DE10104551A1 - Use of a Claudin-4 ligand in the therapy and diagnosis of tumors - Google Patents
Use of a Claudin-4 ligand in the therapy and diagnosis of tumorsInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Claudin-4-Liganden zur Behandlung bzw. Therapie und/oder Diagnose von Tumoren, ein Konjugat, das einen Claudin-4-Liganden und mindestens ein Chemotherapeutikum und/oder mindestens ein nicht-radioaktives Diagnostikum umfaßt, sowie eine pharmazeuti sche Zusammensetzung, welche das erfindungsgemäße Konjugat enthält.The present invention relates to the use of a Claudin-4 ligand for Treatment or therapy and / or diagnosis of tumors, a conjugate that a claudin-4 ligand and at least one chemotherapy agent and / or comprises at least one non-radioactive diagnostic, and a pharmaceutical cal composition which contains the conjugate according to the invention.
Viele Krebsleiden, die mit der Ausbildung von Tumoren einhergehen, werden der zeit chemo- und/oder strahlentherapeutisch behandelt, oder es wird versucht, eine chirurgische Resektion des Tumors in kurativer Intention durchzuführen. Fortge schrittene solide Tumoren, beispielsweise des Gastrointestinaltrakts und anderer Organsysteme, sind in der Regel jedoch nicht durch einen operativen Eingriff zu heilen, bzw. es ist in vielen Fällen bei einem derart fortgeschrittenen Stadium, das zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits häufig vorliegt, kein Eingriff mehr möglich. Die derzeit verfügbaren chemo- und strahlentherapeutischen Verfahren führen meist nur zur Verlangsamung des Tumorwachstums oder im besten Falle zu einer (vorübergehenden) Verkleinerung des Tumors. Eine Heilung ist in der Regel mit den vorstehend genannten Therapien auch bei deren Kombination nicht möglich, und oft spricht nur ein Teil der Patienten auf die Therapie an (sog. An sprechraten von maximal 10 bis 20% werden beispielsweise bei Tumoren der Bauchspeicheldrüse erzielt). Hinzu kommt eine z. T. erhebliche Minderung der Le bensqualität des Patienten durch die Nebenwirkungen der herkömmlichen Zyto statika und der Strahlentherapie.Many cancers associated with the formation of tumors become the time chemotherapy and / or radiation therapy, or an attempt is being made perform surgical resection of the tumor with curative intent. Fortge stepped solid tumors, for example of the gastrointestinal tract and others Organ systems, however, are not usually closed through surgery heal, or in many cases it is at such an advanced stage that is often present at the time of diagnosis, no more intervention possible. The currently available chemotherapy and radiation therapy methods usually only lead to a slowdown in tumor growth or at best for a (temporary) reduction in size of the tumor. A cure is in the Do not rule with the therapies mentioned above, even when they are combined possible, and often only some of the patients respond to the therapy (so-called An Talk rates of at most 10 to 20% are, for example, in the case of tumors Pancreas achieved). In addition there is a z. T. considerable reduction in Le patient's quality of life due to the side effects of conventional cyto statica and radiation therapy.
Hinsichtlich der Diagnostik zur Identifizierung von Tumoren werden verschiedene bildgebende (z. B. Ultraschall-, computertomographische, kernspintomographi sche, nuklearmedizinische Verfahren), endoskopische (z. B. Magenspiegelung, Endosonographie, Dickdarmspiegelung), laborchemische (z. B. mit Tumormarkern) Verfahren sowie feingewebliche Untersuchungen, beispielsweise von Biopsiema terial, durchgeführt. Die vorstehend genannten Verfahren sind häufig mit einer diagnostischen Unsicherheit verbunden, weshalb es häufig nicht gelingt, einen bösartigen von einem gutartigen Tumor zu unterscheiden. Des weiteren können beispielsweise feingewebliche Untersuchungen, insbesondere bei stromareichen Tumoren, nicht zu einer definitiven Abklärung beitragen.With regard to the diagnosis for the identification of tumors, various imaging (e.g. ultrasound, computed tomography, magnetic resonance imaging chemical medicine), endoscopic (e.g. gastroscopy, Endosonography, colonoscopy), laboratory chemistry (e.g. with tumor markers) Procedures and histological examinations, for example of biopsy specimens material. The above methods are often with a diagnostic uncertainty, which is why it is often not possible to find one to distinguish malignant from a benign tumor. Furthermore you can for example, fine tissue examinations, particularly in the case of electricity-rich Tumors, do not contribute to a definitive clarification.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Therapie und Diagnose von Tumorerkrankungen bereitzustellen, welches es ermöglicht, Tumoren zur Therapie bzw. Diagnose mit entsprechenden Therapeu tika bzw. Diagnostika aufgrund von auf den Tumorzellen spezifisch vorhandenen Rezeptormolekülen in effizienter Weise anzusteuern (Drug-Targeting).The present invention is therefore based on the object of a new system for the therapy and diagnosis of tumor diseases, which it enables tumors for therapy or diagnosis with appropriate Therapeu tics or diagnostics based on those that are specifically present on the tumor cells Target receptor molecules in an efficient manner (drug targeting).
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausfüh rungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.This object is achieved by the embodiment characterized in the claims tion forms of the present invention solved.
Insbesondere wird die Verwendung eines Claudin-4-Liganden zur Behandlung bzw. Therapie und/oder Diagnose von Tumoren bereitgestellt.In particular, the use of a Claudin-4 ligand for treatment or therapy and / or diagnosis of tumors.
Claudin-4 wurde als Strukturprotein von Tight Junctions innerhalb der Zellmem bran identifiziert, wobei das Protein differenziell in verschiedenen humanen Ge weben exprimiert wird (Morita et al., 1999). Ursprünglich wurde Claudin-4 als Re zeptor des Clostridium perfringens Enterotoxins bei Darmepithelzellen beschrie ben und kürzlich durch Sequenzhomologien als Claudin-4 der Familie der Claudi ne zugeordnet (Sonoda et al., 1999). Es wurde festgestellt, daß das C. peririn gens Enterotoxin (CPE) an Claudin-4 (= CPE-R) bindet und innerhalb weniger Mi nuten zur Zellysis führt. Dieses Modell entspricht in vivo einer akuten, durch das Clostridium-Bakterium ausgelösten, Enterotoxin-vermittelten Gastroenteritis (McClane, 1996). Durch Mutationsanalysen wurde weiter gezeigt, daß der C- Terminus des CPE spezifisch an Claudin-4 bindet, während durch den N- Terminus der zytotoxische Effekt ausgelöst wird. Es wurde ein C-terminales CPE- Fragment kloniert, das zwar stabil an Claudin-4 bindet, jedoch keine zytotoxischen Eigenschaften aufweist (Hanna et al., 1989; US-Patent 5,695,956). Es wurde aus serdem gezeigt, daß das nicht-zytotoxische C-terminale CPE-Fragment nach Bindung an den Rezeptor eine Internalisierung von Claudin-4 bewirkt, wodurch die Barriere-Funktion der Tight Junctions deutlich reduziert wurde (Sonoda et al., 1999).Claudin-4 was used as a structural protein by tight junctions within the cell membrane bran identified, the protein being differentially in different human Ge weaving is expressed (Morita et al., 1999). Claudin-4 was originally named Re described the clostridium perfringens enterotoxin receptor in intestinal epithelial cells ben and recently through sequence homologies as Claudin-4 of the Claudi family ne assigned (Sonoda et al., 1999). The C. peririn gene binds enterotoxin (CPE) to claudin-4 (= CPE-R) and within a few minutes grooves leads to cellisis. This model corresponds to an acute in vivo, through which Clostridium bacterium-triggered enterotoxin-mediated gastroenteritis (McClane, 1996). Mutation analyzes have further shown that the C- CPE terminus specifically binds to claudin-4, while through the N- Term the cytotoxic effect is triggered. A C-terminal CPE Cloned fragment that binds stably to claudin-4 but not cytotoxic Properties (Hanna et al., 1989; U.S. Patent 5,695,956). It was out also demonstrated that the non-cytotoxic C-terminal CPE fragment after binding internalization of claudin-4 at the receptor causes the Barrier function of the tight junctions was significantly reduced (Sonoda et al., 1999).
Die vorliegenden Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Claudin-4 in diversen Tumorzellen im Vergleich zu gesundem Gewebe vermehrt exprimiert wird (vgl. das beigefügte Beispiel). Tumoren, die eine vermehrte Expression von Claudin-4 aufweisen, sind z. B. Colonkarzinome (Dickdarmkrebs), Mammakarzinome (Brustkrebs) und Pankreaskarzinome (Bauchspeicheldrüsenkrebs).The present invention is based on the finding that Claudin-4 in various Tumor cells are increasingly expressed in comparison to healthy tissue (cf. the attached example). Tumors that show increased expression of Claudin-4 have z. B. Colon cancer (colon cancer), breast cancer (Breast cancer) and pancreatic cancer (pancreatic cancer).
In WO-A-94/24155 wird die therapeutische Verwendung eines anderen Clostridi um-Toxins, nämlich des Clostridium difficile Toxins A, beschrieben. Das Clostridi um difficile Toxin A weist jedoch mit etwa 2.700 Aminosäuren (Molekulargewicht etwa 308 kDa) eine völlig andere Struktur als CPE (319 Aminosäuren) auf, wobei die Aminosäuresequenzen beider Proteine keinerlei Homologie zeigen. Daher ist der Wirkmechanismus des Clostridium difficile Toxins A nicht mit dem des CPE zu vergleichen und führt nicht über die Bindung an Claudin-4.WO-A-94/24155 describes the therapeutic use of another Clostridi um toxin, namely the Clostridium difficile toxin A, described. The Clostridi difficile toxin A, however, has about 2,700 amino acids (molecular weight about 308 kDa) has a completely different structure than CPE (319 amino acids), whereby the amino acid sequences of both proteins show no homology. thats why the mechanism of action of Clostridium difficile toxin A does not match that of CPE compare and does not result in binding to claudin-4.
Der Begriff "Claudin-4-Ligand" bedeutet eine Verbindung, die dazu befähigt ist, spezifisch mit Claudin-4 zu wechselwirken. Die spezifische Bindung des Claudin- 4-Liganden mit dem Rezeptor kann dabei auf jeglichen chemischen bzw. physika lischen Wechselwirkungen, beispielsweise ionischen Wechselwirkungen, Wasser stoffbrückenbindungen, Van-der-Waals-Bindungen und/oder hydrophoben Wech selwirkungen, beruhen. Hinsichtlich der Spezifität des Claudin-4-Liganden ist es bevorzugt, daß die Gleichgewichtskonstante der Assoziationsreaktion zwischen dem Claudin-4-Liganden und dem Rezeptor ausreichend groß ist, was vorzugs weise einem Wert von größer als 1 × 105 M-1, mehr bevorzugt größer als 1 × 107 M-1, entspricht.The term "claudin-4 ligand" means a compound that is capable of specifically interacting with claudin-4. The specific binding of the claudin-4 ligand with the receptor can be based on any chemical or physical interactions, for example ionic interactions, hydrogen bonds, van der Waals bonds and / or hydrophobic interactions. With regard to the specificity of the claudin-4 ligand, it is preferred that the equilibrium constant of the association reaction between the claudin-4 ligand and the receptor is sufficiently large, which is preferably a value greater than 1 × 10 5 M -1 , more preferred greater than 1 × 10 7 M -1 .
Ein bevorzugter, erfindungsgemäß zu verwendender Claudin-4-Ligand ist bei spielsweise das vorstehend genannte C. perfringens Enterotoxin (CPE). Aufgrund der zytotoxischen Wirkung des C. perfringens Enterotoxins, eignet es sich bei spielsweise zur gezielten Zerstörung der den CPE-Rezeptor (d. h. Claudin-4) ex primierenden Tumorzellen. Es ist jedoch möglich, ein Fragment oder Derivat eines derartigen Toxins zu verwenden, das vorzugsweise selbst keine zytotoxische Wir kung aufweist, jedoch weiterhin spezifisch mit Claudin-4 wechselwirkt. Derartige Fragmente umfassen beispielsweise die Aminosäuren 171 bis 390, mehr bevor zugt die Aminosäuren 290 bis 319, des vorstehend genannten CPE (vgl. US- Patent 5,695,956). Weitere Beispiele erfindungsgemäß geeigneter Claudin-4- Liganden umfassen gegen Claudin-4 gerichtete Antikörper und Fragmente bzw. Derivate davon sowie die in WO-A-00/26360 offenbarten Claudin-4-bindenden Peptidverbindungen.A preferred claudin-4 ligand to be used according to the invention is in for example the above-mentioned C. perfringens enterotoxin (CPE). by virtue of the cytotoxic effect of C. perfringens enterotoxin, it is suitable for for example, for the targeted destruction of the CPE receptor (i.e. Claudin-4) ex priming tumor cells. However, it is possible to create a fragment or derivative of one to use such toxin, which preferably itself no cytotoxic Wir kung, but still specifically interacts with Claudin-4. such Fragments include, for example, amino acids 171 to 390, more before adds amino acids 290 to 319 of the above-mentioned CPE (cf. Patent 5,695,956). Further Examples of Claudin-4- Suitable According to the Invention Ligands include antibodies and fragments directed against Claudin-4 or Derivatives thereof and the claudin-4 binding agents disclosed in WO-A-00/26360 Peptide compounds.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung zur Herstellung eines Mittels zur Thera pie von Tumoren ist der Ligand vorzugsweise mit mindestens einem Chemothera peutikum konjugiert. Zur Bereitstellung eines entsprechenden Kombinationspräpa rats kann das herzustellende therapeutische Mittel zusätzlich zum erfindungsge mäßen Liganden bzw. einem vorstehend definierten Konjugat mindestens ein weiteres Chemotherapeutikum enthalten.In the use according to the invention for the preparation of an agent for Thera The tumor is preferably ligand with at least one chemothera aspirin conjugated. To provide a corresponding combination preparation The therapeutic agent to be produced can be used in addition to the invention at least one ligand or a conjugate defined above contain another chemotherapy drug.
Der Begriff "Chemotherapeutikum" bedeutet, daß die betreffende Substanz ent weder selbst oder nach ihrer Umsetzung durch den Stoffwechsel im jeweiligen Organismus ein Mittel zur Wachstumshemmung und/oder Abtötung von Tumor zellen bereitstellt und umfaßt somit auch die sich durch diese Umsetzungen erge benden Derivate. Besonders geeignete Chemotherapeutika sind z. B. Zytostatika.The term "chemotherapeutic" means that the substance in question ent neither themselves or after their implementation through the metabolism in the particular Organism a means of inhibiting the growth and / or killing of tumor cells provides and therefore also includes the results of these implementations derivatives. Particularly suitable chemotherapeutic agents are e.g. B. Cytostatics.
Beispiele von Chemotherapeutika, mit denen der Claudin-4-Ligand gekoppelt werden kann bzw. welche in dem unter Verwendung dieses Claudin-4-Liganden hergestellte therapeutische Mittel enthalten sein können, sind Antibiotika, Anthra zykline, N-Nitrosoharnstoffe, Alkylantien, Antinukleoside, Purin- oder Pyrimidi nantagonisten, Folsäureantagonisten, Taxane, Camptothecine, Podophyllotoxin derivate, Vinca-Alkaloide und Platinverbindungen. Bevorzugte Chemotherapeutika sind beispielsweise aus der Gruppe, bestehend aus 5-Fluoruracil, Gemcitabin, cis- konfigurierten Platin (II)-Komplexen, Oxaliplatin, Irinothecan, Mitoxantron, Mitomy cin C und Taxol, ausgewählt.Examples of chemotherapy drugs with which the Claudin-4 ligand is coupled or which in which using this Claudin-4 ligand Prepared therapeutic agents may be included are antibiotics, anthra cyclines, N-nitrosoureas, alkylating agents, antinucleosides, purine or pyrimidi nantagonists, folic acid antagonists, taxanes, camptothecins, podophyllotoxin derivatives, vinca alkaloids and platinum compounds. Preferred chemotherapy drugs are, for example, from the group consisting of 5-fluorouracil, gemcitabine, cis- configured platinum (II) complexes, oxaliplatin, irinothecan, mitoxantrone, mitomy cin C and Taxol selected.
Zur erfindungsgemäßen diagnostischen Verwendung umfaßt der Claudin-4- Ligand vorzugsweise mindestens eine Markierung bzw. ein Diagnostikum. Der Begriff "Diagnostikum" bzw. "Markierung" bedeutet eine Substanz bzw. eine che mische Gruppe, die mittels geeigneter chemischer und/oder physikalischer Meß methoden im Organismus in vivo oder Teilen davon in vitro, beispielsweise Ge webeproben, Zellen und/oder Flüssigkeiten, wie beispielsweise dem Serum, nachweisbar, vorzugsweise auch quantifizierbar ist.For the diagnostic use according to the invention, the Claudin-4 comprises Ligand preferably at least one label or diagnostic. The The term "diagnostic agent" or "marking" means a substance or a surface mix group by means of suitable chemical and / or physical measurement methods in the organism in vivo or parts thereof in vitro, for example Ge weave samples, cells and / or liquids, such as the serum, is detectable, preferably also quantifiable.
Bevorzugte Markierungen bzw. Diagnostika enthalten beispielsweise ein oder mehrere Radionuklide, ein oder mehrere Radionuklide umfassende, vorzugsweise solche Radionuklide komplexierende Liganden, ein oder mehrere Positronen strahler, ein oder mehrere NMR-Kontrastmittel, eine oder mehrere fluoreszierende Verbindung(en) oder ein oder mehrere Kontrastmittel im nahen IR-Bereich. So kann beispielsweise unter Verwendung des erfindungsgemäßen Claudin-4- Liganden ein Tumor in einer Biopsieprobe durch Detektion einer geeigneten Mar kierung, beispielsweise einem Fluoreszenzmarker, nachgewiesen werden.Preferred markings or diagnostics contain, for example, a or several radionuclides, preferably one or more radionuclides such radionuclides complexing ligands, one or more positrons emitters, one or more NMR contrast agents, one or more fluorescent Compound (s) or one or more contrast agents in the near IR range. So can, for example, using the Claudin-4 according to the invention Ligand a tumor in a biopsy sample by detecting an appropriate Mar Labeling, for example, a fluorescent marker can be detected.
Der Claudin-4-Ligand eignet sich beispielsweise zur Therapie und/oder Diagnose von Pankreaskarzinomen, Karzinomen der Papilla Vateri, Colonkarzinomen, Rektumkarzinomen, Magenkarzinomen, Ovarialkarzinomen und Mammakarzino men.The Claudin-4 ligand is suitable, for example, for therapy and / or diagnosis of pancreatic carcinomas, carcinomas of the papilla Vateri, colon carcinomas, Rectal cancer, gastric cancer, ovarian cancer and breast cancer men.
Im vorstehend definierten Konjugat kann die Verknüpfung zwischen dem Claudin- 4-Liganden und dem Chemotherapeutikum bzw. Diagnostikum entweder im Kör per nicht spaltbar sein oder die Verknüpfung kann pH-abhängig und/oder en zymatisch spaltbar sein.In the conjugate defined above, the link between the claudin 4-ligand and the chemotherapeutic or diagnostic agent either in the body can not be cleaved by or the linkage can be pH-dependent and / or be zymatically fissile.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist in den vorstehend defi nierten Konjugaten der Claudin-4-Ligand mit dem Chemotherapeutikum bzw. dem Diagnostikum über ein Spacermolekül verbunden. Dabei kann, wie schon vorste hend für die direkte Verknüpfung zwischen Chemotherapeutikum bzw. Diagnosti kum und Claudin-4-Ligand ausgeführt, das Spacermolekül und/oder die Ver knüpfung zwischen Chemotherapeutikum und dem Spacermolekül und/oder die Verknüpfung zwischen Claudin-4-Ligand und dem Spacermolekül entweder im Körper nicht spaltbar sein oder das Spacermolekül und/die genannten Verknüp fungen können pH-abhängig und/oder enzymatisch spaltbar sein. Beispiele geeigneter Spacermoleküle (z. B. Maleinimid-, N-Hydroxysuccinimid-Spacer usw.) und die Bereitstellung von pH-abhängig spaltbaren (z. B. säurelabilen Bindungen) bzw. enzymatisch spaltbaren Verknüpfungen (z. B. ein Peptid, das die Erken nungssequenz einer Protease enthält) zwischen den Konjugatbestandteilen sind im Stand der Technik beschrieben.According to a further preferred embodiment, the defi conjugates of the Claudin-4 ligand with the chemotherapeutic agent or the Diagnostics connected via a spacer molecule. It can, like the previous one for the direct link between chemotherapy or diagnostics Cum and Claudin-4 ligand executed, the spacer molecule and / or the ver linkage between chemotherapeutic agent and the spacer molecule and / or the Linkage between claudin-4 ligand and the spacer molecule either in The body cannot be cleaved or the spacer molecule and / or the link mentioned Formations can be pH-dependent and / or enzymatically cleavable. Examples of more suitable Spacer molecules (e.g. maleimide, N-hydroxysuccinimide spacers, etc.) and the provision of pH-dependent cleavages (e.g. acid-labile bonds) or enzymatically cleavable linkages (e.g. a peptide that the orks contains a protease) between the conjugate components described in the prior art.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Konjugat, umfas send einen oben definierten Claudin-4-Liganden und mindestens ein Chemothe rapeutikum und/oder mindestens ein nicht-radioaktives Diagnostikum. Das erfin dungsgemäße Konjugat enthält bevorzugt die vorstehend aufgeführten Chemo therapeutika. Bevorzugte nicht-radioaktive Diagnostika sind beispielsweise aus der Gruppe, bestehend aus Positronenstrahlern, NMR-Kontrastmitteln, fluoreszie renden Verbindungen und Kontrastmitteln im nahen IR-Bereich, ausgewählt.Another object of the present invention relates to a conjugate, comprising send a claudin-4 ligand as defined above and at least one chemothe therapeutic and / or at least one non-radioactive diagnostic. That invented Conjugate according to the invention preferably contains the chemo listed above therapeutics. Preferred non-radioactive diagnostic agents are, for example, from the group consisting of positron emitters, NMR contrast agents, fluoreszie compounds and contrast agents in the near IR range.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die das vorstehend definierte Konjugat und gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder einen Hilfsstoff und/oder ein Verdünnungsmittel enthält. Die er findungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird bevorzugt zur Be handlung von Tumoren, insbesondere den vorstehend genannten Karzinomen, eingesetzt.According to a further embodiment of the present invention, a pharmaceutical composition provided which defined the above Conjugate and optionally at least one pharmaceutically acceptable one Contains carrier and / or an auxiliary and / or a diluent. Which he Pharmaceutical composition according to the invention is preferred for loading treatment of tumors, in particular the carcinomas mentioned above, used.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung der vorstehend genannten Tumorerkrankungen.Furthermore, the present invention relates to a method for treating the tumor diseases mentioned above.
Die erfindungsgemäße Behandlung von Tumoren kann beispielsweise eine sy stemische, lokoregionäre oder lokale Verabreichung eines unter Verwendung des Claudin-4-Liganden hergestellten therapeutischen Mittels, beispielsweise einer pharmazeutischen Zusammensetzung, an einen Patienten umfassen. Der "Patient" kann beispielsweise ein Tier oder ein Mensch sein.The treatment of tumors according to the invention can, for example, a sy stemic, locoregional or local administration of one using the Therapeutic agent prepared by claudin-4 ligands, for example one pharmaceutical composition, to a patient. The For example, "patient" can be an animal or a human.
Eine systemische Verabreichung kann eine Injektion, beispielsweise eine Bolu sinjektion, der pharmazeutischen Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Konjugat enthält, oder eines vorstehend aufgeführten, selbst zytotoxisch wirkenden Toxins, umfassen. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können auch kontinuierlich z. B. über eine Infusion verabreicht werden.Systemic administration can be an injection, for example a bolu injection, the pharmaceutical composition comprising the invention Contains conjugate, or one listed above, itself cytotoxic Toxins. Such pharmaceutical compositions can also continuously z. B. administered via an infusion.
Insbesondere wenn ein auch in anderen Claudin-4-exprimierenden Geweben selbst zytotoxisch wirkender Claudin-4-Ligand, beispielsweise das CPE-Toxin, verwendet wird, ist eine lokale oder lokoregionäre Applikation des therapeutischen Mittels bevorzugt. Bei einer lokoregionären Chemotherapie unter Verwendung des erfindungsgemäßen Claudin-4-Liganden wird beispielsweise das CPE-Toxin oder ein geeignetes Konjugat davon, bevorzugt nach selektiver Katheterisierung des den Tumor versorgenden Blutgefäßes, appliziert, wodurch die selektive Wirkung im Tumor erhöht wird. Eine weitere Möglichkeit besteht in der lokalen intratumo ralen Injektion eines vorstehend genannten Toxins bzw. eines Konjugats bzw. ei ner entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzung.Especially if one also in other Claudin-4-expressing tissues even cytotoxic claudin-4 ligand, for example the CPE toxin, is used is a local or locoregional application of the therapeutic Preferred by means. In the case of locoregional chemotherapy using the Claudin-4 ligand according to the invention is, for example, the CPE toxin or a suitable conjugate thereof, preferably after selective catheterization of the the tumor supplying blood vessel, applied, whereby the selective effect is increased in the tumor. Another option is local intratumo oral injection of an abovementioned toxin or a conjugate or an egg a corresponding pharmaceutical composition.
Die Figuren zeigen:The figures show:
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen der Expression von Claudin-4 in Geweben und Zellinien. (A) ist eine photographische Aufnahme einer Nor thern-Blot-Analyse, welche die Überexpression von Claudin-4 in Pankreas krebsgeweben und Colonkarzinomen zeigt. P1 bis 5 = Pankreasadenokar zinome, stellvertretend für 24 von 31 untersuchten Pankreasadenokarzi nomen; C1 bis 5 = Colonadenokarzinome, stellvertretend für 12 unter suchte Gewebe; PV = Karzinom der Papilla Vateri; G = Magenadenokarzi nom, stellvertretend für zwei untersuchte Magenkrebsgewebe, B = Brust adenokarzinom, stellvertretend für vier untersuchte Brustkrebsgewebe; S = Weichteilsarkom, stellvertretend für zwei untersuchte Sarkomgewebe; CP = chronische Pankreatitis, stellvertretend für neun untersuchte Gewebe mit chronischer Pankreatitis; NP = normaler Pankreas, stellvertretend für neun untersuchte normale Pankreasgewebe. (B) ist eine photographische Auf nahme einer Mehrfachgewebe-Northern-Blot-Matrix-Analyse, welche das Expressionsmuster von Claudin-4 in verschiedenen humanen Geweben zeigt. 1: Gesamthirn, 2: Hirnrinde, 3: Cerebellum, 4: Medulla oblongata, 5: Putamen, 6: Substantia nigra, 7: Thalamus, 8: Hypophyse, 9: Rückenmark, 10: Herz, 11: Aorta, 12: linker Vorhof, 13: linke Herzkammer, 14: Oesophagus, 15: Magen, 16: Duodenum, 17: Jejunum, 18: Ileum, 19: Ileocoecum, 20: aufsteigendes Colon, 21: Quercolon, 22: absteigendes Colon, 23: Rek tum, 24: Milz, 25: Thymus, 26: Leukozyt aus peripherem Blut, 27: Lymphknoten, 28: Knochenmark, 29: Trachea, 30: Lunge, 31: Placenta, 32: Niere, 33: Blase, 34: Uterus, 35: Prostata, 36: Hoden, 37: Ovarien, 38: Le ber, 39: Skelettmuskel, 40: Pankreas, 41: Nebenniere, 42: Schilddrüse, 43: Speicheldrüse, 44: Milchdrüse. (C) ist eine photographische Aufnahme ei ner Northern-Blot-Analyse, welche die Expression in verschiedenen pan kreatischen Krebszellinien, HFL-Fibroblasten und Claudin-4 konstitutiv überexprimierenden S2-007-Zellen zeigt. (D) ist eine photographische Auf nahme von Capan-1-Zellen, die immuncytochemisch mit einem gegen Claudin-4 gerichteten Antikörper gefärbt wurden. Fig. 1 shows the results of studies of the expression of claudin-4 in tissues and cell lines. (A) is a photograph of a Northern blot analysis showing the overexpression of Claudin-4 in pancreatic cancer tissue and colon carcinoma. P1 to 5 = pancreatic adenocarcinoma, representing 24 of 31 pancreatic adenocarcinomas examined; C1 to 5 = colon adenocarcinoma, representative of 12 examined tissues; PV = carcinoma of the papilla Vateri; G = gastric adenocarcinoma, representative of two examined gastric cancer tissues, B = breast adenocarcinoma, representative of four examined breast cancer tissues; S = soft tissue sarcoma, representative of two examined sarcoma tissues; CP = chronic pancreatitis, representative of nine examined tissues with chronic pancreatitis; NP = normal pancreas, representing nine normal pancreatic tissues examined. (B) is a photograph of a multiple tissue Northern blot matrix analysis showing the expression pattern of claudin-4 in various human tissues. 1: whole brain, 2: cerebral cortex, 3: cerebellum, 4: medulla oblongata, 5: putamen, 6: substantia nigra, 7: thalamus, 8: pituitary gland, 9: spinal cord, 10: heart, 11: aorta, 12: left atrium , 13: left ventricle, 14: esophagus, 15: stomach, 16: duodenum, 17: jejunum, 18: ileum, 19: ileocoecum, 20: ascending colon, 21: transverse colon, 22: descending colon, 23: recum, 24 : Spleen, 25: thymus, 26: leukocyte from peripheral blood, 27: lymph nodes, 28: bone marrow, 29: trachea, 30: lung, 31: placenta, 32: kidney, 33: bladder, 34: uterus, 35: prostate, 36: testicles, 37: ovaries, 38: liver, 39: skeletal muscle, 40: pancreas, 41: adrenal gland, 42: thyroid, 43: salivary, 44: mammary. (C) is a photograph of a Northern blot analysis showing expression in various pan-creative cancer cell lines, HFL fibroblasts and Claudin-4 constitutively overexpressing S2-007 cells. (D) is a photograph of Capan-1 cells immunocytochemically stained with an anti-Claudin-4 antibody.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen der Invasions- und Prolifera
tionseigenschaften von Claudin-4-überexprimierenden S2-007-Zellen. (A)
ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Invasionstests mit pa
rentalen S2-007-Zellen und Claudin-4-überexprimierenden S2-007-Zellen
sowie parentalen S2-028-Zellen. Die Ergebnisse mit parentalen S2-007-
Zellen stehen stellvertretend auch für Mock-transfizierte S2-007-Zellen. (B)
ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Softagar-Tests mit
den parentalen S2-007-Zellen und Claudin-4-überexprimierenden S2-007-
Zellen sowie parentalen S2-028-Zellen. (C) ist eine graphische Darstellung
der Ergebnisse eines Softagar-Test mit den gleichen Zellen wie in (B), 10
Tage nach dem Ausplattieren.
* bedeutet P < 0,05 im Vergleich zu parentalen S2-007-Zellen gemäß nicht-
paarweisem Student's-t-Test mit Bonferroni-Korrektur der Mehrfachproben,
falls angezeigt. Fig. 2 shows the results of studies of the invasion and proliferation properties of Claudin-4 overexpressing S2-007 cells. (A) is a graphical representation of the results of an invasion test with parental S2-007 cells and Claudin-4 overexpressing S2-007 cells and parental S2-028 cells. The results with parental S2-007 cells also represent mock-transfected S2-007 cells. (B) is a graphical representation of the results of a soft agar test with the parental S2-007 cells and Claudin-4 overexpressing S2-007 cells as well as parental S2-028 cells. (C) is a graphical representation of the results of a soft agar test with the same cells as in (B) 10 days after plating.
* means P <0.05 compared to parental S2-007 cells according to the non-paired Student's t test with Bonferroni correction of the multiple samples, if indicated.
Fig. 3. zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen zur zytotoxischen Wirkung von CPE auf pankreatische Krebszellen in vitro und in vivo. (A) ist eine graphi sche Darstellung eines Trypanblau-Ausschlußtests, welcher die Wirkung von CPE auf die pankreatischen Krebszellinien Capan-1, Panc-1 und MiaPaca-2 sowie auf die Fibroblastenzellinie HFL (Negativkontrolle) de monstriert. (B) ist die graphische Darstellung von Ergebnissen eines 86Rb- Freisetzungstests, welcher die Dosisabhängigkeit des zytotoxischen Effekts von CPE auf Panc-1-Zellen zeigt. (C) ist die graphische Darstellung der Er gebnisse eines 86Rb-Freisetzungstests bezüglich der Zeitabhängigkeit der zytotoxischen Wirkung von CPE auf Panc-1-Zellen. (D) ist eine weitere gra phische Darstellung eines 86Rb-Freisetzungstests zur zytotoxischen Wir kung von CPE auf konstitutiv TGF-β-überexprimierende Panc-1-Zellen so wie Mock-transfizierte Panc-1-Zellen. (E) ist eine photographische Darstel lung von mit CPE behandelten Panc-1-Xenotransplantaten, welche die Wirkung von CPE-hinsichtlich der Entwicklung von Nekrosen der Xe notransplantate demonstriert. Nekrotische Bereiche erscheinen als schwach gefärbte Bereiche im Zentrum des H Tumors. (F) zeigt die Wirkung von CPE auf das Wachstum von Panc-1-Zellen nach 1 Tag bzw. nach 7 Tagen nach der subkutanen Injektion in Nacktmäuse. Sämtliche Tests in vitro wurden dreifach ausgeführt. Die Ergebnisse sind als ± SEM ausgedrückt und sind stellvertretend für drei unabhängige Ver suche. * bedeutet P < 0,05 im Vergleich zu: HFL-Zellen (A), unbehandelten Zellen (B, C), TGF-β-überexprimierenden Zellen (D) bzw. nach Tag 1 + NaCl (F) unter Verwendung des nicht-paarweisen Student's-t-Tests mit Bonferroni-Korrektur der Mehrfachproben, falls angezeigt. FIG. 3 shows the results of studies on the cytotoxic effect of CPE on pancreatic cancer cells in vitro and in vivo. (A) is a graphical representation of a trypan blue exclusion test demonstrating the effect of CPE on the pancreatic cancer cell lines Capan-1, Panc-1 and MiaPaca-2 and on the fibroblast cell line HFL (negative control). (B) is a graphical representation of results from an 86 Rb release test showing the dose dependence of the cytotoxic effect of CPE on Panc-1 cells. (C) is a graphical representation of the results of an 86 Rb release assay for the time dependence of the cytotoxic effects of CPE on Panc-1 cells. (D) is another graphic representation of an 86 Rb release test for the cytotoxic effect of CPE on constitutively TGF-β-overexpressing Panc-1 cells as well as mock-transfected Panc-1 cells. (E) is a photographic representation of CPE-treated Panc-1 xenografts, which demonstrates the effect of CPE in developing necrosis of the Xe emergency grafts. Necrotic areas appear as weakly colored areas in the center of the H tumor. (F) shows the effect of CPE on the growth of Panc-1 cells after 1 day and after 7 days after subcutaneous injection in nude mice. All tests in vitro were carried out in triplicate. The results are expressed as ± SEM and are representative of three independent experiments. * means P <0.05 compared to: HFL cells (A), untreated cells (B, C), TGF-β overexpressing cells (D) or after day 1 + NaCl (F) using the non- Student's-t tests in pairs with Bonferroni correction of multiple samples, if indicated.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende nicht-einschränkende Beispiel näher erläutert.The present invention is illustrated by the following non-limiting example explained in more detail.
Es wurde eine Northern-Blot-Analyse von insgesamt 31 Pankreaskrebsgeweben im Vergleich zu normalem Pankreasgewebe (n = 9) bzw. Gewebe mit chronischer Pankreatitis (n = 9) hinsichtlich der Claudin-4-Expression durchgeführt. In den Proben mit normalem Pankreasgewebe und den Geweben mit chronischer Pan kreatitis konnte nur eine sehr schwache oder gar keine Expression von Claudin-4 festgestellt werden. Im Gegensatz dazu wurde eine starke Überexpression von Claudin-4 in 24 von 31 getesteten Pankreaskrebsgeweben nachgewiesen (Fig. 1A). Des weiteren wurden hohe Expressionsraten von Claudin-4 in allen 12 gete steten Colonkrebsgeweben und einigen anderen Tumoren wie Brustkrebs (n = 4), dem Karzinom der Papilla Vateri und Magenkrebs (n = 2) festgestellt. In Weich teilsarkomen (n = 2) war keine Claudin-4-mRNA nachweisbar (Fig. 1A).Northern blot analysis of a total of 31 pancreatic cancer tissues compared to normal pancreatic tissue (n = 9) or tissue with chronic pancreatitis (n = 9) was carried out with regard to claudin-4 expression. In the samples with normal pancreatic tissue and the tissue with chronic pan creatitis, only a very weak or no expression of claudin-4 was found. In contrast, strong overexpression of claudin-4 was detected in 24 of 31 pancreatic cancer tissues tested ( Fig. 1A). Furthermore, high expression rates of claudin-4 were found in all 12 colon cancer tissues and some other tumors such as breast cancer (n = 4), carcinoma of the papilla Vateri and gastric cancer (n = 2). No claudin-4 mRNA was detectable in soft sarcomas (n = 2) ( FIG. 1A).
Die Untersuchung des Expressionsmusters von Claudin-4 in einer Anzahl norma ler Gewebe wurde unter Verwendung eines Mehrfachgewebe-RNA-Matrixtests durchgeführt. Die Matrix enthielt RNA aus 61 unterschiedlichen Proben des menschlichen Körpers. Es konnte im Gastrointestinaltrakt, im Atmungstrakt und einigen exo- und endokrinen Drüsen eine gewisse Claudin-4-Expression nachge wiesen werden. In den meisten anderen Geweben, beispielsweise Hirn, Herz, Skelettmuskel, Blut, Knochenmark und Leber wurde keine oder eine nur geringe Expression festgestellt (Fig. 1B).Examination of the expression pattern of claudin-4 in a number of normal tissues was carried out using a multi-tissue RNA matrix test. The matrix contained RNA from 61 different samples of the human body. A certain claudin-4 expression could be demonstrated in the gastrointestinal tract, in the respiratory tract and in some exo- and endocrine glands. In most other tissues, for example brain, heart, skeletal muscle, blood, bone marrow and liver, no or only little expression was found ( FIG. 1B).
Um die Bedeutung von Claudin-4 in vitro zu untersuchen, wurden 16 Pankreas krebszellinien hinsichtlich der Expression von Claudin-4 untersucht. Es wurde eine Claudin-4-Expression in 15 von 16 untersuchten Zelllinien nachgewiesen, wobei Capan-1-Zellen die höchste und MiaPaca-2-Zellen die niedrigste Expressionsrate zeigten (Fig. 1C). Der Subklon 028 von Suit-2-Zellen (S2-028), von dem bekannt ist, daß er ein geringes metastatisches und invasives Potential aufweist (Iwamura et al., 1997), zeigte eine starke Claudin-4-Expression, während im hochinvasiven Subklon 007 (S2-007) (Iwamura et al., 1997) fast keine Claudin-4-Expression feststellbar war. In Fibroblastenzellinien, wie HFL und HFF, war keine Claudin-4- Expression nachweisbar (Fig. 1C). Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Claudin-4 konnte immuncytochemisch bei Capan-1-Zellen nachgewiesen werden, daß Claudin-4 eine spezifische Lokalisation in Zell-Zell-Kontakten zeigt (Fig. 1D).In order to investigate the importance of Claudin-4 in vitro, 16 pancreatic cancer cell lines were examined for the expression of Claudin-4. Claudin-4 expression was detected in 15 of 16 cell lines examined, with Capan-1 cells showing the highest and MiaPaca-2 cells the lowest expression rate ( FIG. 1C). Suit-2 cell subclone 028 (S2-028), which is known to have a low metastatic and invasive potential (Iwamura et al., 1997), showed strong claudin-4 expression, while in the highly invasive one Subclone 007 (S2-007) (Iwamura et al., 1997) almost no claudin-4 expression was detectable. No Claudin-4 expression was detectable in fibroblast cell lines such as HFL and HFF ( FIG. 1C). With the help of a specific antibody against Claudin-4 it could be demonstrated immunocytochemically in Capan-1 cells that Claudin-4 shows a specific localization in cell-cell contacts ( Fig. 1D).
Um zu untersuchen, ob die Claudin-4-Expression durch TGF-β moduliert wird, von dem bekannt ist, daß es das Wachstum von Pankreastumoren stark beeinflußt (Giehl et al., 2000), wurden Pankreaskrebszellinien mit TGF-β für 2 bis 24 Stun den unter serumfreien Bedingungen inkubiert. Nach längerer Inkubation mit TGF- β war in Panc-1-Zellen die Claudin-4-Expression deutlich vermindert (Fig. 1C). Im Gegensatz dazu hatte TGF-β keinen Effekt auf die Claudin-4-Expression bei Zell linien, wie Imim-PC2-Zellen, von denen bekannt ist, daß sie weniger auf TGF-β ansprechen (Wenger et al., 1999).To investigate whether claudin-4 expression is modulated by TGF-β, which is known to greatly affect the growth of pancreatic tumors (Giehl et al., 2000), pancreatic cancer cell lines with TGF-β were used for 2 to 24 Incubated for hours under serum-free conditions. After prolonged incubation with TGF-β, claudin-4 expression was significantly reduced in Panc-1 cells ( FIG. 1C). In contrast, TGF-β had no effect on claudin-4 expression in cell lines, such as Imim-PC2 cells, which are known to respond less to TGF-β (Wenger et al., 1999).
Zur Charakterisierung der biologischen Funktion von Claudin-4 wurde das Protein in hochmetastatischen S2-007-Zellen überexprimiert. Es konnte nach stabiler Transfektion eine starke Expression der Claudin-4-RNA (Fig. 1C) und des ent sprechenden Proteins nachgewiesen werden.To characterize the biological function of claudin-4, the protein was overexpressed in highly metastatic S2-007 cells. After stable transfection, a strong expression of the Claudin-4-RNA ( Fig. 1C) and the corresponding protein could be detected.
Aufgrund der unterschiedlichen Expressionsraten von Claudin-4 in S2-007 und S2-028-Zellen, welche unterschiedliche invasive und metastatische Potentiale aufweisen, wurde die Möglichkeit untersucht, daß Claudin-4 das invasive Verhal ten von Pankreaskrebszellen beeinflußt. Dazu wurden die Wirkungen der Claudin- 4-Überexpression auf das Invasionspotential, das verankerungsunabhängige Wachstum und die Proliferation untersucht. Invasionstests zeigten eine deutlich verminderte Invasionsrate von Claudin-4-überexprimierenden Zellen im Vergleich zu parentalen S2-007-Zellen und Mock-transfizierten Zellen (Fig. 2A). Bei Softag ar-Tests zeigten Claudin-4-transfizierte Zellen im Vergleich zu parentalen oder Mock-transfizierten Zellen eine sowohl hinsichtlich der Anzahl als auch der Größe deutlich verminderte Koloniebildung (Fig. 2B, C). Sowohl hinsichtlich der Kolonie bildung als auch des Invasionsverhaltens ergab sich, daß Claudin-4- überexprimierende S2-007-Zellen stärker den geringer invasiven S2-028-Zellen ähnelten als den parentalen S2-007-Zellen (Fig. 2A B). Im Gegensatz dazu ergab ein Proliferationstest unter Verwendung des [3H]-Thymidineinbaus keine wesent lich veränderte Proliferationsrate von Claudin-4-überexprimierenden Klonen. Die se Ergebnisse zeigen, daß die Claudin-4-Überexpression zu einer erheblichen Verminderung der Invasionsfähigkeit und der Fähigkeit zum verankerungsunab hängigen Wachstum führt, ohne die Zellproliferation direkt zu beeinflussen.Due to the different expression rates of claudin-4 in S2-007 and S2-028 cells, which have different invasive and metastatic potentials, the possibility was investigated that claudin-4 influences the invasive behavior of pancreatic cancer cells. The effects of claudin-4 overexpression on the invasion potential, anchorage-independent growth and proliferation were examined. Invasion tests showed a significantly reduced invasion rate of claudin-4 overexpressing cells compared to parental S2-007 cells and mock-transfected cells ( FIG. 2A). In Softag ar tests, claudin-4-transfected cells showed colony formation which was significantly reduced in both number and size in comparison to parental or mock-transfected cells ( FIG. 2B, C). Both in terms of colony formation and invasion behavior, it was found that claudin-4 overexpressing S2-007 cells were more similar to the less invasive S2-028 cells than the parent S2-007 cells ( FIG. 2A B). In contrast, a proliferation test using the [ 3 H] -thymidine incorporation did not show a significantly changed proliferation rate of claudin-4 overexpressing clones. These results show that claudin-4 overexpression leads to a significant reduction in the invasiveness and the ability for anchorage-independent growth without directly influencing cell proliferation.
Claudin-4 wurde als Rezeptor für das Clostridium perfringens Enterotoxin (CPE-R) identifiziert (Katahira et al., 1997). CPE wirkt auf Darmepithelzellen durch eine Erhöhung der Membranpermeabilität, was zum Verlust des osmotischen Gleichgewichts und dadurch zum Zelltod führt (McClane et al., 1981).Claudin-4 has been used as a receptor for Clostridium perfringens enterotoxin (CPE-R) identified (Katahira et al., 1997). CPE acts on intestinal epithelial cells through a Increase in membrane permeability, leading to loss of osmotic balance and thereby leads to cell death (McClane et al., 1981).
Es wurde daher untersucht, ob das C. perfringens Enterotoxin (CPE) durch Bin dung an Claudin-4-exprimierende Pankreaskarzinomzellen einen Effekt auf das Wachstum dieser Zellen in vitro ausübt.It was therefore examined whether the C. perfringens enterotoxin (CPE) was caused by Bin effect on pancreatic carcinoma cells expressing claudin-4 has an effect on the Growth of these cells exerts in vitro.
Die Erhöhung der Membranpermeabilität wurde durch einen 86Rb- Freisetzungstest untersucht, und der Zelltod wurde durch einen Trypanblau- Ausschlußtest nachgewiesen. CPE induzierte in allen getesteten Pankreaszellini en eine Membranleckage und einen nachfolgenden Zelltod (Fig. 3A). Diese zyto toxische Wirkung korrelierte mit dem Grad der Claudin-4-Expression bei den un tersuchten Pankreaskrebszellinien und erreichte ein Maximum von 90% Trypan blau-positiver Zellen nach 60 Minuten in Capan-1-Zellen (Fig. 3A). Im Gegensatz dazu wurden HFL-Fibroblasten, die kein Claudin-4 exprimieren, nicht durch CPE beeinflußt (Fig. 3A). Die zytotoxische Wirkung von CPE war dosisabhängig (Fig. 3B), wobei die maximale Toxizität mit Konzentrationen von 1 µg/ml erzielt wurde. Hinsichtlich der zeitlichen Abhängigkeit des CPE-Effekts wurde mittels 86Rb- Freisetzungstest eine maximale Zellschädigung nach 30 Minuten erreicht (Fig. 3C), während die Zelltodesrate im Trypanblau-Ausschlußtest ihren Höhepunkt nach 60 Minuten erreichte. Konstitutiv TGF-β-überexprimierende Panc-1-Zellen zeigten eine deutlich geringere Zellschädigung als Mock-transfizierte Zellen (Fig. 3D). Ähnliche Ergebnisse wurden nach 24stündiger Vorinkubation mit exogenem TGF-β erhalten.The increase in membrane permeability was examined by an 86 Rb release test, and cell death was detected by a trypan blue exclusion test. CPE induced membrane leakage and subsequent cell death in all pancreatic cell lines tested ( FIG. 3A). This cytotoxic effect correlated with the degree of claudin-4 expression in the investigated pancreatic cancer cell lines and reached a maximum of 90% trypan blue-positive cells after 60 minutes in Capan-1 cells ( FIG. 3A). In contrast, HFL fibroblasts that do not express claudin-4 were not affected by CPE ( Fig. 3A). The cytotoxic effect of CPE was dose-dependent ( FIG. 3B), the maximum toxicity being achieved with concentrations of 1 μg / ml. With regard to the time dependence of the CPE effect, maximum cell damage was reached after 30 minutes by means of the 86 Rb release test ( FIG. 3C), while the cell death rate in the trypan blue exclusion test reached its peak after 60 minutes. Panc-1 cells constitutively overexpressing TGF-β showed significantly less cell damage than mock-transfected cells ( FIG. 3D). Similar results were obtained after preincubation with exogenous TGF-β for 24 hours.
Um die in der Zellkultur festgestellte, Claudin-4-spezifische Wirkung von CPE in vivo zu bestätigen, wurden Nacktmäuse mit Claudin-4-exprimierenden Panc-1- Zellen subkutan beimpft. Danach wurden vier Injektionen mit CPE direkt in den Tumor innerhalb von 5 Tagen durchgeführt. Zwei Tage später wurden die Tiere getötet, und der Tumor wurde histologisch untersucht. Die Tumorgröße wurde durch Messung von Tumorlänge und Breite vor der Behandlung und nach dem Töten verglichen. Alle mit CPE behandelten Tumore zeigten einen großen nekro tischen Bereich von bis zu 90% des histologischen Schnittes. Im Gegensatz dazu wurde keine oder nur eine minimale Nekrose in sämtlichen histologischen Proben der Kontrolltumoren, die mit physiologischer Salzlösung behandelt wurden, fest gestellt (Fig. 3E). Des weiteren zeigten die mit CPE behandelten Tumore keine Vergrößerung, während die Größe der Kontrolltumore deutlich anstieg (Fig. 3F).In order to confirm the Claudin-4-specific effect of CPE found in cell culture in vivo, nude mice were inoculated with Claudin-4-expressing Panc-1 cells subcutaneously. Four injections of CPE were then made directly into the tumor within 5 days. The animals were sacrificed two days later and the tumor was examined histologically. Tumor size was compared by measuring tumor length and width before treatment and after killing. All tumors treated with CPE showed a large necrotic area of up to 90% of the histological section. In contrast, no or minimal necrosis was found in all histological samples of the control tumors treated with physiological saline ( Fig. 3E). Furthermore, the tumors treated with CPE showed no enlargement, while the size of the control tumors increased significantly ( FIG. 3F).
Somit konnte bestätigt werden, daß CPE auch in vivo zur selektiven Zerstörung von Claudin-4-exprimierenden Tumorzellen befähigt ist.It was thus confirmed that CPE can also be used for selective destruction in vivo is capable of Claudin-4 expressing tumor cells.
Die vorstehenden experimentellen Daten belegen die hervorragende Wirksamkeit von CPE zur Schädigung bzw. Zerstörung von Claudin-4-exprimierenden Tumor zellen. So konnte in vitro ein dosisabhängiger, zytotoxischer Effekt von CPE auf Claudin-4-exprimierende Krebszellen gezeigt werden, welcher darüber hinaus mit dem Expressionsgrad von Claudin-4-korrelierte. In vivo führte eine intratumorale Injektion von CPE in Panc-1-Xenotransplantate zu einem Wachstumsstillstand des Tumors und einer erheblichen Tumornekrose. Diese Ergebnisse belegen die hervorragende Wirksamkeit von Claudin-4-Liganden zur Behandlung von Tumo ren, beispielsweise Pankreaskarzinomen, Colonkarzinomen, Karzinomen der Pa pilla Vateri, Magenkarzinomen, Ovarialkarzinomen und Mammakarzinomen.The above experimental data demonstrate the excellent effectiveness of CPE to damage or destroy Claudin-4-expressing tumor cells. A dose-dependent, cytotoxic effect of CPE could be demonstrated in vitro Claudin-4-expressing cancer cells are shown, which also with the level of expression of claudin-4 correlated. In vivo resulted in an intratumoral Injection of CPE into Panc-1 xenografts to stop growth of the tumor and significant tumor necrosis. These results prove the Excellent efficacy of Claudin-4 ligands for the treatment of tumo ren, for example pancreatic carcinomas, colon carcinomas, carcinomas of the Pa pilla Vateri, gastric cancers, ovarian cancers and breast cancers.
Gewebe humaner Patienten mit duktalen Adenokarzinomen des Pankreas, Karzi nomgewebe unterschiedlicher Herkunft, humanes Pankreasgewebe von Organ spendern und Gewebe mit chronischer Pankreatitis wurden von der Abteilung der Chirurgie der Universität Ulm und der Ungarischen Akademie der Wissenschaften (Budapest, Ungarn) bereitgestellt. Sämtliche Gewebe wurden nach Genehmigung durch die lokale Ethikkommission erhalten.Tissue of human patients with ductal adenocarcinoma of the pancreas, Karzi nom tissue of different origin, human pancreatic tissue from organ Donors and tissues with chronic pancreatitis have been identified by the Department of Surgery at the University of Ulm and the Hungarian Academy of Sciences (Budapest, Hungary). All fabrics were approved received by the local ethics committee.
Humane Pankreaskrebszellinien wurden von den folgenden Lieferanten erhalten: Panc-1 und MiaPaca-2 (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Vereinigtes Königreich), Capan-1, Capan-2 und AsPC-1 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA), Patu-II, Patu8988s und Patu8988t (Universität Marburg, Abteilung für Zellbiologie, Marburg), HPAF (University of North Carolina, Durham, North Carolina, USA), SKPC-1, Imim-PC1 und Imim-PC2 (Institudo Municipial d'Investigacio Medica, Barcelona, Spanien), Suit-2-Klone S2- 007 und S2-028 (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). Stabil mit TGF-β transfizierte Panc-1-Zellen und Mock-transfizierte Panc-1-Zellen wurden von der Medizinischen Klinik der Universität Rostock erhalten. Humane fötale Lungenfi broblasten (HFL) wurden von der European Collection of Animal Cell Cultures er halten. Alle Zellinien wurden in DMEM (Gibco-BRL, Karlsruhe), enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS, Gibco-BRL), gehalten.Human pancreatic cancer cell lines were obtained from the following suppliers: Panc-1 and MiaPaca-2 (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, United Kingdom), Capan-1, Capan-2 and AsPC-1 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA), Patu-II, Patu8988s and Patu8988t (University of Marburg, Department of Cell Biology, Marburg), HPAF (University of North Carolina, Durham, North Carolina, USA), SKPC-1, Imim-PC1 and Imim-PC2 (Institudo Municipial d'Investigacio Medica, Barcelona, Spain), Suit-2-Klone S2- 007 and S2-028 (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). Stable with TGF-β transfected Panc-1 cells and mock-transfected Panc-1 cells were from the Received medical clinic from the University of Rostock. Human fetal lung fi broblasts (HFL) were from the European Collection of Animal Cell Cultures hold. All cell lines were in DMEM (Gibco-BRL, Karlsruhe), containing 10% fetal calf serum (FCS, Gibco-BRL).
Clostridium perfringens Enterotoxin A (CPE) wurde gemäß McDonel et al., 1988, isoliert und gereinigt. Der polyklonale Antikörper gegen Claudin-4 wurde aus Ka ninchen isoliert und charakterisiert (Furuse et al., 1999). TGF-β wurde von RSystems (Minneapolis, Minnesota, USA) bezogen.Clostridium perfringens Enterotoxin A (CPE) was according to McDonel et al., 1988, isolated and cleaned. The polyclonal antibody against Claudin-4 was from Ka rabbits isolated and characterized (Furuse et al., 1999). TGF-β was purchased from RSystems (Minneapolis, Minnesota, USA).
Die Mehrfachgewebe-Matrix mit spezifischer RNA aus 61 verschiedenen mensch lichen Proben wurde von Clontech (Heidelberg) erhalten und gemäß den Anwei sungen des Herstellers unter Verwendung einer [33P]-markierten Claudin-4-Sonde hybridisiert. Die hybridisierte Matrix wurde mit einem Phosphoimager (MolecularDynamics, Sunnyvale, Kalifornien, USA) gescannt, und es wurde eine quantitative Analyse der erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung der ArrayVisi on-Software (Interfocus, Haverhill, Vereinigtes Königreich) durchgeführt.The multiple tissue matrix with specific RNA from 61 different human samples was obtained from Clontech (Heidelberg) and hybridized according to the manufacturer's instructions using a [ 33 P] -labeled claudin-4 probe. The hybridized matrix was scanned with a phosphoimager (MolecularDynamics, Sunnyvale, California, USA) and a quantitative analysis of the results obtained was carried out using the ArrayVision software (Interfocus, Haverhill, United Kingdom).
Die RNA aus Zellinien wurde unter Verwendung des RNAeasy Kits (Qiagen, Hil den) extrahiert. Die RNA aus schockgefrorenem Pankreasgewebe wurde gemäß Wenger et al., 1999, präpariert. Es wurden 30 µg Gesamt-RNA größenfraktioniert auf einer Membran, wie in Gress et al., 1997, beschrieben, aufgetrennt. Die Hy bridisierung wurde mit einer mit Digoxigenin-11-dUTP markierten Claudin-4- spezifischen Sonde unter Verwendung des Dig-Markierungskits (Roche Diagno stics, Mannheim) durchgeführt. Spezifische Banden wurden mittels eines Chemi lumineszenzsubstrats (Roche Diagnostics) nachgewiesen. The RNA from cell lines was analyzed using the RNAeasy kit (Qiagen, Hil the) extracted. The RNA from shock-frozen pancreatic tissue was analyzed according to Wenger et al., 1999. 30 µg of total RNA were size-fractionated on a membrane as described in Gress et al., 1997. The hy bridation was carried out with a claudin-4 labeled with digoxigenin-11-dUTP specific probe using the Dig labeling kit (Roche Diagno stics, Mannheim). Specific bands were determined using a Chemi luminescent substrate (Roche Diagnostics) detected.
Claudin-4-spezifische cDNA wurde aus einem pankreatischen cDNA-Pool amplifi ziert, die Sequenz wurde verifiziert und in den Säugerexpressionsvektor pBIG2R kloniert. Die stabile Transfektion in Zellen der pankreatischen Krebszellinie S2- 007 wurde mittels des Lipofectin-Reagens (Gibco-BAL) durchgeführt. Claudin-4- exprimierende Klone wurden mittels Hygromycin (300 µg/ml) selektioniert, und es wurde ein Screening durch eine Northern-Blot-Analyse, wie vorstehend beschrie ben, durchgeführt.Claudin-4 specific cDNA was amplified from a pancreatic cDNA pool the sequence was verified and inserted into the mammalian expression vector pBIG2R cloned. The stable transfection in cells of the pancreatic cancer cell line S2- 007 was carried out using the Lipofectin reagent (Gibco-BAL). Claudin-4 expressing clones were selected using hygromycin (300 µg / ml), and it was screened by Northern blot analysis as described above ben, carried out.
Zur Proteinanalyse wurden Proben in RIPA-Proteinlysispuffer (0,5 g Gewebe/ml) homogenisiert. Danach wurden die Proben für 10 Minuten bei 95°C inkubiert und 15 µl jeder Probe wurden mittels SDS-PAGE gemäß Giehl et al., 2000, analysiert. Die Proteinmenge wurde durch Färbung des Gels mit Coomassie blue ermittelt. Die fraktionierten Proteine wurden mit Hilfe der Semidry-Technik auf Nitrocellulo semembranen (Schleicher & Schuell, Dassel) übertragen. Zur Immundetektion wurden die Membranen für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem polyklo nalen Kaninchenantikörper gegen Claudin-4 (Verdünnung 1 : 1.000, vgl. Furuse et al., 1999) und dann für eine Stunde mit einem Peroxidase-gekoppelten Antiserum (Pierce, Rochester, New York, USA) inkubiert. Die Antikörperdetektion erfolgte unter Verwendung eines Reaktionssystems zur verstärkten Chemilumineszenz (Pierce).For protein analysis, samples were placed in RIPA protein lysis buffer (0.5 g tissue / ml) homogenized. The samples were then incubated at 95 ° C. for 10 minutes and 15 µl of each sample were analyzed by SDS-PAGE according to Giehl et al., 2000. The amount of protein was determined by staining the gel with Coomassie blue. The fractionated proteins were analyzed using the Semidry technique on nitrocellulo semembranes (Schleicher & Schuell, Dassel). For immunodetection the membranes were polycloated for one hour at room temperature nal rabbit antibody against Claudin-4 (dilution 1: 1,000, see. Furuse et al., 1999) and then for one hour with a peroxidase-coupled antiserum (Pierce, Rochester, New York, USA). The antibody was detected using an enhanced chemiluminescence reaction system (Pierce).
Es wurde der Einbau von [3H]-Thymidin gemessen, um die zelluläre Proliferation zu bestimmen (Giehl et al., 2000). Die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefun gen in einer Dichte von 5 × 104 Zellen pro Vertiefung ausplattiert und in DMEM, enthaltend 10% FCS, (1 ml/Vertiefung) bis zu einer 70%igen Konfluenz wachsen gelassen. Nach dem Halten der Zellen unter Nährstoffmangelbedingungen über Nacht wurde 1 µCl [3H]-Thymidin zugegeben. Nach einer Inkubation für 24 Stun den wurden die Zellen gewaschen und lysiert. Der Einbau von [3H]-Thymidin wur de mit einem Szintillationszähler gemessen. Jeder Test wurde viermal wiederholt. The incorporation of [ 3 H] -thymidine was measured in order to determine the cellular proliferation (Giehl et al., 2000). The cells were plated in 24-well plates at a density of 5 x 10 4 cells per well and grown in DMEM containing 10% FCS (1 ml / well) to a 70% confluency. After keeping the cells under nutrient deficiency conditions overnight, 1 µCl [ 3 H] thymidine was added. After incubation for 24 hours, the cells were washed and lysed. The incorporation of [ 3 H] thymidine was measured with a scintillation counter. Each test was repeated four times.
Der Test wurde gemäß Ellenrieder et al., 2000, mit den parentalen S2-007- und S2-028-Zelilinien sowie mit zwei Claudin-4-überexprimierenden S2-007-Klonen und einem Mock-transfizierten S2-007-Klon durchgeführt. Es wurden 1,5 × 105 Zel len in DMEM/1% FCS auf Matrigel in Platten mit 12 Vertiefungen mit einer Grund schicht aus DMEM/10% FCS ausplattiert. Die Invasion durch das Matrigel wurde nach 28 Stunden durch Zählen der fixierten und mit Methylenblau gefärbten Zel len gemessen.The test was carried out according to Ellenrieder et al., 2000, with the parental S2-007 and S2-028 cell lines and with two Claudin 4 overexpressing S2-007 clones and a mock-transfected S2-007 clone. 1.5 × 105 cells len in DMEM / 1% FCS on Matrigel in 12 well plates with a base layer of DMEM / 10% FCS plated. The Matrigel invasion was after 28 hours by counting the fixed and stained with methylene blue len measured.
Capan-1-Zellen wurden auf Kammerobjektträgern mit vier Vertiefungen (Nalge Nung, Naperville, Illinois, USA) gehalten. Nachdem die Zelldichte eine 80%ige Konfluenz erreichte, wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach dem Waschen, einer Inkubation mit 0,2% Triton X-100 und dem Absättigen mit 1% BSA wurden die Zellen mit einem polyklonalen Kaninchenantikörper gegen Clau din-4 bei einer Verdünnung von 1 : 1.000 (Furuse et al., 1999) für 1 Stunde und danach mit Cy3-konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG inkubiert. Die Proben wur den mit einem konfokalen Leica TCS-4 Mikroskop (Leica, Wetzlar) untersucht.Capan-1 cells were placed on four-well chamber slides (Nalge Nung, Naperville, Illinois, USA). After the cell density is 80% Reached confluence, the cells were fixed in 4% paraformaldehyde. After this Washing, incubation with 0.2% Triton X-100 and saturation with 1% The cells became BSA with a polyclonal rabbit antibody against Clau din-4 at a dilution of 1: 1,000 (Furuse et al., 1999) for 1 hour and then incubated with Cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG. The samples were examined with a confocal Leica TCS-4 microscope (Leica, Wetzlar).
Die Softagar-Tests wurden gemäß Giehl et al., 2000, durchgeführt. Es wurden jeweils 2 × 104 S2-007- und parentale S2-0028-Zellen sowie zwei Claudin-4- überexprimierende S2-007-Klone und ein Mock-transfizierter S2-007-Klon in DMEM/0,33% Bacto-Agar auf einer Grundschicht aus DMEM/0,5% Bacto-Agar ausplattiert. Das von der Verankerung unabhängige Wachstum wurde 2 Wochen später durch Zählen der Anzahl der Kolonien bestimmt.The soft agar tests were carried out according to Giehl et al., 2000. There were 2 × 10 4 S2-007 and parental S2-0028 cells as well as two Claudin-4 overexpressing S2-007 clones and a mock-transfected S2-007 clone in DMEM / 0.33% Bacto agar plated on a base layer of DMEM / 0.5% Bacto agar. Anchoring independent growth was determined 2 weeks later by counting the number of colonies.
Die Pankreaskrebszellinien Panc-1, Capan-1 und MiaPaca-2 sowie die Fibrobla stenzellinie HFL wurden bis zur 80%igen Konfluenz in DMEM, enthaltend 10% FCS, wachsen gelassen. Nach dem Waschen und Erneuern des Mediums wurde CPE derart zugegeben, daß die Endkonzentrationen im Bereich von 0,03 bis 4 µg/ml lagen. Falls nicht anders angegeben, wurde 1 µg/ml als Standardkonzentra tion verwendet. Nach einer Inkubation für 60 Minuten bei 37°C wurden aufschwimmende Zellen entfernt und gelagert. Anhaftende Zellen wurden trypsinisiert und zusammen mit den aufschwimmenden Zellen gesammelt. Nach der Färbung mit Trypanblau wurde die Überlebensrate durch Bestimmen der Anzahl Trypan blau-positiver Zellen und der Gesamtzellzahl bestimmt.The pancreatic cancer cell lines Panc-1, Capan-1 and MiaPaca-2 as well as the Fibrobla stencell line HFL were up to 80% confluency in DMEM containing 10% FCS, let grow. After washing and renewing the medium CPE added such that the final concentrations in the range of 0.03 to 4 µg / ml lay. Unless otherwise stated, 1 µg / ml was used as the standard concentration tion used. After incubation for 60 minutes at 37 ° C, floating were Cells removed and stored. Adherent cells were trypsinized and collected together with the floating cells. After coloring with trypan blue, the survival rate was determined by determining the number of trypan blue-positive cells and the total number of cells.
Der 86Rb-Freisetzungstest wurde gemäß Hanna et al., 1991, durchgeführt. Pan kreatische Zellen wurden mit 86Rb (Amersham Pharmacia, Freiburg) in serumfrei em DMEM für 2 Stunden vorinkubiert. Nach dem Entfernen des 86Rb- enthaltenden Mediums und Waschen wurde CPE in unterschiedlichen Konzentra tionen für 15 Minuten zugegeben. Danach wurde das Medium abgesaugt und in einem β-Zähler gemessen. In Experimenten mit exogenem TGF-β wurden Panc- 1-Zellen in serumfreiem Medium für 24 Stunden gehalten und dann mit TGF-β (10 ng/ml) für weitere 20 Stunden unter serumfreien Bedingungen vor der Zugabe von CPE vorinkubiert. Stabil TGF-β-überexprimierende Panc-1-Zellen und Mock transfizierte Kontrollzellen wurden für 24 Stunden in serumfreiem Medium inku biert, bevor CPE zugegeben wurde.The 86 Rb release test was performed according to Hanna et al., 1991. Pan creative cells were preincubated with 86 Rb (Amersham Pharmacia, Freiburg) in serum-free DMEM for 2 hours. After removing the medium containing 86 Rb and washing, CPE was added in different concentrations for 15 minutes. The medium was then suctioned off and measured in a β counter. In experiments with exogenous TGF-β, Panc-1 cells were kept in serum-free medium for 24 hours and then preincubated with TGF-β (10 ng / ml) for a further 20 hours under serum-free conditions before the addition of CPE. Stable TGF-β overexpressing Panc-1 cells and mock-transfected control cells were incubated for 24 hours in serum-free medium before adding CPE.
NMRI-nu/nu-Mäuse wurden in einer pathogenfreien Umgebung gezüchtet und gehalten. Sechs bis acht Wochen alte Tiere wurden zur Erzeugung von Xe notransplantaten verwendet. Es wurden 2 × 106 Panc-1-Tumorzellen in 0,1 ml DMEM subkutan in die rechte Flanke injiziert. Vier Wochen nach der s. c.-Injektion wurde die Tumorgröße durch Messen der Länge und Breite des Tumors bestimmt und es wurden 2 µg CPE, gelöst in 50 ml 0,9% NaCl, intratumoral am Tag 1, 2, 4 und 5 injiziert. Am siebten Tag wurden die Mäuse getötet, die Tumorgröße wurde bestimmt und die Tumoren wurden explantiert, in 2% Formaldehyd gelagert und mit H zur histologischen Untersuchung gefärbt. Sechs Mäuse wurden mit CPE behandelt, sechs Tiere wurden als Kontrollen verwendet, denen jeweils 50 µl 0,9% NaCl verabreicht wurden. NMRI nu / nu mice were grown and kept in a pathogen-free environment. Six to eight week old animals were used to produce Xe emergency grafts. 2 × 10 6 Panc-1 tumor cells in 0.1 ml DMEM were injected subcutaneously into the right flank. Four weeks after the sc injection, the tumor size was determined by measuring the length and width of the tumor and 2 μg CPE, dissolved in 50 ml 0.9% NaCl, were injected intratumorally on day 1, 2, 4 and 5. On the seventh day, the mice were sacrificed, the tumor size was determined, and the tumors were explanted, stored in 2% formaldehyde and stained with H for histological examination. Six mice were treated with CPE, six animals were used as controls, each of which was given 50 µl of 0.9% NaCl.
Ellenrieder (2000) Int. J. Cancer 85, 14-20
Furuse et al. (1999) J. Cell. Biol. 147, 891-903
Giehl et al. (2000) Oncogene 19, 4531-4541
Giehl et al. (2000) Oncogene 19, 2930-2942
Gress et al. (1996) Oncogene 13, 1819-1830
Hanna et al. (1989) J. Bacteriol. 171, 6815-6826
Hanna et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 11037-11043
Iwamura et al. (1997) Cancer Res. 57, 1206-1212
Katahira et al. (1997) J. Cell. Biol. 136, 1239-1247
McClane (1996) Toxicon 11/12, 1335-1343
McDonel et al. (1988) Methods Enzymol. 165, 94-103
Morita et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 511-516
Sonoda et al. (1999) J. Cell Biol. 147, 195-204
Tsukita et al. (2000) J. Cell Biol. 149, 13-16
Wenger et al. (1999) Oncogene 18, 1073-1080Ellenrieder (2000) Int. J. Cancer 85, 14-20
Furuse et al. (1999) J. Cell. Biol. 147, 891-903
Giehl et al. (2000) Oncogene 19, 4531-4541
Giehl et al. (2000) Oncogene 19, 2930-2942
Gress et al. (1996) Oncogene 13, 1819-1830
Hanna et al. (1989) J. Bacteriol. 171, 6815-6826
Hanna et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 11037-11043
Iwamura et al. (1997) Cancer Res. 57, 1206-1212
Katahira et al. (1997) J. Cell. Biol. 136, 1239-1247
McClane (1996) Toxicon 11/12, 1335-1343
McDonel et al. (1988) Methods Enzymol. 165, 94-103
Morita et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 511-516
Sonoda et al. (1999) J. Cell Biol. 147, 195-204
Tsukita et al. (2000) J. Cell Biol. 149, 13-16
Wenger et al. (1999) Oncogene 18, 1073-1080
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