DE10119597C2 - Process for increasing the selectivity in multidimensional electrophoresis or multidimensional isoelectric focusing - Google Patents
Process for increasing the selectivity in multidimensional electrophoresis or multidimensional isoelectric focusingInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren der mehrdimensionalen Elektrophorese oder der mehrdimensionalen isoelektrischen Fokussierung. Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Auflösung bei der mehrdimensionalen Elektrophorese oder der mehrdimensionalen isoelektrischen Fokussierung.The present invention includes a multi-dimensional method Electrophoresis or multidimensional isoelectric focusing. In particular, the present invention includes a method for increasing the Resolution in multi-dimensional electrophoresis or multi-dimensional isoelectric focusing.
Die Biotechnologie gehört derzeit zu den sich am schnellsten fortentwickelnden Wissenschaften. Fast täglich werden neue Forschungsergebnisse veröffentlicht und viele davon basieren auf molekularbiologischen Untersuchungen (Genetik) oder der Erforschung des Verhaltens oder der Expressionsmuster von Proteinen (Proteomik). Das Herz all dieser Untersuchungen bilden Verfahren, die die große Vielfalt von Nucleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen trennen, so daß Folgeuntersuchungen an nur einer Molekülspezies oder auch nur einem Bruchteil davon erfolgen können. All diesen Trennverfahren, wie z. B. der Gelelektrophorese oder der isoelektrischen Fokussierung ist gemein, daß sie die unterschiedlich gute Beweglichkeit von Molekülen unterschiedlicher Größen in vernetzen Medien, wie zum Beispiel einem Polyacrylamidgel ausnutzen, um eine räumliche Trennung der verschiedenen Moleküle zu erreichen. Sowohl Nucleotide als auch Proteine sind in geeigneten sauren oder basischen Umgebungen elektrisch geladen, wodurch auf diese Moleküle mit Hilfe eines elektrischen Feldes eine konstante treibende Kraft ausgeübt werden kann, die zu der Bewegung in dem viskosen Medium führt.Biotechnology is currently one of the fastest developing Sciences. New research results are published and published almost daily many of them are based on molecular biological studies (genetics) or the Research into the behavior or expression patterns of proteins (proteomics). At the heart of all these investigations are procedures that cover the wide variety of Separate nucleotide sequences or amino acid sequences so that Follow-up studies on only one molecular species or even a fraction of which can be done. All of these separation processes, such as. B. gel electrophoresis or the isoelectric focusing has in common that it has the different good Mobility of molecules of different sizes in networked media, such as For example, use a polyacrylamide gel to separate the to reach different molecules. Both nucleotides and proteins are in suitable acidic or basic environments electrically charged, causing these molecules with the help of an electric field a constant driving force can be exercised, which leads to the movement in the viscous medium.
Die Reinheit der nach den beschriebenen Verfahren getrennten Molekülspezies sowie die nach der Trennung vorliegende Menge einer Spezies ist für die Qualität und die Wirtschaftlichkeit der Folgeuntersuchungen von entscheidender Bedeutung. Beispielsweise kann die Sequenzierung einer durch Elektrophorese getrennten Nucleotidsequenz nur dann ein korrektes Ergebnis liefern, wenn die Nucleotidsequenz in ihrer Reinform vorliegt und nicht mit anderen Sequenzabschnitten kontaminiert ist. So wird zur Verbesserung der Trennschärfe gemäß einem Verfahren des Standes der Technik bei der Gelelektrophorese auf das Trenngel ein sogenanntes Stapelgel aufgegossen, in welche dann vor dem Auspolymerisieren des Stapelgels die Vorratsbehälter zur Aufnahme der zu analysierenden Substanzmischungen eingesetzt werden. Während des Trennvorgangs werden dann im Stapelgel die unterschiedlichen Bestandteile der zu analysierenden Substanzmischung fokussiert, bevor sie in das Trenngel einwandern und dort räumlich voneinander in sog, Banden getrennt werden.The purity of the molecular species separated by the methods described as well as the amount of a species present after the separation is for the quality and the economics of follow-up exams are crucial. For example, sequencing can be separated by electrophoresis Nucleotide sequence will only give a correct result if the Nucleotide sequence is in its pure form and not with others Sequence sections is contaminated. So will improve the selectivity according to a prior art method in gel electrophoresis on the A so-called stacking gel was poured onto the separating gel, in which it was placed in front of the Polymerize the stacking gel to hold the storage containers analyzing substance mixtures are used. During the Separation process then the different components of the stack gel analyzing substance mixture focused before immigrating into the separating gel and there spatially separated from one another in so-called bands.
Insbesondere, wenn die durch Trennung gewonnenen Molekülsorten für einen weiteren Trennschritt nach einem der beschriebenen Verfahren Verwendung finden sollen (sog. mehrdimensionale Trennverfahren), spielen die Auflösung und die Ergiebigkeit der vorhergehenden Trennverfahren eine große Rolle. Beispielsweise wird bei der zweidimensionalen Elektrophorese aus dem Trenngel des Elektrophoreseschrittes der ersten Dimension entlang der Laufrichtung der Moleküle ein die Banden enthaltender Streifen ausgeschnitten und mit einer der beiden Schnittkanten auf ein Trenngel der zweiten Dimension aufgelegt. Die nach dem Auspolymerisieren des Trenngels durchgeführte Elektrophorese führt zu einer weiteren Auftrennung der einzelnen, im Elektrophoreseschritt der ersten Dimension gewonnenen Banden in ihre Molekülbestandteile. Als nachteilig erweist sich hierbei jedoch, dass durch die räumliche Ausdehnung der Banden des Elektrophoreseschrittes der ersten Dimension, die bei dem Trennprozess der zweiten Dimension entlang dessen Laufrichtung angeordnet sind, eine deutliche Verminderung der Trennschärfe resultiert. Außerdem läßt sich eine wesentliche Verminderung der Ergiebigkeit des Trennprozesses der zweiten Dimension feststellen, die es erschwert, die getrennten Molekülspezies für Folgeuntersuchungen, wie Sequenzierung oder Massenspektroskopie zu gewinnen.Especially if the molecular types obtained by separation for one another separation step using one of the methods described (so-called multi-dimensional separation processes), play the resolution and the Productivity of the previous separation processes plays a major role. For example is used in two-dimensional electrophoresis from the separation gel of Electrophoresis step of the first dimension along the running direction of the molecules cut out a strip containing the bands and use one of the two Cut edges placed on a separating gel of the second dimension. The after Polymerization of the separating gel performed electrophoresis leads to a further separation of the individual, in the electrophoresis step of the first dimension obtained bands into their molecular components. This proves to be disadvantageous however, that due to the spatial expansion of the bands of the Electrophoresis step of the first dimension, which is used in the separation process of the second Dimension along whose direction are arranged, a clear Decrease in selectivity results. In addition, an essential one Reduction of the productivity of the separation process of the second dimension notice that it makes it difficult to separate the molecular species for Follow-up examinations, such as sequencing or mass spectrometry.
Die vorliegende Erfindung optimiert sowohl die Trennschärfe als auch die Ergiebigkeit von mehrdimensionalen Trennverfahren, wie zum Beispiel der mehrdimensionalen Gelelektrophorese oder der mehrdimensionalen isoelektrischen Fokussierung, indem auf das Trenngel einer höheren Dimension ein Stapelgel aufgebracht wird, auf welches dann der Trenngelstreifen eines Trennprozesses der vorhergehenden Dimension aufgebracht wird, und daß vor dem Aufbringen des Gelstreifens auf das Sammelgel die aufeinander treffenden Oberflächen des Gelstreifens und des Sammelgels einem Trocknungsverfahren unterzogen werden. Dies führt zu einer deutlichen Verbesserung der Auflösung des Trennverfahrens der höheren Dimension und steigert außerdem die Ergiebigkeit des Trennverfahrens (Fig. 4b und 4c), so dass nach der Trennung eine größere Menge der jeweiligen Molekülspezies für weitere Untersuchungen zur Verfügung steht als bei einem Verfahren gemäß dem Stand der Technik (Fig. 4a). Dadurch können Zeit- und kostenaufwendige Prozesse zur Gewinnung der aus diesen mehrdimenionalen Trennverfahren gewonnenen Molekülspezies vermieden werden. Außerdem kann durch die Erhöhung der Trennschärfe vermieden werden, daß Kontaminationen der interessierenden Molekülspezies durch benachbarte Molekülspezies auftreten. Weiterhin kann durch die bessere Auflösung ein eventuell notwendiger, weiterer Trennschritt zur Auftrennung unscharfer Banden, der bei einem Trennverfahren gemäß dem Stand der Technik notwendig werden würde, eingespart werden.The present invention optimizes both the selectivity and the productivity of multidimensional separation processes, such as, for example, multidimensional gel electrophoresis or multidimensional isoelectric focusing, by applying a stacking gel to the separating gel of a higher dimension, to which the separating gel strip of a separating process of the previous dimension is then applied and that before the application of the gel strip to the stacking gel, the contacting surfaces of the gel strip and the stacking gel are subjected to a drying process. This leads to a significant improvement in the resolution of the separation process of the higher dimension and also increases the productivity of the separation process ( FIGS. 4b and 4c), so that after the separation a larger amount of the respective molecular species is available for further investigations than in a process according to the prior art ( Fig. 4a). As a result, time-consuming and costly processes for obtaining the molecular species obtained from these multi-dimensional separation processes can be avoided. In addition, by increasing the selectivity, it can be avoided that contamination of the molecular species of interest by neighboring molecular species occurs. Furthermore, the better resolution can save a possibly necessary further separation step for the separation of fuzzy bands, which would be necessary in a separation process according to the prior art.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden, detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Patentansprüchen und den Zeichnungen. Es zeigt:Further features and advantages of the present invention result from the following, detailed description in connection with the claims and the drawings. It shows:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Elektrophoreseverfahrens zur Trennung geladener Substanzen unterschiedlichen Molekulargewichtes gemäß dem Stand der Technik; Figure 1 is a schematic representation of an electrophoresis method for the separation of charged substances of different molecular weights according to the prior art.
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer höheren Dimension eines Elektrophoreseverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung; Fig. 2 is a schematic representation of a higher dimension of an electrophoresis method according to the present invention;
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform einer höheren Dimension eines Elektrophoreseverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung; Fig. 3 is a schematic representation of another embodiment of a higher dimension of an electrophoresis method according to the present invention;
Fig. 4a ein Elektrophoresekontinuum nach Trennung der geladenen Substanzen in der zweiten Dimension gemäß dem Stand der Technik; FIG. 4a is a Elektrophoresekontinuum after separation of charged substances in the second dimension according to the prior art;
Fig. 4b ein Elektrophoresekontinuum nach Trennung der geladenen Substanzen in der zweiten Dimension gemäß der vorliegenden Erfindung; FIG. 4b is a Elektrophoresekontinuum after separation of charged substances in the second dimension according to the present invention;
Fig. 4c ein Elektrophoresekontinuum nach Trennung der geladenen Substanzen in der zweiten Dimension gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Fig. 4c a Elektrophoresekontinuum after separation of charged substances in the second dimension to a further embodiment of the present invention according to.
Die folgende, detaillierte Beschreibung verschiedener Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens verdeutlichen lediglich Anwendungen der vorliegenden Erfindung und schränken sein Nutzung nicht darauf ein.The following detailed description of various embodiments of the The inventive method only illustrate applications of present invention and do not limit its use to it.
Bei der Elektrophorese handelt es sich um ein Verfahren, welches geladene Substanzen unterschiedlicher Molekülgröße in einem homogenen elektrischen Feld 5 zwischen einer Kathode 1 und einer Anode 2 trennt. Die Trennung erfolgt dabei aufgrund der unterschiedlich guten Beweglichkeit der verschiedenen Moleküle innerhalb eines vernetzen Trennmediums (z. B. eines Gels), dessen Vernetzungsgrad bei der Herstellung variiert werden kann. Insbesondere im Bereich der Proteinbiochemie wird üblicherweise das Verfahren der denaturierenden SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) angewendet. Hierbei werden Proteine mit dem anionischen Detergenz SDS (Na-dodecylsulfat) beladen, so daß diese eine nahezu konstante Ladung pro Masseneinheit tragen. In einem Trennmedium bestehend aus einem Polyacrylamidgel kann damit eine effektive Trennung von Proteinen entsprechend ihrer Molekularmasse durchgeführt werden. Ein solches Polyacrylamidgel ist üblicherweise diskontinuierlich und besteht aus einem weitmaschigen Sammelgel 3 und einem engmaschigen Trenngel 4. In das Sammelgel 3 werden bei der Herstellung außerdem Vorratsbehälter eingebracht, in die die geladene Substanz 6 vor Beginn des Elektrophoreseprozesses einpipettiert wird. Während des Elektrophoreseprozesses wird durch den geringeren Vernetzungsgrad des Sammelgels eine Aggregation der geladenen Substanz 6 während der Einwanderung aus der Flüssigphase in die Gelphase des Sammelgels 3 verhindert. Die in die Vorratsbehälter im Sammelgel 3 eingebrachten geladenen Substanzen 6 wandern in Laufrichtung 8 in das Sammelgel 3 ein und ordnen sich in der Reihenfolge ihrer Mobilität an. Dieser Stapel aus geladener Substanz wird bei konstantem elektrischen Feld in Laufrichtung 8 mit konstanter Wanderungsge schwindigkeit bis zur Kante des nachfolgenden Trenngels 4 transportiert. Beim Übergang in das engmaschige Trenngel 4 wird die Wanderungsgeschwindigkeit der jeweils übergehenden Substanz herabgesetzt und es kommt zu einer Fokussierung der in das Trenngel 4 eindringenden Substanz an der Grenzfläche zwischen dem Sammelgel 3 und dem Trenngel 4. Im Trenngel 4 erfolgt eine weitere räumliche Trennung der einzelnen Substanzen in Laufrichtung 8 in Abhängigkeit von der Nettoladung und der molekularen Größe der Substanzen. Hierdurch werden voneinander getrennte Konzentrationsbereiche 7 (sog. Banden) der Trennprodukte erzielt.Electrophoresis is a process which separates charged substances of different molecular sizes in a homogeneous electric field 5 between a cathode 1 and an anode 2 . The separation takes place due to the different mobility of the different molecules within a cross-linked separation medium (e.g. a gel), the degree of cross-linking of which can be varied during production. In the field of protein biochemistry in particular, the method of denaturing SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) is usually used. Proteins are loaded with the anionic detergent SDS (Na-dodecyl sulfate) so that they carry an almost constant charge per unit of mass. In a separation medium consisting of a polyacrylamide gel, an effective separation of proteins according to their molecular mass can be carried out. Such a polyacrylamide gel is usually discontinuous and consists of a wide-mesh collecting gel 3 and a narrow-mesh separating gel 4 . Storage containers are also introduced into the collecting gel 3 during manufacture, into which the charged substance 6 is pipetted before the electrophoresis process begins. During the electrophoresis process, the lower degree of crosslinking of the collection gel prevents aggregation of the charged substance 6 during immigration from the liquid phase to the gel phase of the collection gel 3 . The loaded substances 6 introduced into the storage containers in the collecting gel 3 migrate into the collecting gel 3 in the running direction 8 and arrange themselves in the order of their mobility. This stack of charged substance is transported at a constant electric field in the direction 8 with constant Wanderungsge speed to the edge of the subsequent separation gel 4 . At the transition into the close-knit separating gel 4 , the migration speed of the substance going over is reduced and the substance penetrating into the separating gel 4 is focused at the interface between the collecting gel 3 and the separating gel 4 . In separation gel 4 there is a further spatial separation of the individual substances in the direction of travel 8 depending on the net charge and the molecular size of the substances. In this way, separate concentration ranges 7 (so-called bands) of the separation products are achieved.
Trennt man Substanzgemische nach dem vorstehend geschilderten Verfahren, so entsteht in Laufrichtung 8 der geladenen Substanzen ein für das jeweilige Substanzgemisch charakteristisches Kontinuum. Schneidet man nach Fertigstellung des Elektrophoreseprozesses entlang eines Schnittbereichs 9 einen Streifen 10 aus dem Trenngel, so kann dieser Trenngelstreifen 10 für weitere Untersuchgungen verwendet werden.If mixtures of substances are separated using the method described above, a continuum which is characteristic of the respective mixture of substances is formed in the direction 8 of the charged substances. Is cut after completion of the electrophoresis process along a cutting portion 9 a strip 10 from the separating gel, this Trenngelstreifen 10 can be used for other investigators additions.
Werden bei dem vorstehend beschriebenen Elektrophoreseverfahren Hilfstoffe verwendet, die zum Erhalt der Wechselwirkung zwischen den geladenen Substanzen beitragen, so wird im Trenngelstreifen 10 ein Kontinuum von Substanzkomplexen abgebildet, dessen einzelne Konzentrationsbereiche 7 in einem weiteren Trennschritt, dem Trennschritt der nächst höheren Dimension, aufgetrennt werden können. Gemäß dem Stand der Technik wird dazu der Trenngelstreifen 10 mit einer der Schnittkanten 9 auf ein Trenngel 105 der nächst höheren Dimension aufgebracht und als Substanzquelle für diesen Trennprozess verwendet. Gemäß dem beschriebenen Verfahren der Elektrophorese werden dann aus dem Trenngelstreifen 10 die Konzentrationsbereiche 7 des Trennschrittes der ersten Dimension aus dem Trenngelstreifen 10 herausgelöst und entlang der Laufrichtung 108 aufgetrennt. Die Einzelbestandteile der Substanzkomplexe, die sich im ersten Trennschritt in den Bereichen 7 des Trenngels 4 konzentriert hatten sind nach der Durchführung des Trennschrittes der höheren Dimension in einem charakteristischen Kontinuum in den Bereichen 107 des Trenngels 105 konzentriert.If auxiliary substances are used in the electrophoresis method described above, which contribute to maintaining the interaction between the charged substances, a continuum of substance complexes is depicted in the separating gel strip 10 , the individual concentration ranges 7 of which can be separated in a further separation step, the separation step of the next higher dimension , According to the prior art, the separating gel strip 10 with one of the cut edges 9 is applied to a separating gel 105 of the next higher dimension and used as a substance source for this separating process. According to the described method of electrophoresis, the concentration regions 7 of the separation step of the first dimension are then separated out of the separating gel strip 10 from the separating gel strip 10 and separated along the running direction 108 . The individual components of the substance complexes, which had concentrated in the first separation step in the areas 7 of the separation gel 4 , are concentrated in the areas 107 of the separation gel 105 in a characteristic continuum after the separation step of the higher dimension.
Entgegen dem Stand der Technik führt die vorliegende Erfindung bei dem Trennprozess der höheren Dimension ein Sammelgel 103 ein, das zunächst auf das Trenngel 105 der höheren Dimension aufgebracht wird und auf welches dann der Trenngelstreifen 10 des Trennprozesses der ersten Dimension aufgebracht wird. Dazu werden die aufeinander treffenden Oberflächen des Trenngelstreifens 10 sowie die Oberfläche des Sammelgels 103 zunächst zum Beispiel mit einem fusselfreien Filterpapier sowie nachfolgend mit Druckluft getrocknet, so daß sie von jeglicher Restfeuchtigkeit befreit sind. Nachfolgend wird der Trenngelstreifen 10 auf das Sammelgel 103 luftblasenfrei aufgelegt, wodurch die beiden Geloberflächen durch Adhäsionskräft aneinander haften bleiben. Durch das Abtrocknen der aufeinander treffenden Oberflächen wird gewährleistet, daß an der Grenzfläche zwischen dem Trenngelstreifen 10 und dem Sammelgel 103 kein Phasensprung von der Gel- in die Flüssigphase auftritt, an dem bei der Durchführung der Elektrophorese die geladenen Substanzen aus der Substanzquelle 7 in ihrer linearen Bewegung in Laufrichtung 108 gestört werden könnten. Durch die erfindungsgemäße Einführung eines Sammelgels 103 im Trennverfahren der höheren Dimension wird die Trennschärfe dieses Trennschrittes sowie die Ergiebigkeit hinsichtlich der Substanzmenge in den Konzentrationsbereichen 107 des Trenngels 105 der höheren Dimension deutlich verbessert (Fig. 4b).Contrary to the prior art, the present invention introduces a collecting gel 103 in the separation process of the higher dimension, which is first applied to the separation gel 105 of the higher dimension and to which the separation gel strip 10 of the separation process of the first dimension is then applied. For this purpose, the surfaces of the separating gel strip 10 that meet one another and the surface of the collecting gel 103 are first dried, for example, with a lint-free filter paper and then with compressed air, so that they are freed of any residual moisture. Subsequently, the separating gel strip 10 is placed on the collecting gel 103 without air bubbles, as a result of which the two gel surfaces remain adhered to one another by adhesive forces. The drying of the surfaces meeting one another ensures that no phase jump occurs from the gel into the liquid phase at the interface between the separating gel strip 10 and the collecting gel 103 , on which the charged substances from the substance source 7 in their linear form occur when the electrophoresis is carried out Movement in the direction 108 could be disturbed. By introducing a collecting gel 103 according to the invention in the separation process of the higher dimension, the selectivity of this separation step and the yield with regard to the amount of substance in the concentration regions 107 of the separation gel 105 of the higher dimension are significantly improved ( FIG. 4b).
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das nach dem oben beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Gelsandwich bestehend aus Trenngelstreifen 10, Sammelgel 103 sowie Trenngel 105 nach dem Aufbringen des Trenngelstreifens 10 mit einer 0,5% Agaroselösung überschichtet, so daß die Kante der Grenzschicht zwischen Trenngelstreifen 10 und Sammelgel 103 von Agarose 104 umgeben ist und den Trenngelstreifen 10 auf dem Sammelgel 103 fixiert.In a further embodiment of the present invention, the gel sandwich produced by the above-described method of the present invention, consisting of separating gel strip 10 , collecting gel 103 and separating gel 105, is coated with a 0.5% agarose solution after application of the separating gel strip 10 , so that the edge of the boundary layer between separating gel strips 10 and collecting gel 103 is surrounded by agarose 104 and fixes the separating gel strip 10 on the collecting gel 103 .
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden vor dem Aufbringen des Trenngelstreifens 10 auf dem Sammelgel 203 die aufeinander treffenden Oberflächen des Trenngelstreifens 10 und des Sammelgels 203 getrocknet und mit einer Schicht 204 einer 0,5% Agaroselösung überschichtet, bevor der Trenngelstreifen 10 auf das Sammelgel 203 luftblasenfrei aufgelegt wird. Dies führt ebenfalls zu einer Fixierung des Trenngelstreifens 10 auf dem Sammelgel 203 und verhindert, daß durch Restfeuchtigkeit zwischen den Oberflächen des Trenngelstreifens 10 und des Sammelgels 203 Phasensprünge zwischen der Gel- und der Flüssigphase entstehen. Durch die Einführung eines Sammelgels 203 im Trennverfahren der höheren Dimension wird die Trennschärfe dieses Trennschrittes sowie die Ergiebigkeit hinsichtlich der Substanzmenge in den Konzentrationsbereichen 207 des Trenngels 205 der höheren Dimension deutlich verbessert (Fig. 4c).In a further embodiment of the present invention, before the separating gel strip 10 is applied to the collecting gel 203, the contacting surfaces of the separating gel strip 10 and the collecting gel 203 are dried and covered with a layer 204 of a 0.5% agarose solution before the separating gel strip 10 is applied to the collecting gel 203 is placed without air bubbles. This also leads to a fixation of the separating gel strip 10 on the collecting gel 203 and prevents phase jumps between the gel and the liquid phase due to residual moisture between the surfaces of the separating gel strip 10 and the collecting gel 203 . By introducing a collecting gel 203 in the separation process of the higher dimension, the selectivity of this separation step and the yield with regard to the amount of substance in the concentration regions 207 of the separation gel 205 of the higher dimension are significantly improved ( FIG. 4c).
Zur Herstellung von Polymergelen, die zur Auftrennung von Proteinen in einem Molekularmassenbereich von ca. 1000 bis 4 kDa verwendet werden, wird insbesondere eine Trenngel-Lösung von oben flüssig in ein Glas-Sandwich eingefüllt mit n-Butanol überschichtet und auspolymerisiert. Anschließend wird das n-Butanol abgegossen, die Trenngelkante mit Wasser gespült und nach dem Abgießen des Wassers das Restwasser mit Filterpapier gründlich abgetrocknet und mit Luft nachgeblasen. Jetzt wird die Sammelgel-Lösung von oben etwa 1,5 cm hoch eingefüllt mit n-Butanol überschichtet und auspolymerisiert. Abschließend wird n- Butanol entfernt, die Sammelgelkante mit Wasser gespült und das Gel/Glas Sandwich mit feuchten Filterpapier eingeschlagen. Das ganze wird in einer Plastiktüte über Nacht im Kühlschrank gelagert.For the production of polymer gels for the separation of proteins in one Molecular mass range from about 1000 to 4 kDa are used in particular, a separating gel solution is poured into a glass sandwich from above overlaid with n-butanol and polymerized. Then the n-butanol poured, the separating gel edge rinsed with water and after pouring the Water the residual water thoroughly dried with filter paper and with air nachgeblasen. Now the stacking gel solution is about 1.5 cm high from above filled with n-butanol, overlaid and polymerized. Finally n- Butanol removed, the collecting gel edge rinsed with water and the gel / glass Wrapped sandwich with damp filter paper. The whole is in one Plastic bag stored in the refrigerator overnight.
Am darauffolgenden Tag kann je nach verwendetem Puffersystem, die denaturierende und/oder die native Gelelektrophorese zur Trennung von Einzelproteinen und/oder von Proteinkomplexen durchgeführt werden.The following day, depending on the buffer system used, the denaturing and / or native gel electrophoresis for the separation of Single proteins and / or protein complexes can be carried out.
Zur Durchführung der nativen PAGE in der ersten Dimension wird ebenfalls ein Polyacrylamidgel hergestellt, das insbesondere aus einem Sammelgel (4% PPA [Arylamid/Bisacrylamid = 30/0.8], 500 mM ε-Aminocapronsäure, 50 mM Bis-Tris/HCl pH 7,0) und einem Trenngel (6-12% PAA [Acrylamid/Bisacrylamid = 30/0,8], 500 mM ε-Aminocapronsäure, 50 mM Bis-Tris/HCl pH 7,0) zusammengesetzt ist. Als Anodenpuffer dient eine Lösung bestehend aus 50 mM Bis-Tris/HCl pH 7.0; als Kathodenpuffer wird eine Lösung bestehend aus 50 mM Tricine, 15 mM Bis-Tris/HCl pH 7,0 und 0,02% (w/v) Serva blue G verwendet. Sammelgel und Trenngel der nativen PAGE weisen im Unterschied zur SDS-PAGE den gleichen pH-Wert und die gleiche Pufferstärke auf.To carry out the native PAGE in the first dimension is also a Polyacrylamide gel made, in particular from a stacking gel (4% PPA [Arylamide / bisacrylamide = 30 / 0.8], 500 mM ε-aminocaproic acid, 50 mM Bis-Tris / HCl pH 7.0) and a separating gel (6-12% PAA [acrylamide / bisacrylamide = 30 / 0.8], 500 mM ε-aminocaproic acid, 50 mM bis-Tris / HCl pH 7.0) is composed. As Anode buffer serves a solution consisting of 50 mM Bis-Tris / HCl pH 7.0; as Cathode buffer is a solution consisting of 50 mM Tricine, 15 mM Bis-Tris / HCl pH 7.0 and 0.02% (w / v) Serva blue G used. Collection gel and separation gel of the In contrast to SDS-PAGE, native PAGE have the same pH and same buffer strength.
Vor dem Auftrag auf das native Polyacrylamidgel (nPAG) werden die in 60 µl ACA- Puffer resuspendierten Proben (750 mM ε-Aminocapronsäure, 50 mM Bis-Tris/HCL pH 7.0, 0.5 mM EDTA) mit 5 µl DM (10% [w/v] in ddH2O) solubilisiert. Die Lösung wird anschließend mit 5 µl einer Lösung, bestehend aus 5% (w/v) Serva blue G und 750 mM ε-Aminocapronsäure, gemischt. Die Proben werden in die Taschen des Sammelgels pipettiert und eine Spannung von 150 V angelegt, solange sich die Proben noch im Sammelgel befinden. Wenn die Proben in das Trenngel eingewandert sind, wird die Spannung auf 500-1000 V erhöht. Alternativ wird solange sich die Proben noch im Sammelgel befinden, eine Spannung von 500 V pro Gel bei 12 mA angelegt. Wenn die Proben in das Trenngel eingewandert sind, wird die Spannung bei weiterhin 12 mA alle 30 min in 100 V Schritten von 500 auf 1.200 V erhöht. Nachdem die Serva blue G-Lauffront etwa die Hälfte des Trenngels erreicht hat, wird der Kathodenpuffer gegen einen ungefärbten Kathodenpuffer gleicher Zusammensetzung ohne Serva blue G ersetzt. Alle verwendeten Materialien werden auf 4°C gekühlt. Der Gellauf erfolgt unter Kühlung bei konstant 4 und/oder 6 und/oder 10°C. Die angegbenen Spannungen beziehen sich auf 1 Gel der Größe 20 × 20 × 0,075 cm3.Before application to the native polyacrylamide gel (nPAG), the samples resuspended in 60 µl ACA buffer (750 mM ε-aminocaproic acid, 50 mM Bis-Tris / HCL pH 7.0, 0.5 mM EDTA) are mixed with 5 µl DM (10% [w / v] solubilized in ddH 2 O). The solution is then mixed with 5 ul of a solution consisting of 5% (w / v) Serva blue G and 750 mM ε-aminocaproic acid. The samples are pipetted into the pockets of the collection gel and a voltage of 150 V is applied as long as the samples are still in the collection gel. When the samples have migrated into the separating gel, the voltage is increased to 500-1000 V. Alternatively, as long as the samples are still in the bulk gel, a voltage of 500 V per gel at 12 mA is applied. When the samples have migrated into the separating gel, the voltage is increased from 500 to 1,200 V in 30 V steps every 30 min at a constant 12 mA. After the Serva blue G barrel front has reached about half of the separating gel, the cathode buffer is replaced by an undyed cathode buffer of the same composition without Serva blue G. All materials used are cooled to 4 ° C. The gel run takes place with cooling at a constant 4 and / or 6 and / or 10 ° C. The stated voltages relate to 1 gel measuring 20 × 20 × 0.075 cm 3 .
Nach Beendigung des Gellaufs der nativen PAGE (erste Dimension) werden die einzelnen Auftragsspuren in Trennrichtung des Gels mit einem scharfen Skalpell ausgeschnitten und insbesondere in Solubilisierungspuffer (2% SDS [v/v], 66 mM DTT, 66 mM Na2CO3) für 20 min bei RT unter Schütteln und/oder 5 min bei 50°C unter Schütteln im Solubilisierungspuffer inkubiert. Jeder Gelstreifen wird anschließend auf ein vorgefertigtes SDS-PAGE mit einer Dicke von 1 mm aufgelegt. Die Trennung der Proteine erfolgt wie beschrieben in der Gegenwart von Laufpuffer bei 15°C und 40 mA/Gel (20 × 20 × 1 mm3). Alternativ laufen die Gele bei 15°C über Nacht nach folgendem Schema: Beim Durchwandern des Trenngels (ca. 30 min) wird eine Spannung von 30 mA/Gel, über Nacht (ca. 12 h) 7 mA/Gel angelegt und am nächsten Tag bis zum vollständigen Durchlaufen des Trenngels (ca. 2 h) 20 mA/ Gel angelegt. Der Laufpuffer wird in den Kathoden und den Anoden-Puffertank oberhalb und unterhalb des Sammelgels und des Trenngels eingefüllt und steht in direktem Kontakt mit dem Gel/Glas Sandwich.After completion of the gel run of the native PAGE (first dimension), the individual traces of application are cut out in the separation direction of the gel with a sharp scalpel and in particular in solubilization buffer (2% SDS [v / v], 66 mM DTT, 66 mM Na 2 CO 3 ) for Incubate 20 min at RT with shaking and / or 5 min at 50 ° C with shaking in the solubilization buffer. Each gel strip is then placed on a prefabricated SDS-PAGE with a thickness of 1 mm. The proteins are separated as described in the presence of running buffer at 15 ° C. and 40 mA / gel (20 × 20 × 1 mm 3 ). Alternatively, the gels run at 15 ° C overnight according to the following scheme: When walking through the separating gel (approx. 30 min), a voltage of 30 mA / gel is applied, overnight (approx. 12 h) 7 mA / gel and the next day apply 20 mA / gel until the separating gel has completely run through (approx. 2 h). The running buffer is filled into the cathodes and the anode buffer tank above and below the collecting gel and the separating gel and is in direct contact with the gel / glass sandwich.
Claims (5)
dadurch gekennzeichnet,
daß vor dem Aufbringen des Gelstreifens (10) auf das Trenngel (105) der höheren Dimension ein Sammelgel (103) auf das Trenngel (105) aufgebracht wird; und
daß vor dem Aufbringen des Gelstreifens (10) auf das Sammelgel (103) die aufeinander treffenden Oberflächen des Gelstreifens (10) und des Sammelgels (103) einem Trocknungsverfahren unterzogen werden.1. Multi-dimensional method for the separation of charged biological substances of different molecular weights, wherein a gel strip ( 10 ) with a continuum ( 7 ) of the previous dimension serves as a substrate source for the creation of the continuum ( 107 ) of a higher dimension, this gel strip ( 10 ) in the Plane of the higher dimension and orthogonal to the running direction ( 108 ) of the higher dimension is applied to a separating gel ( 105 ),
characterized by
in that before the gel strip ( 10 ) is applied to the separating gel ( 105 ) of the higher dimension, a collecting gel ( 103 ) is applied to the separating gel ( 105 ); and
that the mating surfaces of the gel strip (10) and the stacking gel (103) are subjected to a drying process prior to application of the gel strip (10) onto the stacking gel (103).
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