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DE10105039A1 - Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten - Google Patents

Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten

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Publication number
DE10105039A1
DE10105039A1 DE10105039A DE10105039A DE10105039A1 DE 10105039 A1 DE10105039 A1 DE 10105039A1 DE 10105039 A DE10105039 A DE 10105039A DE 10105039 A DE10105039 A DE 10105039A DE 10105039 A1 DE10105039 A1 DE 10105039A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
alkyl
alkoxy
group
derived
residue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10105039A
Other languages
English (en)
Inventor
Jean Rapin
Hans Klaus Witzmann
Jean-Marie Grumel
Jacques Gonella
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TELL PHARM AG HERGISWIL
Original Assignee
TELL PHARM AG HERGISWIL
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Filing date
Publication date
Application filed by TELL PHARM AG HERGISWIL filed Critical TELL PHARM AG HERGISWIL
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Priority to PCT/EP2002/001181 priority patent/WO2002062830A1/en
Priority to JP2002563182A priority patent/JP2004531480A/ja
Priority to EP02716727A priority patent/EP1358204A1/de
Publication of DE10105039A1 publication Critical patent/DE10105039A1/de
Priority to US10/635,696 priority patent/US20050192228A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
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    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Tripeptid-Derivaten für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten. DOLLAR A Die Tripeptid-Derivate werden durch die folgende Formel dargestellt: DOLLAR F1 wobei X OH, (C¶1-5¶)alkoxy, NH¶2¶, NH-C¶1-5¶-alkyl, N(C¶1-5¶-alkyl)¶2¶ darstellt; DOLLAR A R bevorzugt einen Cinnamoylrest darstellt; DOLLAR A R¶1¶ ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, Pro, Ala, Val, Leu oder Ile ableitet; DOLLAR A R¶2¶ einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly, Ala, Ile, Val, Ser, Thr, His, Arg, Lys, Pro, Glu, Gln, pGlu, Asp und Asn ableitet; DOLLAR A R¶3¶ und R¶4¶ unabhängig voneinander H, OH, (C¶1-5¶) Alkyl oder (C¶1-5)¶ Alkoxy darstellen, vorausgesetzt, dass R¶3¶ und R¶4¶ nicht beide OH oder (C¶1-5¶) Alkoxy sind; und DOLLAR A R¶5¶ H, OH, (C¶1-5¶) Alkyl oder (C¶1-5¶) Alkoxy darstellt; DOLLAR A oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Tripeptid-Derivaten bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere infolge apoptotischer Prozesse.
Neurodegenerative Krankheiten zeichnen sich durch einen Abbau bzw. eine Degeneration der Nerven aus, der in der Regel durch Apoptose hervorgerufen wird. Beispiele für neurodegenerative Krankheiten schließen die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson- Krankheit wie auch die mit AIDS verbundenen neurologischen Störungen ein. Bei z. B. der Alzheimer-Krankheit führt der Nervenabbau zu einer Gedächtnisstörung, einer Störung des Sprach- und Denkvermögens sowie einer Störung der Fähigkeit, Entscheidungen zu treffen. Wie es zu diesen Störungen im einzelnen kommt, ist bislang nicht geklärt. Biochemisch ist u. a. eine Veränderung des kortikalen cholinergen Systems mit einer Verminderung bei der Bildung des Neurotransmitters Acetylcholin nachweisbar. In der Hirnrinde von Patienten, die unter der Alzheimer-Krankheit leiden, ist die Acetylcholin- Konzentration um 20 bis 40% vermindert. In der Folge werden Nervenenden attackiert, und dies führt letztlich zu dem Absterben von Hirnzellen. Hiervon ist insbesondere der Hippokampus betroffen.
Klinisch ist die Alzheimer-Krankheit durch drei Phasen gekennzeichnet: eine Prädemenz-Phase, eine Phase der leichten Demenz sowie eine Phase der schweren Demenz. In der Prädemenz-Phase beobachtet man insbesondere im Hippokampus eine neuronale Degeneration, später erscheinen dann die für die Alzheimer-Krankheiten kennzeichnenden Amyloidablagerungen.
Klassische Behandlungsformen der Alzheimer-Krankheit mit nootropen Substanzen weisen keine anti-degenerative Wirkungen im Bereich des Hippokampus auf. Nootrope Substanzen können nur die Symptome der Krankheit mildern, insbesondere kognitive Störungen. Nootrope Substanzen sind z. B. in EP 0 316 218 B1 beschrieben.
Neuere Therapieansätze für die Alzheimer-Krankheit setzen bei einer Stabilisierung der Acetylcholin-Konzentration an, und zwar durch Inhibierung der Acetylcholinesterase, die Acetylcholin zu Acetat und Cholin abbaut. Die Verwendung von Acetylcholinesterase-Inhibitoren weist jedoch den Nachteil auf, dass sie nur zu einer zeitweiligen Verbesserung führen, nicht jedoch die Nervendegeneration stoppen oder sogar rückgängig machen können.
Andererseits sind sogenannte neurotrophe Faktoren bzw. Neurotrophine bekannt, denen eine maßgebliche Rolle für das Überleben, das Wachstum und die Differenzierung diskreter neuronaler Populationen zugeschrieben wird. Diese Neurotrophin-Familie schließt den Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF), vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor, BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4) und die CNTF-Familie (ziliare neurotrophe Faktoren) ein. Neurotrophine sind kleine basische Proteine mit einem Molekulargewicht in dem Bereich von 26 bis 28 kDa. NGF ist das am besten charakterisierte Mitglied der Neurotrophin- Familie, und es hat sich herausgestellt, dass NGF eine Aktivität in vielen verschiedenen Geweben zeigt.
In dem peripheren Nervensystem (PNS) ist NGF für die Entwicklung von sympathischen und bestimmten sensorischen Nerven maßgeblich. In dem zentralen Nervensystem (ZNS) nimmt NGF eine trophische Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung cholinerger Neuronen im basalen Vorderhirn ein. Es spielt zudem eine Rolle bei der neuronalen Regeneration im erwachsenen ZNS-Gewebe.
Es ist bekannt, dass cholinerge Neuronen Acetylcholin stärker in Anwesenheit von NGF als in dessen Abwesenheit herstellen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in Primaten eine Verabreichung von NGF zu einer Regeneration cholinerger Zellkörper führte. Aufgrund dieser Erkenntnisse wird vermutet, dass eine veränderte Aktivität von NGF daher ein Ausgangspunkt bei der Degeneration von cholinergen Neuronen sein kann. Zumindest theoretisch scheinen daher neurotrophe Substanzen als geeignet für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten wie z. B. der Alzheimer-Krankheit. Diese physiologisch vorkommenden Substanzen weisen jedoch einen kurzen Wirkungsradius auf, der denen autokriner oder parakriner Substanzen ähnelt. Daher ist es bis heute nicht möglich, herkömmliche therapeutische Wege (enteral oder parenteral) für ihre Verabreichung zu nutzen, da sie im Blutkreislauf und anderen Geweben der Proteolyse unterliegen und hierdurch desaktiviert werden. Zudem ist bekannt, dass sie nicht die Bluthirnschranke überwinden können, was jedoch eine Voraussetzung für eine Wirkung auf das ZNS ist.
So haben klinische Versuche mit rekombinant-humanen Neurotrophinen bislang nicht zum Erfolg geführt. Eine in Betracht kommende intrazerebrale Verabreichung sollte zudem aus praktischen Erwägungen ausgeschlossen sein. Daher ist eine Übertragung der Ergebnisse aus in vitro-Experimenten mit NGF oder anderen Neurotrophinen sowie mit Fragmenten dieser Peptide auf eine mögliche therapeutische Verabreichung nicht ohne weiteres möglich.
Somit ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, bestimmte Substanzen bereitzustellen, die sowohl eine anti­ neurodegenerative Wirkung, insbesondere bei der Degeneration von Hippokampuszellen, zeigen als auch einer herkömmlichen therapeutischen Verabreichung zugänglich sind und die somit ihre Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten ermöglichen.
Dieses erfindungsgemäße Ziel wird gelöst durch die Verwendung der Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei X OH, (C1-5)alkoxy, NH2, NH-C1-5-alkyl, N(C1-5-alkyl)2 darstellt;
R1 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, Pro, die jeweils wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5)-Alkoxy-Gruppen, (C1-5)-Alkyl-Gruppen oder Halogenatomen substituiert sein können, sowie Ala, Val, Leu oder Ile ableitet;
R2 einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly, Ala, Ile, Val, Ser, Thr, His, Arg, Lys, Pro, Glu, Gln, pGlu, Asp, und Asn ableitet;
R3 und R4 unabhängig voneinander H, OH, (C1-5)Alkyl oder (C1-5)Alkoxy darstellen, vorausgesetzt, dass R3 und R4 nicht beide OH oder (C1-5)Alkoxy sind;
R5 H, OH, (C1-5)Alkyl oder (C1-5)Alkoxy darstellt;
R eine Gruppe der folgenden Formel darstellt:
worin Y -CO-, -CH2CO-, -CH2CH2CO-, - CH2CH2CH2CO-, -CH=CH-CO oder -OCH2CO- darstellt,
wobei Z ein Halogenatom, eine Trifluormethylgruppe, eine (C1-4)Alkoxygruppe oder eine (C1-4)Alkylgruppe darstellt, oder
wobei zwei benachbarte Substituenten eine (C1-3)- Alkylendioxygruppe bilden können,
und wobei n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon;
zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten.
Sofern nicht anders angegeben, können die Aminosäurereste sowohl in der D- als auch in der L-Form vorliegen, wobei die L-Form bevorzugt ist.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), in denen R1 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp ableitet, die jeweils wahlweise durch eine oder mehrere (C1-5)Alkoxy-Gruppen, (C1-5)Alkyl-Gruppen oder ein oder mehrere Halogenatome substituiert sein können, insbesondere ein Rest, der sich von Phe ableitet, die wahlweise durch eine oder mehrere (C1-5)Alkoxy-Gruppen, (C1-5)Alkyl-Gruppen oder ein oder mehrere Halogenatomen substituiert sein kann.
In der Formel (I) ist X vorzugsweise (C1-5)Alkoxy, NH2, NH- (C1-5)Alkyl oder N(C1-5Alkyl)2, besonders bevorzugt sind NH2- und N (C1-3Alkyl).
R2 ist bevorzugt ein Rest, der sich von der Aminosäure Gly ableitet.
R ist vorzugsweise ein Cinnamoylrest.
Besonders bevorzugt als Verbindung der Formel (I) ist Cinnamoyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid bzw. dessen pharmazeutisch annehmbaren Salze.
Die verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren (Phe für Phenylalanin usw. wie auch die teilweise unten verwendeten Einbuchstabenabkürzungen wie F für Phenylalanin) sind dem Fachmann geläufig (siehe z. B. Beyer und Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988). So bedeutet Phe Phenylalanin, Gly Glycin usw. Der Ausdruck "ein Rest, der sich von der Aminosäure Phe ableitet", bezeichnet somit einen Benzyl (-CH2-C6H5)-Rest. Entsprechend bezeichnet "ein Rest, der sich von der Aminosäure Gly ableitet", ein Wasserstoffatom, "ein Rest, der sich von der Aminosäure Ala ableitet", eine Methyl-Gruppe usw.
Die Synthese der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptid- Derivate ist nicht besonders beschränkt und kann gemäß bekannten Verfahren, vorzugsweise stereo-spezifischen Verfahren der Peptidchemie durchgeführt werden, bei denen die L- bzw. D-Konfiguration der jeweiligen Aminosäuren bzw. ihrer Derivate beibehalten wird. Insbesondere sind die in EP 0 316 218 B1 beschriebenen Synthesen geeignet.
Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen der Formel (I) sind Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit, die für eine enterale und in Form einer Suspension für die parenterale Verabreichung geeignet sind.
Regelmäßig wirksam ist eine Verabreichung in einer Dosis von mehr als 1 mg pro Kilogramm Körpergewicht, bevorzugt 5 bis 300 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Um die anti­ neurodegenerativen Wirkungen zu erzielen, ist regelmäßig eine Verabreichung über mehrere Tage (mindestens 4 bis 5 Tage) erforderlich. Dies steht im Gegensatz zu den anti­ amnästischen Wirkungen, die bereits nach einmaliger Verabreichung beobachtbar sind.
Die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen weisen eine sehr geringe Toxizität auf. Bei Mäusen wurden gemäß dem Irwin-Test in Dosierungen bis zu 1000 mg/kg p. o. keine letalen oder krampfauslösenden Wirkungen beobachtet.
Die Tripeptid-Derivate können für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die für die Verabreichung über verschiedene Wege geeignet sind, z. B. parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan), über den Atemwegstrakt (bukkal, sublingual, nasal, bronchial), den transdermalen Weg (perkutan) und die enterale Route (peroral).
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten weiterhin einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel oder Adjuvantien. Zur Formulierung können Standardtechniken verwendet werden, wie z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (letzte Ausgabe) offenbart.
Die Verabreichungsform wird in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg gewählt und umfasst u. a. Tabletten, Kapseln, Pulver und Lösungen.
Für die orale Verabreichung werden vorzugweise Tabletten und Kapseln verwendet, die ein geeignetes Bindemittel, z. B. Gelatine oder Polyvinylpyrrolidon, einen geeigneten Füllstoff, wie z. B. Lactose oder Stärke, ein geeignetes Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearat, und wahlweise weitere Zusatzstoffe enthalten. Bevorzugt sind Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäß zu verwendenden Tripeptid-Derivate in einer Menge von 1 bis 50 mg, besonders bevorzugt 2,5 bis 50 mg pro Verabreichungseinheit, enthalten.
Die antineurodegenerative Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptid-Derivate, insbesondere nach parenteraler oder enteraler Verabreichung, ist überraschend. Zwar ist die nootrope Wirkung dieser Substanzen aus EP 0 316 218 B1 bekannt. Die Erkenntnis, dass diese Substanzen nicht nur eine vorübergehende Wirkung auf das zentrale Nervensystem zeigen, sondern zu einer dauerhaften Regenerierung führen, konnte jedoch nicht erwartet werden.
Die Verabreichung der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen ist insbesondere für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit, vor allem in der Prädemenz-Phase sowie der Phase der leichten Demenz bevorzugt.
Die hervorragenden therapeutischen Eigenschaften der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptid-Derivate werden im folgenden anhand von drei Modellen für die Alzheimer- Krankheit dargelegt. In diesen Modellen konnte gezeigt werden, dass die Verabreichung der erfindungsgemäß verwendeten Tripeptid-Derivate nicht nur zu einer Erhöhung der Anzahl von Hippokampus-Neuronen bzw. zu einer Erhöhung der Anzahl der relevanten Rezeptoren führt, sondern auch zu einer Verbesserung der Lernfähigkeit der in den Tests verwendeten Ratten.
Beispiele Experimentelle Untersuchungen an Modellen für die Alzheimer- Krankheit 1. Experimentelles Modell der Alzheimer-Krankheit an Ratten, denen das Glycoprotein GP 120 aus HIV-Membranen verabreicht wurde (a) Grundlagen
GP 120 ist ein Glycoprotein, das aus HIV-Membranen erhalten wird. Dieses Glycoprotein spielt eine fundamentale Rolle bei dem Übergang des RNS-Moleküls des HIV-Virus in die Wirtszelle. Das isolierte GP 120 führt in der Zellmembran zu einer Läsion, durch die Calciumionen eindringen, die letztlich zu dem Zelltod führen.
Das Virus vermag nicht die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, jedoch die mit dem Virus befallenen Makrophagen. Im ZNS stirbt dann die Makrophage ab und lässt ihren Zellinhalt einschließlich des GP 120 und anderer desaktivierter Viruspartikel frei. Das GP 120 ist dann für eine neuronale Einwirkung verantwortlich, und zwar die im Endstadium von AIDS beobachteten komplexen Demenzen. Die Läsionen sind sowohl histologisch wie scintigraphisch denen der Alzheimer- Krankheit benachbart, wobei jedoch Unterschiede bezüglich der Lokalisierung bestehen. Man findet bei Erkrankten Amyloid- Ablagerungen und neurofibrilläre Abbauerscheinungen. Vor diesem Hintergrund hat sich die Verabreichung von GP 120 als gutes Modell für die Alzheimer-Krankheit herausgestellt.
(b) Versuche
40 männliche Wistar-Ratten (Charles River, Saint Aubin les Elbeuf, Frankreich) mit einem mittleren Gewicht von 280 bis 300 g wurden für dieses Experiment verwendet. Die Tiere wurden in einer Offenstallhaltung über 1 Woche gehalten, wobei die folgenden Parameter kontrolliert wurden:
Tag/Nacht-Rhythmus: 7 Std./19 Std.
Temperatur: 22 ± 1°C
Luftfeuchtigkeit: 50 ± 10%
Die Tiere erhielten nach Belieben Trinkwasser und eine Standardernährung UARA03.
Für die Versuchsdurchführung wurden die Ratten wie folgt operiert: Die Ratten werden leicht mit Äther anästhesiert, die Schädelhaut dann aufgeschnitten und die Schädeldecke wird mit Hilfe eines Zahnfräsers durchbohrt. Eine Metallkanüle wird unter Stereotaxie bis zum lateralen Hohlraum abgesenkt und dann mit einem Zahnzement fixiert. Die Durchlässigkeit der Kanüle wird an jedem Tag des Experimentes kontrolliert.
3 Tage nach Einführen der Kanüle (Erholung vom Operationsschock) werden die Tiere in 2 Gruppen aufgeteilt:
  • - 1 Gruppe von 10 Ratten, die über 5 Tage täglich 5 µl eines physiologischen Serums erhalten;
  • - 1 Gruppe von 30 Ratten, die über 5 Tage täglich 5 µl physiologisches Serum enthaltend Gp120 in einer Menge von 10 nM pro Kilogramm erhalten.
Die Experimente zeigten, dass eine Degenerierung in Abhängigkeit der Dosierung des verabreichten Gp120 besteht. Eine Dosis von 10 nM/kg führt zu einem 40-60%igen Verlust an Hippokampus-Neuronen.
10 Tage nach der letzten Verabreichung von Gp120 wurden die Tiere der dritten Gruppe in drei Untergruppen à 10 Ratten aufgeteilt:
  • a) eine Kontrollgruppe, die täglich per os über einen Zeitraum von 5 Tagen 1 ml pro Kilogramm Trinkwasser über eine Speiseröhrensonde morgens um 9.00 Uhr erhielten,
  • b) eine Gruppe, die Cinnamoyl-gly-L-Phe-L-Pro-NH2 per os über einen Zeitraum von 5 Tagen in einer Konzentration von 1 ml pro Kilogramm (10 mg pro Kilogramm) über eine Speiseröhrensonde um 9.00 Uhr morgens erhielten; und
  • c) eine Gruppe, die Takrin per os über einen Zeitraum von 5 Tagen in einer Konzentration von 1 ml pro Kilogramm (10 mg pro Kilogramm) über eine Speiseröhrensonde um 9.00 Uhr morgens erhielten.
Die erste Gruppe von 10 Ratten (ohne GP-120-Verabreichung) erhielt unter den gleichen Bedingungen 1 ml/kg Trinkwasser.
(c) Lernverhalten
An den letzten 5 Tagen des Experiments wurden die Tiere 10 Stunden nach Verabreichung (an dem Zeitpunkt der max. Konzentration des Wirkstoffs im Gehirn) in einen Lern-Käfig eingebracht ("Pole Climbing Test"). Die Tiere sollen bei diesem Test lernen, auf eine Stange zu klettern, um einen elektrischen Schock zu vermeiden. Es wurden über einen Zeitraum von 5 Tagen 10 Versuche täglich durchgeführt. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als Prozentsatz der richtigen Antworten, und die Kinetik der Antworten wird durch eine mehrfach exponentielle Kurve dargestellt. Am fünften Tag zeigten alle Testtiere positive Antworten. Das Maximum der Kurve stellt die Lernfähigkeit dar. Die Steigung der Kurve beschreibt die Lerngeschwindigkeit. Die Fläche unter der Kurve ergibt ein gutes Bewertungmaß der Gesamtheit der Konditionierungsparameter. Der max. Wert der Fläche beträgt 500, wenn alle Tiere am nullten Tag positive Antworten ergeben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Für jeden Lerntag entsprechen die angegebenen Werte in der Tabelle dem Prozentsatz der Vermeidung. Die Ratte vermeidet, einen elektrischen Schlag zu bekommen, indem sie auf die Stange klettert. Am ersten Tag wird keine Vermeidung beobachtet. Die Lerngeschwindigkeit und das Lernvermögen sind bei den Ratten stark vermindert, denen das GP 120 verabreicht worden war. Die Behandlung mit der erfindungsgemäß verwendeten Substanz Cinnamoyl-gly-L-Phe-L-Pro-NH2 und mit Tacrin (TAA) führen zur teilweisen Wiederherstellung der Lernparameter. Dieses bedeutsame Resultat wird an den Tagen 2, 3 und 4 beobachtet.
(d) Neuronenanzahl
Nach dem letzten Lernversuch wurden die Tiere enthauptet, und das Gehirn wurde isoliert und auf -80°C in flüssigem Stickstoff eingefroren. Schnitte einer Dicke von 50 µm wurden in einem "Cryocut" erhalten, und die Anzahl an Neuronen in dem CA III Hippokampus-Bereiche wurde durch Zählen unter dem Mikroskop bestimmt. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Kontrollgruppe ausgedrückt.
Wie aus den Versuchsergebnissen ersichtlich, führt die Verabreichung zu einer Verbesserung des Lernverhaltens, wie bei der Verabreichung von Tacrin. Im Gegensatz zu Tacrin geht jedoch diese Verbesserung mit einer weniger starken Degenerierung der Neuronen einher.
2. Experimentelles Modell der Alzheimer-Krankheit an Ratten, denen Dexamethason verabreicht wurde (a) Grundlagen
Das synthetische Corticoid Dexamethason vermag bei Verabreichung per os eine Gehirndegenerierung in der Ratte zu induzieren. Diese Degenerierung führt zu einem neuronalen Verlust im Hippokampus, insbesondere zu einer Verminderung (down regulation) der Glucocorticoid-Rezeptoren vom Typ II und einer Veränderung des Lernverhaltens der Ratte.
(b) Versuche
Ratten wurden wie unter 1. beschrieben gehalten und operiert. Dann wurden folgende Gruppen gebildet:
  • - 1 Gruppe von 10 Ratten, die über 21 Tage täglich 5 µl eines physiologischen Serums erhalten;
  • - 1 Gruppe von 30 Ratten, die über 21 Tage täglich 50 mg/kg Dexamethason, gelöst in physiologischem Serum, erhalten.
Die Experimente zeigten, dass eine Degenerierung in Abhängigkeit der Dosierung des verabreichten Dexamethasons und der Behandlungsdauer besteht. Eine Dosis von 50 mg/kg führt zu einem 50-60%igen Verlust an Glucocorticoid- Rezeptoren im Hippokampus.
Nach der letzten Verabreichung wurde die zweite Gruppe Ratten in drei Untergruppen unterteilt und behandelt, wie unter 5.1 beschrieben.
(c) Lernverhalten
Das Lernverhalten wurde wie unter 1. beschrieben untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
(d) Bestimmung der Corticoid-Rezeptoren
Die Tiere wurden nach der letzten Lernuntersuchung um 10.00 Uhr morgens getötet, und das Hippokampus wurde auf einer auf 0°C gekühlten Platte isoliert.
Die Bestimmung der Anzahl an Rezeptoren wurde durch Fixierung unter Verwendung eines markierten Corticoids und eines spezifischen Inhibitors der Bindung des Corticoids an seinen Rezeptor realisiert. Zudem wurde der Proteingehalt durch die Methode von Lowry bestimmt.
Die Hippokampus-Zellen wurden in 2 ml EDTA-Glycerin- Natriummolybdad homogenisiert, und das Homogenisat wurde bei 100.000 g über 60 min zentrifugiert. Der Proteingehalt des Überstandes wird durch die Methode von Lowry bestimmt. Nach der Verdünnung auf einen Proteingehalt zwischen 1,3 und 1,65 mg/ml wurde der Überstand in 3 Teile von jeweils 0,2 ml aufgeteilt, und wachsende Konzentrationen (25, 50 und 75 nmol/ml) an Dexamethason-3H (Emmerson 50 CI/mM) wurden hinzugefügt. Drei weitere Präparationen wurden in der gleichen Weise hergestellt, wobei jedoch ein Rezeptoragonist in sättigender Menge (RU 28362) hinzugefügt wurde, um die nicht-spezifische Fixierung von Dexamethason zu erhalten.
Nach Inkubierung über Nacht bei 4°C wurde Kohlenstoff/Dextran hinzugefügt. Die Radioaktivität des Überstandes wurde dann durch Flüssigszintillation bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fentomol an markiertem Corticoid am Rezeptor ausgedrückt und beziehen sich auf ein Milligramm Protein.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Die Verabreichung von Dexamethason induziert eine sehr drastische Verminderung der Corticoid-Rezeptoranzahl im Hippokampus. Für die verwendete Dosis und die Behandlungszeit in diesem Experiment wurde eine Verminderung in der Größenordnung von 60% gefunden. Die Verabreichung des erfindunsgemäß verwendeten Tripeptidderivates führt zu einer deutlichen Erhöhung der Anzahl der Rezeptoren der Hippokampus-Neuronen. Takrin zeigt unter den gleichen Bedingungen keine Wirkung.
Dies zeigt, dass die Behandlung mit dem erfindunsgemäß verwendeten Tripeptidderivat zu einer Wiederherstellung eines Großteils des Lernvermögens führt und die Entartung auf dem Niveau des Hippokampus vermindert. Tacrin andererseits, das den Abbau von Acetylcholin inhibiert und das Lernverhalten verbessert, sofern Acetylcholin betroffen ist, zeigt keine Wirkung in dem Modell der Corticoid-Degeneration.
3. Experimentelles Modell der Alzheimer-Krankheit an Ratten mit durch Vincristin induzierter Neurodegeneration (a) Grundlagen
Durch wiederholte intracerebroventrikuläre (ICV) Verabreichung von Vincristin wird eine Hirndegeneration induziert. Diese Degeneration führt zu einem neuronalen Verlust auf dem Niveau der periventrikulären Strukturen bis zu den Hippokampus-Strukturen. Vincristin lagert sich an die Mikrotuboli an und führt so zu einer neurofibrillärartigen Degenerierung, und das Lernvermögen der Tiere wird vermindert.
(b) Versuche
Ratten wurden wie unter 1. beschrieben gehalten und operiert. Dann wurden folgende Gruppen gebildet:
  • - 1 Gruppe von 10 Ratten, die über 5 Tage täglich 5 µl eines physiologischen Serums erhalten;
  • - 1 Gruppe von 30 Ratten, die über 5 Tage täglich 5 µl physiologisches Serum enthaltend 5 µg/kg Vincristin erhalten.
Die Experimente zeigten, dass eine Degenerierung in Abhängigkeit der Dosierung des verabreichten Vincristins besteht. Eine Dosis von 5 µg/kg führt zu einem 40-60%igen Verzweigungsverlust auf dem Niveau des Hippokampus.
Nach der letzten Verabreichung wurde die zweite Gruppe Ratten in drei Untergruppen unterteilt und behandelt, wie unter 4.1 beschrieben.
(c) Lernverhalten
Das Lernverhalten wurde wie unter 1. beschrieben untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Diese Ergebnisse zeigen die vorteilhaften Wirkungen der erfindungsgemäß verwendeten Substanzen auf das Lernverhalten. Tacrin hingegen zeigt in diesem Modell keine Wirkung.

Claims (7)

1. Verwendung von Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei X OH, (C1-5)alkoxy, NH2, NH-C1-5-alkyl, N(C1-5-alkyl)2 darstellt;
R1 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, Pro, die jeweils wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5)Alkoxy-Gruppen, (C1-5)Alkyl-Gruppen oder Halogenatomen substituiert sein können, sowie Ala, Val, Leu oder Ile ableitet;
R2 einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly, Ala, Ile, Val, Ser, Thr, His, Arg, Lys, Pro, Glu, Gln, pGlu, Asp und Asn ableitet;
R3 und R4 unabhängig voneinander H, OH, (C1-5)Alkyl oder (C1-5)Alkoxy darstellen, vorausgesetzt, dass R3 und R4 nicht beide OH oder (C1-5)Alkoxy sind;
R5 H, OH, (C1-5)Alkyl oder (C1-5)Alkoxy darstellt; und
R eine Gruppe der folgenden Formel darstellt:
worin Y -CO-, -CH2CO-, -CH2CH2CO-, - CH2CH2CH2CO-, -CH=CH-CO oder -OCH2CO- darstellt,
wobei Z ein Halogenatom, eine Trifluormethylgruppe, eine (C1-4)Alkoxygruppe oder eine (C1-4)Alkylgruppe darstellt,
oder wobei zwei benachbarte Substituenten eine (C1-3)- Alkylendioxygruppe bilden können,
und wobei n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon;
zur Behandlung neurodegenerativer Krankheiten.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei R1 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, Tyr, Trp ableitet, die jeweils wahlweise durch eine (C1-5)Alkoxy-Gruppe, eine (C1-5)Alkyl-Gruppe oder ein Halogenatom substituiert sein können.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei R1 ein Rest ist, der sich von Phe ableitet, das wahlweise durch eine (C1-5)­ Alkoxy-Gruppe, eine (C1-5)Alkyl-Gruppe oder ein Halogenatom substituiert sein kann.
4. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X (C1-5)Alkoxy, NH2, NH-C1-5Alkyl oder N(C1-5Alkyl)2 ist.
5. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei R2 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Gly ableitet.
6. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei R ein Cinnamoylrest ist.
7. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung der Formel (I) Cinnamoylglycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist.
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