DE10120835A1 - Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern in einem Batchverfahren, wobei Zellen, welche die Antikörper exprimieren, in einem Reaktor unter definierten Wachstumsbedingungen in einer Suspension, enthaltend Nährstoffmedium, kultiviert werden und wobei mittels Mitteln zum Stoffaustausch, welche eine Ausschlußgrenze unterhalb des Molekulargewichts der Antikörper aufweisen, Austauschmedium der Suspension zugeführt und Stoffwechselabfallprodukte der Zellen der Suspension entzogen werden mit den folgenden Verfahrensstufen: a) einer Anfahrphase, b) einer Aufbauphase und c) einer stationären Phase, welche sich aufgrund definiert eingestellter Zelldichten und Stoffaustauschraten zeitlich sehr lang ausdehen läßt.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikör­ pern, in einem Batchverfahren, wobei Zellen, insbeson­ dere Säugetierzellen, welche die Antikörper exprimie­ ren, in einem Reaktor unter definierten Wachstumsbe­ dingungen in einer Suspension enthaltend Nährstoffme­ dium kultiviert werden und wobei mittels Mitteln zum Stoffaustausch, welche eine Ausschlußgrenze unterhalb des Molekulargewichts der monoklonalen Antikörper auf­ weisen, Austauschmedium mit Nährstoffen der Suspension zugeführt und Stoffwechselabfallprodukte der Zellen der Suspension entzogen werden.

Zur Expression von monoklonalen Antikörpern hergerich­ tete Zellen sind typischerweise Hybridomzellen. Ein Batchverfahren ist ein Verfahren, in welchem eine Zellkultur eingerichtet wird, wobei die Zellen der Zellkultur für eine definierte Zeitspanne kultiviert werden und wobei produzierte monoklonale Antikörper nach der definierten Zeitspanne, typischerweise späte­ stens nach Eintritt in die Absterbephase (starker Ab­ fall der Lebensfähigkeit bzw. Viability), aus der Zellkultur gewonnen werden. Die Zellen werden dabei verworfen. Eine Ausschlußgrenze gibt eine Obergrenze für die Größe von Molekülen, gemessen mittels des Mo­ leklargewichtes, an, welche eine Membran oder Barriere zu passieren vermögen. Moleküle mit höherem Molekulargewicht sind nicht in der Lage die Membran oder Barriere zu permeieren. Nährstoffmedium enthält die wesentlichen Komponenten, die für das Zellwachstum bzw. die Proliferation wichtig sind. Nährstoffmedium in der hier verwendeten Terminologie kann auch Protei­ ne, beispielsweise FCS (fetal calf serum), enthalten. Austauschmedium in der hier verwendeten Terminologie wird in der Regel keine Proteine mit einem Molekular­ gewicht über der Ausschlußgrenze enthalten, da diese nicht in die Suspension übertreten können. Eine Kulti­ vierung in Suspension bezeichnet Zellkulturen, deren Zellen nicht oder nur schwach adhärent sind. Bei einer Suspensionskultur sind typischerweise mehr als 90% der Zellen in Suspension, i. e. haften nicht an einer Ober­ fläche des Reaktors. Definierte Wachstumsbedingungen sind einrichtbar insbesondere durch Steuerung und/oder Regelung der Parameter Temperatur, pH und O₂-Gehalt. Diese Parameter werden auf vorgegebene Werte einge­ stellt nach Maßgabe von optimalen Kultivierungseffek­ ten. Die Parameter werden meist konstant gehalten, es ist aber auch möglich, diese Parameter im Laufe eines Batches gezielt zu variieren. Mittel zum Stoffaus­ tausch sind Membranen oder Barrieren, durch die ein Stoffaustausch im Wege diffusiver und/oder konvektiver Prozesse stattfinden kann. Eine solche Membran oder Barriere trennt ansonsten das Austauschmedium von der Suspension in definierte Volumenräume. Antikörper in der hier gewählten Terminologie umfassen neben Anti­ körpern im eigentlichen Sinne auch andere pharmazeu­ tisch brauchbare Stoffe, die von Zellen produziert werden können.

Hintergrund der Erfindung

Insbesondere monoklonale Antikörper gewinnen in zuneh­ mendem Maße an Bedeutung als Wirkstoffe in pharmazeu­ tischen Zusammensetzungen. Daher werden monoklonale Antikörper in großen Mengen benötigt, und zwar zu mög­ lichst geringen Herstellungskosten. Beides wird in hohem Maße von der Effektivität der Kultivierung der produzierenden Zellen bestimmt.

Von besonderer Bedeutung in diesen Zusammenhängen ist, wie lange die Zellen eines Batches zur Produktion von Antikörpern in der Lage sind. Dies hängt insbesondere von der Dauer der Lebensfähigkeit der eingesetzten Zellen unter den Kulturbedingungen ab. Diese Kulturbe­ dingungen unterliegen jedoch hinsichlich der Zusammen­ setzung der Suspension schwer kontrollierbaren Krite­ rien, insbesondere biochemischen Prozessen, die die Lebensfähigkeit der Zellen negativ beeinflussen und/o­ der Apoptose der Zellen induzieren. Hierbei können beispielsweise Nährstoffmangel und/oder Stoffwech­ selabfallprodukte, aber auch Signale, die von Zellen nach Maßgabe der Wachstumsphase, des Zell/Zell-Kontak­ tes, der Zelldichte usw. erzeugt werden, eine Rolle spielen.

Stand der Technik

Aus der Literaturstelle EP 0 224 800 B1 ist ein Ver­ fahren zur Kultivierung von Zellen bekannt, welches der Gewinnung beispielsweise von monoklonalen Antikör­ pern dient. Hierbei handelt es sich um ein Batch Verfahren, wobei Zellen in Suspension kultiviert wer­ den. Im Rahmen der insofern bekannten Maßnahmen sind in dem Reaktor semipermeable Membranhohlfasern einge­ richtet, durch welche ein durch die Hohlfaserwandungen von der Suspension getrenntes Austauschmedium in einem Kreislauf geführt wird. Durch die Hohlfaserwandungen treten Nährstoffe aus dem Austauschmedium in die Sus­ pension und Stoffwechselabfallprodukte aus der Suspen­ sion in das Austauschmedium ein.

Aus der Literaturstelle JP-A-60/207581 ist ein nahezu identisches Verfahren bekannt, welches sich lediglich dadurch unterscheidet, daß das Austauschmedium nicht im Kreislauf geführt wird. Vielmehr wird das Aus­ tauschmedium in Membranhohlfasern, welche keine Aus­ strömöffnung aufweisen, hineingeleitet und Druckbeauf­ schlagt. Hierdurch treten Nährstoffe in die Suspension über. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne werden die Druckverhältnisse umgekehrt, wodurch u. a., Stoffwech­ selabfallprodukte aus der Suspension entnommen werden. Dieser Vorgang wiederholt sich.

Mit beiden vorstehenden Methoden werden vergleichbare Zelldichten und vergleichbare Ausbeuten an Antikörpern erhalten. Beiden Methoden ist weiterhin gemeinsam, daß ein Batch typischerweise unmittelbar nach Ende der logarithmischen Proliferationsphase oder spätestens einige wenige Tage hiernach abgebrochen wird, da die Zunahme der Antikörper-Konzentration abnimmt oder die Konzentrationsänderung gar auf 0 fällt aufgrund des Eintritts in die Absterbephase.

Aus der Literaturstelle Gori, G. B., Applied Microbio­ logy, 13: 93-98 (1965), ist ein Bioreaktor bekannt, welcher mit einem Dialyseschlauch, der von einem FCS enthaltenden Nährmedium durchströmt wird, ausgestattet ist. Bei dem mit diesem Reaktor durchgeführten Verfah­ ren wird chemostatisch gearbeitet und es werden nur recht niedrige Zelldichten erreicht.

Technisches Problem der Erfindung

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Batchverfahren zur Herstellung von Antikörpern mittels einer Zellsuspension anzugeben, welches pro Batch eine erhöhte Menge an Antikörpern liefert.

Grundzüge der Erfindung

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er­ findung ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern in einem Batchverfahren, wobei Zellen, welche die An­ tikörper exprimieren, in einem Reaktor unter definier­ ten Wachstumsbedingungen in einer Suspension enthal­ tend Nährstoffmedium kultiviert werden und wobei mit­ tels Mitteln zum Stoffaustausch, welche eine Aus­ schlußgrenze unterhalb des Molekulargewichts der Anti­ körper aufweisen, Austauschmedium der Suspension zuge­ führt und Stoffwechselabfallprodukte der Zellen der Suspension entzogen werden mit den folgenden Verfah­ renstufen: a) in einer Anfahrphase wird der Reaktor angeimpft und durch stufenweise Zufuhr von Nährstoff­ medium über Mittel zur Mediumzufuhr exponentielles Wachstum der Zellen initiiert, wobei die Zelldichte, bezogen auf das Volumen der Suspension, in einem Be­ reich von 1 × 10⁵ bis 5 × 10⁶ Zellen/ml gehalten wird, b) in einer Aufbauphase werden die Mittel zum Aus­ tausch betrieben, wobei Austauschmedium mit definier­ tem Volumen durch die Mittel zum Austausch in einem Kreislauf gepumpt wird, mit der Maßgabe, daß die Zell­ dichte, bezogen auf das Volumen der Suspension zuzüg­ lich dem Mediumvolumen im Kreislauf, einen Wert von 1 × 10⁵/ml nicht unterschreitet, und wobei im Verlauf der Aufbauphase eine Zelldichte, bezogen auf das Volu­ men der Suspension, von zumindest 5 × 10⁶/ml erreicht wird, c) nach Erreichen einer Zelldichte von zumindest 5 × 10⁶/ml in Stufe b) wird eine stationäre Phase ein­ geleitet, wobei durch Einrichtung und taktweiser Um­ kehr eines Druckgradienten zwischen Kreislauf und Re­ aktor eine Stofftransport durch die Mittel zum Stoffaustausch entlang des Druckgradienten eingestellt wird, wodurch Nährstoffe aus dem Austauschmedium in den Reaktor ein- und Stoffwechselabfallprodukte aus dem Reaktor in das Austauschmedium ausgetragen werden, wobei der Volumenaustausch 0,05 bis 1 des Suspensions­ volumens/Tag entspricht.

Das Volumen der Suspension setzt sich aus dem Volumen des Nährstoffmediums und der Zellen zusammen. Das Animpfen eines Reaktors erfolgt dadurch, daß in den Reaktor Nährstoffmedium und Zellen eingebracht werden. Dabei werden typischerweise Zelldichten von 1 × 10⁵ bis 3 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Der Ausdruck der Zelldichte bezieht sich stets auf die Dichte lebender Zellen. Die stationäre Phase ist dadurch gekennzeich­ net, daß die Zelldichte praktisch unverändert ist und die Zellen mit praktisch konstanten Freisetzungsraten Antikörper produzieren. Mittel zur Mediumzufuhr arbei­ ten ohne Ausschlußgrenze und sind typischerweise Ein­ laßöffnungen oder Einlaßschleusen in einer Reaktorwan­ dung. Mittel zum Stoffaustausch sind typischerweise zumindest zum Teil permanent (bezogen auf die Dauer des Stoffaustausches) in die Suspension eingetaucht und mit einer Wandung somit in Kontakt mit der Suspen­ sion. Die gegenüberliegende Wandung steht in Kontakt mit dem Austauschmedium.

Im Kern wird in der Stufe a) die absolute Anzahl der Zellen expandiert, und zwar einhergehend mit einer Volumenzunahme der Suspension, so daß die Zelldichten trotz der Proliferation im wesentlichen konstant blei­ ben. In der Stufe b) findet dagegen sowohl eine Erhö­ hung des Volumens der Suspension als auch der Zell­ dichten statt. Es lassen sich zum Ende der Stufe b) bis zu 3 × 10⁷ Zellen/ml und mehr erreichen.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die Le­ bensfähigkeit der Zellen sich beachtlich fördern bzw. über einen langen Zeitraum konservieren läßt, wenn die Zelldichten einerseits und die Zufuhr von Austauschme­ dium andererseits in den angegebenen Grenzen gehalten werden. Hierbei ist insbesondere überraschend, daß eine beliebige Erhöhung der Zufuhr von Nährstoffen nicht etwa die Lebensfähigkeit der Zellen fördert, vielmehr daß bei Überschreiten einer Obergrenze der Zufuhr die Lebensfähigkeit sogar irreversibel und dra­ stisch abnimmt, i. e. Apoptose induziert wird.

Mit der Erfindung wird erreicht, daß eine eine ausge­ dehnte stationäre Phase an die Aufbauphase angeschlos­ sen werden kann, die bis zu 30 Tage und mehr währen kann. Somit wird mit einem einzigen Batch ein Vielfa­ ches der Menge an Antikörpern produziert, verglichen mit dem Stand der Technik, wo eine allenfalls nur an­ satzweise stationäre Phase gefahren werden kann. Somit wird für eine vorgegebene Menge an Antikörper beacht­ lich weniger Aufwand bei der Bereitstellung von Zellen und dem Betrieb der technischen Einrichtungen benö­ tigt. Von besonderer Bedeutung für die pharmazeutische Zwecke der Antikörper ist aber auch, daß mit dem Stand der Technik auch nicht annäherungsweise erreichbare Konzentrationen der Antikörper erreicht werden.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Bevorzugt ist es zur effektiven Rückhaltung der Anti­ körper und universeller Einsetzbarkeit der Mittel zum Stoffaustausch bei unterschiedlichen zu produzierenden Antikörpern, wenn die Ausschlußgrenze im Bereich von 2000 bis 20000 Dalton, vorzugsweise im Bereich von 3000 bis 10000 Dalton liegt.

Die Zelldichte in der Stufe a) wird bevorzugterweise in einem Bereich von 5 × 10⁵ bis 3 × 10⁶ Zellen/ml ge­ halten. Die Untergrenze der Zelldichte in der Stufe b) unterschreitet zweckmäßigerweise einen Wert von 3 × 10⁵/ml bis 3 × 10⁶/ml nicht. Die Aufbauphase wird vor­ teilhafterweise bis zu einer Zelldichte von zumindest 1 × 10⁶/ml, besser bis zu zumindest 1 × 10⁷/ml gefahren.

Einen optimalen Stoffaustausch sowohl der Nährstoffe als auch der Stoffwechselabfallprodukte erhält man, wenn die Takte in Stufe c) periodisch mit einer Peri­ odenlänge von 10 bis 3000 s eingerichtet sind. Die Takte können durch den Füllstand im Reaktor gesteuert werden, wobei bei Erreichen eines definierten maxima­ len Füllstandes der Druckgradient zum Kreislauf hin abfällt und bei Abfall auf einen definierten minimalen Füllstand zum Reaktor hin abfällt. In dieser Ausfüh­ rungsform ist ein Füllstandmesser eingerichtet und mit einer Steuerung der Druckverhältnisse verbunden, wel­ cher zwei Schaltgrenzen aufweist, den minimalen und den maximalen Füllstand. Diese beiden Grenzen bilden dann die regelungstechnische Hystereseschleife. Die Steuerung kann dann beispielsweise den Druck des Aus­ tauschmediums in den Mitteln zum Austausch so steuern, daß er bei Erreichen des maximalen Füllstandes auf eine vorgebene Druckdifferenz unterhalb des Druckes im Reaktor und bei Erreichen des minimalen Füllstandes auf eine vorgebene Druckdifferenz oberhalb des Druckes im Reaktor gesteuert wird. Es kann auch mit mit dem Füllstand in Beziehung stehenden Meßgrößen gearbeitet werden, beispielsweise einem maximalen Druck im Reak­ tor und einem minimalen Druck im Reaktor. Denn der Reaktor ist typischerweise ein geschlossenes System, in welchem die Druckverhältnisse definiert steuerbar sind.

Es kann optional auch in der Stufe b) Nährstoffmedium über die Mittel zur Mediumzufuhr zugeführt werden. Dann findet ein Nährstoffeintrag sowohl über die Medi­ umzufuhr als auch über die Mittel zum Stoffaustausch statt. Die Stufe b), in welcher Variante auch immer, wird bis zum Erreichen eines definierten maximalen Füllstandes im Reaktor durchgeführt. Hierbei kann Aus­ tauschmedium in einer Menge von 1 bis 50 ml/10⁸ Zellen und Tag, vorzugsweise von 5 bis 30 ml/10⁸ Zellen und Tag, dadurch mit dem Reaktor korrespondieren, daß vor­ zugsweise zwischen dem Kreislauf und dem Reaktor ein zum Reaktor hin abfallender Druckgradient eingestellt wird.

In der Stufe c ist vorteilhafterweise eine Geschwin­ digkeit des (konvektiven) Stoffaustausches einge­ stellt, die pro 24 h das 0,01- bis 1-fache, vorzugswei­ se das 0,05- bis 0,5-fache des Suspensionsvolumens beträgt.

Insbesondere im Hinblick auf sich im Austauschmedium akkumulierende Stoffwechselabfallprodukte und damit einem abnehmenden Konzentrationsgradienten durch die Mittel zum Stoffaustausch kann es sich empfehlen, das Austauschmedium des Kreislaufes nach einer definierten Zeitspanne gegen frisches Austauschmedium auszutauschen.

Die Mittel zum Stoffaustausch können grundsätzlich beliebig in Hinblick auf Materialien und Größe der Oberflächen ausgebildet sein, sofern sich die o. g. Austauschraten einstellen lassen und die Ausschluß­ grenze eingerichtet ist. Es ist dem Fachmann ohne wei­ teres möglich, die Werkstoffauswahl sowie die geome­ trische Ausbildung nach diesen Maßgaben auszubilden. Es kommen beispielsweise eine handelsübliche Dialyse­ membran, vorzugsweise in Schlauchform, oder ebenfalls handelsübliche Mikrohohlfasern, wie beispielsweise in der Literaturstelle EP 0 224 800 B1 beschrieben, in Frage. In beiden Fällen wird die Austauschrate außer von den geometrischen Eigenschaften (Oberfläche, Struktur des Materials, wie Oberflächenstruktur und/o­ der Porenstruktur) auch von der Strömungsgeschwindig­ keit des Austauschmediums durch den Schlauch bzw. die Mikrohohlfaser abhängen sowie von dem Druckgradienten durch die Membran, der neben diffusiven Prozessen auch konvektive Prozesse durch die Membran induziert.

Die Stufe c) wird zweckmäßigerweise nach Absinken der Antikörper-Freisetzungsrate (Abnahme des Anstiegs der Antikörperkonzentration als Funktion der Zeit) abge­ brochen und die Antikörper werden aus der Suspension gewonnen. Die Details einer Gewinnung der Antikörper aus der Suspension sind dem Fachmann gut vertraut und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden. Als Abbruchkriterium kann beispielsweise ein Vergleich der Steigung einer Kurve Konzentration Antikörper in der Suspension (Ordinate) gegen Zeit (Abszisse) in 24 h Abstand verwendet werden. Nimmt die Steigung um einen definierten relativen Betrag ab, beispielsweise 20%, so wird planmäßig abgebrochen. Alternativ kann ein absoluter Grenzwert der Steigung bei Unterschreitung als Abbruchkriterium dienen.

Neben der Einstellung definierter Kultivierungsbedin­ gungen, wie oben beschrieben, wird es sich empfehlen, die Suspension vorzugsweise kontinuierlich umzuwälzen, damit die Suspension die Oberfläche der Mittel zum Stoffaustausch umfließt und so der Stoffaustauschge­ fördert und besser kontrolliert werden kann. Auch ist eine praktisch homogene Zusamensetzung der Suspension wünschenswert. Eingesetzte Mittel zum Umwälzen sollten möglich zellschonend arbeiten. Bewährt hat sich bei­ spielsweise ein Segelblattrührer.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsformen Beispielen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Diagramm mit Zeitfunktionen der Zelldichte sowie der Konzentration monoklonaler Antikör­ per für ein erfindungsgemäßes Verfahren, und

Fig. 2 ein Diagramm eines Vergleichsversuches mit demgegenüber erhöhtem Austausch.

Beispiel 1 Messung von Zelldichten

Die Zelldichte lebender Zellen in der Suspension läßt sich anhand einer entnommenen Probe bestimmen. In ei­ ner Neubauer Zählkammer werden von der mit 1% Trypan­ blau versetzten und ggf. vorverdünnten Suspension (Endkonzentration: 0,2%) 4 große Quadrate ausgezählt. Als lebend werden die ungefärbten Zellen und als tot die gefärbten Zellen bewertet. Anhand des eingesetzten Suspensionsvolumens, ggf. des Verdünnungsfaktors sowie dem Volumen Trypanblau läßt sich die Zahl der lebenden Zellen je ml berechnen.

Beispiel 2 Messung von Antikörperkonzentrationen

Die Antikörperkonzentration läßt sich mit verschiede­ nen Standardmethoden messen. Dies sind beispielsweise Enzyme Immuno Assay, Immunturbidimetrische Bestimmung monoklonaler IgG Antikörper, Photometrische Ermitte­ lung des reziproken Titers und Bestimmung des serolo­ gischen Titers, visuell bewertet als Agglutination von bakteriellen Prüfstämmen, jeweils nach Vorschrift der Kit-Hersteller.

Beispiel 3 Messung des Volumenaustausches

Der Volumenaustausch läßt sich mittels einer Prüfver­ fahrenstufe mit einem Leerreaktor bestimmen. Hierfür wird der Reaktor wie im Normalbetrieb betrieben, nur ohne Zellen und nicht bis zum maximalen Füllstand mit Nährmedium befüllt. Es versteht sich, daß die Mittel zum Stoffaustausch praktisch vollständig in dem Nähr­ medium eintauchen. Es wird eine Reihe von definierten Druckdifferenzen zwischen Nährmedium im Reaktor und Austauschmedium im Kreislauf eingestellt (Gradient zum Nährmedium hin abfallend) und dann in Abhängigkeit von der Zeit die Volumenzunahme im Reaktor gemessen. Man erhält eine Kurvenschar, die spezifisch für die einge­ setzten Mittel zum Stoffaustausch ist, und aus welcher sich ein definierter Stoffaustausch durch Einstellung der Druckdifferenz einstellen läßt. Wenn Mittel zum Stoffaustausch eingesetzt werden, die aufgrund kapil­ larähnlichem Aufbau einen nennenswerten Druckabfall aufweisen, wird der Druck im Kreislauf eingangsseitig gemessen.

Im Falle von Mittel zum Stoffaustausch, deren Poren­ struktur in Tranportrichtung veränderlich ist (soge­ nannte asymmetrischen Membranen, wie beispielsweise Hohlfasern mit schaumartiger Membranstruktur aus Poly­ sulfon), kann es sich empfehlen, die vorstehenden Mes­ sungen zu Kontrollzwecken mit reversem Druckgradienten durchzuführen. Ggf. kann dann im Betrieb mit entspre­ chenden asymmetrischen Druckgradienten gearbeitet wer­ den, wenn die Volumenströme bei verschiedenen Takten bzw. Stromrichtungen gleich sein sollen. In der Regel werden jedoch praktisch keine Unterschiede festzustel­ len sein.

Beispiel 4 Aufbau eines Reaktors

Ein in einem erfindungsgemäßen Verfahren beispielswei­ se einsetzbarer Reaktor weist die folgenden Bauelemen­ te auf. Es ist ein Reaktorgefäß eingerichtet, welches ein Volumen beispielsweise im Bereich von 1 bis 5 l aufweisen kann. Das Reaktorgefäß weist Sensoren für die Messung von Füllstand, Temperatur, pH und O₂ auf. Es sind Anschlüsse zur Zufuhr von Nährstoffmedium so­ wie ggf. zur Begasung, Probenentnahme und Suspension­ sentnahme (Entleerung) eingerichtet. Im Inneren des Reaktors ist ein Stoffaustauschmodul eingerichtet, welches an einen Kreislauf weiterhin aufweisend eine Kreislaufpumpe, beispielsweise peristaltische Schlauchpumpe, anschließbar ist. Dabei kann der Kreis­ lauf so eingerichtet sein, daß die Mittel zum Stoffaustausch im Durchfluß betrieben werden. In die­ sem Falle sind in den Mitteln zum Stoffaustausch zu­ mindest jeweils eine Eingangs- und eine Ausgangsöffnung vorgesehen. Es ist aber auch möglich, einen Kreislauf einzurichten, an welchem die Mittel zum Stoffaustausch lediglich einseitig angeschlossen sind. Dann wird Austauschmedium einseitig in die Mit­ tel zum Stoffaustausch hinein gedrückt bwz. herausge­ drückt, jeweils nach Maßgabe des Vorzeichens des ange­ legten Druckgradienten. In jedem Fall strömt Aus­ tauschmedium durch die Mittel zum Stoffaustausch, da das Austauschmedium die Membran durchströmt bzw. hin­ durch diffundiert.

Der Füllstandssensor ist mit einer elektronischen Steuerungsvorrichtung verbunden, mittels welche die Druckdifferenz zwischen Reaktor und Kreislauf ansteu­ erbar ist.

Die weiteren Sensoren sind mit üblichen Steuerungs- und Regelungsvorrichtungen verbunden, die entweder die gemessenen Parameter konstant halten oder definierte Programme (zeitliche Verläufe) der Parameter steuern und regeln.

Die Suspension wird beispielsweise mittels eines Se­ gelblattrührers umgewälzt.

Als Mittel zum Stoffaustausch ist ein Dialyseschlauch mit einer Ausschlußgrenze von 10.000 eingerichtet, wobei die geometrischen Dimensionen so gewählt sind, daß sich in einer Prüfverfahrenstufe gemäß Beispiel 3 die gewünschten Austauschraten erzielen lassen. Dies ist ohne weiteres durch einfache Versuche ermittelbar. Alternativ ist es möglich Mikrohohlfasern, beispiels­ weise aus Polysulfon einzusetzen. Für deren Geometrie gilt das Vorstehende analog. Da sterilisierbare Mikro­ hohlfasern mit Ausschlußgrenzen unterhalb 10000 ohne weiteres käuflich erwerbar sind, die Sterilisierung von Dialyseschläuchen mit sehr niedrigen Ausschluß­ grenzen demgegenüber nicht immer unkompliziert ist, kann sich der Einsatz von Mikrohohlfasern lohnen, wenn niedrige Ausschlußgrenzen bei einfacher Sterilisier­ barkeit gefragt sind.

Weiterhin ist eine übliche Begasungeinheit zur Einlei­ tung von Luft, O₂ und/oder CO₂ in die Suspension einge­ richtet.

Beispiel 5 Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Vor dem Einsatz des Bioreaktors werden alle Komponen­ ten nach Vorschrift sterilisiert und die Sensoren ggf. kalibiert. Das Mittel zum Stoffaustausch wird auf Dichtheit geprüft (Blasenbildung bei innenseitiger Beaufschlagung mit Gas und Eintauchen in eine Flüssig­ keit). Dann werden alle vorstehend beschriebenen Kom­ ponenten montiert und der komplette Aufbau durch Auto­ klavierung nachsterilisiert. Der insofern sterile Re­ aktor wird dann positioniert und die elektrischen An­ schlüsse sowie die Fluidanschlüsse und Gasanschlüsse werden steril hergestellt.

Das Animpfen erfolgt dadurch, daß Nährstoffmedium (handelsübliches DMEM, supplementiert mit Natrium­ bikarbonat, L-Glutamin, Gentamycin, Pyruvat, Glucose und FCS) und Zellen in den Reaktor eingebracht werden, wobei die Zelldichte auf etwa 1 × 10⁵/ml, bezogen auf das Volumen der Suspension, eingestellt wird.

Anschließend wird stufenweise Nährstoffmedium zuge­ führt, wobei die Menge zugegebenen Nährstoffmediums nach Maßgabe von Messungen der Zelldichte so gewählt wird, daß die Zelldichte annähernd konstant bleibt. Die Zugabe erfolgt bis zu einem vorgegebenen Füllstand.

Nach Erreichen des vorgegebenen Füllstandes der An­ fahrphase, ggf. bereits zuvor, werden die Mittel zum Stoffaustausch in Betrieb genommen. In dieser Auf­ bauphase wird die Zelldichte auf zumindest 5 × 10⁶/ml (bezogen auf das Volumen der Suspension) erreicht. Eine Volumenzunahme der Suspension erfolgt durch Zu­ fluß von Austauschmedium. Dieser Zufluß wird (über einen Druckgradienten) so gesteuert und überwacht, daß die Zelldichte einen vorgegebenen Mindestwert nicht unterschreitet. Im Rahmen der Aufbauphase wird Aus­ tauschmedium in einer Menge von ca. 37 ml/10⁸ Zellen und Tag in den Reaktor eingetragen.

Nach Erreichen der Mindestzelldichte der Aufbauphase wird die stationäre Phase eingeleitet. Hierbei wird taktweise ein vorgegebener Druckgradient zwischen Sus­ pension und Kreislauf umgekehrt, wobei die Umkehrpunk­ te durch eingestellte minimale und maximale Füllstän­ de, gemessen mittels des Füllstandssensors, angesteu­ ert werden. Die Taktdauer kann, je nach gewünschter Austauschrate, zwischen 10 und 3000 s betragen. Sie hängt auch von veränderlichen Eigenschaften der Mittel zum Stoffaustausch (z. B. blocking) ab, wenn mit kon­ stantem Druckgradient gearbeitet wird.

Im Zuge des vorstehenden Verfahrens wird in definier­ ten Zeitabständen die Zelldichte gemessen, ebenso wie die Antikörperkonzentration. In der Fig. 1 sind die Ergebnisse für die käuflich frei verfügbare Zelllinie AntiA-A003 dargestellt. Man erkennt zunächst, daß sich hohe Zelldichten, wie beim eingangs genannten Stand der Technik erreichen lassen. Erfindungswesentlich ist aber, daß die Antikörperproduktion bis 30 Tage ab An­ fahrphase und mehr anhält, ohne daß ein Abflachen des Anstiegs der Konzetrationskurve erkennbar ist. Im Er­ gebnis wird pro Volumeneinheit Suspension eine um ein Vielfaches höhere Antikörperkonzentration dadurch er­ reicht, daß nicht im Bereich von Tag 10 bis 12 abge­ brochen werden muß, wie im Stand der Technik, sondern eine ausgedehnte stationäre Phase (konstante maximale Zelldichte) gefahren werden kann.

Es werden regelmäßig Antikörperkonzentrationen von 1 bis 4 mg/ml Suspension und mehr erreicht. Gemäß bei­ spielsweise EP 0 224 800 B1 sind nicht mehr als 300 µg/ml erzielbar. Gleichzeitig wird zur Herstellung derselben absoluten Antikörpermenge lediglich 40-60% der Menge an Medium, verglichen mit einem klassischen Batchverfahren, benötigt. Die Integrität der erfin­ dungsgemäß hergestellten Antikörper (Quotient aus ak­ tiver und passiver mAK-Bestimmung) genügt dabei allen Anforderungen.

Beispiel 6 Vergleichsbeispiel mit erhöhtem Eintrag von Austauschmedium in der Stufe b)

In diesem Vergleichsversuch wurde grundsätzlich analog dem Beispiel 5 verfahren, wobei jedoch in der Verfah­ rensstufe b) 100 ml/10⁸ Zellen und Tag an Aufbaumedium eingetragen wurden durch geeignete erhöhung des Druck­ gradienten. Die so gewonnen Daten sind in der Fig. 2 dargestellt.

In der Fig. 2 erkennt man, daß die Stufe b) sich bis ca. Tag 5 erstreckt. In der Stufe b) erkennt man zwar einen starken Anstieg der Zahl lebender Zellen/ml, diese fällt jedoch kurz nach Einleitung der Stufe c) wieder ab. Gleichzeitig steigt die Zahl der toten Zel­ len stark an, mit entsprechender Abnahme der Viabili­ ty, und man erkennt, daß bei ca. Tag 9, i. e. bereits am Tag 4 der Stufe c) kaum noch lebende Zellen präsent sind. Entsprechend findet auch keine Zunahme der Anti­ körperkonzentration mehr statt mit entsprechend nied­ riger Endkonzentration. Offenbar existiert auch eine Obergrenze bei der Nährstoffzufuhr, bei deren deutli­ cher Überschreitung Apoptose unter physiologischen Bedingungen, i. e. nicht toxisch bedingt, induziert, und zwar irreversibel. Die Irreversibilität ist bei­ spielsweise daran erkennbar, daß eine Reduktion des Austausches in Stufe c) nicht zu einem Erholungseffekt führt. In Beispiel ist somit die Ursächlichkeit in dem Überaustausch in Stufe b) demonstriert. Es ist davon auszugehen, daß ein Überaustausch in Stufe c) analoge Effekte bewirkt, nur entsprechend zeitlich verzögert.

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern in einem Batchverfahren, wobei Zellen, welche die Antikörper exprimieren, in einem Reaktor unter definierten Wachstumsbedingungen in einer Suspension enthaltend Nährstoffmedium kultiviert werden und wobei mittels Mitteln zum Stoffaustausch, welche eine Ausschluß­ grenze unterhalb des Molekulargewichts der Antikör­ per aufweisen, Austauschmedium der Suspension zuge­ führt und Stoffwechselabfallprodukte der Zellen der Suspension entzogen werden mit den folgenden Verfahrenstufen:

• a) in einer Anfahrphase wird der Reaktor angeimpft und durch stufenweise Zufuhr von Nährstoffmedi­ um über Mittel zur Mediumzufuhr exponentielles Wachstum der Zellen initiiert, wobei die Zell­ dichte, bezogen auf das Volumen der Suspension, in einem Bereich von 1 × 10⁵ bis 5 × 10⁶ Zel­ len/ml gehalten wird,
• b) in einer Aufbauphase werden die Mittel zum Aus­ tausch betrieben, wobei Austauschmedium mit definiertem Volumen durch die Mittel zum Aus­ tausch in einem Kreislauf gepumpt wird, mit der Maßgabe, daß die Zelldichte, bezogen auf das Volumen der Suspension zuzüglich dem Mediumvo­ lumen im Kreislauf, einen Wert von 1 × 10⁵/ml nicht unterschreitet, und wobei im Verlauf der Aufbauphase eine Zelldichte, bezogen auf das Volumen der Suspension, von zumindest 5 × 10⁶/ml erreicht wird,
• c) nach Erreichen einer Zelldichte von zumindest 5 × 10⁶/ml in Stufe b) wird eine stationäre Phase eingeleitet, wobei durch Einrichtung und takt­ weiser Umkehr eines Druckgradienten zwischen Kreislauf und Reaktor eine Stofftransport durch die Mittel zum Stoffaustausch entlang des Druckgradienten eingestellt wird, wodurch Nähr­ stoffe aus dem Austauschmedium in den Reaktor ein- und Stoffwechselabfallprodukte aus dem Reaktor in das Austauschmedium ausgetragen wer­ den, wobei der Volumenaustausch 0,05 bis 1 des Suspensionsvolumens/Tag entspricht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ausschlußgren­ ze im Bereich von 2000 bis 20000 Dalton, vorzugs­ weise im Bereich von 3000 bis 10000 Dalton liegt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Zelldichte in der Stufe a) in einem Bereich von 5 × 10⁵ bis 3 × 10⁶ Zellen/ml gehalten wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Untergrenze der Zelldichte in der Stufe b) ei­ nen Wert von 3 × 10⁵/ml bis 3 × 10⁶/ml nicht unterschreitet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aufbauphase bis zu einer Zelldichte von zumin­ dest 1 × 10⁶/ml gefahren wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Takte in Stufe c) periodisch mit einer Peri­ odenlänge von 10 bis 3000 s eingerichtet sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in der Stufe b) Nährstoffmedium über die Mittel zur Mediumzufuhr zugeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Stufe b) bis zum Erreichen eines definierten maximalen Füllstandes im Reaktor durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Takte durch den Füllstand im Reaktor gesteuert werden, wobei bei Erreichen eines definierten maxi­ malen Füllstandes der Druckgradient zum Kreislauf hin abfällt und bei Abfall auf einen definierten minimalen Füllstand zum Reaktor hin abfällt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei in der Stufe b) Austauschmedium in einer Menge von 1 bis 100 ml/10⁸ Zellen und Tag, vorzugsweise von 5 bis 50 ml/10⁸ Zellen und Tag, dadurch in den Reaktor eingetragen wird, daß zwischen dem Kreislauf und dem Reaktor ein zum Reaktor hin ab­ fallender Druckgradient eingestellt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei in der Stufe c eine Geschwindigkeit des Stoffaus­ tausches eingestellt ist, die pro 24 h das 0,01- bis 1-fache des Suspensionsvolumens beträgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Austauschmedium des Kreislaufes nach einer definierten Zeitspanne ausgetauscht wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Mittel zum Stoffaustausch eine Dialysemembran, vorzugsweise in Schlauchform, und/oder Mikrohohl­ fasern umfassen.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Stufe c) nach Absinken der AK-Freisetzungsrate abgebrochen und die Antikörper aus der Suspension gewonnen werden.