DE10114063A1 - Neue Pflanzengene und deren Verwendung zur Isolierung von konstitutiven oder induzierbaren Promotoren - Google Patents

Abstract

Beschrieben werden DNA-Sequenzen, die verschiedene Pflanzenproteine kodieren, u. a. ein Protein, dessen biologische Funktion einem mitochondrialen Carrier-Protein entspricht, ein Protein, dessen biologische Funktion einer Rezeptor-ähnlichen Proteinkinase entspricht, ein Protein, dessen biologische Funktion einem Transferrin Bindungs-Protein entspricht, ein Protein, dessen biologische Funktion einem Elongationsfaktor EF-2 entspricht, ein Protein, dessen biologische Funktion einer non-LTR Retroelement Reserve Transkriptase entspricht und ein Protein, dessen biologische Funktion einer Helikase entspricht. Beschrieben werden ferner Verwendungen dieser DNA-Sequenzen, vorzugsweise zur Isolierung von konstitutiven oder aerob bzw. anaerob induzierbaren Promotoren sowie Terminatoren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die ver­ schiedene Pflanzenproteine kodieren, u. a. ein Protein, dessen biologische Funktion einem mitochondrialen Carrier-Protein entspricht, ein Protein, dessen biologische Funktion einem Transferrin Bindungs-Protein entspricht, ein Protein, dessen biologische Funktion einer Rezeptor-ähnlichen Proteinkinase entspricht, ein Protein, dessen biologische Funktion einem Elongationsfaktor EF-2 entspricht, ein Protein, dessen biolo­ gische Funktion einer non-LTR Retroelement Reverse Transkrip­ tase entspricht und ein Protein, dessen biologische Funktion einer Helikase entspricht. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem verschiedene Verwendungen dieser DNA-Sequenzen, vor­ zugsweise zur Isolierung von Promotoren (konstitutive, aerob oder anaerob induzierbare) und Terminatoren.

Bislang standen zur Fremdgenexpression in Nutzpflanzen wie Kartoffel lediglich wenige kartoffeleigene Promotoren und Terminatoren zur Verfügung, die ferner eine Reihe von Nachtei­ len aufweisen, z. B. hinsichtlich Induzierbarkeit und/oder Stärke der Genexpression. Zur Fremdgenexpression in Kartoffeln werden bisher allerdings hauptsächlich heterologe Promotoren und Terminatoren verwendet, die ebenfalls meist nachteilige Eigenschaften aufweisen. So ist z. B. der anaerob induzierbare Mais GapC4-Promotor unter anaeroben Bedingungen schwächer im Vergleich zum CaMV 35S Promotor unter aeroben Bedingungen. Außerdem wird er auch durch Pathogenbefall induziert.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, neue kartoffeleigene Promotoren und Terminatoren bereitzustellen, die vorzugsweise die vorstehenden Nachteile nicht aufweisen.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereit­ stellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Aus­ führungsformen erzielt. Es wurde in den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten, insbesondere mittels der Methode des Differential Display (DD), nach neuen anaerob induzierbaren knollenspezifischen Genen gesucht. Dabei wurden sowohl neue anaerob bzw. aerob induzierbare knollenspezifische Gene als auch neue Gene gefunden, die konstitutiv exprimiert werden. Ausgehend von den gefundenen neuen Genen können deren Promotoren und Terminatoren identifiziert werden, die sich vor allem zur Produktion von gewünschten Proteinen in Pflanzen, vorzugsweise Kartoffelpflanzen, eignen sollten, wobei - je nach Art des Promotors und des gewünschten Zwecks - die Ex­ pression konstitutiv oder aerob bzw. anaerob induzierbar er­ folgen kann. Dabei verspricht die Verwendung homologer Pro­ motoren und Terminatoren in Kartoffel eine höhere Funktions­ wahrscheinlichkeit als die Verwendung heterologer Promotoren und Terminatoren in Kartoffel. Durch die Verwendung der neuen homologen Promotoren und Terminatoren in Kartoffel kann eine höhere Fremdgenexpression, bessere Gewebespezifität bzw. bes­ sere Induzierbarkeit erreicht werden. Ferner kann die Verwen­ dung der so gewonnenen Promotoren und Terminatoren auch in anderen Organismen, insbesondere in Pflanzen, zu einer höheren Fremdgenexpression, besseren Gewebespezifität bzw. besseren Induzierbarkeit führen. Die Promotoren und Terminatoren können z. B. in Kartoffel nicht nur zur Steuerung der Fremdgenexpres­ sion sondern auch zur Steuerung der Expression kartoffeleige­ ner Gene benutzt werden. Außerdem können RNA-Steuerelemente, die nicht translatiert werden, z. B. Antisense-RNA oder Ribozy­ me, transkribiert werden, und so effizient die Expression eines gewünschten Gens blockiert werden. Die Transkription kann konstitutiv, gewebespezifisch oder induzierbar erfolgen. Ferner kann die Transkription in anderen Organismen durch diese Promotoren und Terminatoren gesteuert werden. Mit Hilfe der Sequenz der neuen Gene und deren nicht transkribierten sowie nicht translatierten Bereichen können außerdem Informa­ tionen zur Verbesserung oder Veränderung anderer Gene, Pro­ motoren und Terminatoren durch Modifikation derselben, Modifi­ kationen anderer oder durch Kombinationen mit anderen Elemen­ ten gewonnen werden. Die Identifizierung von anaerob induzier­ ten Genen kann darüber hinaus dazu benutzt werden, transgene Pflanzen mit veränderten Eigenschaften bezüglich Anaerobiose, z. B. Überflutungstoleranz, durch Überexpression oder Repres­ sion der gefundenen Gene zu erzeugen. Schließlich kann z. B. das Gen, das den Elongationsfaktor EF-2 kodiert, zur Verände­ rung des Translationsprofils einer Pflanze und somit zur ge­ zielten posttranskriptionellen Regulation der pflanzlichen Genexpression verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA-Se­ quenz, die eines der folgenden Pflanzenproteine kodiert:

• a) ein Protein, dessen biologische Funktion einem mito­ chondrialen Carrier-Protein entspricht und das die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
• b) ein Protein, dessen biologische Funktion einem Trans­ ferrin Bindungs-Protein entspricht und das die in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
• c) eine Protein, dessen biologische Funktion einer Re­ zeptor-ähnlichen Proteinkinase entspricht und das die in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
• d) ein Protein, dessen biologische Funktion einem Elon­ gationsfaktor EF-2 entspricht und das die in Fig. 4 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
• e) ein Protein, dessen biologische Funktion einer non- LTR Retroelement Reverse Transkriptase entspricht und das die in Fig. 5 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; oder
• f) ein Protein, dessen biologische Funktion einer Heli­ kase entspricht und das die in Fig. 6 gezeigte Aminosäurese­ quenz aufweist.

Vorzugsweise umfaßt diese DNA-Sequenz den kodierenden Bereich einer in Fig. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 gezeigten DNA-Sequenz.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit den vorstehend erwähnten biologischen Eigenschaften kodiert und die sich von der vorstehenden DNA- Sequenz in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, die mit den vorstehenden DNA- Sequenzen hybridisiert, die zu dem kodierenden Bereich der DNA-Sequenz von Fig. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 eine Homologie von mindestens 75%, vorzugsweise 85%, stärker bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% aufweist, oder die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der vorstehenden DNA-Sequenzen ist.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridi­ sieren" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedin­ gungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, bei denen als Lösung 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet wird und/oder die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts- Lösung siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Va­ riante" oder "Fragment" umfassen DNA-Sequenzen, die sich ge­ genüber den in Fig. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 angegebenen Sequen­ zen durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment der ursprünglichen DNA-Sequenz umfassen, wobei das durch diese DNA-Sequenzen kodierte Protein noch die biologischen Eigenschaften des ursprünglichen Pro­ teins aufweist und in Pflanzen biologisch aktiv ist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vor­ stehenden Änderungen in der DNA-Sequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrie­ ben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so ver­ änderten Nukleinsäuresequenz kodiertes Protein noch über die ursprünglichen biologischen Eigenschaften verfügt, z. B. mit­ tels der nachstehenden Assays. Für diese eignet es sich das Protein als Fusionsprotein mit N-terminalem Thioredoxin und C- terminalem His-Tag mit Hilfe des Kits pBAD/TOPO® ThioFusion™ Expression System von Invitrogen (Groningen, NL) in E. coli Zellen zu exprimieren und über eine Ni-NTA-Säule zu reinigen (QIAexpress, Qiagen, Hilden).

Aktivitätsassay für das mitochondriale Carrierprotein

Der funktionelle Nachweis als mitochondriales Carrierprotein erfolgt durch Rekonstituitonsstudien an Liposomen nach Stan­ dardbedingungen unter Berücksichtigung verschiedener Substrate (siehe Palmieri et al. (1999) FEBS Letters 462: 472-476). Zu­ erst werden 10 ng gereinigtes überexprimiertes Protein in Liposomen rekonstituiert. Externes Substrat der Liposomen werden von den Proteoliposomen über eine Sephadex G-75 Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) mit 50 mM NaCl, 10 mM PIPES, pH 7,0 entfernt. Der Transport wird dann bei 25°C durch die Zugabe von radioaktivem Substrat [³H] Carni­ tin (Amersham) gestartet. In Kontrollreaktionen werden gleich­ zeitig Inhibitoren dazugegeben. Nach 60 min wird die Reaktion durch Zugabe von 40 mM Pyridoxal-5'-Phosphat und 15 mM Batho­ phenanthrolin gestoppt, die überschüssige Radioaktivität über eine Sephadex G-75 Säule entfernt und die in die Liposomen integrierte Radioaktivität bestimmt. Die Transportaktivtät leitet sich dann aus dem Verhältnis von eingesetzter Radio­ aktivität zu eingebauter Radioaktivität ab.

Aktivitätsassay für das Transferrin bindende Protein

Die Bindung von Transferrin bindenden Proteinen kann mit Hilfe eines kompetitiven Transferrin-Bindungs-Assay durchgeführt werden. Dazu wird eine Immunolon II Mikrotiterplatte (Dynatech Laboratories, Chantilly, VI, USA) zunächst mit Transferrin durch Inkubation mit jeweils 400 µl 50 µg/ml Transferrin (Sig­ ma, Deisenhofen) in Coating-Puffer (50 mM NaHCO₃, pH 9,6) bei 4°C über Nacht beladen. Anschließend wird die Platte dreifach mit jeweils 400 µl Coating-Puffer ohne Transferrin gewaschen, mit jeweils 400 µl 0,5% Gelatine in TBS-Tween (15 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Tween 80, pH 8,0) eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt und dreifach mit jeweils 400 µl TBS-Tween gewaschen. Mehrere Verdünnungsstufen der in E. coli überexprimierten und aufgereinigten Transferrin bindenden Proteins in jeweils 100 µl 0,5% Gelatine in TBS-Tween werden für eine Stunde in der mit Transferrin beladenen Platte inkubiert. Daraufhin wird die Platte mit 400 µl 0,5% Gelatine in TBS-Tween gewaschen, 100 µl biotinyliertes TfbA (Strutzberg et al. (1995) Infection and Immunity 63, 3846-3850) für eine Stunde hinzugegeben und wie­ derum mit 400 µl 0,5% Gelatine in TBS-Tween gewaschen. Die Detektion des biotinylierten TfbA erfolgt photometrisch bei 405 nm wie bei Strutzberg et al. (1995) beschrieben. Zum Ver­ gleich wird eine Eichreihe mit nicht biotinylierten TfbA er­ stellt, um daraus die spezifische Bindungsaktivität des Trans­ ferrin bindenden Proteins zu ermitteln.

Aktivitätsassay für die Rezeptor Protein Kinase

10 ng der in E. coli überexprimierten und aufgereinigten Re­ zeptor Protein Kinase wird einmal mit und einmal ohne 10 ng GST (Glutathion S-Transferase, Sigma, Deisenhofen) in 15 µl 50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 10 µCi [γ-³²P]ATP (6000 Ci mmol^-1), 20 µM ATP, 1 mM DTT, 10 mM MnCl₂ bei 30°C für 60 min inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 35 µl eiskaltem 10% (v/v) TCA gestoppt. Die Proteine werden durch Zentrifugation sedi­ mentiert, das Pellet wird mit 50 µl eiskaltem 10% (v/v) TCA gewaschen und anschließend in 4 µl 1 M Tris und 5 µl 2 × SDS Probenpuffer (Bio-Rad, München) resuspendiert. Die Probe wird auf ein 10%iges Polyacrylamidgel geladen und bei einer Strom­ stärke von 15 mA aufgetrennt. Zunächst wird das Gel durch Coomassie gefärbt, um den Auftrag vergleichbarer Mengen zu überprüfen. Anschließend wird das Gel getrocknet und ein Auto­ radiogramm mit einem Röntgenfilm bei Raumtemperatur angefer­ tigt. Die Intensität der Banden wird in einem Imaging System Fluor-S-Max (Bio-Rad) quantifiziert. Kinaseaktivität wird durch Autophosphorylierung der Rezeptor Protein Kinase in der Probe ohne GST sowie durch Phosphorylierung der GST und Auto­ phosphorylierung der Rezeptor Protein Kinase in der Probe mit GST nachgewiesen (von der Knaap et al. (1999) Plant Physiology 120: 559-569).

Aktivitätsassay für den Elongationsfaktor 2

Um die Funktion als Elongationsfaktor-2 zu zeigen, werden Aktivitäsassays nach Rekonstitition von überexprimierten EF-2 in funktionelle 80 S Ribosomen unter Standardbeingungen durch­ geführt. Die GTP-Bindung wird über den Einbau und Hydrolyse von GTP bestimmt wie bei Rao und Bodley ((1996) Protein Expe­ rimental Purification 8: 91-96) beschrieben. Als Alternative hierzu kann radioaktiv markiertes EF-2 in aktive 80 S Riboso­ men eingebaut und nachgewiesen werden (siehe Nygard et al. (1987) Biochim Biophys Acta 910: 245-253). Die Herstellung solcher Produkte sind dem Fachmann bekannt.

Aktivitätsassay für die Reverse Transkriptase

10 ng der in E. coli überexprimierten und aufgereinigten Re­ versen Transkriptase werden in 50 µl 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 30 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ in Anwesenheit von jeweils 100 µM dATP, dGTP, dCTP und 5 µCi [α-³²P]dTTP (3000 Ci mmol^-1) sowie 5 µM synthetischer RNA (5'-GUACGGACCG UUAGCAGAUA GGCGUACAGU CCGCU- AGGGC GAUUAGCGCC GGAUAUCGGC AUGUACUCGA UCG-3', Metablon, Pla­ negg-Martinsried) und 10 µM DNA-Primer (5'-CGATCGAGTAC-3', Metablon) 60 min bei 30°C inkubiert. Als Negativkontrolle wird ein Probe ohne Reverse Transkriptase angesetzt. Jeweils 10 µl der Reaktionsansätze werden auf einem 15%iges Polyacrylamid­ gel bei einer Stromstärke von 30 mA aufgetrennt. Das Gel wird getrocknet und ein Autoradiogramm mit einem Röntgenfilm bei Raumtemperatur angefertigt. Die Aktivität der Reversen Trans­ kriptase ist in der Probe mit Reverser Transkriptase durch eine Bande markierter DNA im Vergleich zur Negativkontrolle nachgewiesen (Lanford et al. (1999) Journal of Virology 73: 1885-1893).

Aktivitätsassay für die Helikase

Zunächst werden zu dem Plasmid pUC19 komplementäre Oligodesox­ yribonukleotide mit Längen von 10 nt, 30 nt, 100 nt und 300 nt synthetisiert (Metablon, Planegg-Martinsried) und anschließend mittels Standardprotokoll (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) durch T4 Polynukleotid- Kinase und [γ-³²P]ATP an ihren 5'-Enden markiert. 1 µg pUC19 Plasmid-DNA werden in 25 µl 100 mM Hepes, pH 7,6, 2 mM DTT, 0,2 mg/ml BSA und 14 mM MgCl₂ gelöst, 5 min bei 99°C denatu­ riert und auf Eis gestellt. Dazu werden 10 ng der in E. coli überexprimierten und aufgereinigten Helikase, 4 mM ATP, 1 µM der markierten Olignukleotide sowie H₂O bis zu einem Gesamtvo­ lumen von 50 µl gegeben. Als Negativkontrolle wird eine Probe ohne Helikase angesetzt. Die Reaktion wird 30 min bei 30°C durchgeführt und mittels Zugabe von 5 µl Stoppuffer (200 mM EDTA, 1% SDS, 20% Glyzerin, Bromphenolblau gesättigt) abge­ stoppt. Die Reaktionsprodukte werden auf ein nicht denaturie­ rendes 15%iges Polyacrylamidgel aufgetragen. Als Positivkon­ trolle wird ein Reaktionsansatz, der vorher durch eine 5minü­ tige Hitzebehandlung bei 99°C denaturiert worden ist, ebenfalls mit aufgetragen. Bei einer Stromstärke von 30 mA werden die Fragmente aufgetrennt. Das Gel wird getrocknet und ein Auto­ radiogramm mit einem Röntgenfilm bei Raumtemperatur angefer­ tigt. Während die Spur mit der Positivkontrolle alle und die Spur mit der Negativkontrolle keine markierten Fragmente zeigt, werden in der Probenspur die Fragmente sichtbar, die durch die Aktivität der Helikase vom Plasmid-DNA-Strang gelöst worden sind (Chong et al. (2000) PNAS 97: 1530-1535).

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind für verschiedene Zwecke von Nutzen. So können sie zur rekombinanten Herstellung des jeweiligen Proteins für Analysezwecke, zur weiteren Cha­ rakterisierung oder auch zum Schutz von Pflanzen vor bestimm­ ten schädlichen Einflüssen verwendet werden. Sie können dar­ über hinaus als Hybridisierungs-Sonden zur Identifizierung neuer, verwandter DNA-Sequenzen dienen oder als Informations­ quelle zur Entwicklung von PCR-Primern. Schließlich können sie zur Erzeugung von anti-Protein-Antikörpern, beispielsweise mittels DNA-Immunisierungsverfahren, und als Antigen zur Er­ zeugung von anti-DNA-Antikörpern verwendet werden.

Es ist vorstellbar, daß in bestimmten Fällen oder unter be­ stimmten Bedingungen eine reduzierte Aktivität und/oder Kon­ zentration der erfindungsgemäßen Proteine wünschenswert ist. Beispielsweise kann eine Reduktion der Rezeptor-ähnlichen Proteinkinase zu einem veränderten Phänotyp in einer Pflanze führen. Insbesondere kann eine Reduktion von HAESA bei Arabi­ dopsis thaliana zu einem verspäteten Abwurf verwelkter Blüten­ organe (Jinn, T.-L., Stone, H. M, und Walker, J. C. (2000, Gen. Dev. 14: 108-117) und die Reprimierung von OsBR11 in Reis zu einem reduzierten Strecken der Internodien (Yamamuro, C. Iha­ ra, Y., Wu, X., Noguchi, T., Fujioka, S., Takatsuot, S., Ashi­ kari, M. und Matsuoka, M. (2000), Plant Cell 12: 1591-1606) führen. Auch kann eine Reduktion des Elongationsfaktors EF2 unter anaeroben Bedingungen, wie sie z. B. in kurzen Phasen der Überflutung von Feldern auftritt, zu einer verminderten Translation führen. Dadurch wird unter diesen Bedingungen der Stoffwechsel herunterreguliert, so daß der Energiebedarf ver­ mindert und der Kohlehydratgehalt der Knolle erhalten bleibt. Die Reduktion der erfindungsgemäßen Proteine kann z. B. durch die Erniedrigung oder Hemmung der Expression der erfindungs­ gemäßen DNA-Sequenzen erreicht werden. Daher betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Antisense-RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen komplementär ist und an die davon translatierte mRNA spezifisch binden kann und die Synthese eines von diesen DNA-Sequenzen kodierten Proteins oder eines damit verwandten Proteins verringern oder hemmen kann, und ein Ribozym, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen komplementär ist und an die von diesen DNA-Sequenzen transkribierte mRNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen kodierten Proteins ebenfalls verringert oder gehemmt wird. Vorzugsweise sind diese Antisense-RNAs und Ribozyme zu einer kodierenden Region der mRNA komplementär. Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den offenbarten DNA-Sequenzen, geeignete Antisense-RNAs herzustellen und an­ zuwenden. Geeignete Vorgehensweisen sind beispielsweise in EB- B1 0 223 399 oder EP-A1 0 458 beschrieben. Ribozyme sind RNA- Enzyme und bestehen aus einem einzelnen RNA-Strang. Diese können andere RNAs intermolekular spalten, beispielsweise die von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen transkribierten mRNAs. Diese Ribozyme müssen prinzipiell über zwei Domänen verfügen, (1) eine katalytische Domäne und, (2) eine Domäne, die zu der Ziel-RNA komplementär ist und an diese binden kann, was die Voraussetzung für eine Spaltung der Ziel-RNA ist. Ausgehend von in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen ist es inzwischen möglich, spezifische Ribozyme zu konstruieren, die eine gewünschte RNA an einer bestimmten, vorgewählten Stelle schneiden (siehe beispielsweise Tanner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426). Vorzugsweise hybridisieren die vorstehenden Ribozyme oder Antisense-RNAs über einen Bereich von mindestens 15, mehr bevorzugt mindestens 25 und am meisten bevorzugt mindestens 50 Basen mit der von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen trans­ kribierten mRNA.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. die die vorstehend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme kodierenden DNAs können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA- Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen im Vektor mit regulatori­ schen Elementen funktionell verknüpft, die deren Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replika­ tionsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryoten, beispielsweise E. coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7- Promotor, und für die Expression in Eukaryoten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zel­ len. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Me­ tallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E. coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevor­ zugt ist. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vekto­ ren zählen pY100 und Ycpad1, für die Expression in Säuger­ zellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4. Zu den erfin­ dungsgemäßen Expressionsvektoren zählen auch von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen, beispielsweise pAcSGHisNT-A.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemä­ ßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Diese Vektoren kön­ nen weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisie­ rung der Vektoren im Wirtsorganismus bewirken, wie einen bak­ teriellen Replikationsursprung oder die 2-Mikron-DNA zur Sta­ bilisation in Saccharomyces cerevisiae. Ferner können "left border"- und "right border"-Sequenzen agrobakterieller T-DNA enthalten sein, wodurch eine stabile Integration in das Erb­ gut von Pflanzen ermöglicht wird. Ferner kann eine Termina­ tionssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription und der Addition einer Poly-A-Sequenz an das Transkript dient. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar.

Zur Vorbereitung der Einführung der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184, etc. Das Fremdgen kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert, wodurch das Plasmid erhal­ ten wird. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewon­ nenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologi­ sche Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente können mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Se­ quenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Für die Einführung der DNA, z. B. in eine pflanzliche Wirts­ zelle, stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzel­ len werden an sich keine speziellen Anforderungen an die ver­ wendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide, z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, sollte ein selektierbarer Marker vorhanden sein. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid ver­ wendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, ist es günstig, die einzuführende DNA in spezielle Plasmide zu klo­ nieren, insbesondere in einen intermediären oder in einen bi­ nären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobak­ terien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vekto­ ren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig trans­ formierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflan­ zenzellen verwendet.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial, z. B. Blattstücke, Stengelsegmen­ te, Wurzeln, Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflan­ zenzellen können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der einge­ führten DNA untersucht werden. Alternative Systeme zur Trans­ formation von Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzier­ te DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von par­ tiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Po­ trykus, Physiol. Plant (1990), 269-273). Während die Trans­ formation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels auf Agrobacterium basierenden Vektoren zugänglich sind.

Bei den geeigneten Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflan­ zen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Gramineen, Chenopodien, Leguminosen, Brassicaceen, Solanaceen, Algen, Moose und Pilze, noch mehr bevorzugt um Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Raps, Senf, Rübsen, Flax, Erbse, Bohne, Lupine, Tabak und Kartoffel. Die für die Expression des gewünschten Proteins gewünschten Pflanzenteile betreffen prinzipiell jedes beliebige Pflanzen­ teil, jedenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte dieser Pflanzen, z. B. Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlin­ ge, Stecklinge, etc.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA so in einen Vektor inseriert werden, daß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispielsweise in Form eines Fusionsproteins, z. B. mit einem His-Tag zur Erleichterung der Reinigung nach rekombinanter Herstellung, exprimiert werden können.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend be­ schriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9- Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirts­ zellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Ver­ wendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein von einer erfin­ dungsgemäßen DNA-Sequenz kodiertes Protein bzw. ein Protein mit dessen biologischer Aktivität sowie Verfahren zu deren rekombinanten Herstellung unter Verwendung der erfindungs­ gemäßen Expressionsvektoren. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirts­ zellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugsweise stabile Expres­ sion), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Dem Fachmann sind Bedingungen bekannt, trans­ formierte bzw. transfizierte Wirtszellen zu kultivieren. Ge­ eignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chro­ matographie, Affinitätschromatographie, Immunoaffinitätschro­ matographie, HPLC etc.) sind ebenfalls allgemein bekannt. Ein erfindungsgemäßes Protein bzw. ein damit verwandtes Protein ist nicht nur bei den vorstehend bzw. nachstehend beschriebe­ nen Maßnahmen von Nutzen, sondern kann beispielsweise auch in biologischen Assays hinsichtlich einer Aktivitätsbestimmung Verwendung finden, beispielsweise in Kombination mit einer Vielzahl von weiteren Proteinen für ein "high-throughput"- Screenen. Darüber hinaus kann es z. B. zur Erzeugung von Anti­ körpern nützlich sein, als Reagens (beispielsweise in markier­ ter Form) in kompetitiven Assays zur quantitativen Bestimmung des Proteins in. Pflanzen, als Marker für Pflanzenteile, in denen das entsprechende Protein bevorzugt erzeugt wird (entwe­ der konstitutiv oder während eines bestimmten Stadiums hin­ sichtlich der Gewebedifferenzierung etc.), und außerdem zur Isolierung von interagierenden Proteinen. Schließlich kann ein erfindungsgemäßes Protein bzw. ein damit verwandtes Protein auch zur Isolierung von Inhibitoren, Antagonisten oder Ago­ nisten verwendet werden, wobei es sich beispielsweise um Pep­ tide oder sonstige kleine Moleküle handeln kann.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Er­ findung betrifft Antikörper, die gegen ein vorstehend be­ schriebenes erfindungsgemäßes Protein gerichtet sind. Diese Antikörper können monoklonale, polyklonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoklonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Anti­ körper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfin­ dungsgemäßen Antikörpern um monoklonale Antikörper. Die erfin­ dungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren her­ gestellt werden, wobei vorzugsweise ein von den erfindungs­ gemäßen DNA-Sequenzen kodiertes Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Die erfin­ dungsgemäßen Antikörper können beispielsweise auch zur Immun­ präzipitation eines erfindungsgemäßen Proteins, zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken etc. verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoklonalen Antikörper er­ zeugt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, eines erfindungsgemäßen Ribo­ zyms bzw. Antisense-RNA, eines erfindungsgemäßen Expressions­ vektors, eines erfindunsgemäßen Proteins oder eines Antikör­ pers zur Erzeugung einer Pflanze, vorzugsweise Kartoffelpflan­ ze mit veränderten Eigenschaften, die vorzugsweise unter ana­ eroben Bedingungen wirksam werden.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder eines Fragments, vorzugs­ weise mit einer Länge von mindestens 15 nt als Sonde oder PCR- Primer, zum Screenen nach vorzugsweise konstitutiven, knollen­ spezifischen, aerob oder anaerob induzierbaren oder anaerob induzierbaren Promotoren bzw. Terminatoren. Die so isolierten Promotoren bzw. Terminatoren sind für eine Reihe von Anwendun­ gen nützlich, wie sie bereits vorstehend diskutiert wurden, z. B. zur Expression eines gewünschten Fremdgens in einer Pflanze, vorzugsweise Kartoffelpflanze, unter entweder nicht­ induzierbaren oder induzierbaren Bedingungen. Verfahren zum Screenen nach solchen Steuerelementen, z. B. in einer genom­ ischen Kartoffelbank, und zu deren Identifizierung sind dem Fachmann bekannt und auch u. a. in dem nachstehenden Beispiel 2 beschrieben. Verfahren zur Bestimmung der relevanten Sequenzen eines isolierten Promotors bzw. Terminators sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und dazu zählen z. B. die Erzeugung von Dele­ tionsmutanten in vitro, bei denen schrittweise am 5'- bzw. 3'- Ende Sequenzen entfernt werden, um so die für die Aktivität des Promotors/Terminators verantwortliche DNA-Sequenz ein­ grenzen zu können.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder einen vorstehend be­ schriebenen Antikörper enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können die DNA-Sequenz bzw. der Antikör­ per immobilisiert sein. Der Antikörper kann beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger ge­ bunden werden. Dabei kann der Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungs­ verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immu­ nassays sind ELISA und RIA.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 DNA-Sequenz des Fragments 15-1 und abgeleitete Amino­ säuresequenz
Die biologische Funktion des davon kodierten Proteins ent­ spricht der eines mitochondrialen Carrier-Proteins. Weitere Homologien des längsten Leserasters: TC57459 (Tomate, unbe­ kanntes Protein), TC93200 (Arabidopsis, unbekanntes Protein).

Fig. 2 DNA-Sequenz des Fragments 15-2 und abgeleitete Amino­ säuresequenz
Die biologische Funktion des davon kodierten Proteins ent­ spricht einem Transferrin Bindungs-Protein. Gefundene höchste Homologien des längsten Leserasters: AI771120 (Tomate, hypo­ thetisches Protein), AW549368 (Tomate, vermutetes Protein), TC101033 (Arabidopsis, vermutetes Protein), TC94111 (Arabidop­ sis, hypothetisches Protein)

Fig. 3 DNA-Sequenz des Fragments 15-3 und abgeleitete Amino­ säuresequenz
Die biologische Funktion des davon kodierten Proteins ent­ spricht der eines Rezeptor-ähnlichen mitochondrialen Carrier- Proteins. Weitere Homologien des längsten Leserasters: BE922542 + BE919557 (Kartoffel, ESTs), NP00614 (Tomate, Hcr2- OA).

Fig. 4 DNA-Sequenz des Fragments 15-5 und abgeleitete Amino­ säuresequenz
Die biologische Funktion des davon kodierten Proteins ent­ spricht der des Elongationsfaktors EF-2.

Fig. 5 DNA-Sequenz des Fragments 15-6 und abgeleitete Amino­ säuresequenz
Die biologische. Funktion des davon kodierten Proteins ent­ spricht der einer non-LTR Retroelement Reverse Transkriptase. Weitere Homologien des längsten Leserasters: BE450381 (Tomate, EST).

Fig. 6 DNA-Sequenz des Fragments 15-7 und abgeleitete Amino­ säuresequenz
Die biologische Funktion des davon kodierten Proteins ent­ spricht der einer Helikase. Weitere Homologien des längsten Leserasters: BE924293 (Kartoffel, EST), AW218000 (Tomate, unbekanntes Protein), TC87605 (Arabidopsis, unbekanntes Pro­ tein).

Fig. 7 Ergebnisse der RT-PCR
Die Reaktionen wurden mit RNA aus Kartoffel (-: ohne cDNA, B: Blatt, C: Knolle, aerob, I: Knolle, anaerob) zum Nachweis der Genexpression von Fragment 15-1 (homolog zu einem mitochon­ drialen Carrier-Protein), Fragment 15-2 (homolog zu Trans­ ferrin Bindungs-Protein), 15-3 (homolog zu einer Rezeptor­ ähnlichen Proteinkinase), Fragment 15-5 (homolog zu EF-2), Fragment 15-6 (homolog zu einer non-LTR Retroelement Reverse Transkriptase) und Fragment 15-7 (homolog zu einer Helikase) durchgeführt. Alle Banden hatten die erwartete Größe und wur­ den ausgeschnitten, kloniert und durch Sequenzierung über­ prüft.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Gene der Fragmente 15-2, 15-5 und 15-6 in Kartoffelknollen anaerob induziert werden und folglich deren Promotoren zur anaeroben Induktion in Knollen verwendbar sind. Die Gene der Fragmente 15-1, 15-3 und 15-7 sind dagegen in Kartoffelblättern und aeroben Knol­ len aktiv. Deren Promotoren sind somit konstitutiv.

Fig. 8 Ergebnisse der genomischen PCR
Die Reaktionen zum Nachweis der Gene in Kartoffeln wurden mit genomischer DNA (-: ohne genomische DNA, +: mit genomischer DNA Kartoffel cv. Désirée) und genspezifischen Primern (P: Patatin als Kontrolle, 15-1, 15-2, 15-3, 15-5, 15-6 und 15-7) durchgeführt. Die Banden wurden ausgeschnitten, kloniert und durch Sequenzierung überprüft. Die obere Bande von 15-6 ent­ spricht einem Rearrangement von 15-6. In keinem Fall konnten Intronsequenzen nachgewiesen werden.

Fig. 9 Prinzip der inversen PCR (iPCR)
Genomische DNA wird mit dem Restriktionsenzym X verdaut. Die Enden der so generierten 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen werden daraufhin durch Ligation zusammengeführt und das Frag­ ment somit zirkularisiert. Inkubation mit Restriktionsenzym Y ergibt wieder ein lineares Fragment, aus dem die ursprüngliche flankierende Sequenz über die PCR-Primer A und B amplifiziert wird.

Fig. 10 Schematische Darstellung des Konstrukts der trans­ genen Kartoffellinie 2-13 für iPCR
RB: rechte Begrenzung; LB: linke Begrenzung der T-DNA. Außer­ dem sind die XbaI-Schnittstelle im Vektor und die BclI- Schnittstelle im GUS-Gen (90-95 nt), der Neomycin Phospho­ transferase (NPTII) Selektionsmarker, die Transkriptionsrich­ tungen (große Pfeile) und die Primerbindungsstellen (kleine Pfeile; GUS-L 77-58 nt, GUS-R 357-335 nt) eingezeichnet.

Fig. 11 Ergebnisse der iPCR
Spur 1: 1-kB-Leiter (Gibco BRL), Spuren 2 und 4: 20 µl eines 50 µl iPCR-Ansatzes mit genomischer DNA aus nichttransgenen Kontrollpflanzen (1 bzw. 2 µg genomischer DNA). Spuren 3 und 5: 20 µl eines iPCR-Ansatzes mit genomischer DNA aus Kartof­ felpflanzen mit dem GapC4-GUS-Konstrukt (1 bzw. 2 µg genom­ ischer DNA).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Identifizierung neuer z. T. aerob oder anaerob induzierbarer Kartoffelgene

Zur Identifizierung aerob oder anaerob induzierter Kartoffel­ knollengene wurden Kartoffelknollen aerob und anaerob inku­ biert. Daraufhin wurde aus den Knollen die Gesamt-RNA iso­ liert, die anschließend in cDNA transkribiert wurde. Daraus wurden mittels PCR Genfragmente amplifiziert, die mittels Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt (PAGE) und mittels Silberfärbung sichtbar gemacht wurden. Mögliche differentiell exprimierte Genfragmente wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels PCR reamplifiziert. Die Amplifikate wurden kloniert und sequenziert. Die Sequenzen wurden durch Homologieverglei­ che analysiert.

(A) Aerobe und anaerobe Inkubation von Kartoffelknollen

Für die anaerobe Inkubation wurde der Anaerocult-Kit der Firma Merck (Darmstadt, Deutschland) benutzt. Dieser besteht aus einem gasdichten Anaerobentopf und Anaerocult A, einem Kieselgel, das durch Befeuchtung Kohlendioxid abgibt und Sauerstoff bindet. Zusätzlich beinhaltet der Kit ein Teststäbchen, den Anaerotest, um die Anaerobiose zu kontrollieren. Anaerobe Bedingungen werden durch eine Umfärbung des Teststäbchens von blau nach weiß ange­ zeigt. Als Probenmaterial wurden Knollen der Kartoffelsorte Dési­ rée verwendet. Die Pflanzen waren im Gewächshaus in Töpfen her­ angezogen und die Knollen nach der Ernte ca. ein bis zwei Monate bei 4°C gelagert worden. Zur Inkubation wurden vier gewaschene ganze Knollen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 5 cm in den Anaerobentopf gelegt. Die Proben wurden 96 Stunden bei Raumtemperatur und Dunkelheit anaerob inkubiert. Als Referenz wurde eine gleiche Anzahl Knollen ebenfalls bei Raumtemperatur und Dunkelheit 96 Stunden aerob gelagert. Nach der Inkubation wurden die Knollen geschält, in Scheiben geschnitten und in flüs­ sigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden entweder direkt weiterverarbeitet oder bis zur späteren Verwendung bei -80°C gelagert.

(B) Isolierung von Gesamt-RNA aus Knollen

Das tiefgefrorene Knollenmaterial wurde mit einem Hammer zer­ kleinert und anschließend in flüssigem Stickstoff gemörsert. Pro Probe wurden 2 ml Material mit 4 ml Z6-Puffer (8 M Guanidium- Hydrochlorid, 20 mM MES, 20 mM EDTA gemischt. Die Einstellung des pH-Werts auf 7,5 erfolgte mit NaOH-Plätzchen. Direkt vor Gebrauch wurde der 26-Puffer mit 2-Mercaptoethanol (Endkonzen­ tration 50 mM) versetzt (Logeman et al. (1987) Anal. Biochem. 163, 16-20) gemischt. Die Proben wurden zur Abtrennung der Zelltrümmer 20 min bei 15000 × g und 4°C zentrifugiert. Die gesamten Nukleinsäuren wurden dann mit 1/10 Volumen 3 M NaAc (pH-Wert 4,8) und 0,8 Volumen eiskaltem Isopropanol gefällt. Nach 5 minütiger Inkubation auf Eis wurde 30 min bei 15 000 × g und 4°C zentrifu­ giert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 2 ml 80%igem Ethanol gewaschen, 15 min bei 15 000 × g und 4°C zentrifu­ giert und anschließend 10 min bei Raumtemperatur getrocknet. Die weiteren Schritte zur Reinigung der RNA wurden nach dem Protokoll und mit den Lösungen aus dem Qiagen RNA/DNA "Midi Kit" (Hilden, Deutschland) durchgeführt. Das resultierende RNA-Pellet wurde in 300 µl RNase-freiem Wasser resuspendiert. Die RNA-Konzentrationen der einzelnen Proben wurden photometrisch bestimmt. Die RNA wurde entweder gleich weiter verwendet oder bei -20°C eingefroren.

(C) Erststrang cDNA-Synthese aus Gesamt-RNA

Für die cDNA-Synthese wurden 2 µg Gesamt-RNA verwendet. Das An­ kerprimergemisch bestand aus vier verschiedenen Primern, die sich in der letzten Base unterschieden, z. B. dT₁₁AA, dT₁₁AT, dT₁₁AG, und dT₁₁AC.

Folgende Komponenten wurden zu der Gesamt-RNA gegeben: 10 µl 10 mM dNTP-Mix, 5 µl 5 × Reverse Trankriptase Puffer, 10 µl 50 mM Ankerprimergemisch, 1 µl 5 mg/ml BSA, 4 µl 25 E/µl M-MuLV Reverse Transkriptase (NEB), ad 50 µl H₂O. Die Reaktion erfolgte 1 Stunde bei 37°C.

Folgende Ankerprimer und Ankerprimergemische wurden dabei verwen­ det:

Bezeichnung
Basensequenz
1. Roth-dT11-AT	5'-TTTTTTTTTTTAT-3'
2. Roth-dT11-AA	5'-TTTTTTTTTTTAA-3'
3. Roth-dT11-AG	5'-TTTTTTTTTTTAG-3'
4. Roth-dT11-AC	5'-TTTTTTTTTTTAC-3'
5. Roth-dT11-GT	5'-TTTTTTTTTTTGT-3'
6. Roth-dT11-GA	5'-TTTTTTTTTTTGA-3'
7. Roth-dT11-GG	5'-TTTTTTTTTTTGG-3'
8. Roth-dT11-GC	5'-TTTTTTTTTTTGC-3'
9. Roth-dT11-CT	5'-TTTTTTTTTTTCT-3'
10. Roth-dT11-CA	5'-TTTTTTTTTTTCA-3'
11. Roth-dT11-CG	5'-TTTTTTTTTTTCG-3'
12. Roth-dT11-CC	5'-TTTTTTTTTTTCC-3'
13. dT20	5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
14. DD T18AN	5'-GATCGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTAN-3'

(D) "Differential Display" PCR

Als Matrize für die PCR wurde cDNA eingesetzt. Die PCR-Reaktionen wurden in Eppendorf "Master Cycler"-Geräten durchgeführt (Eppen­ dorf, Hamburg). Mittels der "Differential Display"(DD)-PCR wurden Fragmente aus cDNA amplifiziert. Dabei wurden unter anderem so­ genannte Zufallsprimer mit jeweils einer unspezifischen Sequenz und einem 50%igen GC-Gehalt verwendet.

Reaktionsansatz bei Verwendung von 10mer und 14mer Zufallspri­ mern: 1 µl cDNA, 2 µl 10 × Taq-Polymerase Puffer, 0,5 µl 50 µM Ankerprimer, 1 µl 10 µM Zufallsprimer, 0,6 µl 50 mM MgCl₂, 0,5 µl 10 mM dNTPs, 0,1 µl 10 E/µl Taq DNA-Polymerase (Gibco BRL, Neu- Isenburg, Deutschland), ad 20 µl mit H₂O.

Reaktionsansatz bei Verwendung von 18mer Zufallsprimern: 2 µl cDNA, 2 µl 10 × Taq-Polymerase Puffer, 2 µl 10 µM Ankerprimer, 2 µl 10 µM Zufallsprimer, 1 µl 50 mM MgCl₂, 0,1 µl 10 mM dNTPs, 0,1 µl 10 E/gl Stoffel-Fragment der "Ampli Taq"-DNA-Polymerase (Perkin Elmer (Rodgau-Jügersheim, Deutschland) ad 20 µl mit H₂O.

Die Anlagerungstemperaturen für die verwendeten Primer variierten zwischen 42°C und 57°C. PCR-Profil abgewandelt nach Liang und Pardee ((1992) Science 257, 967-971) für 10mer und 14mer Primer: (1) Denaturierung (4 min, 94°C), (2) Denaturierung (1 min, 94°C), (3) Anlagerung der Primer (1 min, 42°C/46°C), (4) Elongation (3 min, 72°C); (2)-(4): 40 Zyklen; (5) Endelongation (10 min, 72°C).

PCR Profil nach Kociok et al. ((1998) Mol. Biotechnol. 9, 25-33) für 18mer Primer

• a) Denaturierung (3 min, 96°C);
• b) (1) Denaturierung (5 min, 95°C), (2) Anlagerung der Primer (5 min, 42°C), (3) Elongation (5 min, 72°C);
• c) (1) Denaturierung (2 min, 94°C), (2) Anlagerung der Primer (5 min, 42°C), (3) Elongation (5 min, 72°C), 2 Zyklen;
• d) (1) Denaturierung (1 min, 94°C), (2) Anlagerung der Primer (1 min, 57°C), (3) Elongation (2 min, 72°C), 30 Zyklen;
• e) Endelongation (7 min, 72°C).

Folgende Zufallsprimer wurden eingesetzt:

Bezeichnung
Basensequenz
10mer Zufallsprimer
Roth-150 02	5'-CAATGCGTCT-3
Roth-150 08	5'-GGAAGACAAC-3'
Roth-150 10	5'-CCATTTACGC-3'

Die ursprünglichen DD-Primer aus dem DD Primer Kit 10 × 10 nt (Roth, Karlsruhe, Deutschland) wurden am 5'-Ende um die Basenfolge GATC bzw. GATCGATC auf 14mere bzw. 18mere verlängert, um folgende Primer zu erhalten:

14mer Zufallsprimer
DD 14.1	5'-GATCGTGCAATGAG-3'
DD 14.2	5'-GATCGGAAGACAAC-3'

18mer Zufallsprimer
DD 18.1.2	5'-GATCGATCGTGCAATGAG-3'
DD 18.2.2	5'-GATCGATCCAATGCGTCT-3'
DD 18.2	5'-GATCGATCGGAAGACAAC-3'
DD 18.6	5'-GATCGATCAGGTTCTAGC-3'
DD 18.9	5'-GATCGATCAGAAGCGATG-3'
DD 18.10	5'-GATCGATCCCATTTACGC-3'
Ap13-18	5'-GATCGATCAGTTAGGCAA-3'

(E) Polyacrylamid-Gelelektrophorese von DNA und Silberfärbung

Die amplifizierten Fragmente wurden entweder über horizontale Polyacrylamid-Gelektrophorese auf einer "Multiphor II"-Elektro­ phorese-Einheit (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgetrennt (9%iges Gel, Vernetzungsgrad 2%) oder über vertikale Polyacryla­ mid-Gelelektrophorese auf einem "Direct Blotting Sequenzer System 1500" von GATC (Konstanz, Deutschland) (5%iges Gel, Vernetzungsgrad 2,6%). Der Nachweis der amplifizierten cDNA-Banden erfolgte durch Silberfärbung im wesentlichen nach dem Protokoll von Böc­ kelmann et al. ((1999) Skin. Pharmacol. Appl. Skin. Physiol. 12, 54-63).

(F) Elution von DNA-Fragmenten aus silbergefärbten Polyacryla­ midgelen und Reamplifikation

Die relevanten Gelbanden wurden mit einem Skalpell aus dem Poyl­ acrylamidgel ausgeschnitten. Etwa 2 bis 3 Banden gleichen Typs wurden in Reaktionsgefäßen vereinigt und mit einer Pipettenspitze zerkleinert. Anschließend wurde 50 µl TE zu den Proben gegeben, 6 min bei 99°C inkubiert und 5 min bei 10 000 × g bei RT zen­ trifugiert. 2 µl des Überstands wurden für die anschließende Reamplifikation mittels PCR als Matrize eingesetzt. Bei augen­ scheinlich schwachen cDNA-Banden wurden die Gelstücke in 50 µl 0,5 M NH₃Ac/1 mM EDTA überführt und bei 37°C über Nacht inkubiert (Böckelmann et al. (1999), supra). Anschließend wurden die Proben bei 10 000 × g zentrifugiert und 2 µl des Überstandes für die PCR als Matrize eingesetzt. Dieses modifizierte Verfahren wurde auch angewendet, wenn die zuvor genannte Methode bei der Reamplifika­ tion zu keinem Ergebnis führte. Zur Reamplifikation der eluierten cDNA-Fragmente aus dem silbergefärbten Polyacrylamidgelen wurde eine zweite PCR mit den gleichen Primerpaaren, die auch für die DD-PCR eingesetzt wurden, gewählt. Der verwendete Reaktionsansatz setzte sich folgendermaßen zusammen: 2 µl Eluat, 5 µl 10 × Taq- Polymerase Puffer, 2 µl 50 mM MgCl₂, 0,1 µl 10 mM dNTP, 1 µl 10 pH Primer 1, 1 µl 10 pH Primer 2, 0,5 µl 10 E/µl Stoffel Fragment Ampli Taq DNA Polymerase (Perkin Elmer), ad 50 µl mit H₂O.

Es wurde folgendes Zyklus-Programm verwendet: (1) Denaturierung (3 min, 98°C), (2) Denaturierung (1 min, 98°C), (3) Anlagerung der Primer (1 min, 57°C), (4) Elongation (2 min, 72°C), (2)-(4) 30 Zyklen, (5) Endelongation (10 min, 72°). Die PCR-Proben wurden in einem 1%igem Agarose-Gel auf Größe und Reinheit der Fragmente untersucht.

(G) Klonierung von PCR-Produkten

Zur weiteren Klonierung und Sequenzierung wurden die ausgeschnit­ tenen und reamplifizierten Fragmente in den linearisierten pCR2.1-Vektor aus dem "TA-Kloning"-Kit von Invitrogen (Groningen, Niederlande) ligiert und anschließend in kompetente E. coli-Zel­ len des Stamms INVαF' transformiert. Die Ligation wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Abweichend davon wurden jedoch anstelle von 2 bis 3 µl PCR-Ansatz 6 µl PCR-Ansatz für die Ligationsreaktion eingesetzt. Die Transformation erfolgte wie vom Hersteller beschrieben. Jeweils 50 und 250 µl der Transforma­ tionsansätze wurden auf LB-Platten mit Ampicillin (Endkonzen­ tration 100 mg/l) und dem Substrat X-Gal (40 mg/l) ausgestrichen und bei 37°C über Nacht inkubiert. Positive Klone wurden durch Blau/Weiß-Selektion identifiziert.

(H) Sequenzierung von Plasmid-DNA

Die Sequenzierung von Plasmid-DNA erfolgte nach der Didesoxy- Kettenabbruch-Methode (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) mit Hilfe eines DNA-Sequenzierautoma­ ten, Modell "373 A strech" von Perkin Elmer. Das verwendete System arbeitet mit einer Vierfarben-DNA-Markierungstechnik, die es erlaubt, die gesamte DNA-Sequenz in einer Gelspur zu detektieren. Zur Sequenzierung wurden folgende Primer verwen­ det: M13for (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') und M13rev (5'-CAGGAAA­ CAGCTATGAC-3').

(I) Sequenzanalyse

Für die Erstellung von Restriktionskarten, für den Sequenzver­ gleich und die Durchführung virtueller Mutationen wurde das Pro­ gramm LASERGENE (DNASTAR, Madison, USA) verwendet. Über die NCBI- Homepage (http:/ /www.ncbi.nln.nih.gov) und Expasy-Homepage (http:/ /www.expasy.ch) wurden die Nukleinsäuresequenzen in Amino­ säuresequenzen übersetzt und anschließend nach offenen Lesera­ stern gesucht. Mit Hilfe der Datenbanken von NCBI und TIGR (http:/ /www.tigr.org) erfolgten die Homologievergleiche mit be­ reits bekannten Sequenzen. Es wurden die Sequenzen für die Frag­ mente 15-1 (Fig. 1), 15-2 (Fig. 2), 15-3 (Fig. 3), 15-5 (Fig. 4) 15-6 (Fig. 5) und 15-7 (Fig. 6) bestimmt.

(J) RT-PCR

Um die Expression det den cDNAs entsprechenden Gene zu untersu­ chen, wurden RT-PCRs durch geführt. Die cDNA-Synthese erfolgte ausgehend von 2 µg RNA aus Kartoffeln (Blatt, aerob und Knolle aerob oder anaerob).

Reaktionsansatz reverse Transkription: 2 µg RNA, 1 µl Oligo­ dT (400 µg/gl), ad 12 µl H₂O, es wurde 10 min bei 70°C, auf Eis abgekühlt. Danach erfolgte Zugabe von 4 µl 5 × Reaktionspuffer (Gibco BRL), 2 µl 0,1 M DTT, 1 µl dNTPs (je 10 mM). Danach erfolg­ te 10 min Inkubation bei 42°C und kurzes Zentrifugieren. Schließ­ lich erfolgte die Zugabe von 1 µl Superscript II™ RNAseH^- reverse Transkriptase (Gibco BRL) und es wurde 50 min bei 42°C, dann 15 min bei 70°C inkubiert. Der Reaktionsansatz für PCR war:
1 µl cDNA, 5 µl 10 × Puffer, 5 µl dNTPs (je 2 mM), 0,5 µl Primer 1, 0,5 µl Primer 2, 1,5 oder 3 µl MgCl₂ (25 mM), 1 µl Taq- Polymerase (1 E/j µl, MBI-Fermentas (St. Leon Rot, Deutschland)), ad 50 µl H₂O. PCR-Programm: (1) 95°C, 2 min, (2) 95°C, 30 sek, (3) 53°C, 1 min, (4) 72°C, 1 min; (2)-(4) 35 Zyklen, (5) 72°C,5 min.

Folgende Primer wurden verwendet:

Ergebnis

(K) GENOMISCHE PCR

Um die Gene in Kartoffeln nachzuweisen, wurden PCRs mit genom­ ischer DNA aus Kartoffel (Blatt und Knolle) von cv. Désirée durchgeführt. Die DNA wurde mit Hilfe des "RNA/DNA Midi"-Kits der Firma QIAGEN isoliert.

Reaktionsansatz: 1-2 µl DNA, 5 µl 10 × Puffer, 5 µl dNTPs (je 2 mM), 0,5 µl Primer 1, 0,5 µl Primer 2,
1,5 µl MgCl₂ (25 mM), 1 µl Taq-Polymerase (1 E/µl, MBI-Fermentas), ad 50 µl H₂O. PCR-Programm: (1) 95°C, 2 min, (2) 95°C, 30 sek, (3) 53°C, 1 min, (4) 72°C, 2-4 min, (2)-(4) 35 Zyklen, (5) 72°C, 5 min.

Folgende Primer wurden verwendet:

(L) INVERSE PCR

Eine Technik, um fehlende Genfragmente sowie Promotoren und Ter­ minatoren von Genen zu isolieren, ist die inverse PCR (iPCR). Die iPCR ist eine direkte Methode, um die Sequenzinfomationen der 5'- und 3'-flankierenden Regionen von bekannten Genen oder Genfrag­ menten zu erhalten. Diese Methode wurde bei Pflanzen bereits mit Erfolg eingesetzt, um beispielsweise einen samenspezifischen Lipoxygenase-Promotor aus Pisum sativum oder einen Puroindolin- Gen-Promotor aus Triticum aestivum zu isolieren. Ausgangsmaterial für die iPCR ist genomische DNA, die das bekannte Fragment und die flankierenden Sequenzen enthält (Fig. 9). Diese wird mit einem Restriktionsenzym, für das keine Schnittstelle im bekannten Genfragment existiert, verdaut. Daraus entsteht unter anderem ein Fragment, das aus der bekannten Sequenz besteht, die an beiden Enden von unbekannten Sequenzabschnitten flankiert wird. Die linearen DNA-Fragmente werden mit DNA-Ligase behandelt. Dabei können die Fragmente auch mit sich selbst reagieren, wobei u. a. ringförmige DNA-Moleküle entstehen. Dieser Ansatz wird nun mit einem zweiten Restriktionsenzym verdaut, welches innerhalb der bekannten Sequenz schneidet. Dadurch wird das zirkularisierte Fragment linearisiert. Es entsteht ein Sequenzabschnitt, bei dem die unbekannten Anteile an beiden Enden von den bekannten Sequen­ zen begrenzt werden. Mit Hilfe dieser bekannten Sequenzen lassen sich Primer auswählen, um das unbekannte Fragment zu amplifizie­ ren. Bezogen auf das ursprüngliche Fragment befinden sich die Bindungsstellen für die Primer voneinander abgewandt, also invers verglichen mit der Standard PCR, woraus sich die Bezeichnung dieser Methode ableitet. Das amplifizierte Fragment wird kloniert und sequenziert, und man erhält die Sequenzinformationen über die flankierenden Bereiche. Dabei ist die Begrenzung zwischen der ursprünglichen 5'- und 3'-Region durch die Schnittstelle des ersten Restriktionserizyms definiert. Der Vorgang wird anhand der neuen Sequenzinformationen wiederholt, bis der gesamte gewünschte Sequenzbereich identifiziert ist.

Zur Durchführung der iPCR wurde auf eine transgene Linie zurück­ gegriffen, die ein bekanntes T-DNA-Fragment trägt. Genomische DNA aus Blättern der Linie 2-13 (Bülow et al. (1999), Mol. Plant- Microbe Interact. 12, 182-188), die das E. coli GUS-Gen unter der Kontolle des Mais GapC4-Promotors trägt (Fig. 10), wurde mit Hilfe des "DNeasy Plant Mini Kits" von Qiagen isoliert. Zur Kon­ trolle wurde ebenfalls genomische DNA einer nicht transgenen Linie präpariert. 1 bzw. 2 µg genomische DNA aus Blättern der transgenen Linie 2-13 sowie DNA aus Blättern einer nicht trans­ genen Kontrollpflanze wurden mit XbaI als erstem Restriktions­ enzym vollständig verdaut. Anschließend wurden die DNA-Fragmente mit dem "Nucleotide Removal Kit" von Qiagen aufgereinigt. Die DNA wurde mit 50 µl H₂O eluiert und anschließend ligiert. Zur Über­ prüfung der Ligation wurden die Fragmente in einem Agarosegel aufgetrennt. Zum Vergleich wurde nicht ligierte verdaute genom­ ische DNA ebenfalls aufgetragen (Fig. 11). In der Spur mit XbaI verdauter genomischer DNA war mit ein gleichmäßiger Schmier zu sehen. In der Spur mit verdauter genomischer DNA nach der Liga­ tion war eine auffällige Änderung des Migrationsverhalten der Fragmente zu beobachten. Die durch die Ligation größer gewordenen Fragmente liefen wie erwartet langsamer, sie befanden sich also an einer höheren Position im Gel. Daraufhin wurde die teilweise zikularisierte DNA linearisiert. Dazu wurde der Ansatz mit 40 Einheiten des zweiten Restriktionsenzyms BclI in einem Reaktions­ volumen von 200 µl vollständig verdaut. Danach wurde die DNA mit dem "Nucleotide Removal Kit" von Qiagen aufgereinigt und mit 50 µl H₂O eluiert. Nach dieser Aufreinigung der DNA wurde die eigent­ liche iPCR durchgeführt.

Die iPCR erfolgte nach einem Protokoll von Digeon et al., Plant Mol. Biol. 39 (1999), 1101-1112. Als Primer wurden GUS-L (5'- TCGCGATCCAGACTGAATGC-3') und GUS-R (5'-CATTTGAAGCCGATGTCACG-3') ausgewählt. Der Primer GUS-L hybridisiert mit den Nukleotiden 77 bis 58 des Sense-Strangs des E. coli-GUS-Gens. Der Primer GUS-R hybridisiert mit den Nukleotiden 357 bis 335 des Antisense- Strangs des E. coli GUS-Gens. Auf Grund der Größe des Amplifikats wurde die iPCR mit einer "High Fidelity Platinum"-Taq DNA-Polyme­ rase von Gibco BRL durchgeführt. Der Reaktionsansatz setzte sich folgendermaßen zusammen: 5 µl DNA-Eluat, 1,5 µl 50 mM MgSO₄, 1 µl 10 mM dNTP, 5 µl 10 × High Fidelity PCR-Puffer (Gibco BRL), 1,25 µl 10 µM Primer GUS-L, 1,25 µl 10 µM Primer GUS-R, 0,3 µl 5 E/µl "High Fidelity Platinum"-Taq Polymerase (Gibco BRL), ad 50 µl mit H₂O. Es wurde folgendes iPCR-Programm in einem Eppendorf "Master­ cycler"-Gerät verwendet: (1) Denaturierung (4 min, 94°C), (2) Denaturierung (30 sec, 94°C), (3) Anlagerung der Primer (30 sec, 60°C), (4) Elongation (3 min, 68°C), (2)-(4) 35 Zyklen, (5) Endelongation (10 min, 72°C).

Das Ergebnis wurde in einem 1%igem Agarose-Gel Agarose-Gel über­ prüft (Fig. 11). Dabei sah man bei der erwarteten Fragmentgröße von etwa 3,2 kB eine kräftige Bande in den Spuren 3 und 5. Die Amplifikate zeigten bei 1 und 2 µg Ausgangs-DNA in der Stärke keinen Unterschied. In den Kontrollreaktionen (Spur 2 und 4) konnte die ca. 3,2 kB große Bande nicht detektiert werden, es waren nur unspezifische Banden bei etwa 500 bp zu erkennen. Das amplifizierte Fragment wurde ausgeschnitten und mittels des "TA- Cloning"-Kit von Invitrogen in den pCR2.1-Vektor kloniert. Die Sequenzanalyse erfolgte mit den Oligonukleotiden M13 for (5'- GTAAAACGACGGCCAG-3') und M13 rev (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') als Sequenzierprimern. Anschließend wurde die Sequenz mit der bekann­ ten Sequenz des GapC4-Promotor-GUS-Konstrukts verglichen. Der mit der Sequenz durchgeführte Homologievergleich ergab, daß sich das Fragment an der 5'-Seite aus dem GapC4 Promotor und an der 3'- Seite aus dem GUS-Gen zusammensetzte. Damit konnte demonstriert werden, daß man mit der Methode der iPCR noch unbekannte Pro­ motoren bekannter Gene identifizieren kann.

BEISPIEL 2 DURCHMUSTERN VON GENBIBLIOTHEKEN ZUR ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA- FRAGMENTE (PROMOTOREN/TERMINATOREN)

Zur Isolierung der zu den cDNA-Fragmenten gehörenden Gene sowie deren Promotoren und Terminatoren wird die genomische DNA-Biblio­ thek von Solanum tuberosum cv. Saturna in λ-Vektor EMBL3 (Strata­ gene, Heidelberg, Deutschland) von DANISCO (Kopenhagen) verendet. Das Durchmustern der DNA-Bibliotheken erfolgt nach dem Protokoll des Herstellers. Die Voranzucht der Bakterien geschieht über Nacht in 50 ml LB-Medium mit 0,2% (Gew./Vol.) Maltose und 10 mM MgSO₄ bei 30°C. Nach Zentrifugation (10 min bei 3000 × g) werden die Bakterien mit 10 mM MgSO₄ auf eine OD₆₀₀ von 0,5 eingestellt. Der Phagentiter wird durch Infizieren der Bakterien (s. u.) mit jeweils unterschiedlich verdünnten Phagensupensionen und an­ schließendem Zählen der Plaques bestimmt. Zur Isolierung der genomischen DNA-Klone werden 1 × 10⁶ pfu (Plaque forming units) verwendet.

In der ersten Runde des Durchmusterns werden 400 µl MRA(P2)-Zel­ len (genomische DNA-Bibliothek) (Stratagene, Heidelberg, Deutsch­ land) mit 50000 pfu 20 min bei 37°C infiziert, mit 4,5 ml (kleine Platten; Durchmesser: 9 cm) warmer (45°C) Mg²⁺-Topagarose gemischt und auf je eine NZY-Platte (1% (Gew./Vol.) Casein-Hydrolysat, 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,2%, (Gew./Vol.) MgSO₄, 0,5% (Gew./Vol.) NaCl, 1,5% (Gew./Vol.) Agar) gegeben. Nach 12-16 h Inkubation bei 37°C werden die Infektionsereignisse in Form von Plaques im Bakterienrasen sichtbar. Anschließend läßt sich die DNA aus den Phagen auf einer aufgelegten Nitrozellulose-Membran (45 µm Porengröße, Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) fixieren. Dazu werden die Membranen zuerst auf die 4°C kalten Platten gelegt und die Orientierung der Membranen auf den Platten durch je drei Einstiche mit einer Kanüle markiert. Nach 10minü­ tigem Transfer der DNA auf die Membran wird diese nacheinander je 10 min auf getränktem Filterpapier mit Denaturierungs-Lösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl), Neutralisierungs-Lösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris/HCl pH 7,0) und Äquilibrierungs-Lösung (2 × SSPE oder 2 × SSC) inkubiert und anschließend 1 h bei 80°C gebacken. Die Identifi­ zierung positiver Phagenklone erfolgt dann über Hybridisierung der Membranen mit Digoxygenin-markierten (DIG-)Sonden. Diese können mit Hilfe entsprechender Kits hergestellt und anschließend mittels einer Farbreaktion nachgewiesen werden ("DIG DNA Labeling and Detection"-Kit der Firma Roche, Mannheim, Deutschland). Nach dem Farbnachweis auf den Filtern werden die Bereiche auf der Platte, die den Signalen zugeordnet werden können, mit einer umgedrehten sterilen Pasteurpipette ausgestochen und in 1 ml SM- Puffer plus 20 µl Chloroform gegeben. Nach kräftigem Vortexen eluieren die Phagen über Nacht bei 4°C aus dem Agarblock in die Lösung. Ausgehend von dieser Phagensuspension werden, wie oben beschrieben, Bakterien infiziert, ausplattiert und analysiert, wobei jeweils nur noch 10 bis 100 pfu als Träger der gesuchten DNA dienen. Durch dreimaliges Wiederholen dieser Vorgänge lassen sich die Signale isolierten Plaques zuordnen. Die Phagen-DNA wird anschließend nach Standardmethoden isoliert. DNA-Fragmente, wel­ che die gewünschten DNA-Bereiche (Promotor bzw. Terminator) ent­ halten, können dann in E. coli subkloniert werden.

Beispiel 3 Überprüfung der Induzierbarkeit und Stärke isolierter Promoto­ ren anhand der Nachernte-Produktion von scFv in transgenen Kar­ toffeln

Die DNA-Sequenz eines induzierbaren Kartoffelknollenpromotors wird mittels Linker-Ligation an seinem 5'- und 3'-Ende derart modifiziert, daß er am 5'-Ende eine HincII-Restriktionsschnitt­ stelle und am 3'-Ende eine NcoI-Restriktionschnittstelle erhält. Für die Linker-Ligation wird folgendes Oligonukleotidpaar verwen­ det: HincII-Linker: 5'-GATCGTCGACGATC-3'; NcoI-Linker: 5'- GATCCCATGGGATC-3'. Die von Artsaenko et al., (1998) Molecular Breeding 4, 313-319, beschriebene cDNA, die für einen im endo­ plasmatischen Retikulum lokalisierten scFv-Antikörper codiert, wird mittels einer Linker-Ligation (am 5'-Ende mit 5'- CATGCCATGGCATG-3', [5' -phosphoryliertes Oligonukleotid] und am 3'-Ende mit 5'-GCTCTAGAGC-3' [5'-phosphoryliertes Oligonukleotid] derart modifiziert, daß sie am 5'-Ende eine NcoI-Restriktions­ schnittstelle und am 3'-Ende eine XbaI Restriktionsschnittstelle aufweist. Aus dem Plasmid pRT100 (Töpfer et al. (1987) Nucleic Acid Research 15, 5890) wird der CaMV 35S Promotor mittels Re­ striktionsverdau mit HincII und XbaI entfernt. Stattdessen werden die beiden vorstehend beschriebenen Nucleinsäurefragmente, die für den zu untersuchenden Promotor und den scFv Antikörper kodie­ ren, inseriert. Nach Spaltung mit Hindill wird die Expressions­ kassette isoliert und in den binären Vektor pSR 8-30 (Düring et al. (1993), Plant Journal 3, 587-598; Porsch et al. (1998), Plant Molecular Biology 37, 581-585) inseriert, wobei der Expressions­ vektor pSR 8-30/scFv(ox) erhalten wird.

Dieser wird zur Transformation von E. coli SM10 (Koncz und Schell (1986), Molecular and General Genetics 204, 383-296) verwendet. Transformanten werden mit Agrobacterium GV 3101 (Koncz und Schell (1986), supra) gemischt und über Nacht bei 28°C inkubiert (Koncz et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 131-135). Die Agro­ bakterien werden auf Carbenicillin selektioniert, wobei das hier­ für notwendige bla-Gen in dem vorstehenden Expressionsvektor vorliegt. Selektionsklone von Agrobacterium tumefaciens werden auf abgeschnittenen und mehrfach an der Mittelrippe eingeritzten Blättern der Kartoffelpflanze cv. Désirée aufgebracht, und die Blätter 2 Tage bei 20°C im Dunkeln inkubiert. Danach werden die Agrobakterien abgewaschen und den Kartoffelblättern Pflanzen­ wuchsstoffe zugesetzt, so daß bevorzugt Sprosse regenerieren. Ferner werden durch die Zugabe von Kanamycin (100 mg/l) in das Pflanzenmedium nicht-transformierte Zellen in den Kartoffelblät­ tern abgetötet. Heranwachsende Sprosse werden abgeschnitten und in dem Medium ohne Pflanzenwachstumsstoffe, aber mit Kanamycin, bewurzelt. Die weitere Kultivierung der Kartoffelpflanzen erfolgt in üblicher Weise.

Zum Nachweis der Expression des scFv-Antikörpers wird abgeschnit­ tenes oder intaktes Blattmaterial oder intaktes oder geschnitte­ nes Knollenmaterial mittels des Anaerocult-Systems (Merck, Darm­ stadt, Deutschland) wie bei Bülow et al. (1999), Mol. Plant-Mi­ crobe Interact. 12, 182-188) beschrieben, induziert. Nach 40 Stunden wird das Blattmaterial entnommen und gemörsert. Der Nach­ weis des exprimierten scFv-Antikörpers wird über den enthaltenen c-myc-"Tag" mittels des monoklonalen Antikörpers 9E10-igG (Cam­ bridge Research Chemicals, Northwich, Cheshire, UK) oder Protein L (Clontech, Palo Alto, CA., USA) im Western Blot bzw. ELISA erbracht. Hierzu wird das Gesamtprotein des Kartoffelmaterials isoliert und in die entsprechenden Nachweisverfahren eingesetzt.

Als expressionspositiv ermittelte transgene Kartoffelpflanzen werden im Gewächshaus (im Topf oder im Erdbeet) oder im Freiland unter üblichen gartenbaulichen bzw. landwirtschaftlichen Bedin­ gungen angebaut. Die Knollen wurden nach üblicher Handhabung geerntet und gelagert. Für die Nachernte-Produktion des scFv- Antikörpers werden die Knollen in einen Reaktionsbehälter aus Stahl oder Kunststoff verbracht, der unten ein Gaszufuhrventil und oben ein Gasabfuhrventil aufweist. Die Raumluft im Behälter wird (zum Nachweis eines anaerob induzierbaren Promotors) schnell von technischem Stickstoff oder Kohlendioxid verdrängt. Unter langsamem Gasstrom (1 m³ pro Stunde pro m² Grundfläche) wird eine konstante Zusammensetzung der Gasphase im Reaktionsbehälter ein­ gestellt. Nach 40 Stunden werden die Knollen aus dem Reaktions­ behälter entnommen, homogenisiert, der Festanteil abzentrifugiert und der wäßrige Überstand der chromatographischen Aufreinigung des scFv-Antikörpers zugeführt. Durch Vergleich von Proben vor und nach Sauerstoffentzug kann dann (bei Vorliegen eines anaerob induzierbaren Promotors) gezeigt werden, daß vor der Verdrängung des Sauerstoffs kein scFv-Antikörper, danach jedoch signifikante Mengen davon produziert werden.

Beispiel 4 Herstellung transgener Kartoffelpflanzen mit einem Gen unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors

Die DNA-Sequenz eines vorstehend beschriebenen Kartoffelpromotors wird mittels Linker-Ligation an seinem 5'- und 3'-Ende derart modifiziert, daß er am 5'-Ende eine XbaI-Restriktionsschnitt­ stelle und am 3'-Ende eine XhoI-Restriktionschnittstelle erhält.

Für die Linker-Ligation wird folgendes Oligonukleotidpaar verwen­ det: XbaI-Linker: 5'-GATCTCTAGAGATC-3'; XhoI-Linker: 5'- GATCCTCGAGGATC-3'. Durch Restriktionsverdau mit XbaI und XhoI wird der Promotor der Kanamycinresistenz-vermittelnden Kassette des binären Vektors pLH9000 (Hausmann und Töpfer (1999), Vorträge Pflanzenzüchtung 45, 155-172) entfernt, und an seine Stelle die DNA-Sequenz des konstitutiven Kartoffelpromotors nach Restriktion mit XbaI und XhoI eingesetzt. In die HindIII-Restriktionsschnitt­ stelle dieses Vektors wird eine Expressionskassette, die das Gen für das T4-Lysozym unter der Kontrolle des CaMV 35S Promotors enthält, kloniert. Das zu transferierende Fragment wird aus dem binären Vektor pSR8-40 (Porsch et al. (1998), Plant Molecular Biology 37, 581-585) durch Restriktionsverdau mit Hindill ge­ schnitten.

Der Expressionsvektor wird zur Transformation von E. coli SM10 verwendet. Transformanten wurden mit Agrobacterium GV 3101 ge­ mischt und über Nacht bei 28°C inkubiert (vgl. C. Koncz und J. Schell (1986), Mol. Gen. Genet. 204, 383-396; C. Koncz. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 131-135). Die Agrobakte­ rien werden auf Streptomycin und Spectinomycin selektioniert, wobei das hierfür notwendige aadA-Gen in dem vorstehenden Ex­ pressionsvektor vorliegt. Selektionsklone von Agrobacterium tume­ faciens werden auf abgeschnittenen und mehrfach an der Mittelrip­ pe eingeritzten Blättern der Kartoffelpflanze cv. Désirée aufge­ bracht und die Blätter 2 Tage bei 20°C im Dunkeln inkubiert. Danach werden die Agrobakterien abgewaschen und den Kartoffel­ blättern Pflanzenwuchststoffe zugesetzt, so daß bevorzugt Sprosse regenerierten. Ferner werden durch die Zugabe von Kanamycin in das Pflanzenmedium nicht-transformierte Zellen in den Kartoffel­ blättern abgetötet. Transgene Zellen exprimieren dagegen das Kanamycinresistenzgen unter der Kontrolle des Promotors, weswegen lediglich sie sich vermehren. Aus diesen Zellen hervorgehende Sprosse sind demnach transgen. Diese werden abgeschnitten und auf Medium ohne Pflanzenwachstumsstoffe, aber mit Kanamycin, bewur­ zelt. Die weitere Kultivierung der Kartoffelpflanzen erfolgt in üblicher Weise.

Zur Überprüfung auf Einbau der Fremd-DNA in das Chromosom der Kartoffel können außerdem alle regenerierten Linien mittels Sout­ hern Hybridisierung auf die integrierte Fremd-DNA hin untersucht werden. Dazu werden mit dem Fachmann bekannten Methoden genom­ ische DNA aus Blättern der einzelnen Linien isoliert, mit dem Restriktionsenzym NotI verdaut und auf einem Agarosegel aufge­ trennt. Die Fragmente werden auf eine positiv geladene Nylon- Membran transferiert und mit markierter DNA des Gens für T4-Lyso­ zym als Sonde hybridisiert. Die Verfahren dazu sind dem Fachmann bekannt. Der Nachweis der Expression von T4-Lysozym wird mittels eines polyklonalen Antikörpers (vgl. Düring et al. (1993) Plant Journal 3, 587-598) im Western Blot erbracht. Zur weiteren Über­ prüfung der Wirksamkeit der DNA-Transfermethode und des Selek­ tionsmechanismus kann genomische DNA aus Blättern der einzelnen Linien mittels PCR der gesamten T-DNA mit den borderspezifischen Primern 5'-GGC AGG ATA TAT TCA ATT GTA AAT-3' und 5'-GTA AAC CTA AGA GAA AAG AGC GTT TA-3' amplifiziert werden. Im Agarosegel wird die Größe der Amplifikate mit Kontrollen aus aufgereinigter Plas­ mid-DNA verglichen. Die Fragmente werden kloniert und durch Se­ quenzierung wird die T-DNA Sequenz bestätigt.

Folgende Klone wurden bei der DSMZ, Braunschweig, gemäß den Be­ stimmungen des Budapester Vertrags am 22. Februar 2001 hinter­ legt:

Claims (14)

1. DNA-Sequenz, die eines der folgenden Pflanzenproteine kodiert:

• a) ein Protein, dessen biologische Funktion einem mito­ chondrialen Carrier-Protein entspricht und das die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
• b) ein Protein, dessen biologische Funktionen einem Tranferrin Bindungs-Protein entspricht und das die in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
• c) eine Protein, dessen biologische Funktion einer Re­ zeptor-ähnlichen Proteinkinase entspricht und das die in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
• d) ein Protein, dessen biologische Funktion einem Elon­ gationsfaktor EF-2 entspricht und das die in Fig. 4 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist;
• e) ein Protein, dessen biologische Funktion einer non- LTR Retroelement Reverse Transkriptase entspricht und das die in Fig. 5 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; oder
• f) ein Protein, dessen biologische Funktion einer Heli­ kase entspricht und das die in Fig. 6 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die den kodierenden Bereich einer in Fig. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 gezeigten DNA-Sequenz umfaßt.

3. DNA-Sequenz, die ein Protein mit der jeweiligen in Anspruch 1 definierten biologischen Funktion kodiert,

• a) die sich von der DNA-Sequenz von Anspruch 2 in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
• b) die mit der DNA-Sequenz von Anspruch 2 oder 3(a) hybridisiert;
• c) die zu der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder 3(a) eine Homologie von mindestens 75% aufweist; oder
• d) die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der DNA-Sequenz von Anspruch 2 oder 3(a) bis 3(c) ist.

4. Ribozym, dadurch gekennzeichnet, daß es zu einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte mRNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von dieser DNA-Se­ quenz kodierten Proteins verringert oder gehemmt wird.

5. Antisense-RNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu einer DNA- Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte mRNA spezifisch binden kann, wodurch die Synthese des von dieser DNA-Sequenz kodierten Proteins verringert oder gehemmt wird.

6. Expressionsvektor, eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine das Ribozym nach Anspruch 4 oder die Antisense- RNA nach Anspruch 5 kodierende DNA enthaltend.

7. Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert ist.

8. Protein mit der in Anspruch 1 definierten biologischen Funk­ tion, das von einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert wird.

9. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit einer in Anspruch 1 definierten biologischen Funktion, das die Züchtung der Wirts­ zelle nach Anspruch 7 unter geeigneten Bedingungen und die Gewin­ nung des Proteins aus der Zelle oder dem Zuchtmedium umfaßt.

10. Antikörper, der an ein Protein gemäß Anspruch 8 spezifisch bindet.

11. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Ribozyms nach Anspruch 4, einer Antisense-RNA nach An­ spruch 5, eines Expressionsvektors nach Anspruch 6, eines Pro­ teins nach Anspruch 9 oder eines Antikörpers nach Anspruch 10 zur Erzeugung einer Pflanze mit veränderten Eigenschaften.

12. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Fragments davon zum Screenen nach Terminatoren oder konstitutiv, aerob bzw. anaerob induzierbaren Pflanzenpromotoren.

13. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1(d) zur Erzeugung einer Pflanze mit einem modifizierten Translationsprofil.

14. Kit, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Antikörper nach Anspruch 10 enthält.