäß Anspruch 11 zur Gentherapie, insbesondere zur Gentherapie von HCV-Infektionen.

19. Gentherapieverfahren, insbesondere Verfahren zur Behandlung von HCV- Infektionen, umfassend Verabreichen des Gentransfervektors gemäß Anspruch 11 an den Patienten.