DE10100122A1 - Verfahren zur Bestimmung der Hautalterung in vitro - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstresses und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung des Hautstresses und/oder der Hautalterung sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß
und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro, Test-Kits und Biochips zur
Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung sowie die Verwendung
von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-
Molekülen als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut; ferner ein Testverfah
ren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung sowie ein Screening-
Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstof
fen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung und ein Verfahren zur Herstellung
einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß
und/oder Hautalterung.
Die menschliche Haut ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus
einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht. Der Metabolismus der lebenden
Zellen ist nicht statisch sondern sehr dynamisch. In der Haut bemerken Zellen
Veränderungen ihrer Umgebung (z. B. die Einstrahlung von Sonnenlicht) und
reagieren darauf mit der Umstellung ihrer RNA- und/oder Proteinsyntheselei
stungen.
Einige Moleküle werden nach einem Stresstimulus (z. B. Sonnenlicht) vermehrt
synthetisiert (z. B. MMP-1), andere wiederum werden in einem geringerem Um
fang produziert (z. B. Kollagen α1 (I)). Weiterhin wird bei einer Vielzahl der Syn
theseprozesse keine signifikante Veränderung erfolgen (z. B. TIMP-1).
Die Reaktionen der Haut auf Stress dürfen nicht als Reaktionen einzelner, iso
lierter Hautzellen betrachtet werden. Vielmehr ist jede Zelle in ein komplexes
Kommunikationsnetzwerk eingebunden. Dieses Netzwerk beinhaltet z. B. die
Kommunikation zwischen Zellen der Epidermis und Zellen der Dermis. An der
Kommunikation zwischen den Zellen der Haut sind Signalmoleküle wie z. B.
Interleukine, Wachstumsfaktoren (z. B. KGF, EGF oder FGF) usw. beteiligt.
Die makroskopischen Phänomene alternder Haut beruhen zum einen auf der
intrinsischen oder chronologischen Alterung (Hautalterung), zum anderen auf
der extrinsischen Alterung durch Umweltstress (Hautstreß). Die Fähigkeit le
bender Hautzellen, auf Ihre Umwelt zu reagieren, verändert sich mit der Zeit -
es finden Alterungsprozesse statt, die zur Seneszenz und letztendlich zum
Zelltod führen. Die sichtbaren Zeichen gealterter Haut sind als Integral der
intrinsischen und der extrinsischen Alterung (z. B. durch Sonnenlicht) zu verste
hen, wobei die Ereignisse der extrinsischen Alterung über einen längeren Zeit
raum in der Haut akkumulieren.
Diese Einzelereignisse können direkte Reaktionen von Hautzellen auf den
Streßstimulus oder indirekte Reaktionen aufgrund eines Signals (z. B. Interleu
kine oder Wachstumsfaktoren) benachbarter, gestresster Zellen sein.
Effektive Anti-Ageprodukte zeigen ihre Wirkung auf ein möglichst breites Spek
trum molekularer Einzelereignisse der extrinsischen Hautalterung. Bisher sind
jedoch nur wenige solcher Ereignisse in lebenden Hautzellen bekannt, die als
Marker gestresster Haut und somit zur Wirksamkeitsüberprüfung von Antiage-
Produkten dienen können.
Die Identifikation neuer stressinduzierter Hautreaktionen ermöglicht es, den
komplexen Prozess der Hautalterung und seine kausalen Zusammenhänge zu
begreifen.
Mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische oder pharmazeuti
sche Antiage-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite Spek
trum der Alterungsprozesse in der Haut ausüben.
Jeder Zelltyp der Haut synthetisiert ca. 15.000 verschiedene Proteine. Welche
Proteine davon für die intrinsische und/oder extrinsische Hautalterung eine
Rolle spielen ist bisher weitgehend unklar.
Erschwerend kommt hinzu, dass die Haut aus mehreren verschiedenen Zellty
pen (Fibroblasten, Keratinozyten in verschiedenen Differenzierungszuständen,
Melanozyten, Langerhanszellen Haarfollikelzellen, Schweißdrüsenzellen etc.)
besteht und somit die Komplexität in der Haut produzierter Proteingemische
sehr groß ist.
Es ist bisher nicht möglich gewesen, aus dieser immensen Komplexität die
Proteine zu identifizieren, die mit der Hautalterung in kausalem Zusammenhang
stehen.
Ein Verständnis der komplexen Alterungsprozesse in der Haut durch die Identi
fikation stressregulierter Markerproteine gestattet die gezielte Suche nach Sub
stanzen oder Kombinationen von Substanzen mit einem breiten Antiage-
Wirkspektrum.
Produktkonzepte dieser Art konnten jedoch bis zu dem jetzigen Zeitpunkt nicht
entwickelt werden, da eine Vielzahl der Markerproteine für die Hautalterung
noch nicht bekannt waren.
Ein erhebliches Problem bei der Identifikation von Markern der Hautalterung ist
die komplexe Zusammensetzung der Haut aus verschiedenen Zelltypen. Dieses
Problem kann minimiert werden indem man sich für die Identifikation hautrele
vanter Altersmarker auf einzelne Zelltypen der Haut beschränkt. Dabei wird
jedoch außer Acht gelassen, dass auch Zellen die nicht direkt einem Streßsti
mulus ausgesetzt waren, durch die Kommunikation mit benachbarten, gestress
ten Zellen extrinsisch altern.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, für die Hautalterung und/oder
den Hautstreß charakteristische Marker und die für diese kodierenden Gene
auch aus solchen Hautschichten bzw. Hautzellen zu identifizieren, die nicht
direkt, sondern indirekt (durch Kommunikation mit benachbarten, gestressten
Zellen) extrinsisch altern. Außerdem sollen mittels der identifizierten Marker
bzw. Gene Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalte
rung bereitgestellt werden.
Diese erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur
Identifizierung von für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen
Markern bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) Menschliche Haut, ein Vollhautmodell oder gentechnisch humanisierte Haut eines Tieres einem Streßstimulus aussetzt,
- b) Ein erstes Gemisch von translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus der in a) gestressten Haut gewinnt,
- c) ein zweites Gemisch von translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus nicht gestresster menschlicher Haut, einem nicht gestressten Vollhautmodell oder nicht ge stresster gentechnisch humanisierter Haut eines Tieres gewinnt,
- d) die in b) und c) gewonnenen Gemische einer Analyse der translatierten genetisch codierten Faktoren unterwirft, und durch den Vergleich der Ergeb nisse dieser Analyse die Faktoren identifiziert, die in gestreßter bzw. alter und ungestreßter bzw. junger Haut unterschiedlich stark produziert werden.
Ein in Schritt a) vorteilhaft einsetzbares Vollhautmodell ist beispielsweise von
der Firma CellSystems® Biotechnologie Vertrieb GmbH aus D-53562 St. Katha
rinen unter der Bezeichnung Haut-Testsystem AST-2000 erhältlich.
Ein geeignetes Vollhautmodell besteht aus dermalen und epidermalen Kompo
nenten und ist daher mit der natürlichen Haut physiologisch vergleichbar. Das
Hautäquivalent besteht aus dermalen Fibroblasten (Unterhaut) und einer mehr
schichtigen Epidermis mit Verhornungsschicht (stratum corneum). Dieses
Hautmodell kommt in seiner Struktur und Funktion der lebenden, natürlichen
Haut sehr nahe.
Geeignete Streßstimuli können beispielsweise sein:
- - UV-Licht, insbesondere UV-A (320-400 nm), beispielsweise in einer Do sis von etwa 10 J/cm2 oder UV-B (280-320 nm), beispielsweise in einer Dosis von etwa 360 mJ/cm2
- - Sonnenlicht, grundsätzlich das gesamte solare Strahlungsspektrum. Man kann aber auch ein Teilspektrum zur Quantifizierung heranziehen, z. B. durch
- - Bestrahlung mit Sonnenlicht entsprechend einer Dosis UV-A von etwa 10 J/cm2 oder
- - Bestrahlung mit etwa ¼ bis < 1,0 MED (Minimale Erythemale Do sis)
- - Hitze, im Temperaturbereich von etwa < 37°C bis 44°C für etwa 1-60 min
- - Chemische Reizung durch Oxidantien, Reizende Chemikalien (z. B.: SDS = sodium dodecyl sulfate), Ozon, Schwefeldioxid, Stickoxide, Reaktive Sauerstoffspezies (Sauerstoffradikal; Superoxidanion, Wasserstoffpero xid etc.)
Vorzugsweise führt man die Analyse in d) mittels Ein- oder zweidimensionaler
Gelelektrophorese und nachfolgender Massenspektrometrie, insbesondere
Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) durch.
Überraschenderweise wurde mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
gefunden, daß die Proteine Stratifin (14-3-3, σ-Isoform), HSP27 (Heat shock
protein 27 kDa) und GRP78/BiP von menschlicher Haut streßinduzierbar pro
duziert werden, d. h. gestreßte Haut produziert diese Proteine in erheblich grö
ßerer Menge, als nicht gestreßte Haut. Außerdem wurde überraschenderweise
gefunden, daß gestreßte Haut phosphorylierte, insbesondere hyperphosphory
lierte Isoformen des HSP27 (Heat shock protein 27 kDa) in erheblich größerer
Menge produziert, als nicht gestreßte Haut. Die für gestreßte bzw. nicht ge
streßte Haut jeweils charakteristische Menge der genannten Proteine, das
Verhältnis der produzierten Mengen zueinander sowie das Vorhandensein bzw.
Fehlen der phosphorylierten Isoformen des HSP27 ergeben zusammenge
nommen ein für gestreßte bzw. ungestreßte Haut charakteristisches Translati
onsprofil.
Die zweite der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird daher
erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß
und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß
man
- a) ein Gemisch von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus menschli cher Haut gewinnt,
- b) das Gemisch auf das Vorhandensein und die Menge von Stratifin (14-3-3, σ- Isoform), GRP78/BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylier ten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27 oder von Fragmenten dieser Proteine untersucht und
- c) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es hinsichtlich der in b) aufgeführten Proteine ein für alte bzw. gestreßte Haut charakteristisches Translationsprofil aufweist; oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es hinsichtlich der in b) aufgeführten Proteine ein für junge bzw. ungestreßte Haut charakteri stisches Translationsprofil aufweist.
Ein für alte Haut charakteristisches Translationsprofil liegt vor, wenn das Ge
misch entweder mehr unterschiedliche typischerweise in alter Haut translatierte
Verbindungen enthält, als solche, die typischerweise in junger Haut exprimiert
werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise in
alter Haut exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in junger Haut
vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu junger
bzw. ungestreßter Haut wird in komplementärer Weise verfahren.
Ein charakteristisches Translationsprofil liegt auch dann vor, wenn mehrere
Marker (Translatioprodukte der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß
bedeutsamen Gene) quantifiziert werden, die dann untereinander in einem
charakteristischen Verhältnis vorhanden sein müssen, um junge Haut zu reprä
sentieren, bzw. in einem hiervon verschiedenen charakteristischen Verhältnis
vorhanden sein müssen, um alte Haut zu repräsentieren.
Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung das Gemisch aus einer
Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermis
probe. Hierbei eröffnet die Vollhautprobe umfassendere Vergleichsmöglichkei
ten mit den gleichfalls auf Vollhaut oder auf entsprechende in vitro- oder Tier
modelle bezogenen Translationsprofilen. Die Epidermisprobe ist hingegen leich
ter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes auf die
Haut und Abreißen desselben, wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die
hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung gewinnt man in Schritt a)
das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispiels
weise in "Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism",
Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735-
8; sowie in "Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption stu
dies", Anderson, C. et al.; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; und auch im
Internet unter http:/ /www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf
hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in
die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam
zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich
liefert die Mikrodialyse Proteine oder Fragmente von Proteinen, die im extrazel
lulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der
Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mi
krodialyse ist weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist
aber nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkom
mender Verbindungen beschränkt.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des
Hautstreß und/oder der Hautalterung so durchgeführt, daß man die Untersu
chung auf das Vorhandensein und die Menge von Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylierten, insbeson
dere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27 oder von Fragmenten dieser
Proteine durch Separation der Proteine mittels Gelelektrophorese und nachfol
gende Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorpti
ons Ionisation (MALDI) vornimmt.
Besonders bevorzugt erfolgt die Separation der Proteine durch 2D-
Gelelektrophorese, wie beispielsweise in L. D. Adams, Two-dimensional Gel
Electrophoresis using the Isodalt System oder in L. D. Adams & S. R. Gallagher,
Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Cur
rent Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F. M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1
-10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt;
Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die Gewinnung der Proteine erfolgt vorzugsweise durch Proteinpräzipitation,
beispielsweise mit Methanol/Chloroformgemisch im Verhältnis von etwa 4 : 1 : 4
zur Probe und/oder durch Aufkonzentrierung der Proteine, beispielsweise durch
Ultrafiltration mit einem Cut off von etwa 5.000 Da, z. B. mittels der Vivaspin-
Produkte der Fa. Sartorius.
Das so erhaltene Konzentrat bzw. Präzipitat kann dann in dem Fachmann be
kannter Weise in Rehydratisierungspuffer aufgenommen werden, beispielswei
se, wie in "2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients. Principles and
methods", Berkelman, T. and Stenstedt, T (eds); Amersham Pharmacia Biotech
Inc (1998) 80-6429-60; beschrieben.
Die erfindungsgemäß bevorzugte Separation der Proteine durch 2-
Dimensionale Gelelektrophorese kann beispielsweise so erfolgen, daß man in
der ersten Dimension eine isoelektrische Fokussierung vornimmt, beispielswei
se unter Verwendung von Immobilin DryStrips mit einem immobilisierten pH-
Gradienten (IPG) von 4 bis 7 der Fa. Amersham-Pharmacia oder unter Ver
wendung von Carrierampholyt tragenden Polyacrylamid-Gelstreifen, die im
elektrischen Feld einen pH-Gradienten aufbauen (O'Farrell, P. H.; 1975; J Biol.
Chem. 250, 4007-4021) und in der zweiten Dimension eine SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese, z. B. mit 12.5%tigem Polyacrylamid bei 30 mA für 3 bis 4 h
vornimmt.
Die Gelfärbung kann nach üblichen Methoden, beispielsweise durch Silberfär
bung nach Heukeshoven oder durch Colloidal Coomassieblaufärbung erfolgen.
Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine erfolgt in der
Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen
beschrieben:
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology;
Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte
Methoden zur Analyse bzw. zum Nachweis der oben genannten Proteine oder
Proteinfragmente eingesetzt werden, insbesondere Methoden, die auf der spezifischen
Bindung von Antikörpern an Proteine beruhen, beispielsweise Radio
immunoassays und auf Immunofluoreszenz basierende Nachweisverfahren.
Ein weiteres besonders bevorzugtes Verfahren zum Nachweis der oben ge
nannten Proteine oder Proteinfragmente ist der Einsatz eines Proteinchip.
Stratifin gehört zu der großen Familie der 14-3-3-Proteine. Einige Mitglieder
dieser Proteinfamilie werden ubiquitär exprimiert (z. B. die ξ-Isoform), während
z. B. die τ-Isoform spezifisch in T-Zellen vorkommt. Eine spezifisch in stratifizier
ten Epithelien (z. B. in der Epidermis) produzierte Form des 14-3-3-Proteines ist
das Stratifin (die σ-Isoform). Eine herausragende Eigenschaft aller 14-3-3-
Proteine ist deren Fähigkeit an verschiedene, funktionell unterschiedliche Si
gnalproteine, wie z. B. Kinasen, Phosphatasen oder Transmembranrezeptoren,
zu binden. Eine wichtige biologische Funktion von Stratifin wurde entdeckt, als
das Wachstum colonrectaler Karzinomazellen mit γ-Strahlen inhibiert wurde
(Hermeking, H. et al., 1997, Mol. Cell. 1, 3-11) Einige der Zellen stoppten ihr
Wachstum in der G1-Phase des Zellzyklus, während andere in der G2-Phase
arretiert wurden. Beide Varianten des Wachstumarrests sind an die vermehrte
Produktion des Transkriptionsfaktors p53 gekoppelt. Exogener Stress, wie z. B.
γ-Strahlung oder UV-Strahlung führt zu einer Induktion des Gens für p53. Der
Transkriptionsfaktor p53 bindet dann an die Promotoren der Gene für Stratifin
und p21 und aktiviert deren Transkription. Während p21 am Wachstumsstopp in
der G1-Phase beteiligt ist, führt Stratifin zum Wachstumsarrest in der G2-
Phase. Der Wachstumsarrest sich teilender Zellen ist eine notwendige Voraus
setzung für deren Differenzierung. Wachstum und Differenzierung sind also
zwei gegenläufige Prozesse die sich gegenseitig ausschließen.
Die exakte Regulation dieser Prozesse ist insbesondere in der Haut von ent
scheidender Bedeutung. Die Epidermis ist ein Teil der Haut, welcher sich konti
nuierlich erneuert. Im Stratum basale, der tiefsten Schicht der Epidermis, befin
den sich teilungsfähige Keratinozyten. Diese Zellen wandern langsam in höhere
Schichten der Epidermis und differenzieren dabei zu den Corneozyten des
Stratum corneum.
An diesem Differenzierungsprozess kann Stratifin maßgeblich beteiligt sein.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Stratifin" ein Protein mit der
Aminosäurensequenz (A)
verstanden, sowie Proteine, die mehr als 40%, insbesondere mehr als 60%,
besonders bevorzugt mehr als 80% Sequenzhomologie mit dieser Sequenz
aufweisen. Die Aminosäuresequenz (A) ist in der Proteindatenbank des Natio
nal Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Nummer 5454052
offenbart. Über einen direkten Link ist dort auch die Sequenz der entsprechen
den mRNA offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse
zugänglich: http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt "Stratifin" auch solche Proteine,
deren Aminosäuresequenzen durch konservative Mutationen, also durch den
Austausch strukturell oder funktionell ähnlicher Aminosäuren, aus der oben
aufgeführten Sequenz (A) erhalten werden können.
Jede lebende Zelle ist kontinuierlich einem gewissen Maß an Stress ausge
setzt. Im Laufe der Evolution wurden jedoch Mechanismen entwickelt, die es
Zellen erlauben dem Stress entgegenzuwirken. Ein großes stressbedingtes
Problem einer jeden Zelle sind Proteine, die eine falsche Tertiärstruktur haben,
also nicht korrekt gefaltet sind. Dies ist insbesondere unter erhöhter Energie
einwirkung wie z. B. durch Strahlung oder Temperatur der Fall. Die Qualitäts
kontrolle neu produzierter Proteine ist daher für das Überleben von Organismen
von entscheidender Bedeutung. An dieser Qualitätskontrolle sind Glukose
regulierte Proteine (GRP's) wie z. B. GRP78/BiP und Heat shock Proteine wie
z. B. HSP27 entscheident beteiligt. Diese Proteine vermitteln lebenden Zellen in
gewissem Maße eine Resistenz gegen sublethale Stressbedingungen.
Die Ansammlung nicht korrekt gefalteter Proteine im Endoplasmatischen Reti
culum (ER) führt zur Aktivierung eines Signaltransduktionswegs vom ER in den
Nukleus der Zelle (unfolded protein response; UPR). Im Kern der Zelle werden
Gene aktiviert, deren Produkte im Endoplasmatischen Reticulum (ER) korrekte
Proteinfaltungen unterstützen (Chaperone). Zu diesen Chaperonen gehört
GRP78/BiP. Die Bindung von GRP78/BiP z. B. an naszierende Proteine im ER
verhindert die Akkumulation denaturierter, also entfalteter Proteine. Mit dem
Ende der Stressbedingungen kann GRP78/BiP von den gebundenen Proteinen
in einer-ATP-abhängigen Reaktion dissoziieren, sodass diese dann korrekt
gefaltet werden können. Ein weitere Mechanismus beinhaltet die gezielten
Degradation GRP78/BiP-gebundener Proteine über den Ubiquitin/Proteasom-
Weg. Weiterhin ist HSP27 an der Regulation des Zytoskeletts, insbesondere
der Actin-Polymerisation, beteiligt.
Die Bestrahlung humaner Ganzhautmodelle mit simuliertem Sonnenlicht führte
in Experimenten der Anmelderin ebenfalls zu Induktion der HSP27-Synthese.
Dabei konnten mehrere HSP-27-Isoformen detektiert werden, die unterschied
liche isoelektrische Punkte aufwiesen. Diese Unterschiede entstehen durch
Phosphorylierungen des Proteins an Serinresten, die zwei Aminosäuren nach
einem Arginin im Molekül vorkommen. Neben den in der Literatur beschriebe
nen mono- und bi-phosphorylierten Isoformen von HSP27 konnten weiterhin
hyperphosphorylierte Moleküle detektiert werden. Die Phosphorylierung von
HSP27 kann ebenso wie seine Synthese durch die Zugabe des Zytokins Inter
leukin-1 induziert werden. Dieses Zytokin ist bekannt dafür (Wlaschek et al.
1997, FEBS Letters 413; 239-242), daß es durch UV-Licht induziert wird und an
der verstärkten Produktion der Matrix-Metalloprotease-1 (ein Markerprotein
photogealterter Haut), beteiligt ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "GRP78/BiP" ein Protein mit
der Aminosäurensequenz (B)
verstanden, sowie Proteine, die mehr als 40%, insbesondere mehr als 60%,
besonders bevorzugt mehr als 80% Sequenzhomologie mit dieser Sequenz
aufweisen. Die Aminosäuresequenz (B) ist in der Proteindatenbank des Natio
nal Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Nummer 6900104
offenbart. Über einen direkten Link ist dort auch die Sequenz der entsprechen
den mRNA offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse
zugänglich: http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt "GRP78/BiP" auch solche Pro
teine, deren Aminosäuresequenzen durch konservative Mutationen, also durch
den Austausch strukturell oder funktionell ähnlicher Aminosäuren, aus der oben
aufgeführten Sequenz (B) erhalten werden können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "HSP27" ein Protein mit der
Aminosäurensequenz (C)
verstanden, sowie Proteine, die mehr als 40%, insbesondere mehr als 60%,
besonders bevorzugt mehr als 80% Sequenzhomologie mit dieser Sequenz
aufweisen. Die Aminosäuresequenz (C) ist in der Proteindatenbank des Natio
nal Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Nummer 4504517
offenbart. Über einen direkten Link ist dort auch die Sequenz der entsprechen
den mRNA offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse
zugänglich: http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt "HSP27" auch solche Proteine,
deren Aminosäuresequenzen durch konservative Mutationen, also durch den
Austausch strukturell oder funktionell ähnlicher Aminosäuren, aus der oben
aufgeführten Sequenz (C) erhalten werden können.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Be
stimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro,
umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur
Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur Be
stimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro,
umfassend
- a) einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und
- b) auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an
mindestens eines der Moleküle befähigt sind, die ausgewählt sind un
ter:
- - Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
- - GRP78/BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- - phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isofor men des HSP27,
- - Fragmenten dieser Proteine,
- - für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
- - Fragmenten dieser mRNA-Moleküle.
Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit
auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen,
die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf;
man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. bio
chemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können,
müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden.
Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in
Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten
können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon
vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezepto
ren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle).
Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit
biologisch oder biochemisch funktionellen Materialien. Die Basisflächen können
beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanä
len gebildet sein.
Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen
werden: Nature Genetics, Vol. 21, supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips);
Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in
Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die Übersichts
artikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes
and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), und "Ge
nomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788,
827-836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in
vollem Umfang Bezug genommen wird.
Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der
DNA-Chiptechnologie liefern die Bücher "DNA Microarrays: A Practical Appro
ach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und "Microarray
Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die
hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA-
Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre
Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete techni
sche Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot-
Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei de
nen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA-
Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu
untersuchen.
Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z. B. Glas
oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher
Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch
wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden-
Immobilisierung eingeschätzt.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden-
Immobilisierung realisiert:
E. M. Southern (E. M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679- 1684 und E. M. Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Syn these an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.
E. M. Southern (E. M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679- 1684 und E. M. Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Syn these an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.
Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden
mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithogra
phischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A. C. et al. (1994), Proc.
Natl Acad Sci USA 91, 5022-5026).
Neben diesen auf der in situ-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Tech
niken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von
Trägermaterial gebunden werden.
P. O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) beschreibt die Immobi
lisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen.
Die Veröffentlichung von L. M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Re
search 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die
eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebun
den werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4-
Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde.
Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenann
ten "Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z. B. einem
Durchmesser von 250 µm, in Sondenlösungen ein und überführen anschlie
ßend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trä
germaterial des DNA-Chips.
Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezoge
steuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlö
sungen mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche
des Trägermaterials aufbringt.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z. B. wie in der EP-A-0 965 647 be
schrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter
Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'-
Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit
ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glas
oberfläche gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan
und anschließend mit 1,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspe
zifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäuresequenz
in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen
beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisier
ten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei
96°C für 10 Min entfernt.
In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu verglei
chenden Zeilpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser
Transkription unter Verwendung von z. B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in
cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z. B. rot
bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit
den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschlie
ßend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, insbeson
dere 1 bis etwa 1000, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 500, besonders bevor
zugt etwa 10 bis etwa 250, in besonderem Maße bevorzugt etwa 10 bis etwa
100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschie
dene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehr
facher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbe
sondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die
Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000,
insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600,
besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf.
In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip
Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von
Molekülen, die ausgewählt sind unter:
- - Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
- - GRP78/BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- - phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isofor men des HSP27,
- - Fragmenten dieser Proteine,
- - für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
- - Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum
Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstof
fen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestim mung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines er findungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt,
- b) einen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und
- d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Zur Beschleunigung des Testverfahrens ist es auch möglich, verschiedene
Wirkstoffe oder Placebos parallel auf verschiedene Hautareale aufzubringen;
beispielsweise einen Wirkstoff auf den linken Unterarm und ein Placebo auf den rechten Unterarm, oder umgekehrt.
beispielsweise einen Wirkstoff auf den linken Unterarm und ein Placebo auf den rechten Unterarm, oder umgekehrt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nach
weis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen
gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, umfassend Mittel zur Durchfüh
rung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von
Molekülen, die ausgewählt sind unter:
- - Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
- - GRP78/BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- - phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isofor men des HSP27,
- - Fragmenten dieser Proteine,
- - für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
- - Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-
Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstof
fen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungs gemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalte rung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt,
- b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung ein mal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Be stimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines er findungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und
- d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von
Molekülen, die ausgewählt sind unter:
- - Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
- - GRP78/BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- - phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isofor men des HSP27,
- - Fragmenten dieser Proteine,
- - für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
- - Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen
Hautstreß und/oder Hautalterung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her
stellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Haut
streß und/oder Hautalterung, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalte rung bestimmt und
- b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Claims (23)
1. Verfahren zur Identifizierung von für die Hautalterung und/oder den Haut
streß bedeutsamen Markern bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeich
net, daß man
- a) Menschliche Haut, ein Vollhautmodell oder gentechnisch humanisierte Haut eines Tieres einem Streßstimulus aussetzt,
- b) Ein erstes Gemisch von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus der in a) gestressten Haut gewinnt,
- c) ein zweites Gemisch von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus nicht gestresster menschlicher Haut, einem nicht gestressten Vollhaut modell oder nicht gestresster gentechnisch humanisierter Haut eines Tie res gewinnt,
- d) die in b) und c) gewonnenen Gemische einer Analyse der Proteine oder Proteinfragmente unterwirft, und durch den Vergleich der Ergebnisse dieser Analyse die Faktoren identifiziert, die in gestreßter bzw. alter und ungestreßter bzw. junger Haut unterschiedlich stark produziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Analy
se in Schritt d) durch Separation der Proteine mittels Gelelektrophorese
und nachfolgende Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter
Laser Desorptions Ionisation (MALDI), durchführt.
3. Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei
Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) ein Gemisch von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus mensch licher Haut gewinnt,
- b) das Gemisch auf das Vorhandensein und die Menge von Stratifin (14-3- 3, σ-Isoform), GRP78/BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27 oder von Fragmenten dieser Proteine untersucht und
- c) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es hinsichtlich der in b) aufgeführten Proteine ein für alte bzw. ge streßte Haut charakteristisches Translationsprofil aufweist; oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es hinsichtlich der in b) aufgeführten Proteine ein für junge bzw. ungestreß te Haut charakteristisches Translationsprofil aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt
b) auf das Vorhandensein und die Menge von Stratifin oder einem Frag
ment davon untersucht, das durch die Aminosäuresequenz (A)
gekennzeichnet ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt
b) auf das Vorhandensein und die Menge von GRP78/BiP oder einem
Fragment davon untersucht, das durch die Aminosäuresequenz (B) ge
kennzeichnet ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt
b) auf das Vorhandensein und die Menge von HSP27 oder einem Frag
ment davon untersucht, das durch die Aminosäuresequenz (C) gekenn
zeichnet ist:
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt
b) auf das Vorhandensein und die Menge von hyperphosphorylierten Iso
formen des HSP27 oder Fragmenten davon untersucht.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Analyse in Sehritt d) durch Separation der Proteine mittels
Gelelektrophorese und nachfolgende Massenspektrometrie, insbesondere
Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI), durchführt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man in Schritt a) das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere
aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe gewinnt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse gewinnt.
11. Test-Kit zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei
Menschen in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens
nach einem der Ansprüche 3 bis 10.
12. Biochip zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei
Menschen in vitro, umfassend
- a) einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und
- b) auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an min
destens eines der Moleküle befähigt sind, die ausgewählt sind unter:
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle.
13. Biochip nach Anspruch 12, umfassend 1 bis etwa 5000, insbesondere 1
bis etwa 1000, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 500, besonders bevorzugt
etwa 10 bis etwa 250, in besonderem Maße bevorzugt etwa 10 bis etwa
100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander ver
schiedene Sonden.
14. Biochip nach Anspruch 12 oder 13, umfassend Nukleinsäuresonden, ins
besondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.
15. Biochip nach Anspruch 14, umfassend Sonden mit einer Länge von etwa
10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa
100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleoti
den.
16. Biochip nach Anspruch 12 oder 13, umfassend Peptid- oder Proteinson
den, insbesondere Antikörper.
17. Verwendung von Molekülen, die ausgewählt sind unter:
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen.
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen.
18. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder
pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in
vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 11, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bestimmt,
- b) einen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 11, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bestimmt, und
- d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
19. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharma
zeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro,
umfassend Mittel zur Durchführung des Testverfahrens nach Anspruch 18.
20. Verwendung von Molekülen, die ausgewählt sind unter:
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
1. Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeu
tischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, da
durch gekennzeichnet, daß man
- a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 11, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bestimmt,
- b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 11, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bestimmt, und
- d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
22. Verwendung von Molekülen, die ausgewählt sind unter:
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
23. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen
Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, dadurch
gekennzeichnet, daß man
- a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 21, oder der Verwendung nach Anspruch 22 bestimmt und
- b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| DE10100122A DE10100122A1 (de) | 2001-01-03 | 2001-01-03 | Verfahren zur Bestimmung der Hautalterung in vitro |
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| AU2002219190A AU2002219190A1 (en) | 2001-01-03 | 2001-12-14 | Method for determining skin ageing in vitro |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10100122A DE10100122A1 (de) | 2001-01-03 | 2001-01-03 | Verfahren zur Bestimmung der Hautalterung in vitro |
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|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE10100122A Ceased DE10100122A1 (de) | 2001-01-03 | 2001-01-03 | Verfahren zur Bestimmung der Hautalterung in vitro |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2847268A1 (fr) * | 2002-11-19 | 2004-05-21 | Coletica | Procede d'identification d'une modification eventuelle d'au moins un parametre biologique mettant en oeuvre des cellules vivantes soumises a un stress et des cellules vivantes non soumises a ce meme stress |
| DE10320602A1 (de) * | 2002-11-19 | 2004-06-09 | Coletica | Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von jungen und alten lebenden Zellen |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2924613B1 (fr) * | 2007-12-10 | 2012-12-21 | Oreal | Utilisation cosmetique de proteines de type hsp27. |
| JP5653684B2 (ja) * | 2010-08-21 | 2015-01-14 | 日本メナード化粧品株式会社 | 皮膚損傷の程度を検査する方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4603146A (en) * | 1984-05-16 | 1986-07-29 | Kligman Albert M | Methods for retarding the effects of aging of the skin |
| DE19742025A1 (de) * | 1997-09-24 | 1999-03-25 | Beiersdorf Ag | Verwendung von Flavonen und Flavonoiden zur Hautaufhellung oder zur Verhinderung der durch oxidative Proteinaggregation hervorgerufenen Altersflecken |
| DE69131692T2 (de) * | 1991-05-16 | 2000-03-16 | Senetek, Plc | Verfahren und zusammensetzung zur verbesserung der ungünstigen auswirkungen des alterns |
| DE69423911T2 (de) * | 1993-12-15 | 2000-08-03 | Avon Products, Inc. | Neue retinoidkonjugate zur behandlung von alterserscheinungen der haut |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2950519B2 (ja) * | 1991-02-28 | 1999-09-20 | アンティキャンサー インコーポレイテッド | 皮膚の未変性状態組織培養法 |
| JP2002504812A (ja) * | 1997-05-21 | 2002-02-12 | クローンテック ラボラトリーズ，インコーポレイテッド | 核酸アレイ |
| EP1051624A4 (de) * | 1998-01-29 | 2002-05-02 | Glaucus Proteomics B V | Hochdichte matrizen zur proteomanalyse und verfahren und zusammensetzungen dafür |
-
2001
- 2001-01-03 DE DE10100122A patent/DE10100122A1/de not_active Ceased
- 2001-12-14 WO PCT/EP2001/014812 patent/WO2002054078A2/de not_active Ceased
- 2001-12-14 AU AU2002219190A patent/AU2002219190A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4603146A (en) * | 1984-05-16 | 1986-07-29 | Kligman Albert M | Methods for retarding the effects of aging of the skin |
| DE69131692T2 (de) * | 1991-05-16 | 2000-03-16 | Senetek, Plc | Verfahren und zusammensetzung zur verbesserung der ungünstigen auswirkungen des alterns |
| DE69423911T2 (de) * | 1993-12-15 | 2000-08-03 | Avon Products, Inc. | Neue retinoidkonjugate zur behandlung von alterserscheinungen der haut |
| DE19742025A1 (de) * | 1997-09-24 | 1999-03-25 | Beiersdorf Ag | Verwendung von Flavonen und Flavonoiden zur Hautaufhellung oder zur Verhinderung der durch oxidative Proteinaggregation hervorgerufenen Altersflecken |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2847268A1 (fr) * | 2002-11-19 | 2004-05-21 | Coletica | Procede d'identification d'une modification eventuelle d'au moins un parametre biologique mettant en oeuvre des cellules vivantes soumises a un stress et des cellules vivantes non soumises a ce meme stress |
| DE10320633A1 (de) * | 2002-11-19 | 2004-06-09 | Coletica | Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt wurden, und lebenden Zellen, die nicht diesem Reiz ausgesetzt wurden |
| DE10320602A1 (de) * | 2002-11-19 | 2004-06-09 | Coletica | Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von jungen und alten lebenden Zellen |
| DE10320633B4 (de) * | 2002-11-19 | 2006-04-13 | Coletica | Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt wurden, und lebenden Zellen, die nicht diesem Reiz ausgesetzt wurden |
| DE10320602B4 (de) * | 2002-11-19 | 2006-05-04 | Coletica | Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von jungen und alten lebenden Zellen |
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