DE10109813A1 - Tumor-Peptidantigen aus humanem mdm2 Proto-Onkogen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein universelles tumorassoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird und das eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeiführt. Das Oligopeptid weist die Aminosäuresequenz LLGDLFGV auf, die den Aminosäurepositionen 81 bis 88 des hdm2-Proto-Onkoproteins entspricht, oder eine davon ableitbare Aminosäuresequenz, die ein funktionelles Äquivalent zu der Aminosäuresequenz LLGDLFGV darstellt. Es stellt ein Epitop für CD8-positive ZTL dar und ist dazu geeignet, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 restringierte Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Tumor- und Leukämiezellen zu induzieren.

Description

Die Erfindung betrifft ein universelles tumorassoziiertes Oligopeptid, das von CD8- positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird und das eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeiführt.

CD8-positive ZTL stellen Effektorzellen des zellulären Immunsystems dar. Ihre Funktion besteht in der spezifischen Eliminierung von infizierten oder entarteten körpereigenen Zellen. Die ZTL erkennen unter anderem tumorspezifische oder tumorassoziierte Peptidantigene, die an Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Moleküle der Klasse I gebunden und auf der Oberfläche der entarteten Zellen präsentiert sind. Die Erkennung der Peptidantigene im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen erfolgt durch spezifische membranständige T-Zellrezeptoren (TZR) der ZTL. Nach Erkennung wird die betreffende Zelle abgetötet, indem die ZTL die Zielzellen lysieren und/oder den programmierten Zelltod (Apoptose) dieser Zielzellen induzieren oder Cytokine freisetzen.

Die Erkennung von Zielzellen durch ZTL wird durch die Expression des CD8- Korezeptors auf ZTL erleichtert. Der CD8-Korezeptor bindet an konservierte Regionen der α2- und α3-Domänen des MHC Klasse I-Moleküls und trägt damit zur Stabilisierung des TZR-Peptid-MHC-Komplexes bei.

Unter den tumorassoziierten Peptidantigenen (TAA), die im Kontext von MHC Klasse I- Molekülen auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentiert werden, sind die sogenannten "universellen" TAA von besonderem Interesse. "Universelle" TAA leiten sich überwiegend von zellulären Proteinen ab, die in normalen Zellen schwach exprimiert und in Tumorzellen überexprimiert werden. Zu diesen Proteinen gehört u. a. das humane Homolog des "mouse double minute 2" Proto-Onkogens (mdm2), das sogenannte "humane mdm2" oder abgekürzt "hdm2" Proto-Onkoprotein, das nicht nur in einer Reihe solider Tumore, sondern auch bei den hämatologischen Neoplasien (malignen hämatologischen Systemerkrankungen) AML, ALL und CLL überexprimiert wird. Die aus der zellulären Prozessierung des hdm2-Proteins resultierenden Oligopeptide können im Kontext von MHC Klasse I Molekülen der Allelvariante A2, Subtyp A2.1 (kurz: A2.1; das häufigste MHC-Klasse I-Allel in der kaukasischen Bevölkerung), auf der Zelloberfläche präsentiert werden und repräsentieren attraktive Zielstrukturen für CD8- positive ZTL. Die Expression von hdm2 in Normalgeweben ist bisher nicht intensiv untersucht worden. Für mdm2 der Maus ist jedoch eine erhöhte Expression von mdm2- mRNA im Testis und eine geringere Expression in Thymus, Ovar und zentralem Nervensystem sowie eine erhöhte Expression von mdm2-Protein im Uterus festgestellt worden.

Voraussetzung für die Entwicklung immuntherapeutischer Verfahren zur Behandlung von bösartigen Tumorerkrankungen ist die Identifizierung immunogener Tumorantigene. Solche Tumorantigene können unter bestimmten Voraussetzungen als Impfstoff zur Induktion von T-Zellen im allgemeinen und von Tumor-reaktiven T-Zellen im besonderen eingesetzt werden mit dem Ziel, daß diese T-Zellen die Remission und Eradikation eines bestimmten Tumors herbeiführen. Im Fall von Melanomen sind bereits einige Peptidantigene bekannt, die auf diese Weise zur Immuntherapie innerhalb klinischer Prüfungen verwendet werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, "universelle" tumorassoziierte Peptidantigene (universelle TAA) bereitzustellen, die von CD8-positiven ZTL erkannt werden und eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeiführen.

Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Oligopeptids, das (a) die Aminosäuresequenz LLGDLFGV aufweist, die den Aminosäurepositionen 81 bis 88 des hdm2-Proto-Onkoproteins entspricht, oder das eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, -Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren davon ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, die ein funktionelles Äquivalent zu der Aminosäuresequenz LLGDLFGV darstellt, das (b) ein Epitop für CD8-positive ZTL darstellt, und das (c) dazu geeignet ist, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Tumor- und Leukämiezellen zu induzieren.

Eine äquivalente Lösung besteht in der Bereitstellung eines zu diesem erfindungsgemäßen Oligopeptid analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids, das anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen Nichtpeptidbindungen wie z. B. -NH-CO-Bindungen aufweist (Meziere et al. 1997).

Mit dem Oligopeptid "hdm2 81-88" wird erstmals ein Peptidantigen bereitgestellt, dessen Aminosäuresequenz aus dem hdm2-Onkoprotein stammt. Das hdm2 81-88 Oligopeptid und dessen Derivate stellen ubiquitäre, quantitativ tumorassoziierte ZTL-Epitope dar und liefern damit die molekulare Grundlage für eine hdm2-spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

Die erfindungsgemäßen Oligopeptide (hdm2 81-88 und dessen Derivate) können in der aktiven und passiven Immunisierung von Patienten mit bösartigen soliden Tumorerkrankungen und/oder lymphohämopoetischen Neoplasien, bei denen das hdm2 Epitop 81-88 im Kontext von A2.1 präsentiert wird, eingesetzt werden, um die Induktion, Generierung und Expandierung von hdm2 81-88 spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten herbeizuführen, die in der Lage sind, die Tumor- oder Leukämiezellen der betreffenden Patienten spezifisch abzutöten und dadurch eine Heilung zu vermitteln.

Im Zuge der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß hdm2 bei malignen hämatologischen Erkrankungen auch in Form eines Multiplen Myeloms (oder Plasmozytoms), eines histiozytischen Lymphoms und eines CML-Blastenschubs überexprimiert wird, während es in ruhenden B-Zellen, T-Zellen, Mononukleären Zellen des Peripheren Blutes, Lungenfibroblasten und physiologisch aktivierten Dendritischen und T-Zellen nicht nachweisbar ist. Für das Oligopeptid hdm2 81-88 und dessen Derivate ergibt sich daraus der Vorteil eines breiten Indikationsgebiets bei vernachlässigbar geringem Risiko eines unerwünschten Angriffs auf Normalzellen.

Die Derivate des hdm2 81-88 Oligopeptids haben gegenüber dem Oligopeptid selbst den Vorteil, daß damit eine potentielle funktionelle Selbsttoleranz (gegenüber dem hdm2 81-­ 88 Oligopeptid) auf T-Zellebene umgangen werden kann. Während das hdm2 81-88 Oligopeptid aufgrund der (geringen) Expression in einigen Normalgeweben u. U. in dem betreffenden Organismus (Patientenkörper) ein sogenanntes Tolerogen darstellt und für die organismuseigenen (patienteneigenen) ZTL nicht immunogen ist, werden die Derivate des hdm2 81-88 Oligopeptids im Regelfall als Antigene erkannt und induzieren die Aktivierung und Expandierung von ZTL. Diese Derivat-induzierten ZTL weisen in der Regel eine hohe Kreuzreaktivität gegenüber der hdm2 81-88 Wildtypsequenz auf und induzieren infolgedessen auch die Lyse und/oder Apoptose von solchen (Tumor-)Zellen, die hdm2 81-88 (im Kontext von A2, insbesondere von A2.1) auf ihrer Oberfläche präsentieren.

Besonders bevorzugte Derivate des hdm2 81-88 Oligopeptids sind solche, die natürlicherweise in anderen Säuge- oder Wirbeltieren vorkommen, z. B. hdm2 81-88-Homologe aus der Maus. Die hdm2-(Protein-)Homologe und die dafür kodierenden Nukleinsäuren können relativ leicht, nämlich direkt und mit geläufigen Isolationsverfahren aus dem jeweiligen Organismus gewonnen werden.

Das Oligopeptid hdm2 81-88 und dessen Derivate können mittels gängiger Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, und die für diese Oligopeptide kodierenden Nukleotidsequenzen können mit bekannten chemischen oder mit molekularbiologischen Verfahren gewonnen werden.

Die erfindungsgemäßen Oligopeptide (hdm2 81-88 und dessen Derivate) eignen sich sowohl zur in-vivo-Induktion von T-Lymphozyten im Patienten als auch zur in-vitro- Induktion und -Expansion entsprechend reaktiver patienteneigener oder patientenfremder T-Lymphozyten.

Für eine in-vivo-Induktion und -Expansion von T-Lymphozyten im Patienten kommen verschiedene Verfahren in Betracht, beispielsweise (a) die Injektion des hdm2 81-88 Oligopeptids und/oder eines oder mehrerer seiner Derivate als reines Peptid oder zusammen mit Adjuvantien oder mit Cytokinen oder in einem geeigneten Freisetzungssystem wie z. B. Liposomen, (b) die Injektion einer oder mehrerer mindestens für das hdm2 81-88 Oligopeptid oder für dessen Derivate kodierenden Nukleinsäuren in "nackter" oder komplexierter Form oder in Form von viralen oder nichtviralen Vektoren oder zusammen mit Freisetzungssystemen wie kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren, (c) die Beladung von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit dem hdm2 81-88 Oligopeptid oder dessen Derivaten oder dazu analogen retro-inversen Peptiden oder Pseudopeptiden, (d) die Beladung von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit dem hdm2-Protein oder Homologen anderer Spezies, so daß infolgedessen das hdm2 81-88 Oligopeptid oder dessen Derivate auf den jeweiligen Zellen präsentiert wird, oder (e) die Transfektion oder Infektion von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit den mindestens für das Peptid oder dessen Derivate kodierenden Nukleinsäuren (wiederum entweder in "nackter" oder komplexierter Form oder in Form von viralen oder nichtviralen Vektoren).

Im Fall einer in-vitro-Induktion und -Expansion werden die in-vitro gewonnenen T- Lymphozyten anschließend dem Patienten per Infusion oder Injektion o. ä. Verfahren zugeführt.

Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung des hdm2 81-88 Oligopeptids und/oder dessen Derivate und/oder dazu analoger retro-inverser Peptide oder Pseudopeptide und/oder wenigstens eines Polynukleotids, das mindestens für das Oligopeptid oder dessen Derivate kodiert, zur Herstellung von Diagnostika - insbesondere MHC-Tetramere oder andere Strukturen, an die wenigstens ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid oder retroinverses Peptid oder Pseudopeptid assoziiert ist - und/oder Prophylaktika und/oder Therapeutika (insbesondere Impfstoffe) für den Nachweis und/oder die Beeinflussung und/oder Generierung und/oder Expandierung und/oder Steuerung des Aktivierungs- und Funktionszustands von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven ZTL.

Als Therapeutika und/oder Prophylaktika kommen insbesondere Impfstoffe oder Injektionen oder Infusionslösungen in Betracht, die als Wirkstoff (a) das hdm2 81-88 Oligopeptid und/oder wenigstens ein Derivat davon und/oder wenigstens ein zu diesem Oligopeptid oder zu dessen Derivat analoges retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid enthalten, und/oder die (b) eine Nukleinsäure enthalten, die mindestens für das hdm2 81-­ 88 Oligopeptid oder mindetens für eines seiner Derivate kodiert, und/oder die (c) in-vitro erzeugte T-Lymphozyten, welche spezifisch gegen das hdm2 81-88 Oligopeptid und/oder dessen Derivate und/oder gegen ein zu diesem Oligopeptid oder zu dessen Derivat(en) analoges retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid gerichtet sind, enthalten.

Zur Herstellung der Diagnostika oder auch der Therapeutika oder auch der Prophylaktika eignen sich insbesondere auch rekombinante DNS- oder RNS-Vektormoleküle, die ein oder mehrere Polynukleotid(e) enthalten, welche für mindestens das hdm2 81-88 Oligopeptid und/oder für mindestens ein Derivat davon kodieren, und die in Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs transkribierbar bzw. exprimierbar sind. Die Erfindung umfaßt deshalb auch solche rekombinanten DNS- oder RNS-Vektormoleküle und Wirtszellen, die diese Vektormoleküle enthalten.

Als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von hdm2 überexprimierenden Zellen können erfindungsgemäß auch polyklonale, monoklonale oder rekombinante Antikörper eingesetzt werden, die gegen das hdm2 81-88 Oligopeptid und/oder gegen dessen Derivat(e) und/oder gegen ein zu dem Oligopeptid oder seinem Derivat analoges retro- inverses Peptid oder Pseudopeptid gerichtet sind oder die mit einem Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) bzw. dessen Derivat(en) bzw. dazu retro-inversen Peptid(en) und/oder Pseudopeptid(en) und HLA-A2 reagieren. Die Verwendung des hdm2 81-88 Oligopeptids und/oder dessen Derivat(e) und/oder eines zu dem Oligopeptid oder einem seiner Derivate analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids für die Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid bzw. retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und der/die betreffende(n) Antikörper an sich sind folglich ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.

Als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von hdm2 überexprimierenden Zellen können erfindungsgemäß auch polyklonale, monoklonale oder rekombinante A2-restringierte T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalente Moleküle eingesetzt werden, die spezifisch für das hdm2 81-88 Oligopeptid und/oder dessen Derivate und/oder für dazu analoge retro-inverse Peptide oder Pseudopeptide sind. Die T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle können autologen, allogenen oder xenogenen Ursprungs sein.

Zum Gegenstand vorliegender Erfindung gehört folglich vorrangig auch:

• - die Verwendung des hdm2 81-88 Oligopeptids und/oder dessen Derivate und/oder dazu analoger retro-inverser Peptide oder Pseudopeptide oder die Verwendung von Polynukleotiden mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens für das hdm2 81-88 Oligopeptid und/oder ein Derivat davon kodiert, zur Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter A2-restringierter T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenter Moleküle mit Spezifität für ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid bzw. retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid,
• - der/die betreffende(n) T-Zellrezeptor(en) an sich und dazu funktionell äquivalente Moleküle,
• - sowie Polynukleotide, die für diese T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle kodieren,
• - Expressionsvektoren mit der Fähigkeit zur Expression dieser T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle.

Die Erfindung umfaßt außerdem Reagenzien zur in-vivo- oder in-vitro-Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven ZTL, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie unter Verwendung des hdm2 81-88 Oligopeptids und/oder wenigstens eines seiner Derivate und/oder wenigstens eines dazu analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids und/oder unter Verwendung wenigstens eines Polynukleotids, das mindestens für das Oligopeptid oder dessen Derivat(e) kodiert und/oder unter Verwendung des hdm2-Proteins oder dazu Homologen anderer Spezies, hergestellt sind. Bei diesen Reagenzien kann es sich insbesondere um Therapeutika, und dabei vor allem um Impfstoffe handeln.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Herstellungs- und Anwendungsbeispielen mit Figuren näher erläutert. Die verwendeten Abkürzungen bedeuten:
A2: humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2"
A2.1: humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2", Subtyp "A2.1"
A2K^b: A2.1/K^b = MHC Klasse I-Molekül aus α₁- und α₂-Domäne von A2 und α₃-Domäne von K^b
ALL: akute lymphatische Leukämie
AML: akute myeloische Leukämie
APS: Ammoniumpersulfat
APZ: antigenpräsentierende Zelle
ATCC: American Type Culture Collection
ATP: Adenosin-5'-triphosphat
B-ALL: B-Zell-ALL
bkgd: unspezifische Fluoreszenzintensität
bp: Basenpaare
BSA: Rinderserumalbumin
C-terminal: Carboxyl-terminal
CD: Differenzierungscluster
CD8: humaner CD8α/β-Korezeptor
CDR: komplementaritätsbestimmende Region
CLL: chronisch lymphatische Leukämie
CML: chronisch myeloische Leukämie
CMV: Cytomegalievirus
Con A: Concanavalin A
DMSO: Dimethylsulfoxid
DNA: Desoxyribonukleinsäure
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
DTT: Dithiothreitol
DZ: dendritische Zellen
E : T: Effektor- zu Zielzell-Verhältnis
EBV: Epstein-Barr-Virus
EDTA: Ethylendiamintetraacetat
ER: Endoplasmatisches Retikulum
FACS: Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sortierer
FCS: fötales Kälberserum
FITC: Fluoreszein-Isothiocyanat
Flu M1: A/PR/8/34 Influenza Virus-Matrixprotein M1
G-418: Geneticin (Neomycin-Antibiotikum)
GM-CSF: Granulozyten-Makrophagen-colony stimulating factor
HBV pol: Hepatitis B Virus-Polymerase
hdm2: humanes Homolog von mdm2
HEPES: N-(2-Hydroxyethyl)piperizan-N'-ethansulfonsäure
HLA: humanes Leukozyten-Antigen
HLA-A2.1: humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2", Subtyp "A2.1"
HPLC: Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
IFA: inkomplettes Freundsches Adjuvans
IFN: Interferon
Ig: Immunglobulin
IL: Interleukin
kb: Kilobasenpaare
K^b: H-2K^b
kDa: kilo Dalton
LB: Luria-Bertani
LCL: lymphoblastoide Zellinie
LMP: low molecular mass polypeptide
LPS: Lipopolysaccharid
mdm2: mouse double minute 2
MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex
Mio: Million
mut: mutiert
N-terminal: Amino-terminal
OD: optische Dichte
PBMC: mononukleäre Zellen des peripheren Bluts
PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PG-E₂: Prostaglandin E₂
PHA: Phytohämagglutinin
PMSF: Phenylmethylsulfonylfluorid
PVDF: Polyvinylidendifluorid
Rad: radiation absorbed dose
RP: reverse phase
SDS: Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SL: spezifische Lyse
SV-40: Simian Virus-40
TAA: tumorassoziierte(s) Antigen(e)
TAP: Transporter assoziiert mit Antigenprozessierung
TBE: Tris-Borsäure-EDTA
TE: Tris-EDTA
TEMED: N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TFA: Trifluoressigsäure
TIL: Tumor-infiltrierende Lymphozyten
TNF-α: Tumor Nekrosis Faktor-α
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TZR: T-Zellrezeptor
u: internationale Einheiten (units)
Upm: Umdrehungen pro Minute
VSV-N: Vesikuläres Stomatitis-Virus-Nukleoprotein
v/v: Volumen pro Volumen
wt: Wildtyp
w/v: Masse pro Volumen
ZTL: zytotoxische T-Lymphozyten

Abkürzungen für Aminosäuren

A: Alanin
C: Cystein
D: Aspartat
E: Glutamat
F: Phenylalanin
G: Glycin
H: Histidin
I: Isoleucin
K: Lysin
L: Leucin
M: Methionin
N: Asparagin
P: Prolin
Q: Glutamin
R: Arginin
S: Serin
T: Threonin
V: Valin
W: Tryptophan
Y: Tyrosin

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Bindung selektierter synthetischer hdm2-Peptide. Die relative A2.1- Bindungsaffinität (angegeben als % Inhibition) wurde bestimmt durch die Fähigkeit des jeweiligen Peptids, die A2.1-Bindung des Peptids p53 264-272 zu inhibieren. Dies wurde anhand der lnhibition der p53-spezifischen ZTL-Lyse von p53 264-272-beladenen EA2-Zielzellen durch hdm2-Peptide unterschiedlicher Konzentration gemessen. Die Inhibitionswerte für die Peptide Flu M1 58-66 und VSV-N 52-59 wurden aus 7 unabhängigen Experimenten gemittelt.

Fig. 2: A2.1-restringierte Immunogenität synthetischer hdm2-Peptide in A2K^b- oder CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen. Die Immunogenität wurde anhand der lytischen Aktivität der in diesen Mäusen durch Peptid-Immunisierung induzierten ZTL in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest überprüft. Als Zielzellen wurden mit 2 µg Peptid beladene oder unbeladene T2A2K^b-Zellen eingesetzt. Dargestellt sind repräsentative spezifische Lysen individueller ZTL-Kulturen aus durchschnittlich 4 immunisierten Mäusen.

Fig. 3: H-2^b-restringierte Immunogenität synthetischer hdm2-Peptide in A2K^b- oder CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen. Die Immunogenität wurde anhand der lytischen Aktivität der in diesen Mäusen durch Peptid-Immunisierung induzierten ZTL in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest überprüft. Als Zielzellen wurden mit 2 µg Peptid beladene oder unbeladene EL4-Zellen eingesetzt. Die Daten repräsentieren die spezifischen Lysen der in Abb. 2 ausgewählten ZTL-Kulturen.

Fig. 4: Immunogenität des synthetischen Peptids hdm2 81-88 in A2.1 und CD8 × A2K^b- transgenen Mäusen. Die lytische Aktivität der in diesen Mäusen durch Immunisierung mit hdm2 81-88 induzierten I° ZTL A2 81 (⚫) und CD8 × A2K^b 81 (○) wurde in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest bestimmt. Zielzellen waren: bei den angegebenen Peptidkonzentrationen inkubierte T2-Zellen (A), Saos-2- Zellen (▲) und hdm2-transfizierte Saos-2/cl 6 (Δ) (B, C).

Fig. 5: hdm2 81-88-spezifische ZTL-Linien: Effizienz der Peptiderkennung, Peptidspezifität und A2-Restriktion. Aus A2.1- und CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen wurden durch wiederholte in vitro-Stimulation mit hdm2 81-88-Peptid die hdm2-reaktiven ZTL-Linien A2 81 (⚫) und CD8 × A2K^b 81 (○) etabliert und in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest getestet. Zielzellen waren: bei den angegebenen Peptidkonzentrationen inkubierte T2-Zellen (A), hdm2 81-88- beladene (○), Flu M1 58-66-beladene (∎) und unbeladene (⚫) T2-Zielzellen sowie hdm2 81-88-beladene (Δ) und unbeladene (▲) EL4-Zellen (B, C).

Fig. 6: hdm2-Protein-Expression von hdm2-Transfektanten. Durch Transfektion von Saos-2- und EL4-Zellen wurden die hdm2-Transfektanten Saos-2/cl 5 und 6 sowie EA2/cl 13 generiert. Nukleäre Extrakte dieser Zellen wurden gelelekirophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran transferiert, mit einem anti- hdm2-Antikörper inkubiert und photochemisch sichtbar gemacht. EU-3 fungierte als Positivkontrolle. Die Pfeile markieren das 90 kDa Volllängen-hdm2-Protein und eine 75 kDa hdm2-"splice"-Variante.

Fig. 7: A2.1-Expression von Saos-2 hdm2-Transfektanten. Saos-2-Zellen und hdm2- transfizierte Saos-2/cl 5- und Saos-2/cl 6-Zellen wurden bezüglich ihrer A2.1- Expression nach Antikörper-Markierung im FACS analysiert. Die Fluoreszenz- Intensitäten der mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper BB7.2 (A2.1) oder Serum (bkgd) sowie einem FITC-konjugierten Sekundär-Antikörper gefärbten Zellen sind dargestellt. Die Fluoreszenz-Intensität ist als A2.1-Expression angegeben.

Fig. 8: ZTL-Erkennung von Saos-2 hdm2-Transfektanten. Die A2.1-restringierten und hdm2 81-88-spezifischen ZTL A2 und CD8 × A2K^b 81 sowie die allo-A2.1- reaktiven ZTL CD8 allo A2 und die Flu M1 58-66-spezifischen ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T- Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen folgende Zielzellen getestet: Saos-2 (⚫), hdm2-transfizierte Saos-2/cl 5 (▲) und Saos-2/cl 6 (∎); sämtliche Zielzellen wurden wie dargestellt (○, Δ, ) mit dem anti-A2.1- monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 9: ZTL-Erkennung von EA2 hdm2-Transfektanten. ZTL A2 81, ZTL CD8 × A2K^b 81, ZTL CD8 allo A2 und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen folgende Zielzellen getestet: A2.1-transfizierte EL4-Zellen (EA2) (⚫) und EA2-Zellen, die zusätzlich mit dem hdm2-Gen kotransfiziert wurden (EA2/cl 13) (▲); die Zielzellen wurden wie dargestellt (○, Δ) mit dem anti-A2.1- monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 10: ZTL-Erkennung von SW480-hdm2-Transfektanten. ZTL CD8 × A2K^b 81, ZTL CD8 allo A2 und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen folgende Zielzellen getestet: SW480-Zellen (SW480) (⚫) und hdm2-transfizierte SW480-Zellen (SW480/cl 2) (▲); die Zielzellen wurden wie dargestellt (○, Δ) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 11: Das Peptid hdm2 81-88 ist das natürliche A2.1-präsentierte Epitop für hdm2- reaktive ZTL. Natürliche Peptidextrakte aus MHC Klasse I-Molekülen von Saos- 2/cl 6 und das synthetische hdm2 81-88-Peptid wurden HPLC-fraktioniert und die individuellen HPLC-Fraktionen unter Serumfreien Bedingungen für 45 min mit ⁵¹Cr-markierten T2-Zielzellen inkubiert. Die beladenen T2-Zellen wurden einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest mit ZTL CD8 × A2K^b 81 bei einem E : T- Verhältnis von 20 : 1 unterzogen. Das HPLC-Profil (Absorption bei 214 nm) und die spezifische Lyse (Balken) der mit den individuellen HPLC-Fraktionen beladenen T2-Zielzellen sind in Abhängigkeit von der Retentionszeit dargestellt.

Fig. 12: hdm2-Potein-Expression humaner A2-positiver Tumor-Zellinien. Von EU-3, UoC-B11 und BV173 (prä-B-ALL) sowie U-937 (histiozytisches Lymphom) und OPM-2 (Plasmozytom) wurden nukleäre Extrakte präpariert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran transferiert, mit einem anti- hdm2-Antikörper inkubiert und photochemisch sichtbar gemacht. Die Pfeile markieren das 90 kDa Volllängen-hdm2-Protein und eine 75 kDa hdm2-"splice"- Variante.

Fig. 13: hdm2-Potein-Expression humaner A2-negativer Tumor-Zellinien. Von den B- ALL-Linien UoC-B4, SUP-B 15 und EU-1 wurden nukleäre Extrakte präpariert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran transferiert, mit einem anti­ hdm2-Antikörper inkubiert und photochemisch sichtbar gemacht. EU-3 fungierte als Positiv-, Saos-2 als Negativkontrolle. Die Pfeile markieren das 90 kDa Volllängen-hdm2-Protein und eine 75 kDa hdm2-"splice"-Variante.

Fig. 14: ZTL-Erkennung p53/143-transfizierter Saos-2-Zellen. Die A2.1-restringierten und hdm2 81-88-spezifischen ZTL CD8 × A2K^b 81 sowie die allo-A2.1-reaktiven ZTL CD8 allo A2 und die Flu M1 58-66-spezifischen ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6- stündigen Zytotoxizitätstest gegen folgende Zielzellen getestet: Saos-2 mit (○) und ohne (⚫) IFN-γ-Behandlung (20 ng/ml für 20 h) sowie p53/143-transfizierte Saos-2-Zellen (Saos-2/143) mit (∎) und ohne (▲) IFN-γ-Behandlung. Saos- 2/143-Zellen wurden wie dargestellt (Δ, ) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 15: ZTL-Erkennung der hdm2-überexprimierenden A2-positiven Tumor-Zellinie EU-3. ZTL A2 81, ZTL CD8 × A2K^b 81, I° ZTL CD8 allo A2 und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T- Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die prä-B-ALL- Zellinie EU-3 mit (○) und ohne (⚫) PA2.1 getestet.

Fig. 16: ZTL-Erkennung von hdm2-überexprimierenden A2-positiven Leukämie- Zellinien. ZTL CD8 × A2K^b 81, I° ZTL CD8 allo A2 und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die Zielzellen UoC-B11 (⚫) und BV173 (▲) (prä-B-ALL) getestet. Sämtliche Zielzellen wurden wie dargestellt (○, Δ) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 17: ZTL-Erkennung von hdm2-überexprimierenden A2-positiven Lymphom- und Plasmozytom-Zellinien. ZTL CD8 × A2K^b 81, ZTL CD8 allo A2 N und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T- Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die Zielzellen OPM-2 (⚫) (Plasmozytom) und U-937 (▲) (histiozytisches Lymphom) getestet. Sämtliche Zielzellen wurden wie dargestellt (○, Δ) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 18: A2-negative hdm2-überexprimierende Leukämie-Zellinien werden nicht erkannt. ZTL CD8 × A2K^b 81, allo-A2.1-reaktive ZTL und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6- stündigen Zytotoxizitätstest gegen die prä-B-ALL-Zellinien UoC-B4 (⚫), EU-1 (▲) und SUP-B15 (○) getestet. Die A2-positive prä-B-ALL-Linie EU-3 (Δ) fungierte als Positivkontrolle.

Fig. 19: hdm2-Potein-Expression lymphohämopoetischer Zellen. Folgende Zellen wurden untersucht: die EBV-LCL LG-2, PHA- und Con A-Blasten, der Tyrosinase-spezifische ZTL-Klon IVSB, ruhende T- und B-Zellen, ruhende PBMZ. Nukleäre Extrakte wurden präpariert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran transferiert, mit einem anti-hdm2-Antikörper markiert und photochemisch sichtbar gemacht. EU-3 fungierte als Positiv-, Saos-2 als Negativkontrolle. Die Pfeile markieren das 90 kDa Vollängen-hdm2-Protein und eine 75 kDa hdm2-"splice"-Variante.

Fig. 20: ZTL-Erkennung von transformierten lymphohämopoetischen Zellen. ZTL CD8 × A2K^b 81, allo-A2.1-reaktive ZTL und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen folgende Zielzellen getestet: EBV-LCL LG-2 (⚫), PHA- Blasten (▲) und Con A-Blasten (∎). Sämtliche Zielzellen wurden wie dargestellt (○, Δ, ) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 21: Fehlen substantieller Erkennung aktivierter reifer dendritischer Zellen (DZ). ZTL A2 81, ZTL CD8 × A2K^b 81, allo-A2.1-reaktive ZTL und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T- Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen aktivierte reife DZ (⚫) und die gleichen Zellen beladen mit hdm2 81-88-Peptid (10 µM) (▲) getestet. Die Zielzellen wurden wie dargestellt (○) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 22: Fehlen substantieller Erkennung Antigen-aktivierter T-Zellen. ZTL A2 81, ZTL CD8 × A2K^b 81, allo-A2.1-reaktive ZTL und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6- stündigen Zytotoxizitätstest gegen Tyrosinase-spezifischer ZTL-Klon IVSB (⚫) und die gleichen Zellen beladen mit hdm2 81-88-Peptid (10 µM) (▲) getestet. Die Zielzellen wurden wie dargestellt (○) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 23: Ruhende lymphohämopoetische Zellen werden nicht erkannt. ZTL A2 81, ZTL CD8 × A2K^b 81, ZTL CD8 allo A2 und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen ruhende T-Zellen (⚫) und die gleichen Zellen beladen mit hdm2 81-88-Peptid (10 µM) (▲) getestet. Die Zielzellen wurden wie dargestellt (○) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 24: Ruhende lymphohämopoetische Zellen werden nicht erkannt. ZTL A2 81, ZTL CD8 × A2K^b 81, ZTL CD8 allo A2 und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen ruhende B-Zellen (⚫) und die gleichen Zellen beladen mit hdm2 81-88-Peptid (10 µM) (▲) getestet. Die Zielzellen wurden wie dargestellt (○) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 25: Ruhende lymphohämopoetische Zellen werden nicht erkannt. ZTL A2 81, ZTL CD8 × A2K^b 81, ZTL CD8 allo A2 und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E : T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen PBMZ (⚫) und die gleichen Zellen beladen mit hdm2 81-88-Peptid (10 µM) (▲) getestet. Die Zielzellen wurden wie dargestellt (○) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.

Fig. 26: Für das hdm 2-Protein 2 kodierende Plasmid pCHDMIA.

Fig. 27: Für A2.1 kodierende Plasmid pSV2-A2.1.

A) In den Beispielen erwähnte Materialien (1) Mäuse

Transgene Mäuse, die das humane MHC Klasse I-Transgen HLA-A2.1 (A2.1) exprimieren, wurden mit fachüblichen Methoden in den C57BL/6-Hintergrund eingekreuzt (Irwin et al., 1989). Hierfür wurden folgende Stämme verwendet:

• 1. A2.1/K^b (A2K^b)-transgene Mäuse - sie sind homozygot für ein chimäres MHC Klasse I-Transgen, das sich aus den humanen α₁- und α₂-Domänen von A2.1 und aus der α₃-Domäne von H-2K^b der Maus zusammensetzt, sowie für das H-2^b-Gen.
• 2. huCD8α/β (CD8)-transgene Mäuse - sie sind homozygot für die α- und β-Kette des humanen CD8-Korezeptors.
• 3. [huCD8α/β × A2.1/K^b]_F1 (CD8 × A2K^b)-transgene Mäuse - sie exprimieren heterozygot das chimäre A2K^b-Molekül und zusätzlich die α- und β-Kette des humanen CD8. Außerdem sind sie homozygot für H-2^b.
• 4. A2.1-transgene Mäuse (([A2.1 × C57BL/6] × C57BL/6)_F1-transgen) - sie exprimieren die α₁-, α₂- und α₃-Domänen des humanen A2.1-Moleküls heterozygot und sind homozygot für H-2^b.
• 5. C57BL/6-Mäuse - sie besitzen den H-2^b-Phänotyp.

(2) Synthetische Peptide

Synthetische Peptide wurden vom "Scripps Research Institute" und von SNPE (Neosystem laboratoire, Straßburg, Frankreich) bezogen. Die Reinheit der vom "Scripps Research Institute" mit dem automatischen Peptid-Synthese-Gerät 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisierten Peptide betrug mindestens 70%, die Reinheit der von SNPE synthetisierten Peptide mindestens 75%. Reinheit und korrekte Aminosäurezusammensetzung aller Peptide wurde durch HPLC-Analyse sowie massenspektrometrisch überprüft. Lyophilisierte und entsalzte Peptide vom "Scripps Research Institute" wurden nach Mengenkontrolle in Abhängigkeit von der Peptidsequenz zu 10 mg/ml in DMSO, H₂O, Gemischen aus DMSO und H₂O, oder in 0,1%iger NaOH gelöst. Nichtentsalzte Peptide von SNPE wurden grundsätzlich in DMSO zu 10 mg/ml gelöst. Die Lagerung erfolgte in Aliquots bei -20 bis -80°C. Zusätzlich zu den in Tab. 1 dargestellten Peptiden wurde ein Peptid, das die Residuen 128-140 des Hepatitis B-Virus Core-Proteins repräsentiert (TPPAYRPPNAPIL), synthetisiert.

(3) Antikörper

Für die Blockade von A2.1 wurde der von der Hybridom-Zellinie PA2.1 (ATCC HB-117) produzierte monoklonale Antikörper verwendet.

Zur HLA-Typisierung von Tumor-Zellinien und von A2-transgenen Mäusen wurde der von der Maus-Hybridom-Linie BB7.2 (ATCC HB-82) produzierte monoklonale Antikörper eingesetzt.

Für die Analyse der hdm2-Expression von Zellen wurde der im Handel erhältliche anti- hdm2 monoklonale Antikörper IF2 (Maus IgG_2b) (Oncogene Reasearch Products, Cambridge, MA) verwendet.

Zur Detektion von monoklonalen Antikörpern der Maus in der Durchflußzytometrie wurde ein FITC-konjugierter polyklonaler Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG F(ab)₂-Fragment; 1 : 30-Verdünnung; Jackson [Dianova], Hamburg) eingesetzt. Die Detektion des monoklonalen Antikörpers IF2 erfolgte mit einem Peroxidase("Horse Radish Peroxidase")-konjugierten Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG; Pierce, IL).

(4) Zellen, Zelllinien und Transfektanten

Sämtliche Zellen und Zelllinien wurden in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) in Gegenwart von 10% hitzeinaktiviertem (30 min, 56°C) FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich), 1% 0,2 M L-Glutamin (Biowhittaker) und 50 µg/ml Gentamycin (Gibco BRL, Eggenstein) kultiviert. Zur Propagation von Zellen und ZTL-Linien aus der Maus wurde dem Medium zusätzlich β-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 5 × 10^-5 M zugesetzt. Zur Kultivierung Neomycin-transfizierter Zellen wurde dem Medium Geneticin (G-418) (Gibco BRL) in einer effektiven Konzentration von 280-560 µg/ml zugegeben. Alle Zellen wurden bei 37°C und 5% CO₂ in Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre in Zellkulturflaschen oder 24-Loch-Platten (ZTL) (Corning Costar, Bodenheim) kultiviert.

(4.1) Zellen

Zur Gewinnung von mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMZ) wurde das Blut eines gesunden A2-positiven Spenders mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) im Verhältnis 1 : 3 verdünnt und mit dem gleichen Volumen Ficoll (Seromed Biochrom, Berlin) unterschichtet. Nach Zentrifugation (1500 Upm, 5°C, 7 min) wurden die PBMZ aus der Interphase isoliert und gewaschen.

Con A- und PHA-aktivierte Lymphoblasten wurden mit fachüblichen Verfahren (vgl. Theobald et al., 1995) durch 3-tägige Stimulation von A2-positiven PBMZ mit Con A (10 µg/ml) und PHA (1,5% w/v) (Gibco BRL, Eggenstein) generiert.

Die Gewinnung ruhender T- und B-Zellen erfolgte nach negativer Selektion von A2- positiven PBMZ mit Antikörper-beschichteten "beads" (Dynal, Hamburg). Zur Isolierung von T-Zellen wurden die PBMZ nach Anweisung des Herstellers mit anti-CD 19- und anti-CD14-"beads" inkubiert, zur Isolierung von B-Zellen mit anti-CD2- und anti-CD14- "beads".

Dendritische Zellen (DZ) wurden mit fachüblichen Methoden aus PBMZ eines A2- positiven Spenders generiert. Nach Inkubation der PBMZ für 45 min bei 37°C in einer Petrischale wurden nicht-adhärente Zellen abgespült und die adhärenten PBMZ in X- Vivo 15 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) aufgenommen, das mit 1,5% autologem hitzeinaktiviertem Plasma, 1000 U/ml IL-4 (PBH Strathmann Biotech, Hannover) und 800 U/ml GM-CSF ("Leucomax"; Sandoz, Nürnberg) supplementiert wurde (Jonuleit et al., 1997). An Tag 3 und 5 erfolgte ein teilweiser Mediumwechsel unter Zugabe von 1000 U/ml IL-4 und 1600 /ml GM-CSF, jedoch ohne autologes Plasma. Die adhärenten PBMZ differenzierten zu nicht-adhärenten "Dendriphagen". An Tag 7 wurden diese unreifen DZ in X-Vivo 15 mit 1,5% autologem Plasma ausgesät und mit 500 U/ml IL-4, 800 U/ml GM-CSF, 10 ng/ml TNF-a (Genzyme, Cambridge, MA), 10 ng/ml IL-1β (PBH Strathmann Biotech), 1000 U/ml IL-6 (PBH Strathmann Biotech) und 1 µg/ml PG-E₂ ("Minprostin E2"; Pharmacia Biotech, Freiburg) behandelt (Jonuleit et al., 1997). Die reifen DZ exprimierten an Tag 9 und 10 HLA-DR, CD58, CD80, CD83 und CD86.

Ein A2.1-positiver ZTL-Klon "IVSB" mit Spezifität für das Tyrosinase-Peptid 369-377 wurde mit fachüblichen Methoden erzeugt und bereitgestellt.

Sämtliche aufgeführten Zellen dienten als Zielzellen im Zytotoxizitätstest ("ZTL- Erkennung").

(4.2) Zellinien und Transfektanten

Für die hier beschriebenen Untersuchungen wurden die nachfolgend aufgelisteten, gemäß (4.1) hergestellten oder im Stand der Technik bekannten und jederzeit erhältlichen Zellinien und Transfektanten eingesetzt:

• - die humane A2.1-positive T2-Zellinie ist ein B/T-Zellhybridom der Fusionspartner 721.147 und CEM (Salter und Cresswell, 1986),
• - T2-Zellen, die gemäß Theobald et al., 1995, mit dem A2K^b-Gen transfiziert wurden (T2A2K^b),
• - die Thymom-Zellinie EL4 aus der C57BL/6-Maus (Theobald et al., 1995),
• - EL4-Zellen, die mit A2.1 transfiziert waren (EA2) (Theobald et al., 1995),
• - die humane T-Zell Leukämie-Linie Jurkat (Theobald et al., 1995),
• - Jurkat-Zellen, die mit A2.1 transfiziert waren (JA2) (Theobald et al., 1995),
• - die konstitutiv A2.1-positive und p53-defektmutante Osteosarkom-Zellinie Saos-2 (Dittmer et al., 1993),
• - Saos-2-Zellen, die mit humanem p53-Gen transfiziert wurden, das eine Mutation am Residuum 143 (V → A) aufweist (Dittmer et al., 1993);
• - die humane hdm2-überexprimierende Leukämie-Linie EU-3 (Prä-B-ALL, A2-positiv) (Zhou et al., 1995),
• - die humane hdm2-überexprimierende Leukämie-Linie UoC-B11 (Prä-B-ALL, A2-positiv) (Zhou et al., 1995),
• - die humane hdm2-überexprimierende Leukämie-Linie EU-1 (Prä-B-ALL, A2-negativ) (Zhou et al., 1995),
• - die humane hdm2-überexprimierende Leukämie-Linie UoC-B4 (Prä-B-ALL, A2-negativ) (Zhou et al., 1995),
• - die humane hdm2-überexprimierende Leukämie-Linie SUP-B15 (Prä-B-ALL, A2-negativ) (Zhou et al., 1995),
• - die A2-positive Zellinie Prä-B-ALL BV173 (DSM ACC 20; DSMZ, Braunschweig, Deutschland),
• - die A2-positive histiozytische Lymphom-Zellinie U-937 (ATCC CRL-1593; Rockville, MA, USA),
• - die A2-positive Zellinie Plasmozytom OPM-2 (DSM ACC 50; DSMZ, Braunschweig, Deutschland),
• - die EBV-transformierte lyrnphoblastoide und A2-positive Zellinie LG-2,
• - die humane A2-positive Kolonkarzinom-Zellinie SW480 (DKFZ, Heidelberg, BRD).

Sämtliche aufgeführten Zellen dienten als Zielzellen im Zytotoxizitätstest. Die Saos-2- und Saos-2/143-Zielzellen wurden für Zytotoxizitätstests für 20 Stunden mit rekombinantem IFN-γ (R & D Systems, Minneapolis, MN) in einer Konzentration von 20 ng/ml vorbehandelt.

B) In den Beispielen verwendete Methoden (1) Transfektion (1.1) Molekularbiologische Methoden

Um Säugerzellen mit dem hdm2- oder A2.1-Gen stabil zu transfizieren wurde das für hdm2 kodierende Plasmid pCHDMIA gemäß Fig. 26 (vgl. Wu et al., 1993) und das für A2.1 kodierende Plasmid pSV2-A2.1 gemäß Fig. 27 (vgl. Irwin et al., 1989) eingesetzt. Das pCHDMIA-Plasmid kodiert zusätzlich für Neomycin- und Ampicillin-Resistenz, das pSV2-A2.1-Plasmid zusätzlich für Ampicillin-Resistenz. Die hdm2-cDNA steht unter Kontrolle des CMV-Promotors, die A2.1-cDNA unter Kontrolle des SV-40-Promotors.

Für die Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA wurden mit dem Fachmann geläufigen Verfahren kompetente Zellen des E. coli-Stamms DH5α hergestellt. Zu den kompetenten Bakterienzellen wurde DNA gegeben und nach 15- minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen einem Hitzeschock für 2 min bei 42°C ausgesetzt. Nach Zugabe von LB-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, H₂O ad 1000 ml, pH 7,5) wurde der Ansatz für 20 min bei 37°C inkubiert und schließlich auf LB-Agarplatten (1,5% w/v Japan-Agar; Merck, Darmstadt) in Gegenwart von 100 µg/ml Ampicillin (Boehringer Mannheim, Mannheim) ausplattiert und bei 37°C bebrütet. Einzelkolonien wurden gepickt, in LB-Medium mit Ampicillin ausgesät und bei 37°C schüttelnd (220 Upm) inkubiert (Vorkultur). Anschließend wurden die Zellen geerntet und einer Plasmid-Präparation unterzogen. Die Präparation erfolgte mit einem "QIAprep Spin Miniprep Kit" nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden). Plasmid-tragende Transformanten wurden durch Restriktionsanalyse mit geeigneten Restriktionsendonukleasen und nachfolgende Agarose-Gelelektrophorese identifiziert. Als Gelmaterial wurde 0,6-1,5%ige Agarose (w/v) verwendet, die in TBE- Puffer (50 mM Tris-Borat, 2,5 mM Na₂-EDTA, pH 8,5) angesetzt wurde. Die positiven Transformanten wurden anschließend in größerem Maßstab (Hauptkultur) in Ampicillin- haltigem LB-Medium über Nacht bei 37°C kultiviert. Nach der Zellernte wurden die Plasmide mit einem "QIAGEN Plasmid Maxi Kit" nach Herstelleranweisung präpariert (Qiagen). Die resultierende DNA-Lösung wurde photometrisch durch Messung der Absorption (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm in Quarzküvetten auf ihre Konzentration und Reinheit überprüft. Nach erneuter analytischer Restriktion und Agarose-Gelelektrophorese wurde die DNA für die Elektroporation, nicht aber für die Lipofektion, linearisiert. Das Plasmid pCHDMIA wurde mit der Restriktionsendonukleasen PvuI (MBI Fermentas, St. Leon Rot) unter Zusatz von BSA (0,2 mg/ml) und das pSV2-A2.1-Plasmid mit EcoRI (MBI Fermentas) geschnitten. Zur Kontrolle der Restriktion wurden die Proben gelelektrophoretisch analysiert. Um die Restriktionsendonukleasen aus den DNA-Lösungen zu eliminieren, wurde eine Extraktion durchgeführt. Dazu wurden die Proben mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 24 : 1, v/v/v; Roth, Karlsruhe) versetzt und nach guter Durchmischung zentrifugiert (14000 Upm, 4 min, Raumtemperatur). Die DNA- haltige wäßrige Oberphase wurde isoliert und einer erneuten Extraktion unterzogen. Zur Fällung der DNA wurde die DNA-Lösung mit 1/10 Volumen Na-Acetat (3 M) und nach Durchmischung mit 2 Volumen Ethanol (96%, v/v, -20°C) versetzt. Im Anschluß an eine einstündige Inkubation bei -20°C wurden die Proben für 20 min bei 4°C abzentrifugiert und mit etwa 2 Volumen Ethanol (70%, v/v, -20°C) kurz gewaschen. Nach Trocknen des DNA-Pellets an der Luft wurde die DNA in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM Na₂-EDTA, pH 8) gelöst und bei -20°C gelagert.

(1.2) Transfektionsmethoden

Für die stabile Transfektion von Säugerzellen wurde DNA von hoher Reinheit eingesetzt, die einen OD-Quotienten 260/280 nm von mindestens 1,8 aufwies.

a) Lipofektion

Die adhärenten Saos-2- und SW480-Zellen wurden in Petrischalen kultiviert (Greiner, Frickenhausen) und waren am Tag der Transfektion zu 30-50% konfluent (ca. 15 Mio Zellen/78 cm²-Schale). Die Durchführung erfolgte unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Lipofektionskits (Gibco BRL, Eggenstein) modifiziert nach Anweisung des Herstellers. In 12 ml-Schnappdeckelröhrchen aus Polystyrol (Corning Costar, Bodenheim) wurden 30 µg DNA mit 1,5 ml Opti-Mem I (Gibco BRL) (Ansatz A) oder 60 µl Lipofektin (Gibco BRL) mit 0,3 ml Opti-Mem I (Ansatz B) vermischt und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Ansätze A und B wurden gemischt (A/B) und für weitere 10-15 min inkubiert. Anschließend wurde zum Ansatz A/B RPMI 1640 (1% Glutamin) (Biowhittaker, Verviers, Belgien), in einem Endvolumen von insgesamt 2-6 ml zugegeben. Diese DNA und Lipofektin enthaltende Lösung wurde nach Durchmischung über die zwischenzeitlich mit RPMI 1640 (1% Glutamin) gewaschenen Zellen verteilt. Nach mindestens 5-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ unter Wasserdampfsättigung wurde das DNA-haltige Medium abgenommen und die Zellen mit 10 ml Zellkulturmedium (s. 2.4) überschichtet. Im Anschluß an eine weitere Inkubation für ca. 24 Stunden wurden die transflzierten Zellen 1 : 2 in Selektionsmedium (Zellkulturmedium mit 0,56 mg/ml G-418 [Gibco BRL]) selektiert. Zweimal pro Woche wurde ein Wechsel des Selektionsmediums durchgeführt. Nach 3-4 Wochen wurden nach wiederholtem Waschen der Petrischalen mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) neomycinresistente Klone isoliert und in eine 48-Loch- Platte überführt. Die Transfektanten wurden letztlich in Zellkulturflaschen überführt und auf ihre hdm2- und A2.1-Expression getestet.

b) Elektroporation

Zur Kotransfektion der Suspensions-Zellinie EL4 mit pCHDMIA- und pSV2-A2.1-Plasmiden wurden 10 Mio EL4-Zellen gewaschen, in 0,5 ml RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) und 1% FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) resuspendiert und in 4 mm-Küvetten (BioRad Laboratories, München) pipettiert. 20 µg linearisierte DNA des pSV2-A2.1-Plasmids und 4,5 µg des linearisierten pCHDMIA- Plasmids wurden vermischt und anschließend zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden bei 1200 µFarad und 300 Volt für 2 ms in einem "Gene Pulser" (Fischer, Heidelberg) elektroporiert. Anschließend wurden die Zellen in 96-Loch-Platten seriell mit Zellkulturmedium (s. 2.4) verdünnt und für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ unter Wasserdampfsättigung kultiviert. Es folgte die Zugabe von G-418 (Gibco BRL, Eggenstein) in einer effektiven finalen Konzentration von 560 µg/ml. Wöchentlich wurde ein Wechsel des Selektionsmediums durchgeführt. Nach etwa 2-3 Wochen wurden die neomycinresistenten Transfektanten-Klone zunächst in 24-Loch-Platten, später in Zellkulturflaschen überführt, bis sie schließlich auf die Expression von hdm2 und A2.1 überprüft wurden.

(2) Durchflußzytometrie

Die A2.1-Expression von Zellen, Zellinien und Transfektanten wurde im Fluoreszenz- aktivierten Zell-Sortierer (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, CA) gemessen. Jeweils 0,5 Mio Zellen wurden abzentrifugiert und mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper BB7.2 (oder RPMI 1640, 10% FCS, s. 2.4) in einem Volumen von 50 µl markiert (Lustgarten et al., 1997). Nach einstündiger Inkubation auf Eis wurden die Ansätze zweimal mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) gewaschen und die Zellen anschließend mit einem FITC-konjugierten Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG F_ab-Fragment; 50 µl einer 1 : 30-Verdünnung in PBS) gegengefärbt. Nach 25 min Inkubation auf Eis wurden die Proben zweimal mit PBS gewaschen und schließlich in PBS und 1% Formalin fixiert. Die Fluoreszenz-Aktivität der im Vorwärtsstreulicht selektierten Zellpopulationen wurde im FACS ermittelt.

(3) Westernblot a) Nukleäre Proteinextraktion

Sämtliche Arbeitsschritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) gewaschen (1500 Upm, 5°C, 7 min) und anschließend in Puffer A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl) in Anwesenheit von Protease-Inhibitoren (s. u.) resuspendiert. Zur Lyse der Zellmembranen wurden 2 µl PufferA/Mio Suspensionszellen oder 4 µl Puffer A/Mio adhärente Zellen eingesetzt. Die Lösung wurde nach 10 min Inkubation auf Eis zentrifugiert (14000 Upm, 4°C, 10 s). Nach erneuter Aufnahme, Inkubation und Zentrifugation wurden die Zellkerne in Puffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl₂, 0,42 M NaCl, 0,2 mM EDTA und 25% Glyzerin) in Anwesenheit der Protease-Inhibitoren resuspendiert. Im Anschluß an eine Inkubation für 30 min auf Eis wurde die Lösung für 30 min zentrifugiert. Die Überstände enthielten die nukleären Proteine und wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren, bevor sie bei -80°C gelagert wurden.

Puffer A und C wurden folgende bei -20°C gelagerte Protease-Inhibitoren zugesetzt: 1,5 µl/ml Peptstatin A (1 mg/ml in 96% Ethanol), 1 µl/ml Aprotinin (10 mg/ml in H₂O), 1 µl/ml Leupeptin (10 mg/ml in Methanol), 1 µl/ml DTT (1 M in H₂O), 10 µl/ml PMSF (17,4 mg/ml in Isopropanol).

b) Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung wurde mit den dem Fachmann geläufigen Verfahren (siehe Bradford, 1976) durchgeführt. Die Proteinkonzentration der nukleären Extrakte wurde photometrisch als Extinktion bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen. 1 µl der Probe wurde zusammen mit 800 µl H₂O und 200 µl "BioRad- Protein-Assay" (BioRad Laboratories, München) in Gegenwart von Protease-Inhibitoren vermischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anhand einer Eichgeraden, die mit BSA (1 mg/ml) aufgenommen wurde, konnte der Proteingehalt ermittelt werden.

c) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS- PAGE wurde nach dem für den Fachmann geläufigen Verfahren durchgeführt. Folgende Lösungen und Puffer wurden für die Gelherstellung verwendet:

• 1. Trenngel (8%): 8,97 ml H₂O, 4,8 ml Trenngelpuffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 0,4% SDS), 5 ml 30% Acrylamid/Bisacrylamid, 112,5 µl APS, 22,5 µl TEMED.
• 2. Sammelgel (4%): 3,7 ml H₂O, 1,5 ml Sammelgelpuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,4% SDS), 0,8 ml 30% Acrylamid/Bisacrylamid, 70 µl APS, 7 µl TEMED.

Jeweils 50 µg Proteinprobe wurde mit Puffer C 1 : 2 verdünnt und anschließend 1 : 2 mit "Loading Dilution"-Puffer (6,25 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 2 g SDS, 20 ml Glyzerin, eine Spatelspitze Bromphenolblau, ad 50 ml H₂O) sowie 10% 1 M β-Mercaptoethanol versetzt. Nach Denaturierung für 5 min bei 95°C wurden die Proben und der "Rainbow"-Molekulargewichtsstandard (Amersham, Braunschweig) aufgetragen. Der Laufpuffer setzte sich aus 7,56 g Tris-Base, 36 g Glycin und 2,5 g SDS, ad 2,5 l H₂O, zusammen.

d) Proteintransfer auf Membranen

Die Proteine des SDS-Gels wurden durch Anlegen eines elektrischen Felds (100 mA) für etwa 12 Stunden auf eine PVDF- Membran (Boehringer Mannheim, Mannheim) transferiert. Als Transferpuffer wurde der Laufpuffer aus c) mit Methanol in einer Endkonzentration von 20% verwendet.

e) Antikörper-Markierung

Die Membran mit den transferierten Proteinen wurde zweimal für 10 min mit PBS (Biowhittaker) gewaschen, bevor sie für 1 Stunde mit "Blocking Solution" (1 : 10) (Boehringer Mannheim) nach Angaben des Herstellers inkubiert wurde. Anschließend wurde die Membran mit 3 µg/ml des Primär-Antikörpers (anti-hdm2 monoklonaler Antikörper IF2, Maus IgG_2b) für 2 Stunden inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS, 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween-20), wurde die Membran zweimal mit verdünnter "Blocking Solution" (1 : 20) gewaschen. Es folgte die Inkubation mit einem Peroxidase-konjugierten Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG, 1 : 10000) für 2 Stunden. Die Membran wurde dreimal für 15 min mit PBS, 0,1% Tween-20, und schließlich einmal mit PBS gewaschen.

f) Entwicklung

Die Entwicklung der Antikörper-markierten Membran erfolgte für 1 min in "Solution A", 1% "Solution B" (Boehringer Mannheim), nach Anweisung des Herstellers. Zur Autoradiographie wurde ein Röntgenfilm auf die Membran gelegt und die markierten Proteine über ihre Chemilumineszens detektiert.

(4) Bestimmung der Peptidbindungs-Affinität für HLA-A2.1

Ein Kompetitionstest wurde angewandt, um die Bindung der hdm2-Peptide an A2.1 zu ermitteln. EA2-Zellen wurden mit 0,01 µg des A2.1-bindenden Peptids p53 264-272 (Theobald et al., 1995) und 3 oder 10 µg hdm2-Peptid beladen. Die A2.1-bindenden Peptide Tyrosinase 369-377 (Wölfel et al., 1994) und das Peptid 58-66 des A/PR/834 Influenza Virus Matrix-Proteins M1 (Flu M1 58-66) (Theobald et al., 1995) dienten als Positivkontrollen, das H-2K^b-bindende Peptid 52-59 des Vesikulären Stomatitis Virus- Nukleoproteins (VSV-N 52-59) (Theobald et al., 1995) als Negativkontrolle. Die A2.1- restringierten und p53 264-272-spezifischen ZTL (CDS ×) A2 264 wurden bei verschiedenen Effektor- zu Zielzell(E : T)-Verhältnissen auf ihre lytische Aktivität gegenüber peptidbeladenen und unbeladenen EA2-Zielzellen in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest (s. Kapitel B 8) untersucht (Theobald et al., 1995). Die prozentuale Inhibition der ZTL (CD8 ×) A2 264-vermittelten spezifischen Lyse (SL) von p53 264-­ 272-beladenen EA2-Zellen durch die Test-Peptide wurde bei einem E : T-Verhältnis von 1 : 1 (0,3 : 1 bei hdm2 314-324, 365-375, 402-411 und 419-426) nach folgender Formel berechnet:

(5) Immunisierung A2.1-transgener Mäuse und Induktion peptidspezifscher sowie alloreaktiver ZTL

Zur Generierung A2.1-restringierter peptidspezifischer ZTL wurden 8-12 Wochen alten A2.1-transgenen Mäusen (50-) 100 µg des jeweiligen Test-Peptids sowie 120 µg HBV core 128-140 (ein I-A^b-bindendes synthetisches T-Helfer-Peptid) (Theobald et al., 1995), emulgiert in 100 µl inkomplettem Freundschen Adjuvans (IFA; Difco Laboratories, Detroit, USA), subkutan in den Schwanzansatz injiziert (Theobald et al., 1995). Nach etwa 10 Tagen wurde die Milz entnommen, zerrieben und die Milzzellsuspension zweimal gewaschen (1500 Upm, 5°C, 7 min). Die Milzzellen wurden zu 7 Mio/ml/Loch in eine 24-Lochplatte ausgesät. Als Stimulatorzellen wurden mit 3000 Rad (¹³²Cäsium) bestrahlte LPS-aktivierte B-Zellblasten, beladen mit 5 µg/ml des jeweiligen Test-Peptids und 10 µg/ml humanem β₂-Mikroglobulin, nach zweimaligem Waschen zu 3 Mio/ml/Loch dazugegeben (Theobald et al., 1995). Die LPS-Blasten wurden durch dreitägige Stimulation von Milzzellen (1 Mio/ml) aus A2.1-transgenen Mäusen mit 25 µg/ml LPS (Salmonella typhosa) und 7 µg/ml Dextransulfat (Pharmacia Biotech, Freiburg) gewonnen. Die Ansätze aus Effektor- und Stimulatorzellen wurden für 6 Tage inkubiert (I° Kulturen) und einem Zytotoxizitätstest unterzogen.

Allo-A2.1-reaktive I° ZTL wurden generiert, indem Milzzellen aus CD8-transgenen Mäusen zu 7 /ml/Loch (Effektorzellen) zusammen mit bestrahlten Milzzellen aus A2.1-transgenen Mäusen zu 6 Mio/ml/Loch (Stimulatorzellen) für 6 Tage inkubiert wurden.

(6) Etablierung von ZTL-Linien

Polyklonale peptidspezifische ZTL-Linien mit Spezifität für hdm2 81-88 (ZTL A2 81 und CD8 × A2K^b 81) und für Flu M1 58-66 (ZTL CD8 × A2K^b Flu M1) wurden durch wöchentliche Restimulation der Effektorzellen mit peptidbeladenen Stimulatorzellen etabliert. Als Stimulatorzellen dienten JA2-Zellen, die mit 20000 Rad bestrahlt, anschließend in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) mit 5 µg/ml des jeweiligen Peptids und 10 µg/ml humanem β₂-Mikroglobulin für etwa 40 min beladen und schließlich zweimal gewaschen wurden. Die Effektorzellen wurden zusammen mit 0,5 Mio JA2-Zellen und 6 Mio mit 3000 Rad bestrahlten C57BL/6-Milzzellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml/Loch in eine 24-Loch-Platte ausgesät. Den Ansätzen wurde 2% (v/v) Überstand aus dem Kulturmedium Con A-aktivierter Milzzellen (TCGF) von Lewis-Ratten zugegeben (Theobald et al., 1995).

Allo-A2.1-reaktive ZTL-Linien wurden durch intraperitoneale Immunisierung von CD8- transgenen Mäusen mit 20 Mio JA2-Zellen/Maus induziert. Nach drei Wochen wurden die Milzzellen isoliert und in vitro (7 Mio/ml/Loch) mit bestrahlten JA2-Zellen (0,5 Mio/ml/Loch) oder Milzzellen (6 Mio/ml/Loch) A2.1-transgener Mäuse stimuliert. Durch wiederholte wöchentliche in vitro-Restimulation mit JA2-Zellen in Gegenwart von bestrahlten C57BL/6-Milzzellen (6 Mio/ml/Loch) und 2-5% TCGF wurden schließlich allo-A2.1-reaktive ZTL-Linien generiert.

(7) Extraktion und HPLC-Fraktionierung natürlicher Peptide und Rekonstitution der ZTL-Erkennung a) Extraktion natürlicher Peptide aus MHC Klasse I-Molekülen

Adhärente Saos- 2/cl 6-Zellen wuchsen bis zu einer Dichte von etwa 5 × 10⁷ Zellen/Flasche. Die Zellen wurden zweimal mit HBSS (Biowhittaker, Verviers, Belgien) gewaschen und MHC Klasse I-gebundene Peptide durch Behandlung der Zellen für 1 min mit 5 ml Extraktionspuffer (0,13 M Zitronensäure, 0,061 M Na₂HPO₄, pH 3,0) extrahiert (Theobald et al., 1998). Nach zweimaligem Waschen mit RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) wurden die Zellen in Zellkulturmedium (s. 2.4) weiterkultiviert. Die Extrakte wurden zentrifugiert und der peptidhaltige Überstand eingefroren. Diese Prozedur wurde alle 2 Tage für 10 Tage wiederholt, um Peptidextrakte von einem Äquivalent von etwa 2 × 10⁹ Saos-2/cl 6-Zellen zu sammeln. Die Extrakte wurden aufgetaut, gepoolt und auf C-18 "spice cartidges" (Analtech Inc., Newark, DE) geladen, die zuvor mit 4 ml Methanol und 4 ml H₂O gewaschen wurden. Die "cartridges" wurden erneut mit 10 ml H₂O gewaschen und die Peptide mit 4 ml Acetonitril (enthält 0,1% TFA) eluiert. Das peptidhaltige Eluat wurde vakuumgetrocknet, in H₂O resuspendiert und durch Zentrifugation von Rückständen befreit. Der Überstand wurde durch eine Centricon-10-Säule (Amicon, Beverly, MA) gefiltert und der resultierende Peptidextrakt erneut vakuumgetrocknet (Theobald et al., 1998).

b) HPLC-Fraktionierung natürlicher Peptideitrakte und Rekonstitution der ZTL- Erkennung

0,9 ml des in 0,05% TFA resuspendierten natürlichen Peptidextrakts sowie jeweils 1 ml (= 100 ng) der synthetischen Peptide hdm2 81-88 oder hdm2 80-88 wurden an einem RP-HPLC SMART-System, das mit einer µRPC C2/C18 SC 2.1/10-Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) ausgerüstet war, aufgetrennt und über einen Gradienten, bestehend aus 20-95% Eluent B (70% Acetonitril in 0,05% TFA) in Eluent A (0,05% TFA), in 36 min und einer Flußrate von 50 µl/min in 2-min Fraktionen zu 100 µl (natürlicher Peptidextrakt sowie hdm2 81-88) oder mit einer Flußrate von 25 µl/min zu 50 µl (hdm2 80-88) eluiert (Theobald et al., 1998). HPLC-Fraktionen wurden im Bereich von 30-70 min gesammelt.

⁵¹Cr-markierte T2-Zielzellen wurden für 60 min in Serumfreiem RPMI 1640 (Biowhittaker), 5% BSA und 10 µg/ml β₂-Mikroglobulin, mit 50 µl der individuellen HPLC-Fraktionen des natürlichen Peptidextrakts sowie mit 0,03 µl (hdm2 81-88) oder 2,5 µl (hdm2 80-88) der individuellen HPLC-Fraktionen der synthetischen Peptide beladen und anschließend einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest zugeführt (Theobald et al., 1998). ZTL CD8 × A2K^b 81 wurden als Effektorzellen in einem E : T-Verhältnis von 20 : 1 eingesetzt.

(8) Zytotoxizitätstest

Die lytische Reaktivität von Effektorzellen gegenüber verschiedenen Zielzellen wurde in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest überprüft (Theobald et al., 1995). Als Zielzellen für Peptidtitrationstests wurden T2- und T2A2K^b-Zellen eingesetzt. 1-5 Mio Zielzellen wurden für 60-90 min mit 150 µCi Na (⁵¹Cr) O₄ (1 mCi/ml) (NEN Life Science, Belgien) markiert. Vor dieser Markierung wurde den Zellen bei Peptidtitrationstests 2 µl Peptidlösung unterschiedlicher Konzentration und 15 µl FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) oder FCS ohne Peptid zugegeben. Die markierten Zielzellen wurden viermal gewaschen und die Zellzahl auf 0,1 Mio/ml eingestellt. Die Effektorzellen wurden mit Zellkulturmedium seriell 1 : 3 verdünnt und zu 0,1 ml/Loch in 96-Loch-Platten ausgesät. Insgesamt wurden fünf verschiedene E : T-Verhältnisse getestet. Anschließend wurden 0,1 ml/Loch der Zielzellsuspension zu den Effektorzellen gegeben und die Ansätze für 4-6 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert (1300 Upm, 5°C, 9 min), der Überstand (0,1 ml/Loch) abgenommen und die ⁵¹Cr-Freisetzung mit einem Gamma- "Counter" (Canberra Packard, Dreieich) gemessen. Die prozentuale spezifische Lyse (SL) wurde nach folgender Formel berechnet:

Die maximale ⁵¹Cr-Freisetzung entsprach der gesamten ⁵¹Cr-Inkorporation durch die Zielzellen, die spontane ⁵¹Cr-Freisetzung entsprach der Zielzell-Lyse in Abwesenheit von Effektorzellen und betrug in der Regel weniger als 10% der maximalen ⁵¹Cr- Freisetzung. Die Werte für spontane und maximale Lysen wurden aus jeweils vier, die für experimentelle Lysen aus zwei Ansätzen gemittelt.

C) Beispiele Beispiel 1 Experimentelle Gewinnung des Oligopeptids hdm2 81-88 (1.1) Selektion potentiell A2.1-bindender hdm2-Peptide

Anhand der bekannten Aminosäuresequenz des hdm2-Onkoproteins wurden 8mere, 9mere, 10mere und 11mere bestimmt, die Teilsequenzen dieses hdm2-Polypeptids darstellen und die die folgenden Kriterien erfüllen:

• 1. 1.) Sie weisen als sogenannte primäre Ankeraminosäuren, das sind Aminosäuren innerhalb des Peptids, die mit Residuen der Bindungstasche des MHC Klasse I- Moleküls interagieren und die sich bei endogen prozessierten und im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen präsentierten Peptide an Position 2 und am C-Terminus des Epitops befinden, an Position 2 klassischerweise die Aminosäuren L, M, I, V oder T, und nichtklassischerweise die Aminosäuren A, Q oder K auf und am C- Terminus klassischerweise die Aminosäuren V, L oder I und nichtklassischerweise die Aminosäuren A, M oder T (Theobald et al., 1995).
• 2. 2.) Die betreffenden hdm2-Peptide sollten möglichst nicht homolog zu den korrespondierenden mdm2-Peptiden der Maus sein.
• 3. 3.) Die 9mere sollten einen möglichst hohen "score" besitzen, der auf Bindungsdaten synthetischer Peptide basiert (Parker et al., 1994).

Insgesamt wurden 51 hdm2-Peptide selektiert (siehe Fig. 1).

(1.2) Bindung selektierter synthetischer hdm2-Peptide an A2.1

Die gemäß (1.1) anhand ihrer theoretischen Bindungsstärke selektierten hdm2-Peptide wurden auf ihre tatsächliche Bindungsaffinität für A2.1 untersucht. Hierfür wurde in einem kompetitiven Bindungstest, der in der Publikation von Theobald et al. (1995) näher beschrieben ist, funktionell die Fähigkeit der hdm2-Peptide getestet, die A2.1- Bindung des konkurrierenden synthetischen Peptids p53 264-272 zu inhibieren. Diese Inhibition wurde anhand der Abnahme der durch eine A2.1-restringierte p53 264-272- spezifische ZTL-Linie vermittelte Lyse von EA2-Zellen gemessen, die mit p53 264-272- Peptid und dem individuellen hdm2-Testpeptid beladen waren. Die Bindungsergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt dargestellt. Die stärkste Inhibition und damit Bindung an A2.1 zeigte das Peptid Tyrosinase 369-377 (vgl. Wölfel et al., 1994), das als Positivkontrolle diente und sowohl bei 3 als auch bei 10 µg 100% Inhibition erreichte, während das H-2K^b-bindende Peptid VSV-N 52-59 (Theobald et al., 1995) als Negativkontrolle keinerlei A2.1-Bindungsaktivität aufwies. Die hdm2-Peptide wurden nach ihrer Bindungsstärke in 4 Gruppen eingeteilt. Von insgesamt 51 getesteten Peptiden hatten 12 eine hohe Bindungsaktivität (mindestens 85% Inhibition bei 10 µg Testpeptid), 16 eine mittlere (50-84% Inhibition), 13 eine schwache (10-49%) und 10 keine Bindungsaktivität (< 10% oder keine Dosisabhängigkeit der Inhibition). Die am stärksten bindenden hdm2-Peptide waren 80-88, 81-88, 48-57 und 33-41 bei 10 µg mit jeweils 100% Inhibition der Bindung des konkurrierenden Peptids p53 264-272. Die beobachtete Inhibition war dosisabhängig, da für alle A2.1-bindenden Peptide die Inhibitionswerte bei 10 µg deutlich über denen bei 3 µg lagen.

Insgesamt zeigten 55% aller selektierten Peptide eine starke oder intermediäre A2.1- Bindung, nur 20% konnten nicht an A2.1 binden.

Beispiel 2 Experimenteller Nachweis der Eignung des hdm2 81-88 Oligopeptids zur Erzeugung einer spezifischen, ZTL vermittelten Immunogenität (2.1) Immunogenität A2.1-bindender synthetischer hdm2-Peptide in A2.1-transgenen Mäusen

Ein Hindernis bei der Erkennung von humanen MHC Klasse I-Molekülen durch Maus-T- Zellen ist die Unfähigkeit von Maus-CD8, mit HLA-Molekülen wie A2.1 zu interagieren. Zur Umgehung bzw. Behebung dieses Hindernisses wurden zwei Strategien anagewendet. Die eine Strategie bestand in der Konstruktion des chimären Moleküls A2.1/K^b (A2K^b), das sich aus den humanen α1- und α2-Domänen von A2.1 und aus der α3-Domäne von Maus-K^b, die für die Interaktion mit CD8 wesentlich ist, zusammensetzt. In A2K^b-transgenen Mäusen induzierte ZTL mit Restriktion für das A2K^b-Transgen erkennen dieselben Peptidantigene, die auch in A2.1-positiven Menschen immunogen sind.

Die andere Strategie zur Verstärkung der A2.1-restringierten Antwort bestand in der Erzeugung einer doppelt-transgenen Maus "CD8 × A2.1/K^b" durch Kreuzung einer A2K^b-transgenen mit einer huCD8α/β-transgenen Maus. Die Expression der α- und β- Kette des huCD8-Moleküls ermöglicht den generierten ZTL, mit der α3-Domäne des A2.1-Moleküls humaner Zellen zu interagieren.

Mit den gemäß Beispiel 1 gewonnenen stark oder intermediär bindenden Peptiden (s. Fig. 1) wurden A2K^b- und CD8 × A2K^b-transgene Mäuse immunisiert um hdm2- Peptid-reaktive ZTL zu gewinnen. 9 bis 11 Tage nach der Immnunisierung wurden Milzzellen der betreffenden Mäuse in vitro mit Peptid-beladenen syngenen LPS-Blasten stimuliert und 6 Tage danach auf eine A2.1-restringierte peptidspezifische ZTL-Antwort in einem Zytotoxizitätstest untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefaßt dargestellt. Für die Positivkontrolle Flu M1 58-66 war die Induktion A2.1-restringierter ZTL bereits bekannt (Theobald et al., 1995). Eine A2.1-restringierte und peptidspezifische ZTL-Antwort wurde für die stark bindenden Peptide hdm2 81-88, 33-­ 41 und 80-88 sowie für das intermediär bindende Peptid hdm2 101-110 nachgewiesen. Die Höhe der Lyse war vom E : T-Verhältnis abhängig. Die ZTL waren peptidspezifisch, da sie mit dem entsprechendem Peptid beladene Zellen lysierten, nicht aber Zellen, die mit irrelevanten A2.1-bindenden Peptiden beladen waren (Daten nicht gezeigt).

Die Immunogenität des Peptids hdm2 80-88 beruhte wahrscheinlich auf einer Kontamination mit hdm2 81-88, da nach unabhängig durchgeführten Immunisierungen mit hdm2 80-88 die ZTL-Erkennung mit zunehmender Reinheit des Peptids abnahm. Die Kontamination ließ sich auch massenspektrometrisch nachweisen (Daten nicht gezeigt). Durch hdm2 81-88 induzierte ZTL waren A2.1-restringiert, da mit dem entsprechenden Peptid beladene A2.1-negative EL4-Zellen (H-2^b) der Maus nicht erkannt wurden (Fig. 3).

(2.2) hdm2 81-88-spezifische ZTL: A2.1-Restriktion, Peptidspezifität und Effizienz der Peptiderkennung

A2.1-restringierte und für hdm2 81-88 spezifische ZTL wurden im folgenden näher untersucht. Da bis zu diesem Zeitpunkt der Arbeit nur aus A2K^b-transgenen Mäusen generierte hdm2 81-88-spezifische ZTL-Linien existierten, wurden A2.1- und CD8 × A2K^b-transgene Mäuse mit hdm2 81-88 immunisiert in der Absicht, ZTL mit höherer Avidität zu erhalten.

Nach Immunisierung von A2.1- und CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen mit hdm2 81-88 wurden die Milzzellen mit Peptid-beladenen LPS-Blasten aus A2.1-transgenen Mäusen stimuliert (I° Kultur) und 6 Tage später im Zytotoxizitätstest gegen T2-Zielzellen, inkubiert bei unterschiedlichen Konzentrationen an synthetischem Peptid hdm² 81-88, getestet (Fig. 4A). Die I° ZTL-Kulturen A2.1 (A2) und CD8 × A2K^b 81 unterschieden sich in ihrer Effizienz der Peptiderkennung um den Faktor 5. Die halbmaximale Lyse der Zielzellen durch I° ZTL A2 81 lag bei einer Peptidkonzentration von 0,95 nM im Vergleich zu 0,2 nM durch I° ZTL CD8 × A2K^b 81. Aus dem Unterschied in der Effizienz der Peptiderkennung kann abgeleitet werden, daß I° ZTL CD8 × A2K^b 81 eine höhere Avidität als I° ZTL A2 81 besitzen. Auch die absolute maximale Lyse war bei I° ZTL CD8 × A2K^b 81 mit 100% wesentlich höher als bei I° ZTL A2 81 mit 62%. Dieser Unterschied in der Avidität hdm2-reaktiver T-Zellen spiegelt sich auch in der Erkennung endogen präsentierten hdm2 81-88-Peptids wider (Fig. 4B und C). Während I° ZTL CD8 × A2K^b 81 die hdm2-überexprimierende und A2.1-positive Transfektante Saos-2/cl 6 bei einem E : T-Verhältnis von 30 : 1 zu 42% lysierten, erkannten I° ZTL A2 81 Saos- 2/cl 6 nur zu 23%. Die Osteosarkom-Zellinie Saos-2, die kein detektierbares hdm2- Protein exprimiert und daher als Negativkontrolle diente, wurde von I° ZTL nicht erkannt (s. dazu auch Fig. 6).

Diese Ergebnisse zeigen, daß nach einmaliger Immunisierung von A2.1- und CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen und einmaliger in vitro-Stimulation mit dem hdm2 81-88- Peptid hoch-avide ZTL induziert wurden, die endogen präsentiertes Peptid erkannten. Zur Erkennung von hdm2-Transfektanten siehe Beispiel 4.

Durch wiederholte Restimulation von I° ZTL aus A2.1- und CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen mit Peptid-beladenen Stimulatorzellen wurden stabile ZTL-Linien mit Spezifität für hdm2 81-88 generiert. Fig. 5A zeigt die Effizienz der Erkennung von synthetischem hdm2 81-88 durch beide ZTL-Linien bei einem E : T-Verhältnis von 10 : 1. Die Avidität der ZTL-Linie A2 81 gegenüber den I° ZTL nahm um mehr als eine log-Stufe zu, da die halbmaximale Lyse der Zielzellen bei einer Peptidkonzentration von 0,069 nM erreicht wurde. Die lytische Aktivität durch ZTL CD8 × A2K^b 81 war bei 0,036 nM halbmaximal, was einer Steigerung der Sensitivität um den Faktor 5 entsprach. Die beobachtete Zunahme der Avidität der ZTL-Linien ist auf die Expansion hoch-avider hdm2-reaktiver ZTL zurückzuführen. Beide ZTL-Linien waren peptidspezifisch, da T2-Zellen beladen mit hdm2 81-88 effizient lysiert wurden, während unbeladene oder mit dem irrelevanten Peptid Flu M1 58-66 beladene T2-Zielzellen nicht erkannt wurden (Fig. 5B und C). Flu M1 58-66-präsentierende T2-Zellen wurden jedoch von einer CD8 × A2K^b T-Zell- Population mit Spezifität für Flu M1 58-66 lysiert (ohne Figur). Außerdem waren die hdm² 81-88-reaktiven ZTL-Linien A2.1-restringiert, da mit A2.1-negativen und hdm2 81-88-beladenen EL4-Zellen (H-2^b) der Maus keinerlei lytische Aktivität zu beobachten war.

Im Endergebnis wurden hoch-avide A2.1-restringierte ZTL-Populationen mit Spezifität für hdm2 81-88 generiert.

Beispiel 3 Charakterisierung von hdm2-transfizierten Zellinien

Um zu bestimmen, ob das Peptid hdm2 81-88 tatsächlich endogen prozessiert und im Kontext von A2.1-Molekülen hdm2-überexprimierender Tumorzellen präsentiert wird, wurden verschiedene hdm2-negative (Saos-2, EL4) oder hdm2-gering exprimierende (SW480) Tumor-Zellinien mit dem hdm2-Gen (Oliner et al., 1992) transfiziert. Die Erkennung der resultierenden hdm2-überexprimierenden Transfektanten durch hdm2 81-­ 88-spezifische ZTL stellt ein Indiz für die endogene Produktion des Peptids hdm2 81-88 dar.

Für die Transfektion mit dem hdm2-Gen wurden die Tumor-Zellinien Saos-2, SW480 und EL4 (H-2^b) ausgewählt. Saos-2 ist eine p53-defiziente und A2.1-positive Osteosarkom-Linie und für die hdm2-Transfektion besonders geeignet, da p53 Transkriptionsaktivator für das hdm2-Gen ist und somit in Saos-2 keine signifikante endogene Expression an hdm2 zu erwarten ist. SW480 ist eine A2.1-positive Kolonkarzinom-Linie und exprimiert geringe Mengen hdm2-Protein. EL4 ist eine A2.1- negative Thymom-Linie der Maus mit fehlender hdm2-Expression.

Durch Lipofektion der Zellinie Saos-2 mit dem Plasmid pCHDMIA, welches für das hdm2-Protein und die Neomycin-Resistenz kodiert (Fig. 26), wurden Transfektanten generiert, die hdm2 unter der Kontrolle des CMV-Promoters konstitutiv überexprimierten. Aus den Zellen wurden nukleäre Extrakte präpariert, da hdm2 überwiegend nukleär lokalisiert ist. Die Extrakte wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf Membranen transferiert, mit anti-hdm2-Antikörper markiert und schließlich via Chemilumineszens sichtbar gemacht. Der Westernblot gemäß Fig. 6 zeigt die hdm2-Proteinexpression der hdm2-Transfektanten Saos-2/cl 5 und Saos-2/cl 6. Während bei 90 kDa eine deutliche und bei 75 kDa eine schwache Proteinbande zu erkennen ist (Pfeile), exprimierten die parentalen Saos-2-Zellen wie erwartet kein hdm2- Protein. Bei dem 90 kDa-Protein handelt es sich um das Vollängen-hdm2-Produkt aus 491 Aminosäuren (vgl. Oliner et al., 1992), während das 75 kDa-Produkt aus einer hdm2-mRNA "splice"-Variante mit einer Deletion der Basen 158-667 translatiert wurde (Sigalas et al., 1996). Die als Positivkontrolle dienende prä-B-ALL-Zellinie EU-3 (Zhou et al., 1995) zeigte eine sehr starke Expression sowohl des 90 kDa- als auch des 75 kDa- Proteins.

Für eine effektive Präsentation der hdm2-Peptide ist u. a. eine hinreichende Expression von A2 Voraussetzung. Die durchflußzytometrische Analyse der hdm2-Transfektanten ergab eine vergleichbare A2-Expression von Saos-2/cl 5 und 6, die nur unwesentlich stärker war als die der parentalen Saos-2-Zellen (Fig. 7).

EL4-Zellen der Maus wurden mit den Plasmiden pSV₂A2 (Fig. 27), welches für das A2.1-Molekül kodiert (Theobald et al., 1995), und pCHDMIA mittels Elektroporation kotransfiziert. Fig. 6 zeigt die signifikante Expression des 90 kDa-Vollängen-hdm2- Proteins durch die A2.1-positive Transfektante EA2/cl 13 im Gegensatz zu hdm2- negativen EA2-Zellen. Beide Transfektanten waren in ihrer A2.1-Expression vergleichbar (Daten nicht gezeigt). Außerdem wurde die Kolonkarzinom-Linie SW480, die nur wenig hdm2 exprimiert, mit pCHDMIA lipofiziert, wobei jedoch zunächst kein signifikanter Unterschied in der hdm2-Expression des resultierenden Klons SW480/cl 2 und der parentalen Zellen im Westernblot zu beobachten war (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 4 Erkennung von hdm2-Transfektanten durch hdm2 81-88-spezifische ZTL

Zur Überprüfung der natürlichen Prozessierung und A2.1-Präsentation des Peptids hdm2 81-88 wurden die hdm2-Transfektanten auf ihre Erkennung durch A2.1-restringierte hdm2 81-88-spezifische ZTL getestet. Die Saos-2-Transfektanten Saos-2/cl 5 und 6 wurden von den hdm2-reaktiven ZTL A2 und CD8 × A2K^b 81 effizient lysiert, während die parentale Saos-2-Linie nicht erkannt und folglich nicht lysiert wurde (Fig. 8). Die Lyse der Transfektanten konnte durch den anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 inhibiert werden, was einen weiteren Beleg für die A2.1-Restriktion der hdm2-reaktiven ZTL darstellt. Wie bereits erläutert, zeigten ZTL CD8 × A2K^b 81 auch bei der endogenen Erkennung eine höhere Lyse der Zielzellen als ZTL A2 81, möglicherweise durch CD8-vermittelte Steigerung der Avidität. Als Positivkontrolle diente die ZTL- Linie CD8 allo A2. Sowohl die hdm2-Transfektanten als auch die parentalen Zellen wurden durch die allo-A2.1-reaktiven Effektorzellen lysiert (Fig. 8). Da diese alloreaktiven ZTL peptidspezifisch waren, d. h. A2.1-Moleküle nur im Kontext mit (prozessierten) Selbst-Peptiden (nicht jedoch Signalpeptiden) erkannten (Ergebnisse nicht dargestellt), konnten auf diese Weise mögliche Defizite z. B. im Transportsystem der untersuchten Zellen quasi ausgeschlossen werden. Als Negativkontrolle fungierte die A2.1-restringierte ZTL-Linie CD8 × A2K^b Flu M1, die keine der getesteten Zellinien lysierte (Fig. 8).

Die Erkennung der hdm2-Transfektanten EA2/cl 13 und SW480/cl 2 ist in den Fig. 9 und 10 dargestellt. Die Lyse dieser Zielzellen durch hdm2 81-88-spezifische ZTL war im Vergleich zu Saos-2/cl 5 und 6 weniger effizient, aber blockierbar. Die parentalen Zellinien wurden wie erwartet nicht von den hdm2-reaktiven ZTL erkannt (Fig. 9 und 10). Allo-A2.1-reaktive ZTL lysierten sämtliche, Flu M1-spezifische ZTL dagegen keine der angebotenen Zielzellen (Fig. 9 und 10). Obwohl bei SW480/cl 2 im Vergleich zu SW480 eine hdm2-Überexpression im Westernblot nicht detektierbar war, wurde SW480/cl 2 signifikant von ZTL CD8 × A2K^b 81 lysiert, was auf eine vergleichsweise höhere Sensitivität des Zytotoxizitätstests deuten könnte. Außerdem ist es denkbar, daß die Zahl der spezifischen Peptid-MHC-Komplexe von SW480/cl 2-Zellen größer ist als diejenige von SW480-Zellen, da SW480/cl 2 suszeptibler gegenüber allo-A2.1-reaktiven T-Zellen war als die parentale Zellinie (Fig. 10).

Alle in diesen Experimenten verwendeten hdm2-Transfektanten wurden mit dem pCHDMIA-Expressionsplasmid transfiziert (Fig. 26). Dieses kodiert für das hdm2- Protein und zusätzlich für die Neomycin-Resistenz, die als Selektionsmarker fungiert. Die Vermutung lag nahe, daß das Peptid hdm2 81-88 endogen prozessiert und im Kontext von A2.1 präsentiert wurde und damit das Epitop für die hdm2-reaktiven ZTL repräsentierte. Da es sich bei diesen ZTL um Populationen handelte, war allerdings die Anwesenheit von T-Zell-Subpopulationen mit Spezifität für Peptide, die aus der Neomycin-Resistenz prozessiert wurden, nicht auszuschließen, zumal die Restimulation der ZTL mit Neomycin-resistenten Transfektanten erfolgte. Gegen eine Lyse der hdm2- Transfektanten durch potentielle Subpopulationen mit Spezifität für die Neomycin- Resistenz sprach jedoch die fehlende Erkennung der EA2- und EA2K^b-Kontrollen, die, wie die hdm2-Transfektanten auch, Neomycin-Resistenz exprimieren. Außerdem wurden z. B. mit ZTL-Klon 3, der aus der ZTL-Population CD8 × A2K^b 81 isoliert worden war, vergleichbare Zytotoxizitätsdaten mit den hdm2-Transfektanten als Zielzellen erhalten (Daten nicht gezeigt). Da ein ZTL-Klon im allgemeinen strikt peptidspezifisch ist, ist die beobachtete Lyse der hdm2-Transfektanten auf hdm2 81-88-spezifische Erkennung zurückzuführen.

Ein weiteres deutliches Indiz für hdm2 81-88 als T-Zellepitop war die Lyse von verschiedenen hdm2-überexprimierenden Tumorzellen (s. Beispiel 6), während im Gegensatz dazu Saos-2-Zellen keine detektierbare hdm2-Expression zeigten und nicht erkannt wurden. Demnach handelt es sich bei dem hdm2 81-88 Opligopeptid auch nicht um ein Epitop aus anderen prozessierten Selbstproteinen.

Die hier gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß das Peptid hdm2 81-88 tatsächlich endogen prozessiert und im Kontext von A2.1 präsentiert wird.

Beispiel 5 Nachweis der Identität des synthetischen Peptids hdm2 81-88 mit dem natürlichen A2.1-präsentierten hdm2-ZTL-Epitop

Um nachzuweisen, daß das natürliche A2.1-präsentierte ZTL-Epitop für die hdm2 81-­ 88-spezifischen ZTL und das synthetische Peptid hdm2 81-88 identisch sind, wurden aus MHC Klasse I-Molekülen natürliche Peptide durch Säurebehandlung extrahiert (Lustgarten et al., 1997). Die konzentrierten und gereinigten Peptidextrakte und das synthetische hdm2 81-88-Peptid wurden anschließend mittels HPLC weiter aufgereinigt. Die resultierenden, individuellen natürlichen oder synthetischen HPLC-Fraktionen wurden auf T2-Zellen geladen und ihre Erkennung durch hdm2 81-88-spezifische ZTL getestet (Lustgarten et al., 1997). Fig. 11 zeigt die Erkennung der jeweiligen HPLC- Fraktionen des natürlichen Peptidextrakts von Saos-2/cl 6 in Abhängigkeit von ihrer Retentionszeit durch ZTL CD8 × A2K^b 81.

Mit HPLC-Fraktion 21 des natürlichen Peptidextrakts wurde ZTL-Lyse rekonstituiert. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit ZTL A2 81 und ZTL-Klon 3 CD8 × A2K^b 81 erzielt. ZTL-Lyse des HPLC-fraktionierten synthetischen Peptids hdm2 81-88 wurde durch Fraktion 21 rekonstituiert, die eine identische Retentionszeit im Vergleich zur antigenen Fraktion 21 des natürlichen Peptidextrakts hatte (Fig. 11). Auch im HPLC- Profil eluierte das synthetische Peptid in Fraktion 21, was beweist, daß die beobachtete lytische Aktivität allein auf die spezifische Erkennung von hdm2 81-88 zurückzuführen ist.

Um auszuschließen, daß das erkannte T-Zellepitop durch das Peptid hdm2 80-88 repräsentiert wurde, und die Erkennung auf einer Kreuzreaktion beruht, wurde das synthetische und zu 90% reine Peptid hdm2 80-88 über HPLC weiter aufgereinigt. Die T-Zellerkennung der resultierenden HPLC-Fraktionen ergab zwei "peaks", den ersten bei Fraktion 21 mit einer im Vergleich zu hdm2 81-88 praktisch identischen Retentionszeit, den zweiten bei Fraktion 23 (Daten nicht gezeigt). Während der erste "peak" auf einer Kontamination von hdm2 80-88 mit dem Synthese-Abbruchprodukt hdm2 81-88 beruht - wie die massenspektrometrische Analyse belegte - war der zweite "peak" auf die Kreuzreaktivität der hdm2 81-88-spezifischen ZTL mit hdm2 80-88 zurückzuführen. Bei den HPLC-Fraktionen des natürlichen Peptidextrakts trat jedoch nur in Fraktion 21, die eine zur erkannten Fraktion des synthetischen Peptids hdm2 81-88 identische Retentionszeit besaß, eine Lyse auf. In Fraktion 23 war keine Lyse nachweisbar. Aufgrund der Kreuzreaktivität hätte aber auch in Fraktion 23 ein Lyse stattfinden müssen, wenn hdm2 80-88 natürlich präsentiert würde.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß es sich bei dem natürlich prozessierten und A2.1-präsentierten ZTL-Epitop tatsächlich um das Peptid hdm2 81-88 handelt.

Beispiel 6 Verwendung von hdm2 81-88 spezifischen ZTL zur spezifischen Erkennung und Lyse von humanen Tumonellen (6.1) hdm2-Protein-Expression von humanen Tumor-Zelllinien

Zum Nachweis, daß hdm2 81-88-spezifische ZTL nicht nur hdm2-Transfektanten effizient lysieren sondern auch nicht-transfizierte A2-positive Tumor-Zellinien wurden ALL-Zellinien eingesetzt, für welche die Überexpression von hdm2-mRNA, nicht aber von hdm2-Protein, bekannt ist (vgl. Zhou et al., 1995). Da neben der Überexpression von hdm2-Protein das Vorhandensein von A2 Voraussetzung für die ZTL-Erkennung ist, wurden diese Zellinien zunächst durchflußzytometrisch analysiert. Von 13 untersuchten ALL-Zellinien waren zwei A2-positiv und eine A2.24-positiv (Daten nicht gezeigt). Von diesen zwei ALL- sowie drei weiteren A2-positiven ALL-, Lymphom- und Plasmozytom-Linien wurden Westernblots durchgeführt, da für eine Peptid-Präsentation letztlich u. a. die Überexpression von hdm2-Protein, nicht aber von hdm2-mRNA, von Bedeutung ist. In Fig. 12 ist die hdm2-Protein-Expression verschiedener A2-positiver humaner Tumor-Zellinien dargestellt. Alle untersuchten Leukämie-Linien sowie eine Lymphom- und eine Plasmozytom-Linie überexprimierten das 90 kDa Vollängen-hdm2- Produkt. Die 75 kDa "splice"-Variante von hdm2 wurde von diesen Zellinien ebenfalls in erkennbaren Mengen produziert.

Die hdm2-Protein-Expression von drei A2-negativen ALL-Zellinien ist in Fig. 13 dargestellt. Auch hier stimmten die Daten der Protein- mit denen der mRNA-Expression überein (Zhou et al., 1995), so daß bei allen hier untersuchten ALL-Zellinien offenbar kein posttranskriptioneller Mechanismus der hdm2-Überexpression zugrunde liegt. Ausnahmen sind die prä-B-ALL-Zellinien EU-6 und EU-8, für die eine schwache oder fehlende hdm2-mRNA-Expression beschrieben wurde (Zhou et al., 1995). Diese Zellinien wiesen jedoch im Westernblot eine starke bzw. mäßige hdm2-Protein- Expression auf (Daten nicht gezeigt).

(6.2) Erkennung von hdm2-überexprimierenden A2-positiven Tumor-Zellinien durch hdm2 81-88-spezifische ZTL

Die hdm2-Protein überexprimierenden und A2-positiven Tumor-Zellinien aus Fig. 12 wurden im folgenden als Zielzellen für hdm2 81-88-spezifische ZTL verwendet um nachzuweisen, daß nicht nur hdm2-transfizierte, sondern auch nicht-transfizierte Tumorzellen effizient lysiert werden.

Saos-2/143-Zellen, die mit mutiertem p53 (Theobald et al., 1995), nicht aber mit hdm2 transfiziert waren, wurden im Gegensatz zu den parentalen Saos-2-Zellen von ZTL CD8 × A2K^b 81 erkannt (Fig. 14). Die Lyse konnte durch 20-stündige Vorbehandlung der Zielzellen mit IFN-γ (20 ng/ml) gesteigert und durch Zugabe von PA2.1 inhibiert werden. Die Erkennung unbehandelter Saos-2- und Saos-2/143-Zellen durch die als Positivkontrolle dienenden allo-A2-reaktiven ZTL war vergleichbar, die Erkennung IFN- γ-behandelter Saos-2/143-Zellen war besser als die unbehandelter (Fig. 14). Grund für die verbesserte Lyse IFN-γ-behandelter Zellen ist u. a. die erhöhte Expression von MHC- Peptid-Komplexen und Adhäsionsmolekulen. Mit der Flu M1 58-66-spezifischen Negativkontrolle ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 war dagegen keine Lyse zu beobachten. Die Erkennung hdm2-überexprimierender und A2-positiver B-ALL-Zellinien durch hdm2-reaktive ZTL wurde im folgenden untersucht. Die Zellinie EU-3 wurde von ZTL A2 und CD8 × A2K^b 81 erkannt, wobei ZTL CD8 × A2K^b 81 bei einem E : T-Verhältnis von 30 : 1 100% Lyse erreichten (Fig. 15). Die Lyse durch beide ZTL-Linien wurde vollständig durch PA2.1 blockiert. In diesen Experimenten fungierten als Positivkontrolle allo-A2.1-reaktive T-Zellen, die primär in vitro generiert wurden und daher eine geringere Effizienz der Erkennung aufwiesen als die ZTL-Linie CD8 allo A2. Gegen EU- 3 fand sich von seiten der ZTL-Linie CD8 × A2K^b Flu M1 keine lytische Aktivität. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit den prä-B-ALL-Zellinien UoC-B11 und BV173 als Zielzellen für ZTL CD8 × A2K^b 81 erzielt (Fig. 16). Bei einem E : T-Verhältnis von lediglich 0,3 : 1 wurden beide Zellinien zu mehr als 50% lysiert. Auch hier konnte mit PA2.1 eine vollständige Inhibition der Erkennung erreicht werden. Obwohl die Lyse von UoC-B11 durch allo-reaktive ZTL mindestens zweimal so hoch war wie die von BV 173, wirkte sich dies - bei vergleichbarer hdm2-Expression (s. Fig. 12) - nicht auf die Höhe der hdm2-spezifischen Erkennung aus (Fig. 16). Offensichtlich war für ZTL CD8 × A2K^b 81 die Menge an Peptid : MHC Klasse I-Komplexen nicht limitierend. Diese Zellinien waren nicht suszeptibel gegenüber den Flu M1-spezifischen T-Zellen. Die Zellinien OPM-2 (Plasmozytom) und U-937 (histiozytisches Lymphom) wurden ebenfalls selektiv lysiert (Fig. 17).

Diese Befunde zeigten, daß ZTL mit Spezifität für hdm2 81-88 A2-positive Tumorzellen, die endogen hdm2 überexprimieren, spezifisch, A2-restringiert und effizient erkannten und lysierten.

(6.3) A2-negative hdm2-überexprimierende Tumor-Zellinien werden nicht von A2-restringierten hdm2-reaktiven ZTL lysiert

Zur Kontrolle der Erkennung der A2-positiven Tumor-Zellinien durch hdm2 81-88- spezifische ZTL wurden Zielzellen verwendet, die zwar hdm2 überexprimierten (s. Fig. 13), jedoch in der durchilußzytometrischen Analyse keinen A2-Phänotyp aufwiesen (Daten nicht gezeigt). Die prä-B-ALL-Zellinien UoC-B4, EU-1 und SUP-B 15 wurden von ZTL CD8 × A2K^b 81 und allo-A2.1-reaktiven ZTL nicht lysiert (Fig. 18). A2-positive EU-3-Zellen wurden von seiten dieser ZTL-Linien effizient erkannt. Keine Lyse war dagegen mit Flu M1-spezifischen ZTL zu beobachten.

Diese Experimente bzw. deren Ergebnisse demonstrieren, daß die Erkennung hdm2- überexprimierender Tumorzellen A2-restringiert erfolgt, und daß ausgeschlossen werden kann, daß die beobachtete Lyse A2-positiver Tumorzellen durch natürliche oder Lymphokin-aktivierte Killerzellen vermittelt wurde.

Beispiel 7 Verwendung von hdm2 81-88-spezifischen ZTL zur selektiven Erkennung und Lyse von humanen Tumorzellen (7.1) hdm2-Protein-Expression von transformierten, aktivierten oder ruhenden Zellen lymphohämopoetischen Ursprungs

Für eine potentielle, hdm2-spezifische ZTL-vermittelte Immuntherapie ist es wünschenswert, daß Normalzellen nicht lysiert werden. Das hdm2-Onkoprotein ist bei malignen hämatologischen Erkrankungen überexprimiert (s. Beispiel 6, (6.1)) und wird bekanntermaßen auch von einigen Normalzellen, darunter auch lymphohämopoetischen Zellen, exprimiert.

In Fig. 19 ist die hdm2-Protein-Expression lymphohämopoetischer Zellen unterschiedlichen Transformations- und Aktivierungszustands dargestellt. Die EBV- transformierte lymphoblastoide Zellinie (LCL) LG-2 zeigte eine sehr starke Expression des hdm2-Proteins. PHA- und Con A-transformierte Blasten exprimierten wesentlich geringere, aber immer noch substantielle Mengen an hdm2-Protein. Diesen transformierten B- und T-Zellblasten wurde zum Vergleich die hdm2-Protein-Expression nicht-transformierter Normalzellen gegenübergestellt. Bei dem Antigen-aktivierten Tyrosinase 369-377-spezifischen T-Zellklon IVSB (Wölfel et al., 1994) wurde im Westernblot kein hdm2-Protein detektiert (Fig. 19). Zusätzlich wurde die hdm2-Protein- Expression ruhender T-Zellen, B-Zellen und PBMZ untersucht. Auch bei diesen Zellen wurde kein hdm2-Protein nachgewiesen.

(7.2) Zytolytische Reaktivität hdm2 81-88-spezifischer ZTL gegenüber transformierten, aktivierten oder ruhenden Zellen lymphohämopoetischen Ursprungs

Transformierte und nicht-transformierte lymphohämopoetische Zellen wurden im folgenden als Zielzellen für A2-restringierte ZTL mit Spezifität für hdm2 81-88 eingesetzt. Die A2-positive EBV-transformierte LCL LG-2 sowie A2-positive PHA- und Con A-transformierte Blasten wurden von ZTL CD8 × A2K^b 81 effizient lysiert (Fig. 20). Diese Zytotoxizitätsdaten stehen im Einklang mit den Daten zur hdm2-Protein- Expression (s. Fig. 19). Die Lyse war A2-restringiert, da sie fast vollständig mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 blockiert werden konnte. Die als Positivkontrolle dienenden allo-A2.1-reaktiven ZTL erkannten alle 3 Zelltypen, hingegen war mit den als Negativkontrolle fungierenden Flu M1-spezifische 08196 00070 552 001000280000000200012000285910808500040 0002010109813 00004 08077n ZTL keine Lyse zu beobachten.

Ausgereifte dendritische Zellen (DZ) exprimieren MHC Klasse I- und II-, kostimulatorische sowie Adhäsions-Moleküle und eignen sich daher besonders gut als Antigen-präsentierende Zellen für ZTL. Diese reifen DZ wurden von ZTL A2 und CD8 × A2K^b 81 nicht suffizient erkannt (Fig. 21). Nach Beladung der DZ mit exogenem Peptid hdm2 81-88 wurde ZTL-Lyse rekonstituiert. Da außerdem eine lytische Aktivität von seiten allo-A2.1-reaktiver ZTL stattfand, konnten potentielle Defizite in der A2- Expression ausgeschlossen werden. Durch Flu M1-spezifische ZTL erfolgte keine Erkennung.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß reife DZ kein detektierbares hdm2-Protein exprimieren.

Im Gegensatz zu transformierten EBV-LCL, PHA- und Con A-Blasten sind reife DZ und Antigen-aktivierte T-Zellen nicht transformiert, sondern spezifisch aktiviert. Als Beispiel für Antigen-aktivierte ZTL wurde der Tyrosinase-spezifische und A2.1-positive Klon IVSB (Wölfel et al., 1994) als Zielzelle für ZTL mit Spezifität für hdm2 81-88 eingesetzt (Fig. 22). Ebenso wie im Falle der DZ war keine suffiziente Lyse erkennbar und die ZTL-Lyse konnte durch exogenes Peptid hdm2 81-88 rekonstituiert werden. Die allo- A2.1-reaktiven peptidspezifischen ZTL CD8 allo A2 zeigten mit der Lyse von IVSB nicht nur eine hinreichende A2-Expression der Zielzellen an, sondern aufgrund ihrer strikten Peptidabhängigkeit (Daten nicht gezeigt) auch eine funktionelle Antigen- Prozessierung und -Präsentation. ZTL CD8 allo A2 erkennen nämlich nicht die allogenen A2-Moleküle per se, sondern ausschließlich im Kontext mit endogen prozessierten zellulären Selbst-Peptiden.

Um auszuschließen, daß ruhende Zellen lymphohämopoetischen Ursprungs durch die Isolierungsmethode aktiviert werden, wurden ruhende T- und B-Zellen auf ihre Empfindlichkeit gegenüber hdm2-reaktiven ZTL getestet. Weder T-Zellen (Fig. 23) noch B-Zellen (Fig. 24) wurden von hdm2-reaktiven ZTL erkannt. Ebenso war keine lytische Aktivität gegen ruhende PBMZ zu beobachten (Fig. 25). Bei allen 3 Zelltypen konnte ZTL-Erkennung durch exogenes Peptid hdm2 81-88 rekonstituiert werden, was eine hinreichende A2-Expression bestätigte. Die Fähigkeit der Zielzellen, endogene Selbst- Peptide zu prozessieren und präsentieren, wurde mit deren Lyse durch die peptidabhängigen ZTL CD8 allo A2 kontrolliert. Von seiten der ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 fand sich keine lytische Aktivität.

Beispiel 8 Herstellung von A2.1-restringierten T-Zellrezeptoren, die spezifisch für das erfindungsgemäße Oligopeptid hdm2 81-88 sind

A2.1-transgene Mäuse werden mit dem erfindungsgemäßen Oligopeptid hdm2 81-88 immunisiert. Nach 10 Tagen wird die Milz entnommen. Die Milzzellen werden mit zuvor hergestellten, A2.1-positiven Antigen-präsentierenden Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Oligopeptid beladen sind, in vitro stimuliert. Die Herstellung dieser 2.1-positiven Antigen-präsentierenden Zellen erfolgt mit den im Stand der Technik bekannten und dem Fachmann geläufigen Techniken. Nach mehrwöchiger Kultur werden die T-Zellen auf ihre Peptid- und Tumorerkennung, Peptidspezifität und A2.1- Restriktion überprüft. Nach erfolgreicher Testung wird die T-Zellinie kloniert. Die resultierenden T-Zellklone werden erneut hinsichtlich Peptid- und Tumorerkennung, Peptidspezifität und A2.1-Restriktion getestet.

Von einem T-Zellklon mit positivem Testergebnis wird die Gesamt-mRNA präpariert. Mittels RT-PCR werden die T-Zellrezeptor α- und β-Ketten amplifiziert. Die jeweiligen Ketten werden zunächst in bakterielle Plasmide kloniert und sequenziert. Die Ketten werden partiell humanisiert, indem die konstanten Maus-Regionen durch die homologen humanen Regionen ersetzt werden. Anschließend erfolgt die Klonierung der resultierenden Konstrukte in geeignete retrovirale Vektoren.

Periphere Blut-Lymphozyten eines A2.1-positiven Krebspatienten, dessen Tumor- oder Leukämiezellen hdm2-Protein überexprimieren, werden entnommen, mit den Vektoren für α- und β-Kette des T-Zellrezeptors in vitro transduziert und die Genexpression auf Proteinebene untersucht. T-Zellrezeptor-exprimierende T-Lymphozyten werden auf ihre Fähigkeit zur Lyse von Tumorzellen analysiert. Nach erfolgreicher Testung werden die genmodifizierten Lymphozyten in den Patienten transfundiert und sollen dort die Abtötung der entarteten Zellen und damit die Heilung bewirken.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (15)

1. Universelles tumorassoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird und eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeiführt, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligopeptid (a) die Aminosäuresequenz LLGDLFGV, die den Aminosäurepositionen 81 bis 88 des humanen mdm2(= hdm2)-Proto-Onkoproteins entspricht, oder eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, -Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren davon ableitbare Aminosäuresequenz, die ein funktionelles Äquivalent der Aminosäuresequenz LLGDLFGV darstellt, aufweist, daß es (b) ein Epitop für CD8-positive ZTL darstellt, und daß es (c) dazu geeignet ist, eine auf humanes Leukozyten-Antigen (HLA) der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2", insbesondere Subtyp A2.1, eingeschränkte Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Tumor- und Leukämiezellen zu induzieren.

2. Retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es einem Oligopeptid gemäß Anspruch 1 entspricht, bei dem anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen -NH-CO-Bindungen oder andere Nichtpeptidbindungen ausgebildet sind.

3. Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens für ein Oligopeptid gemäß Anspruch 1 kodiert.

4. Verwendung eines Oligopeptids nach Anspruch 1 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 und/oder eines Polynukleotids nach Anspruch 3 zur Herstellung von Diagnostika und/oder Therapeutika und/oder Prophylaktika für den Nachweis und/oder die Beeinflussung und/oder Generierung und/oder Expandierung und/oder Steuerung des Aktivierungs- und Funktionszustands von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven zytotoxischen T- Lymphozyten.

5. Reagenz zur in-vivo- oder in-vitro-Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD8- positiven zytotoxischen T-Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz unter Verwendung wenigstens eines Oligopeptids nach Anspruch 1 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 und/oder eines Polynukleotids nach Anspruch 3 hergestellt ist.

6. Rekombinantes DNS- oder RNS-Vektormolekül, das mindestens ein oder mehrere Polynukleotid(e) nach Anspruch 3 enthält und das in Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs exprimierbar ist.

7. Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 3 oder ein Vektormolekül gemäß Anspruch 6 enthält.

8. Verwendung wenigstens eines Oligopeptids nach Anspruch 1 und/oder eines retro- inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 für die Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen das/die betreffende(n) Oligopeptide(e) oder gegen einen Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) und HLA-A2.

9. Antikörper, der spezifisch mit wenigstens einem Oligopeptid nach Anspruch 1 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 oder mit einem Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) und HLA-A2 reagiert.

10. Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es im Assoziationskomplex mit MHC Klasse I-Tetrameren oder pharmazeutisch geeigneten Trägern oder sonstigen Strukturen vorliegt.

11. Retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es im Assoziationskomplex mit MHC Klasse I-Tetrameren oder pharmazeutisch geeigneten Trägern oder sonstigen Strukturen vorliegt.

12. Verwendung wenigstens eines Oligopeptids gemäß Anspruch 1 und/oder eines retro- inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 oder eines Polynukleotids gemäß Anspruch 3 zur Herstellung polyklonaler oder monoklonaler oder rekombinanter A2-restringierter T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Molekülen gegen das /die betreffenden(n) Oligopeptid(e).

13. T-Zellrezeptor oder dazu funktionell äquivalentes Molekül, der/das spezifisch mit wenigstens einem Oligopeptid gemäß Anspruch 1 und/oder einem retro-inversen Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 2 reagiert.

14. Polynukleotid, das für einen T-Zellrezeptor gemäß Anspruch 13 kodiert.

15. Expressionsvektor, der die Fähigkeit besitzt, einen T-Zellrezeptor gemäß Anspruch 13 zu exprimieren.