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DE10103652A1 - Magnetische Polyvinylalkoholpartikel mit modifizierter Oberfläche zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren - Google Patents

Magnetische Polyvinylalkoholpartikel mit modifizierter Oberfläche zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren

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Publication number
DE10103652A1
DE10103652A1 DE2001103652 DE10103652A DE10103652A1 DE 10103652 A1 DE10103652 A1 DE 10103652A1 DE 2001103652 DE2001103652 DE 2001103652 DE 10103652 A DE10103652 A DE 10103652A DE 10103652 A1 DE10103652 A1 DE 10103652A1
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DE
Germany
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germanium
polyvinyl alcohol
nucleic acids
nucleic acid
magnetic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE2001103652
Other languages
English (en)
Inventor
Lothar A Brassard
Jeffrey Parker
Helga Smets
Juergen Oster
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chemagen Biopolymer Technologie AG
Original Assignee
Chemagen Biopolymer Technologie AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chemagen Biopolymer Technologie AG filed Critical Chemagen Biopolymer Technologie AG
Priority to DE2001103652 priority Critical patent/DE10103652A1/de
Publication of DE10103652A1 publication Critical patent/DE10103652A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

Magnetische oder magnetisierbare Polyvinylalkohol-Trägermaterialien für die reversible Bindung von Nucleinsäuren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie durch chemische Umsetzung mit einer Germanium-enthaltenden Verbindung modifiziert sind.

Description

Die Erfindung betrifft magnetische oder magnetisierbare Po­ lyvinylalkohol(PVA)-Trägermaterialien, die zur reversiblen Bindung von Nucleinsäuren befähigt sind, und die für die Isolierung und/oder Reinigung von Nucleinsäuren verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung solcher Trägermaterialien, sowie Verfahren zur Reinigung von Nucleinsäuren unter Verwendung solcher Trägermateriali­ en.
Die Entwicklung neuer molekularbiologischer Methoden und deren Etablierung in den unterschiedlichsten Bereichen der akademischen wie auch industriellen Forschung, wie auch im Bereich der Diagnostik, hat entscheidend zum raschen Wachs­ tum des sogenannten "Life-Science"-Bereichs beigetragen. Die Anwendung vieler dieser Methoden, wie z. B. die Polyme­ rase-Kettenreaktion (PCR), das Klonieren oder die Sequen­ zierung von Nucleinsäuren, stellt hohe Anforderungen an die Qualität der bei diesen Reaktionen oder Methoden eingesetz­ ten Ausgangssubstrate. Insbesondere die Isolierung und die Aufreinigung der bei vielen Reaktionen als Ausgangssubstrat dienenden Nucleinsäuren ist daher von großer Bedeutung. Verunreinigungen des Ausgangssubstrats (z. B. Nucleinsäu­ ren, DNA, RNA) können die Ausbeute bei den genannten Metho­ den oder Reaktionen erheblich vermindern, oder sogar ein völliges Mißlingen zur Folge haben, oder für das Auftreten von unerwünschten Artefakten verantwortlich sein.
Weil DNA und RNA in der Regel aus sehr komplexen, heterogen zusammengesetzten, biologischen Probenmaterialien als Aus­ gangsmaterialien (z. B. Blut oder Gewebe- oder Bakterienlysate) gewonnen werden müssen, gestaltet sich die Isolierung von Nucleinsäuren mit dem geforderten Reinheitsgrad oft schwierig. Derartige Probenmaterialien oder Ausgangsmate­ rialien enthalten häufig eine Vielzahl von Verunreinigun­ gen, wie z. B. Proteine, Polysaccharide, Enzyme, aber auch Enzym-Inhibitoren, welche sich bei nachfolgenden chemischen oder enzymatischen Reaktionen, als störend erweisen können, falls sie nicht durch geeignete Reinigungsmethoden von den Nucleinsäuren abgetrennt werden.
Zwar läßt sich der Reinheitsgrad von Nucleinsäure-Präpa­ rationen verbessern, indem die aus dem biologischen Aus­ gangsmaterial gewonnenen Nucleinsäuren mehrfach in Folge verschiedenen bekannten Reinigungsverfahren unterworfen werden. Dies ist jedoch sehr zeitaufwendig und führt zu ei­ ner sehr niedrigen Ausbeute, weshalb relativ große Mengen des biologischen Ausgangsmaterials eingesetzt werden müs­ sen, was oft nicht möglich ist.
In vielen Bereichen der molekularbiologischen Forschung, insbesondere in der Diagnostik, werden Nucleinsäuren-Präpa­ rationen mit hohem Reinheitsgrad benötigt, und zudem müssen diese hochreinen Nucleinsäure-Präparationen oftmals aus ei­ ner sehr großen Anzahl unterschiedlichster, komplexer bio­ logischer Ausgangsmaterialien (Probenmaterialien) isoliert und gereinigt werden.
Bedingt durch die ständig wachsende Anzahl an durchzufüh­ renden Untersuchungen, bei welchen hochreine Nucleinsäuren als Ausgangssubstrat benötigt werden, ist deshalb die Ein­ führung von geeigneten, vorzugsweise automatisierten "Hoch­ durchsatz"-Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nu­ cleinsäuren, ausgehend von verschiedensten Probenmateriali­ en und unterschiedlichen Ausgangsmengen, dringend erforder­ lich.
Bisher bekannte Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren sind entweder problematisch bei der automatisierten Anwendung, oder sie liefern keine quantitativen Ausbeuten, oder die so erhaltenen Nucleinsäuren haben eine nur unzureichen­ de Reinheit. Konventionelle Methoden zur Gewinnung von Nucleinsäuren aus komplexen Gemischen beinhalten die Lyse bzw. den Aufschluß des biologischen Ausgangsmaterials in Gegenwart von proteolytischen Enzymen, eine mehrfache Ex­ traktion mit organischen Lösungsmitteln (z. B. Phenol, Chloroform), sowie die nachfolgende Präzipitation der auf­ gereinigten Nucleinsäuren durch Zusatz eines Alkohols. Zur Inaktivierung der bei der Zell-Lyse freigesetzten Nucleasen kann z. B. Guanidin-Hydrochlorid oder Guanidin-Thiocyanat verwendet werden (D. D. L. BOWTELL: Rapid Isolation of Euka­ ryotic DNA; Analytical Biochemistry 162 (1987), 463-465). Eine vollständige Entfernung von Proteinen aus der Nuclein­ säure-Präparation wird z. B. durch den Zusatz von Natrium­ perchlorat erreicht (J. WILCOCRSON: The Use of Sodium Per­ chlorate in Deproteinization during the Preparation of Nucleic Acids; Biochem. Journal 135 (1973), 559-561).
Bei den vorstehend genannten Reinigungsmethoden sind jedoch verschiedene aufwendige Arbeitsschritte erforderlich, die deren Einsatz in automatisierten Reinigungsverfahren für Nucleinsäuren verhindern. Eine Anwendung in Verbindung mit Hochdurchsatz-Verfahren ist deshalb nicht möglich.
Andere Reinigungs- bzw. Trennverfahren für Nucleinsäuren basieren auf nucleinsäurebindenden, nicht-magnetischen, fe­ sten Trägermaterialien (Matrices), die beispielsweise in chromatographische Trennsäulen gefüllt werden. Als nuclein­ säurebindende Trägermaterialien werden vor allem Silica- Materialien, wie Silica-Gele, oder Glaspartikel verwendet. Diese Trägermaterialien werden in Verbindung mit hochkon­ zentrierten, stark chaotropen Salzlösungen (z. B. von Na­ triumiodid, Natriumperchlorat, Guanidiniumthiocyanat) zur Isolierung oder Reinigung von DNA verwendet. Beispielsweise wird in US 5,075,430 die Verwendung von Diatomeenerde als Trägermaterial zur Reinigung von DNA beschrieben, wobei die Bindung in Gegenwart eines chaotropen Salzes erfolgt. EP 0 389 063 B1 und US 5,234,809 offenbaren ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren, bei welchem Siliciumdioxid- Partikel als DNA-bindende feste Phase verwendet werden. Auch hier erfolgt die Bindung in Gegenwart einer chaotropen Substanz.
Andere Verfahren zur Isolierung bzw. Reinigung von Nuclein­ säuren beruhen auf der Verwendung von Detergenzien in Kom­ bination mit einer nucleinsäurebindenden Matrix (WO-A- 96/18731), oder auf der Verwendung eines festen Trägers mit DNA-bindenden funktionellen Gruppen in Kombination mit Po­ lyethylenglykol und Salzen in hohen Konzentrationen (WO 99/58664).
Die Automatisierung der Isolierung bzw. Reinigung von Nu­ cleinsäuren unter Verwendung der vorstehend beschriebenen nichtmagnetischen Trägermaterialien ist generell äußerst schwierig, weil dies erfordern würde, daß Zentrifugations- oder Vakuum-Schritte in ein solches automatisches Trennver­ fahren integriert werden. Ein vollständiges Abtrennen der festen Trägermatrix durch Zentrifugation ist zudem oft nicht möglich. Die Verwendung von mit Trägermaterial ge­ füllten Trennsäulen ist nachteilig, da diese Methode auf­ grund der unvermeidlichen Totvolumina der Säulen und der dadurch bedingten Verluste für kleine Mengen biologischen Probenmaterials nicht geeignet ist. Bei Verwendung von Trennsäulen besteht außerdem die Gefahr einer gegenseitigen Kontamination unterschiedlicher biologischer Proben, insbe­ sondere beim Entleeren nebeneinander befindlicher Säulen durch Vakuum. Jedoch ist es gerade im Hinblick auf eine Hochdurchsatz-Aufreinigung von Nucleinsäuren im diagnosti­ schen Bereich, z. B. zur Erkennung von genetisch bedingten Krankheiten, unbedingt erforderlich, daß auch ausgehend von möglichst kleinen Mengen oder Volumina von biologischem Ausgangs- bzw. Probenmaterial zuverlässig hochreine Nucle­ insäure-Präparationen gewonnen werden können. Bei den übli­ chen Mikrotiterplatten mit 384 "wells" beträgt das Proben­ volumen in den einzelnen "wells" beispielsweise maximal ca. 30 µl.
Die Verwendung von magnetischen festen Trägermaterialien, die in zunehmendem Maße bei biochemischen oder molekular­ biologischen Arbeitsmethoden eingesetzt werden, hat gegen­ über konventionellen (d. h. nicht-magnetischen) Trennverfah­ ren entscheidende Vorteile. Diese Trägermaterialien lassen sich mit Hilfe magnetischer Kräfte auf einfache Weise von den übrigen Bestandteilen des Ausgangsmaterials abtrennen. Sie eignen sich ferner auch für kleinere Probenvolumina, sofern die Größe und die magnetischen Eigenschaften des verwendeten Trägermaterials für das jeweilige Trennproblem geeignet sind.
Es sind magnetische Trägermaterialien beschrieben worden, und z. T. kommerziell erhältlich, die zur Isolierung bzw. Reinigung von Nucleinsäuren eingesetzt werden können. Bei­ spielsweise sind für die Abtrennung von Nucleinsäuren mit spezifischen Sequenzen z. B. Streptavidin-beschichtete ma­ gnetische Partikel bekannt, die nach Bindung eines biotiny­ lierten Oligonucleotids an das immobilisierte Streptavidin für die sequenzspezifische Abtrennung von Nucleinsäuren mit komplementären Sequenzen verwendet werden können. Ein wich­ tiges Beispiel hierfür ist die Isolierung von mRNA unter Verwendung von biotinyliertem oligo (dT).
Daneben sind auch magnetische Partikel bekannt, welche die Abtrennung bzw. Isolierung von Nucleinsäuren, unabhängig von deren Nucleotidsequenz, ermöglichen. Solche Partikel können auf der Basis von Silica durch Einlagerung von ma­ gnetischen oder magnetisierbaren Eisenoxid-Partikeln hergestellt werden; sie sind beispielsweise in den US-Patenten 4,395,271 oder 4,297,337 beschrieben. Bekannte Nachteile dieser Partikel sind zum einen die oftmals erschwerte oder unvollständige Ablösung der an die Partikel gebundenen Nucleinsäuren, und zum anderen ein Austreten von gelösten Eisensalzen aus dem eingekapselten Eisenoxid, das sich stö­ rend auf weitere Anwendungen auswirkt.
Zudem ist mit den bekannten magnetischen Partikeln eine quantitative, vollständige Isolierung von Nucleinsäuren aus komplexen Ausgangsmaterialien oder aber die Gewinnung von hochreinen Nucleinsäure-Präparationen in der Regel nicht möglich. Ein weiterer Nachteil dieser Partikel ist darin zu sehen, daß diese meist einen nur geringen Anteil an magne­ tisierbarem Material aufweisen, weshalb deren vollständige magnetische Separation erschwert ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ma­ gnetische oder magnetisierbare feste Trägermaterialien be­ reitzustellen, welche zur reversiblen Bindung von Nuclein­ säuren befähigt und zur Isolierung bzw. Reinigung von Nu­ cleinsäuren geeignet sind. Weiterhin sollen derartige Trä­ germaterialien sowohl rasch als auch vollständig mittels magnetischer Krafteinwirkung aus dem Nucleinsäuren enthal­ tenden Ausgangsmaterial abtrennbar sein, und sie sollen die quantitative Isolierung von hochreiner Nucleinsäure aus komplexen biologischen Ausgangsmaterialien ermöglichen. Des weiteren wird gefordert, daß sich solche Trägermaterialien für die Verwendung in automatisierten Hochdurchsatz-Verfah­ ren zur Isolierung oder Reinigung von Nucleinsäuren eignen, und daß sie auch für die Isolation oder Reinigung von Nu­ cleinsäuren aus sehr kleinen Mengen des Ausgangsmaterials verwendet werden können.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die vorstehend ge­ nannte Aufgabe durch magnetische oder magnetisierbare Polyvinylalkohol-Trägermaterialien gemäß Anspruch 1 gelöst wird. Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien sind dadurch gekennzeichnet, daß sie durch chemische Umsetzung mit einer Germanium-enthaltenden Verbindung modifiziert sind. Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Trä­ germaterialien sind in den abhängigen Ansprüchen 2-10 be­ schrieben.
Die erfindungsgemäßen magnetischen oder magnetisierbaren Polyvinylalkohol-Trägermaterialien sind befähigt, Nuclein­ säuren reversibel und in sequenz-unspezifischer Weise mit hoher Bindungskapazität selektiv zu binden.
Polyvinylalkohol als solcher weist nur geringe Nucleinsäu­ re-Bindungseigenschaften auf. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die Bindungskapazität von Polyvinylalkohol- Trägermaterialien beträchtlich erhöht wird, wenn diese Ma­ terialien durch chemische Behandlung mit einer Germanium­ enthaltenden Verbindung modifiziert werden.
Andererseits zeichnen sich die erfindungsgemäßen Polyvinyl­ alkohol-Trägermaterialien aufgrund ihrer stark hydrophilen Eigenschaften durch eine minimale unspezifische Proteinbin­ dung aus. Dies ist im Hinblick auf die Verwendung dieser Trägermaterialien zur Isolierung oder Reinigung von Nucle­ insäuren ein sehr wichtiges Kriterium, weil aufgrund dieses Bindungsverhaltens eine hohe Reinheit der gewonnenen Nucle­ insäuren sichergestellt wird.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen, Germanium-modi­ fizierten Polyvinylalkoholpartikel besteht darin, daß diese gegenüber nicht-modifizierten PVA-Partikeln verbesserte Suspendiereigenschaften aufweisen, so daß sie sich bei Wasch- oder Elutionsschritten nach vorangegangener magneti­ scher Separation wieder leichter in Suspension bringen las­ sen. Dies hat den Vorteil, daß die Waschschritte bzw. die Elution effektiver durchgeführt werden können.
Als magnetische oder magnetisierbare Polyvinylalkohol- Trägermaterialien, welche gemäß Anspruch 1 durch Umsetzung mit einer germaniumhaltigen Verbindung modifiziert werden können, eignen sich vorzugsweise magnetische oder magneti­ sierbare Polyvinylalkohol-Partikel, die nach den in WO 97/04862 beschriebenen Verfahren hergestellt sind. Bezüg­ lich der Herstellung dieser Polyvinylalkohol-Partikel wird deshalb auf WO 97/04862 verwiesen. Die mit den dort be­ schriebenen Verfahren erhältlichen magnetischen oder magne­ tisierbaren Polyvinylalkoholpartikel weisen eine Reihe von Vorteilen auf:
  • - sie können mit den genannten Verfahren in verschiedenen Größenverteilungen, bevorzugt mit einem Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 15 µm, hergestellt werden;
  • - sie können hinsichtlich der Größenverteilung (Durchmes­ ser) im Hinblick auf einen bestimmten Anwendungszweck ad­ aptiert werden; beispielsweise können mit dem in WO 97/04862 beschriebenen Verfahren magnetische Polyvinylal­ koholpartikel erhalten werden, deren Größe vom Bereich von 0,5 bis 1 µm oder im Bereich von 1 bis 3 µm liegt;
  • - sie können hinsichtlich ihres Magnetit-Gehalts für be­ stimmte Anwendungszwecke angepaßt werden, beispielsweise mit einem sehr hohen Magnetitgehalt von bis zu 90 Gew.-%; derartige Polyvinylalkoholpartikel weisen, bezogen auf das Partikelvolumen, eine große Oberfläche auf, wodurch eine hohe Bindungskapazität bei ihrer Verwendung in einem Trenn- oder Reinigungsverfahren für Nucleinsäuren er­ reicht werden kann;
  • - der als Polymermatrix verwendete Polyvinylalkohol ist aufgrund bestimmter Eigenschaften, z. B. des hydrophilen Charakters, für biochemische Trennverfahren besonders ge­ eignet.
Aus den genannten Gründen werden als Polyvinylalkoholträ­ germaterialien, die erfindungsgemäß durch Behandlung mit germaniumhaltigen Verbindungen modifiziert werden, besonders bevorzugt die in WO 97/04862 beschriebenen magneti­ schen Polymerpartikel verwendet.
Grundsätzlich lassen sich aber auch auf andere Weise herge­ stellte, magnetische oder magnetisierbare Polyvinylalkohol- Trägermaterialien für die erfindungsgemäße Modifizierungs­ reaktion mit einer germaniumhaltigen Verbindung verwenden.
Die erfindungsgemäßen, durch Modifikation mit germaniumhal­ tigen Verbindungen hergestellten magnetischen oder magneti­ sierbaren Polyvinylalkohol-Trägermaterialien, insbesondere in Form von Polyvinylalkoholpartikeln, können zur quantita­ tiven Abtrennung von Nucleinsäuren aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien eingesetzt werden. Die so gewonnenen Nucleinsäuren weisen eine hohe Reinheit auf, so daß sie di­ rekt als Substrat in weiteren Anwendungen, z. B. in der PCR, eingesetzt werden können.
Das magnetische oder magnetisierbare Polyvinyl-Trägermate­ rial wird gemäß Anspruch 1 durch chemische Reaktion mit ei­ ner Germanium-enthaltenden Verbindung modifiziert, wobei vorzugsweise eine hydrolysierbare Germaniumverbindung ver­ wendet wird.
Diese Modifizierung kann darin bestehen, daß die Polyvinyl­ alkohol-Trägermaterialien kovalent gebundenes Germanium bzw. Germanium(IV)dioxid oder ein kovalent gebundenes ger­ maniumhaltiges Polymer enthalten, vorzugsweise an der Ober­ fläche der Trägermaterialien.
Im Falle der Verwendung eines Tetraalkoxy-Germans (z. B. Germaniumtetraethoxid (Germanium(IV)-ethylat, Ge(OC2H5))4) zur Modifizierung der Trägermaterialien wird Germaniumdi­ oxid an die Oberfläche der Trägermaterialien gebunden, so daß eine Beschichtung aus Germaniumdioxid erzeugt wird.
Die Germaniumatome, oder zumindest ein Teil davon, sind da­ bei über ein Sauerstoffatom an den Polyvinylalkohol gebun­ den. Sie können zusätzlich über Sauerstoffbrücken unterein­ ander verbunden sein, so daß ein dreidimensionales Netzwerk gebildet werden kann ("Polygermoxan"; vgl. Fig. 1).
Folglich kann durch die genannte Modifizierungsreaktion be­ wirkt werden, daß die Polyvinylalkohol-Trägermaterialien an ihrer Oberfläche eine Schicht von Germanium(IV)oxid oder Polygermoxan aufweisen, welches kovalent an das Polyvinyl­ alkohol-Trägermaterial gebunden ist. Jedoch ist die Modifi­ zierungsreaktion nicht notwendigerweise auf die Oberfläche des Trägermaterials beschränkt.
Auch ist es nicht erforderlich, daß die genannte Schicht vollständig ausgebildet ist; es kann sich auch um eine nur teilweise Beschichtung handeln. Die Schicht kann als Mono­ layer ausgebildet sein, sie kann aber auch aus mehreren La­ gen bestehen.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise solche magnetische oder magnetisierbaren Trägermaterialien, die durch Behandlung von Polyvinylalkohol-Trägermaterialien mit Germaniumhaloge­ niden, besonders bevorzugt Germaniumtetrachlorid, oder or­ ganischen Germanium-Verbindungen, vorzugsweise Germaniumal­ koholaten (Alkoxy-Derivate der Germane), besonders bevor­ zugt Germaniumtetraethoxid (Germanium(IV)-ethylat, Ge(OC2H5))4), hergestellt sind.
Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien weisen magnetische Eigenschaften auf oder sind magnetisierbar; vorzugsweise wird dies dadurch erreicht, daß sie superparamagnetische oder paramagnetische Eisenoxidpartikel enthalten, besonders bevorzugt Magnetit.
Damit die Abtrennung der magnetischen Trägermaterialien aus dem biologischen Ausgangsmaterial, nach Bindung der Nucle­ insäuren an das Trägermaterial, möglichst effizient erfolgen kann, wird bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Träger­ materialien einen Magnetitgehalt von mindestens 50 Gew.-% aufweisen, besonders bevorzugt von mindestens 75 Gew.-%.
Des weiteren sieht eine bevorzugte Ausführungsform der Er­ findung vor, daß die mit einer Germanium-enthaltenden Ver­ bindung modifizierten magnetischen Polyvinylalkohol-Träger­ materialien als Hydrogel vorliegen.
Bevorzugt liegen die erfindungsgemäßen Trägermaterialien in Form von Partikeln vor, welche Partikelgrößen von 0,2-50 µm, vorzugsweise von 0,4-8 µm aufweisen. Am meisten bevor­ zugt sind Partikel, die eine Größe von 0,4-4 µm aufweisen, da diese ein besonders günstiges Oberflächen/Volumen-Ver­ hältnis aufweisen, wodurch eine hohe Bindungskapazität bei der Verwendung zur Abtrennung von Nucleinsäuren erreicht wird.
Als "Größe" der Partikel wird der mittlere Durchmesser der Partikel verstanden. Die vorstehend angegebenen Größenbe­ reiche besagen, daß mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80% der Partikel eine Größe aufweisen, die innerhalb des jeweiligen Größenbereichs liegt. Beispielsweise liegt der mittlere Durchmesser bei Partikeln mit einer Größe von 1-3 µm bei ca. 2 µm.
Hinsichtlich der geometrischen Form der genannten Partikel wird bevorzugt, daß sie als im wesentlichen perl- oder ku­ gelförmige Partikel (sogenannte "beads") vorliegen.
Am besten geeignet für Verfahren zur Nucleinsäure-Isolie­ rung bzw. Reinigung sind perl- oder kugelförmige, magneti­ sche oder magnetisierbare Polyvinylalkoholpartikel, welche gemäß der Erfindung durch Umsetzung mit einer germaniumhal­ tigen Verbindung modifiziert worden sind, und die eine ge­ ringe Größe (0,4-4 µm) und einen hohen Magnatitanteil (min­ destens 50 Gew.-%) aufweisen.
Der hohe Magnetitanteil und die geringe Größe der erfin­ dungsgemäßen Partikel ermöglicht eine Nucleinsäure-Isolie­ rung sowohl aus sehr kleinen Mengen biologischen Probenma­ terials (z. B. 1 µl Blut), als auch aus sehr großen Proben­ mengen (z. B. 20 ml Blut), wobei auf sonst übliche Zentri­ fugationsschritte verzichtet werden kann. Zentrifugations­ schritte bei der Isolierung von Nucleinsäuren, z. B. aus Blut, werden oft zur Steigerung der Reinheit der gewonnenen Nucleinsäure durchgeführt. Aufgrund der Möglichkeit, mit den erfindungsgemäßen Partikeln eine hochreine Präparation auch ohne Zentrifugationsschritte zu erhalten, kann auf diese zeitraubenden und schlecht zu automatisierenden Schritte verzichtet werden.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von magnetischen oder magnetisierbaren Polyvinylalkohol-Träger­ materialien, die durch Behandlung mit Germanium-enthalten­ den Verbindungen modifiziert sind.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren beruht auf der Umsetzung eines magnetischen oder magnetisierbaren Polyvi­ nylalkohol-Trägermaterials, mit einer Germaniumverbindung, vorzugsweise mit einer organischen Germanium-Verbindung oder mit einem Germanium-Halogenid. Für diesen Zweck eignen sich in hervorragender Weise solche Germanium-Verbindungen, die hydrolysierbare Alkoxy- oder Halogenid-Funktionen ent­ halten.
Grundsätzlich können für die genannte Umsetzung Germanium- Verbindungen mit der allgemeinen Formel Xq-Ge-(Y)4-q verwendet werden,
  • - worin X = Wasserstoff oder Alkyl, vorzugsweise mit 1-6 C-Atomen, oder X = Aryl, vorzugsweise Phenyl, oder X = Alkoxy (OR), wobei R ein Kohlenwasserstoffrest, vorzugs­ weise ein Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Isopropylrest ist,
    oder worin X = Halogenid, vorzugsweise Chlor oder Brom, und
  • - worin Y = Alkoxy (OR'), wobei R' ein Kohlenwasserstoff­ rest, vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl ist,
    oder worin Y ein Halogenid, vorzugsweise Chlor oder Brom, ist, und
  • - wobei q eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist.
Der Kohlenwasserstoffrest R bzw. R' kann sowohl verzweigt als auch unverzweigt sein. Die Gesamtzahl der C-Atome in den Resten R bzw. R' liegt jeweils zwischen 1 und 30, vor­ zugsweise zwischen 1 und 12.
Vorzugsweise wird die Germanium-Verbindung aus der Gruppe ausgewählt, die Germanium(IV)ethoxid (= Germanium(IV)-Ethy­ lat = Germaniumsäure-tetraethylester, Ge(OC2H5)4), Germani­ um(VI)methoxid (= Germanium(IV)-Methylat = Germaniumsäure­ tetramethylester, Ge(OCH3)4), Germanium(IV)isopropoxid (= Germanium(IV)-isopropylat = Germaniumsäure-tetra-isopropyl­ ester, Ge[OCH(CH3)2]4), Germanium(IV)butoxid, und Germani­ umtetrachlorid (GeCl4) umfaßt, wobei Germanium(IV)ethoxid und Germaniumtetrachlorid besonders bevorzugt sind.
Das Verfahren zur chemischen Modifizierung eines magneti­ schen oder magnetisierbaren Polyvinylalkohol-Trägermate­ rials durch Umsetzung mit einer germaniumhaltigen Verbin­ dung wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt (vgl. Bei­ spiel 1):
Das Polyvinylalkohol-Trägermaterial wird in einem wässrigen Puffer bei einem pH von 2 bis 7 suspendiert und unter Rüh­ ren erhitzt (auf ca. 50 bis 95°C). Anschließend wird eine der genannten Germanium-Verbindungen hinzugefügt, und man läßt das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur (20-25°C) ab­ kühlen. Nach mindestens 1maligem Waschen des modifizierten Trägermaterials mit Wasser oder einem wässrigen Puffer kann das Trägermaterial zur Trennung bzw. Reinigung von Nuclein­ säuren verwendet werden. Das vorstehend beschriebene Ver­ fahren eignet sich insbesondere, wenn Germanium(IV)-ethoxid oder ein anderes Alkoxy-Derivat als Germanium-enthaltende Verbindung eingesetzt wird.
Alternativ kann das Verfahren zur chemischen Modifizierung eines magnetischen oder magnetisierbaren Polyvinylalkohol- Trägermaterials in der Weise durchgeführt werden, daß das Polyvinylalkohol-Trägermaterial in einem organischen Lö­ sungsmittel, z. B. Aceton oder Toluol, suspendiert wird (vgl. Beispiel 2). Anschließend wird die Suspension erhitzt (ca. 50-150°C) und die germaniumhaltige Verbindung zuge­ setzt. Nach Ende der Umsetzungsreaktion läßt man das Reak­ tionsgemisch abkühlen, und es wird tropfenweise Wasser hin­ zugefügt. Schließlich wird das modifizierte Trägermaterial mit Wasser bzw. einem wässrigen Puffer gewaschen. Das letztgenannte Verfahren eignet sich insbesondere dann, wenn Germanium(IV)chlorid oder ein anderes Germaniumhalogenid als germaniumhaltige Verbindung verwendet wird.
Als organisches Lösungsmittel kann neben Aceton oder Toluol jedes andere Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch ver­ wendet werden, in welchem die PVA-Partikel stabil sind; dazu zählen beispielsweise Kohlenwasserstoffe, Dimethyl­ formamid, Dimethoxyethan, Chloroform, Dichlormethan oder Tetrahydrofuran.
Bei den Umsetzungsreaktionen nach den vorstehend beschrie­ benen Verfahren wird die jeweilige Germanium-Verbindung vorzugsweise in einer Menge von 0,1-10 mmol pro Gramm Po­ lyvinylalkoholpartikel eingesetzt, besonders bevorzugt in einem Mengenverhältnis von 0,7-2,5 mmol pro Gramm Polyvinylalkoholpartikel. Bei dem letztgenannten Mengenverhält­ nis werden Germanium-modifizierte Partikel mit besonders guten Nucleinsäure-Bindungseigenschaften erhalten.
Als magnetische oder magnetisierbare Polyvinylalkohol- Trägermaterialien werden bevorzugt kugelförmige Partikel ("beads") verwendet, die mit den in WO 97/04862 beschriebe­ nen Verfahren erhalten werden und von der Fa. chemagen AG, D-52499 Baesweiler erhältlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von Nucleinsäuren aus komplexen Ausgangsmaterialien oder Gemischen, unter Verwendung der erfindungsgemäßen, durch Umsetzung mit einer germaniumhal­ tigen Verbindung modifizierten magnetischen Polyvinylalko­ hol-Trägermaterialien.
Diese Verfahren beruhen grundsätzlich darauf, daß das er­ findungsgemäße Trägermaterial mit dem nucleinsäurehaltigen Ausgangsmaterial oder Gemisch in Kontakt gebracht oder da­ mit vermischt wird, wobei die Nucleinsäuren reversibel an das Trägermaterial gebunden werden. Anschließend wird das Trägermaterial mit Hilfe magnetischer Krafteinwirkung von dem Ausgangsmaterial oder Gemisch abgetrennt (separiert), und die gebundenen Nucleinsäuren werden vom Trägermaterial gelöst (eluiert).
Die "komplexen Ausgangsmaterialien", aus welchen Nuclein­ säure(n) isoliert bzw. abgetrennt werden sollen, können beispielsweise aus Körperflüssigkeiten, wie Blut oder Se­ rum, oder Fraktionen davon, z. b. buffy coat, oder auch aus pflanzlichen oder tierischen Zellen oder Geweben, Pilzen, Bakterien oder Viren oder einem anderen biologischen Mate­ rial gewonnen werden. Falls erforderlich, werden diese Aus­ gangsmaterialien durch geeignete, dem Fachmann bekannte Methoden oder Reagenzien aufgeschlossen, um die Nucleinsäuren aus den Zellen bzw. Geweben freizusetzen. In jedem Fall müssen die Ausgangsmaterialien bzw. das biologische Proben­ material so vorbehandelt werden, daß zumindest ein Teil der Nucleinsäuren freigesetzt wird und in Lösung vorliegt. Bei­ spielsweise können Zellen oder Gewebe mittels mechanischer Scherkräfte, durch Einwirkung lytischer Enzyme oder mit Hilfe von Detergenzien aufgeschlossen bzw. lysiert werden.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verfahren auch verwendet werden, um Nucleinsäuren aus Gemischen, Lösungen oder Suspensionen abzutrennen, die chemisch oder enzyma­ tisch modifizierte, synthetisierte oder synthetisch ampli­ fizierte Nucleinsäuren (vgl. Beispiel 3) enthalten. Unter "Nucleinsäuren" werden insbesondere DNA und RNA ver­ standen, sowie Oligonucleotide, DNA- oder RNA-Fragmente, chemisch oder enzymatisch modifizierte Nucleinsäuren, ein­ zel- oder doppelsträngige Nucleinsäuren, genomische DNA (vgl. Beispiel 4) oder RNA, gesamte zelluläre DNA oder RNA, Plasmide und virale DNA sowie virale RNA, wobei es sich hier lediglich um Beispiele handelt.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren zur Abtrennung bzw. Reinigung von Nucleinsäuren wird in einem ersten Schritt ein magnetisches oder magnetisierbares, Nucleinsäure­ bindendes, festes Trägermaterial mit dem Ausgangsmaterial oder Gemisch in Kontakt gebracht oder damit vermischt, wo­ bei die Nucleinsäure(n) oder Nucleinsäurederivat(e) rever­ sibel an das feste Trägermaterial gebunden wird/werden. Als Trägermaterial wird dabei ein magnetisches oder magneti­ sierbares, Nucleinsäure-bindendes, festes Polyvinylalkohol- Trägermaterial verwendet, welches durch Umsetzung mit einer germaniumhaltigen Verbindung modifiziert worden ist, wie oben beschrieben. Bevorzugt handelt es sich bei dem Träger­ material um perl- oder kugelförmige, magnetische oder magnetisierbare Polyvinylalkoholpartikel, die eine geringe Größe (0,4-4 µm) und einen hohen Magnetitanteil (mindestens 50 Gew.-%) aufweisen.
Die Zugabe des Trägermaterials bzw. der Partikel zum nucle­ insäurehaltigen Ausgangsmaterial erfolgt vorzugsweise in Gegenwart eines Puffers, der die Bindung der Nucleinsäuren an die Trägerpartikel unterstützt ("Bindungspuffer"). Zur Entfernung von Proteinen aus Zell-Lysaten, insbesondere zur Abtrennung von DNA-bindenden Proteinen, kann während dieses ersten Schrittes (Bindungs-Schritt) bevorzugt Natri­ umperchlorat in einer Endkonzentration von 1-1,5 M zuge­ setzt werden.
Als Bindungspuffer wird bevorzugt eine Wasser (40-70 Vol.- %), Ethanol, Natriumacetat und Natriumperchlorat enthal­ tende Lösung verwendet, wobei die Reihenfolge der Zugabe dieser Komponenten nicht von Bedeutung ist. Alternativ dazu können beispielsweise folgende Puffer, Lösungen bzw. Gemi­ sche als Bindungspuffer eingesetzt werden:
  • - 2,2 M NaClO4, 0,3 M Natriumacetat, in Wasser, pH 5,5-6,5.
  • - 40-60 Vol.-% Ethanol, 10-15 Vol.-% Dimethylformamid, 0,1- 0,5% NaCl, Wasser ad 100%; pH 6-7. Wahlweise kann statt Dimethylformamid auch z. B. Glycerin oder ein Dimethoxy­ alkylenglykol verwendet werden.
  • - 60-90 Vol.-% Ethanol, 0,01-0,2 M MgCl2, 20-100 mM Tris pH 6,5 (Tris = Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan).
Welcher Puffer in einem bestimmten Anwendungsfall, d. h. für ein bestimmtes biologisches Ausgangsmaterial, am besten geeignet ist, kann der Fachmann durch entsprechende Vorver­ suche auf einfache Weise ermitteln. Es hat sich z. B. ge­ zeigt, daß in manchen Fällen ethanolfreie Bindungspuffer am besten geeignet sind (z. B.: Nucleinsäure-Isolierung aus Bakterienlysaten), in anderen Fällen dagegen ethanolhaltige Bindungspuffer (z. B. Nucleinsäure-Isolierung aus Blut).
Die Bindung der Nucleinsäuren an das Trägermaterial erfolgt relativ schnell und erfordert gewöhnlich nur eine Inkubati­ onszeit von einer bis wenigen (fünf) Minuten. Falls erfor­ derlich, kann die Inkubationszeit für den ersten Schritt (Bindungs-Schritt) auch ausgedehnt werden, von 5 min. bis ca. 2 h oder noch länger.
Am Ende des Bindungsschrittes kann das Ausgangsmaterial zu­ sammen mit dem Bindungspuffer abgetrennt und verworfen wer­ den (z. B. Absaugen oder Dekantieren), wobei das Trägerma­ terial (an welches die Nucleinsäuren gebunden sind) mit Hilfe eines Magneten oder sonstigen Magnetfeldes zurückge­ halten wird (= "magnetische Separation").
In einem zweiten Schritt wird/werden die an das Trägermate­ rial gebundene(n) Nucleinsäuren unter Verwendung geeigneter Waschpuffer gewaschen. Als Waschpuffer kann z. B. verdünn­ ter Alkohol (30-80 Vol.-%) verwendet werden, wobei optional auch Salze darin gelöst sein können (z. B. Natriumperchlo­ rat, Natriumacetat). Je nach Einsatzgebiet sind aber auch andere Niedrig- oder Hochsalzpuffer bzw. -lösungen ohne Al­ koholzusatz als Waschpuffer verwendbar. "Niedrigsalz" be­ deutet eine Salzkonzentration von 0,01-0,2 M, "Hochsalz" bedeutet eine Salzkonzentration von 1-7 M.
Aufgrund der magnetischen Eigenschaften des Trägermaterials ist der Wechsel der Waschlösungen sehr einfach möglich, da das Trägermaterial mit Hilfe eines Magneten zurückgehalten werden kann, während die Waschlösung entfernt wird. Falls erforderlich, kann dieser Wasch-Schritt ein- oder mehrmals wiederholt werden.
Alternativ können beispielsweise folgende Puffer, Lösungen oder Gemische als Waschpuffer verwendet werden:
  • - 30-90 Vol.-% Ethanol, 0,05-0,2 M NaCl. Statt NaCl kann auch z. B. Natriumacetat, Ammoniumacetat, Magnesiumchlo­ rid oder Natriumperchlorat verwendet werden.
  • - 30-90 Vol.-% Ethanol, 1-2 M Natriumperchlorat (oder, al­ ternativ, eines der vorstehend genannten Salze).
  • - 1-4 M Natriumperchlorat, in Wasser; (oder, alternativ, eines der vorstehend genannten Salze).
  • - 0,02-0,2 M Annoniumacetat, in Wasser; (oder, alternativ, eines der vorstehend genannten Salze).
Ebenso ist es möglich, Wasser als "Waschpuffer" zu verwen­ den.
Anstelle von Ethanol kann im Bindungs- bzw. Waschpuffer auch ein anderer Alkohol, oder ein Gemisch von Alkoholen, verwendet werden; beispielsweise läßt sich Ethanol durch Isopropanol ersetzen.
In einem dritten Schritt (Elutions-Schritt) werden die an das Trägermaterial reversibel gebundenen Nucleinsäuren aus der Bindung freigesetzt bzw. eluiert. Hierzu wird das mit Nucleinsäuren beladene Trägermaterial vorzugsweise mit ei­ nem Niedrigsalz-Puffer (0,01-0,2 M) oder Wasser (als Eluti­ onspuffer oder -lösung), nötigenfalls bei erhöhter Tempera­ tur (bevorzugt 40-70°C, stärker bevorzugt 50-60°C) behan­ delt, wodurch die Elution der Nucleinsäure von den Träger­ material-Partikeln bewirkt wird. Als Salze im Niedrigsalz- Puffer kommmen beispielsweise die oben unter "Bindungspuf­ fer" bzw. "Waschpuffer" genannten Salze in Betracht. Optional kann auf den Elutions-Schritt verzichtet werden; in diesem Fall wird die an das Trägermaterial gebundene Nucleinsäure direkt bei nachfolgenden Reaktionen einge­ setzt. Beispielsweise kann die an die erfindungsgemäßen Partikel gebundene Nucleinsäure ohne vorherige Elution di­ rekt in einer PCR eingesetzt werden.
Die Erfindung umfaßt ferner Kits zur Isolierung und/oder Reinigung von Nucleinsäuren, welche ein magnetisches oder magnetisierbares Polyvinylalkohol-Trägermaterial enthalten, das erfindungsgemäß durch Umsetzung mit einer germaniumhal­ tigen Verbindung modifiziert worden ist, sowie Lösungen und /oder Reagenzien zur Durchführung der Isolierung und/oder Reinigung. Beispielsweise können als Lösungen oder Reagen­ zien Bindungs-Puffer, Wasch-Puffer, Elutionspuffer oder - lösungen, oder Reagenzien oder Lösungen zum Aufschluß (Ly­ se) des nucleinsäurehaltigen Ausgangsmaterials (z. B. Zel­ len, Gewebe) enthalten sein.
Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele näher er­ läutert.
Beispiel 1 Modifizierung von Polyvinylalkohol-Partikeln durch Umset­ zung mit einer germaniumhaltigen Verbindung in wässriger Lösung
500 mg magnetisierbarer Polyvinylalkoholpartikel der Größe 1-3 µm, mit einem Magnetitgehalt von 90 Gew.-%, werden zweimal mit jeweils 20 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 4,5), der vorher entgast wurde, unter Argon gewaschen, wo­ bei die Abtrennung der Partikel jeweils mit einem Handma­ gneten erfolgt, und dann in 20 ml ebenfalls entgastem 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 4,5) resuspendiert. Die Suspension wird unter Rühren auf 60°C erhitzt und anschließend werden im Argonstrom 200 µl Germaniumtetraethoxid tropfenweise zu­ gesetzt. Nach zweistündiger Reaktion bei dieser Temperatur läßt man das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen, trennt den Überstand nach magnetischer Separation ab und wäscht die Partikel dreimal mit jeweils 20 ml destilliertem Wasser; dies kann in Gegenwart von Luft erfolgen. Anschlie­ ßend werden die Partikel zur Lagerung in 0,1 M Natriumace­ tatpuffer (pH 5,5) resuspendiert und die Konzentration der Partikel auf 25 mg/ml eingestellt.
Beispiel 2 Modifizierung von Polyvinylalkohol-Partikeln durch Umset­ zung mit einer germaniumhaltigen Verbindung in einem orga­ nischen Lösungsmittel
500 mg magnetisierbarer Polyvinylalkoholpartikel der Größe 1-3 µm, mit einem Magnetitgehalt von 90 Gew.-%, werden suk­ zessive entwässert durch Waschen mit Aceton-Wasser-Gemi­ schen und anschließend durch Waschen mit absolutem Aceton. Nach Abtrennen des Aceton-Überstandes werden die Partikel unter Argon in 10 ml absolutem Toluol (Reinheitsgrad mind. 99,5%) gewaschen und dann in 20 ml absolutem Toluol resus­ pendiert. Die Suspension wird unter Rühren auf 100°C er­ hitzt, und anschließend werden im Argonstrom 100 µl Germa­ niumtetrachlorid tropfenweise zugesetzt. Nach vierstündiger Reaktion bei dieser Temperatur läßt man das Reaktionsge­ misch auf 80°C abkühlen und gibt tropfenweise 500 µl Was­ ser dazu. Nach weiteren zwei Stunden bei dieser Temperatur trennt man den Überstand nach magnetischer Separation ab und wäscht die Partikel an der Luft mit jeweils 50 ml de­ stilliertem Wasser. Anschließend werden die Partikel zur Lagerung in 0,1 M Natriumacetat (pH < 6) resuspendiert.
Beispiel 3 Aufreinigung eines PCR-Amplifikationsproduktes unter Ver­ wendung der gemäß Beispiel 1 hergestellten Partikel
Ein 595 bp DNA-Fragment der malB-Region von genomischer DNA, isoliert aus E. coli (K12) unter Verwendung des "Bugs'n Beads Kits" (Fa. chemagen AG, D-52499 Baesweiler). wird in einer PCR amplifiziert (Primer und Reaktionsbedin­ gungen entsprechend CANDRIAN et al., Int. J. Food Micro­ biol. 12 (1991) 339).
40 µl des PCR-Produkts werden nach der Amplifikation von der Ölphase abgetrennt, mit 16 µl der Partikelsuspension aus Beispiel 1 versetzt, und es werden 100 µl Bindungs- Puffer (60 Vol.-% Ethanol, 2,2 M NaClO4, 0,3 M Natriumace­ tat) hinzugefügt. Nach fünfminütiger Inkubation wird magne­ tisch separiert und der Überstand verworfen. Es wird zwei­ mal mit jeweils 400 µl 60%igem Ethanol gewaschen und die Partikel nach vollständiger Abtrennung der Waschlösung 8 min bei geöffnetem Reaktionsgefäß getrocknet. Anschließend werden die Partikel in 30 µl Tris-HCl (10 mM, pH 8,0) re­ suspendiert. Nach 5minütiger Inkubation bei 55°C wird der Überstand mit dem aufgereinigten DNA-Amplifikationsprodukt von den Partikeln abgetrennt (durch magnetische Separation) und in ein neues Gefäß überführt.
Beispiel 4 Isolierung von genomischer DNA aus Vollblut, unter Verwen­ dung der gemäß Beispiel 1 hergestellten Partikel
10 µl Vollblut (EDTA-stabilisiert) werden in einem 1,5 ml- Reaktionsgefäß mit 65 µl Lyse-Puffer (1,6 M Guanidin- Hydrochlorid; 30 mM Tris-HCl, pH7; 30 mM EDTA; 10 Vol.-% Tween 20; 1 Vol.-% Triton X-100) durchmischt und 1 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden 8 µl der mo­ difizierten Partikel aus Beispiel 1 und 110 µl Bindungspuf­ fer (siehe Beispiel 3) zugesetzt. Nach 5minütiger Inkubati­ on bei Raumtemperatur wird der Überstand nach magnetischer Separation verworfen. Die Partikel werden anschließend mit 190 µl Waschpuffer A (30 Vol.-% Ethanol; 1,1 M NaClO4; 0,15 M Natriumacetat) und anschließend kurz mit 300 µl Wasser gewaschen. Nach Abtrennung der letzten Waschlösung werden die Partikel in 30 µl Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl) 5 min bei 55°C inkubiert, um die DNA zu eluieren. Die so iso­ lierte genomische DNA kann direkt z. B. in einer PCR einge­ setzt werden.
Fig. 1 zeigt beispielhaft die Ausbildung eines "Polygermoxan"- Monolayers (2) auf der Oberfläche eines Polyvinylalkohol- Trägermaterials (1); die erfindungsgemäße Modifizierung kann aber auch zu andersartigen Molekülstrukturen führen, die von der hier gezeigten abweichen.
R steht beispielsweise für einen Alkylrest oder eine freie (endständige) OH-Gruppe.
(1) bezeichnet die Oberfläche des Polyvinylalkohol-Träger­ materials, an welche das "Polygermoxan"-Monolayer (2) über Sauerstoffatome gebunden ist.

Claims (24)

1. Magnetische oder magnetisierbare Polyvinylalkohol- Trägermaterialien für die reversible Bindung von Nuclein­ säuren, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch chemische Um­ setzung mit einer Germanium-enthaltenden Verbindung modifi­ ziert sind.
2. Magnetische oder magnetisierbare Polyvinylalkohol- Trägermaterialien nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent gebundenes Germanium oder Germanium(IV)- oxid oder ein kovalent gebundenes germaniumhaltiges Polymer enthalten, vorzugsweise an dar Oberfläche der Trägermate­ rialien.
3. Trägermaterialien nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie an ihrer Oberfläche eine oder mehrere Schicht(en) von über Sauerstoffbrücken verbundenen Germani­ umatomen aufweisen, wobei zumindest ein Teil der Germanium­ atome über Sauerstoffatome kovalent an das Polyvinylalko­ hol-Trägermaterial gebunden ist.
4. Trägermaterialien nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder teilweise mit Germanium(IV)oxid beschichtet sind.
5. Trägermaterialien nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Behandlung von Poly­ vinylalkohol-Trägermaterialien mit Germaniumhalogeniden oder organischen Germanium-Verbindungen, vorzugsweise Ger­ maniumalkoholaten oder Alkoxy-Derivaten von Germanium, her­ gestellt sind.
6. Trägermaterialien nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie superparamagnetische oder paramagnetische Eisenoxidpartikel enthalten, vorzugsweise Magnetit.
7. Trägermaterialien nach Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie einen Magnetitgehalt von mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 75 Gew.-%, am stärksten bevorzugt von 90 Gew.-% aufweisen.
8. Trägermaterialien nach einem oder mehreren der voran­ gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Hy­ drogel vorliegen.
9. Trägermaterialien nach einem oder mehreren dar voran­ gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Partikel vorliegen, welche Partikelgrößen von 0,2-50 µm, vorzugsweise von 0,4-8 µm, am meisten bevorzugt von 0,4-4 µm aufweisen.
10. Trägermaterialien nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie als im wesentlichen perl- oder kugelför­ mige Partikel vorliegen.
11. Verfahren zur Herstellung eines Trägermaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 10 durch chemische Modifizierung eines magnetischen oder magnetisierbaren Polyvinylalkohol- Trägermaterials durch Umsetzung dieses Trägermaterials mit einer Germaniumverbindung, vorzugsweise mit einer organi­ schen Germanium-Verbindung oder mit einem Germanium-Halo­ genid.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktur der Germanium-Verbindung der allgemeinen Formel Xq-Ge-(Y)4-q entspricht,
worin X = Wasserstoff oder Alkyl, vorzugsweise mit 1-6 C-Atomen, oder X = Aryl, vorzugsweise Phenyl, oder X = Alkoxy (OR), wobei R ein Kohlenwasserstoffrest, vorzugs­ weise ein Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Isopropylrest ist,
oder worin X = Halogenid, vorzugsweise Chlor oder Brom, und
worin Y = Alkoxy (OR'), wobei R' ein Kohlenwasserstoff­ rest, vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl ist,
oder worin Y ein Halogenid, vorzugsweise Chlor oder Brom, ist, und
wobei q eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die zur Modifizierung verwendete Germanium- Verbindung ausgewählt ist aus der Germanium(IV)ethoxid, Germanium(VI)methoxid, Germanium(IV)isopropoxid, Germani­ um(IV)butoxid und Germaniumtetrachlorid umfassenden Gruppe, wobei Germanium(IV)ethoxid und Germaniumtetrachlorid beson­ ders bevorzugt sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Umsetzung des magnetischen oder ma­ gnetisierbaren Polyvinylalkohol-Trägermaterials mit der or­ ganischen Germanium-Verbindung bei Temperaturen von 20-150 °C, vorzugsweise von 50-95°C erfolgt.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 11- 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyvinylalkohol- Trägermaterial zur Umsetzung mit der Germaniumverbindung, vorzugsweise einem Germanium-Alkoholat oder einem Alkoxy- Derivat, in einem wässrigen Puffer bei einem pH von 2 bis 7 suspendiert wird.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 11- 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyvinylalkohol- Trägermaterial zur Umsetzung mit der Germaniumverbindung, vorzugsweise einem Germanium-Halogenid, in einem organi­ schen Lösungsmittel suspendiert wird.
17. Verwendung von Polyvinylalkohol-Trägermaterialien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, oder von Poly­ vinylalkohol-Trägermaterialien, die nach einem oder mehre­ ren der Verfahren 11-16 hergestellt sind, als Nucleinsäu­ ren-bindende Matrix zur Isolierung und/oder zur Reinigung von Nucleinsäuren.
18. Verwendung von Polyvinylalkohol-Trägermaterialien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, oder von Polyvinylalkohol-Trägermaterialien, die nach einem oder mehreren der Verfahren 11-16 hergestellt sind, als Nuclein­ säuren-bindende Matrix zur Isolierung und/oder zur Reini­ gung von Nucleinsäuren aus komplexen Ausgangsmaterialien oder Gemischen, welche vorzugsweise aus Blut, Serum, buffy coat, pflanzlichen oder tierischen Zellen oder Geweben, Pilzen, Bakterien oder Viren oder einem anderen biologi­ schen Material erhalten werden.
19. Verwendung von Polyvinylalkohol-Trägermaterialien nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, oder von Polyvinylalkohol-Trägermaterialien, die nach einem oder mehreren der Verfahren 11-16 hergestellt sind, als Nuclein­ säuren-bindende Matrix zur Isolierung und/oder zur Reini­ gung von Nucleinsäuren aus Gemischen, Lösungen oder Suspen­ sionen, die eine oder mehrere chemisch oder enzymatisch mo­ difizierte, synthetisierte oder synthetisch amplifizierte Nucleinsäuren enthalten.
20. Verfahren zur Isolierung und/oder Reinigung von Nucle­ insäuren oder Nucleinsäurederivaten aus komplexen Ausgangs­ materialien oder Gemischen, wobei die Nucleinsäure(n) oder Nacleinsäurederivat(e) reversibel an ein festes Trägermate­ rial gebunden wird/werden, dadurch gekennzeichnet, daß als festes Trägermaterial ein magnetisches oder magnetisierba­ res Polyvinylalkohol-Trägermaterial nach einem oder mehre­ ren der Ansprüche 1 bis 10, oder ein nach einem oder mehre­ ren der Verfahren 11-16 hergestelltes Polyvinylalkohol- Trägermaterial verwendet wird.
21. Verfahren zur Isolierung und/oder Reinigung von Nucleinsäuren oder Nucleinsäurederivaten aus komplexen Aus­ gangsmaterialien oder Gemischen, wobei
in einem ersten Schritt ein magnetisches oder magneti­ sierbares, Nucleinsäure-bindendes, festes Trägermaterial mit dem Ausgangsmaterial oder Gemisch in Kontakt gebracht wird oder damit vermischt wird, wobei die Nucleinsäure(n) oder Nucleinsäurederivat(e) reversibel an das feste Trä­ germaterial gebunden wird/werden, und
in einem zweiten Schritt die an das Trägermaterial gebun­ dene(n) Nucleinsäuren gewaschen werden, und
in einem dritten Schritt die an das feste Trägermaterial gebundene(n) Nucleinsäure(n) von diesem Trägermaterial eluiert oder freigesetzt werden,
dadurch gekennzeichnet, daß als festes Trägermaterial ein magnetisches oder magnetisierbares Polyvinylalkohol-Trä­ germaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, oder ein nach einem oder mehreren der Verfahren 11-16 hergestelltes Polyvinylalkohol-Trägermaterial verwendet wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die genannten, Nucleinsäuren oder Nucleinsäu­ rederivate enthaltenden komplexen Ausgangsmaterialien oder Gemische vorzugsweise aus Blut, Serum, buffy coat, pflanz­ lichen oder tierischen Zellen oder Geweben, Pilzen, Bakte­ rien oder Viren oder einem anderen biologischen Material erhalten werden, wobei die genannten biologischen Materia­ lien zur Nucleinsäure-Isolierung bzw. -Reinigung aufge­ schlossen werden.
23. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die genannten Ausgangsmaterialien oder Gemi­ sche eine oder mehrere chemisch oder enzymatisch modifi­ zierte, synthetisierte oder synthetisch amplifizierte Nucleinsäuren enthalten.
24. Ein Kit zur Isolierung und/oder Reinigung von Nuclein­ säuren, welcher ein Trägermaterial zur reversiblen Bindung von Nucleinsäuren sowie Lösungen und/oder Reagenzien zur Durchführung der Isolierung und/oder Reinigung enthält, da­ durch gekennzeichnet, daß der Kit als Trägermaterial ein magnetisches oder magnetisierbares Polyvinylalkohol-Träger­ material nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, oder ein nach einem oder mehreren der Verfahren 11-16 her­ gestelltes Polyvinylalkohol-Trägermaterial enthält.
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