DE10065710A1

DE10065710A1 - Arzneimittel enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz

Info

Publication number: DE10065710A1
Application number: DE10065710A
Authority: DE
Inventors: Tobias Schlapp; Sonja Maria Friederichs; Martin Vollmer
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2000-12-29
Publication date: 2002-07-04
Also published as: CA2433125A1; WO2002053149A3; WO2002053149A2; ZA200304928B; NZ526721A; CN1507349A; EP1392268A2; JP2004520328A; US20040077610A1; BR0116653A; KR20030070085A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel, enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz, sowie die Verwendung eines Polyamins zur Herstellung von immunstimulierenden Arzneimitteln bzw. von Arzneimitteln für die Behandlung und/oder Prophylaxe verschiedener Krankheiten bei Mensch und Tier.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz, sowie die Verwendung eines Polyamins zur Herstellung von immunstimulierenden Arzneimitteln bzw. von Arzneimitteln für die Behandlung und/oder Prophylaxe verschiedener Krankheiten bei Mensch und Tier.

In der tiermedizinischen Praxis wird seit längerer Zeit ein Produkt zur Induktion "paraspezifischer Immunität" - ein sogenannter Immunstimulator oder Paramunitätsinducer - therapeutisch, meta- und prophylaktisch eingesetzt. Immunstimulatoren bestehen z. B. aus chemisch inaktiviertem Parapoxvirus ovis, Stamm D 1701 (DE-A 35 04 940). Ein auf der Basis dieses Virus hergestelltes Produkt ist BAYPAMUN®.

Das inaktivierte Parapoxvirus induziert im Tier einen unspezifischen Schutz gegenüber Infektionen mit den verschiedensten Erregern. Man nimmt an, dass dieser Schutz über verschiedene Mechanismen des Organismus-eigenen Abwehrsystems vermittelt wird.

Zu diesen Mechanismen zählen die Induktion von Interferon, die Aktivierung der natürlichen Killerzellen, die Induktion der "Kolonien-stimulierenden Aktivität" (CAS), sowie die Stimulierung der Lymphozytenproliferation. Frühere Untersuchungen zum Wirkmechanismus zeigten die Stimulation von Interleukin 2 und Interferon-α (Steinmassl & Wolf, 1990).

Darüber hinaus können Immunstimulatoren, wie beispielsweise unmethylierte, CpG-beinhaltende Oligonukleotide (WO 98/18810) zur Aktivierung des nicht-adaptiven Immunsystems und zur Stärkung des Organismus gegen das Auftreten von Krankheitserregern eingesetzt werden. In verschiedenen Mausmodellen konnte bereits experimentell gezeigt werden, dass durch einmalige Gabe die initiale Immunantwort aktiviert und eine Infektion mit verschiedenen Pathogenen verhindert werden kann, so z. B. die Infektion mit Listeria monocytogenes (Elkins et al., 1999; Krieg et al., 1998; Oxenius et al., 1999), Francisella tularensis (Elkins et al., 1999), Leishmania (Walker et al., 1999; Zimmermann et al., 1998), Anthrax, Ebola und Malaria (Krieg, 2000; Klinman et al., 1999).

In der Analyse des Wirkungsmechanismus konnte demonstriert werden, dass sowohl murine B-Zellen, Makrophagen, Dendritische Zellen und NK-Zellen durch die CpG-enthaltenden Oligonukleotide stimuliert werden. Ferner wurde die Induktion der Zytokine IL-18, IL-12 und Interferon-γ demonstriert (Krieg, 2000).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Arzneimittel bereitzustellen, die neue Immunstimulatoren enthalten, welche eine ähnliche Wirksamkeit wie Parapox ovis aufweisen, jedoch chemisch synthetisierbar und daher billiger zu produzieren und leichter mit Chemotherapeutika zu kombinieren sind.

Die Aufgabe wurde gelöst durch die Bereitstellung von Arzneimitteln, die ein Polyamin als Wirksubstanz enthalten.

Das Polyamin kann eine lineare oder verzweigte Struktur aufweisen.

Bevorzugt ist das Polyamin in Wasser löslich oder dispergierbar; in wässrigen Medien erfolgt eine vom pH-Wert abhängige partielle Protonierung. Der Protonierungsgrad lässt sich durch physikalisch-chemische Messmethoden wie beispielsweise Zetapotentialmessungen bestimmen.

Weiterhin bevorzugt weist das Polyamin hydrophobe Substituenten auf.

Die hydrophoben Substituenten können als Seitenketten oder endständig an dem Polymer angeordnet sein. Der Substitutionsgrad (prozentualer Anteil funktionali sierter N-Atome in der Polymerhauptkette) beträgt vorzugsweise zwischen 0,01 und 10 Prozent.

Als hydrophobe Substituenten kommen insbesondere Alkylketten, Acylketten oder Steroid-artige Substituenten in Frage. Besonders geeignet als hydrophobe Substitu enten sind Acylketten. Des Weiteren kommen hydrophobe Substituenten in Frage, die durch Addition der Stickstofffunktionen der Polymerhauptkette an Isocyanate oder an α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen eingeführt werden können.

Besonders bevorzugt stellt das Polyamin ein Polyethylenimin dar.

Ein vorzugsweise für die Arzneimittelherstellung verwendbares Polyethylenimin weist die folgende allgemeine Formel auf:

worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R² Alkyl mit 1 bis 23 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 12 bis 23 Kohlen stoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 17 Kohlenstoffatomen, bedeutet,
und worin
R³ und R⁴ (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R⁵ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH₂, NHR oder NR₂, wobei die Reste R den Endgruppen R³ und R⁴ entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a × P mit 0,001 < a < 0,1, vorzugsweise 0,01 < a < 0,05 und besonders bevorzugt a = 0,03.

Dabei sind die Einheiten m und n keine Blockstrukturen, sondern statistisch im Polymer verteilt.

Ein weiteres vorzugsweise für die Arzneimittelherstellung verwendbares Polyethylenimin weist die folgende allgemeine Formel auf:

worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R² Alkyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 11 bis 22 Kohlen stoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 16 Kohlenstoffatomen, bedeutet,
und worin
R³ und R⁴ (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Acyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, beson ders bevorzugt Acyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R⁵ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH₂, NHR oder NR₂, wobei die Reste R den Endgruppen R³ und R⁴ entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a × P mit 0,001 < a < 0,1, vorzugsweise 0,01 < a < 0,05 und besonders bevorzugt a = 0,03.

worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹, R² und R³ Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten,
und worin
R⁴ und R⁵ (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Gallensäuren bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R⁶ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH₂, NHR oder NR₂, wobei die Reste R den Endgruppen R⁴ und R⁵ entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a × P mit 0,001 < a < 0,1, vorzugsweise 0,01 < a < 0,05 und besonders bevorzugt a = 0,03.

worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹ OR⁴ oder NR⁴R⁵ bedeutet,
wobei
R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 24 Kohlen stoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeuten,
und worin
R² und R³ (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoff atome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R⁶ (Endgruppe) ein von der Abbruchreaktion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH₂, NHR oder NR₂, wobei die Reste R den Endgruppen R² und R³ entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a × p mit 0,001 < a < 0,1, vorzugsweise 0,01 < a < 0,05 und besonders bevorzugt a = 0,03.

worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹ Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Alkyl mit 13 bis 24 Kohlen stoffatomen, besonders bevorzugt Alkyl mit 18 Kohlenstoffatomen, bedeutet,
und worin
R² und R³ (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoff atome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R⁴ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist, beispielsweise Hydroxyl, NH₂, NHR oder NR₂, wobei die Reste R den Endgruppen R² und R³ entsprechen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a × P mit 0,001 < a < 0,1, vorzugsweise 0,01 < a < 0,05 und besonders bevorzugt a = 0,03.

worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit der Rest R entweder Wasserstoff oder ein Rest der Formel

sein kann und worin R^x entweder Wasserstoff oder ebenfalls wieder ein Rest des Typs R sein kann,
und worin jede einzelne [CH₂-CH₂-N]-Einheit und die Endgruppen die vorstehend genannten Substituenten tragen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250, bevorzugt im Bereich 250 bis 2250, besonders bevorzugt im Bereich 500 bis 2050, liegt und n = a × P mit 0,001 < a < 0,1, vorzugsweise 0,01 < a < 0,05 und besonders bevorzugt a = 0,03. Diese Polyethylenimine weisen eine verzweigte bzw. vernetzte Struktur auf.

Vorzugsweise weist das Polymer ein mittleres Molekulargewicht unter 220000 g/mol, besonders bevorzugt ein Molekulargewicht zwischen 2000 und 100000 g/mol, ganz besonders bevorzugt ein Molekulargewicht zwischen 20000 und 100000 g/mol, auf.

Die hydrophoben Gruppen werden in polymeranalogen Reaktionen eingeführt, bei spielsweise durch Alkylierung mit Halogenalkanen, Acylierung mit Carbonsäure chloriden, Acylierung mit Reaktivestern, Michael-Addition an α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen (Carbonsäuren, Carbonsäureamide, Carbonsäureester) oder durch Addition an Isocyanate. Es handelt sich hierbei um literaturbekannte Reak tionstypen (March, 1992).

Die Herstellung der linearen Polyethylenimine erfolgt beispielsweise durch kationi sche Ringöffnungspolymerisation von 2-Ethyloxazolin mit kationischen Initiatoren, vorzugsweise nach einer Vorschrift von B. L. Rivas und S. I. Ananias (1992). Die so erhaltenen Poly(ethyloxazoline) werden quantitativ durch Behandlung mit einer Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Wasser, vorzugsweise einer 1 : 1 Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Wasser, unter Abspaltung von Propan säure in die linearen Polyethylenimine überführt. Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise zwischen 80 und 100°C, besonders bevorzugt bei 100°C. Die Reak tionszeit liegt vorzugsweise zwischen 12 und 30 Stunden, besonders bevorzugt bei 24 Stunden. Die Reinigung des Produkts erfolgt vorzugsweise durch mehrfache Um kristallisation aus Ethanol.

Mit dem beschriebenen Verfahren lassen sich die linearen Polyethylenimine im gewünschten Molekulargewichtsbereich von 2000 bis 220000 g/mol herstellen.

Die Einführung der Alkylgruppen, wie z. B. C18-Alkylgruppen, erfolgt beispiels weise durch Reaktion einer 5%-igen Lösung des entsprechenden linearen Poly ethylenimins in absolutem Ethanol bei einer Reaktionstemperatur von 40 bis 75°C, vorzugsweise 60°C, mit Octadecylchlorid. Die Dosiermenge des Alkylchlorids orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10%). Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 17 Stunden.

Die Einführung von Acylgruppen, wie z. B. C18-Acylgruppen, erfolgt beispielsweise durch Reaktion einer 5%-igen Lösung des entsprechenden linearen Polyethylenimins in absolutem Ethanol bei einer Reaktionstemperatur von 40 bis 60°C, vorzugsweise 50°C, mit Octadecansäurechlorid. Die Dosiermenge des Säurechlorids orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10%). Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 20 Stunden.

Die Einführung von Acylgruppen kann auch über eine Reaktivestermethode unter Aktivierung eines Carbonsäurederivates mit N-Hydroxysuccinimid erfolgen. Dieses Verfahren wird vorzugsweise im Fall der Polyethylenimin-Funktionalisierung mit Gallensäuren angewendet. Dazu wird beispielsweise das Gallensäure-Derivat Cheno desoxycholsäure (3α,7α-Dihydroxy-5β-cholansäure), im folgenden als Substituent mit CDC abgekürzt, mit N-Hydroxysuccinimid in Dimethoxyethan als Lösungsmittel in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodümid umgesetzt. Die Reaktion erfolgt bei Raumtemperatur, die Reaktionszeit beträgt 16 Stunden. Der so hergestellte Reaktiv ester wird mit einer 5%-igen Lösung des entsprechenden linearen Polyethylenimins in absolutem Ethanol umgesetzt. Die Dosiermenge des Reaktivesters orientiert sich exakt an dem gewünschten Substitutionsgrad (0,1 bis 10%). Die Reaktionstempera tur liegt zwischen 20 und 60°C, vorzugsweise bei 50°C. Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 24 Stunden, besonders bevorzugt 20 Stunden.

Die Einführung von beispielsweise Chenodesoxycholsäure in Oligoamine wie bei spielsweise Spermin oder Pentaethylenhexamin über die Reaktivestermethode ist in der Literatur beschrieben (Walker et al., 1998). Die erfindungsgemäßen Gallensäure-substituierten Polymere weisen hydrophobe Substituenten auf, wobei sich der Grad der Hydrophobizität durch die Anzahl der Hydroxygruppen steuern lässt, analog wie in den von S. Walker et al. beschriebenen "cationic facial amphiphiles".

Hochgereinigte Proben werden hergestellt, indem die Polyamine und insbesondere die hydrophoben Polyethylenimine in Wasser bei pH 7 in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/ml, vorzugsweise 0,5 mg/ml, gelöst und durch Säulenchromatographie über Sephadex und anschließende Gefriertrocknung gereinigt werden. Anschließend werden die Polymere erneut in Wasser oder vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung unter Ultraschallbehandlung gelöst und auf pH 7 eingestellt. Die Konzentration der Polyamin- bzw. Polyethylenimin-Stammlösungen liegt vorzugsweise zwischen 0,1 und 1 mg/ml, besonders bevorzugt bei 0,5 mg/ml. Die Stammlösungen sind bei Raumtemperatur lagerstabil, die Lagerung erfolgt vorzugsweise bei 4°C.

Zur Charakterisierung der kationischen Polymere können Standardmethoden wie 1H-NMR-Spektroskopie, FT-IR-Spektroskopie und Zetapotentialmessungen angewendet werden.

Die für die Arzneimittelherstellung verwendbaren Polyamine können auch an zellspezifische Liganden gekoppelt sein. Solche zellspezifischen Liganden können beispielsweise derart beschaffen sein, dass sie an die äußere Membran einer Ziel zelle, vorzugsweise einer tierischen bzw. menschlichen Zielzelle binden. Die Zielzelle kann beispielsweise eine Endothelzelle, eine Muskelzelle, ein Makrophage, ein Lymphozyt, eine Gliazelle, eine blutbildende Zelle, eine Tumorzelle, z. B. eine Leukämiezelle, eine virusinfizierte Zelle, eine Bronchialepithelzelle oder eine Leber zelle, z. B. eine sinusoidale Zelle der Leber sein. Ein Ligand, der spezifisch an Endothelzellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten, die spezifisch sind für Endothelzellen, endständig Mannose tragende Glykoproteine, Glykolipide oder Polysaccharide, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Endothelzellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an glatte Muskelzellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend monoklonale Antikörper oder deren Fragmente, die spezifisch sind für Aktin, Zellmembranrezeptoren sowie Wachstumsfaktoren oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für glatte Muskelzellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an Makrophagen und/oder Lymphozyten bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend monoklonale Antikörper, die spezifisch sind für Membranantigene auf Makrophagen und/oder Lymphozyten, intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die spezifisch sind für Membranantigene auf Makrophagen und/oder Lymphozyten, Zytokine, Wachstumsfaktoren, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine, Lipide oder Polysaccharide oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, insbesondere das HEF-Protein vom Influenza C-Virus mit Mutation in der Nukleotidposition 872 oder HEF-Spaltprodukte des Influenza C-Virus enthaltend die katalytische Triade Serin-71, Histidin-368 oder -369 und Asparaginsäure-261. Ein Ligand, der spezifisch an Gliazellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antikörper und Antikörperfragmente, die spezifisch an Membranstrukturen von Gliazellen binden, Adhäsionsmoleküle, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine, Lipide oder Polysaccharide, Wachstumsfaktoren oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Gliazellen haben. Ein Ligand, der spezifisch an blutbildende Zellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antikörper oder Antikörperfragmente, die spezifisch sind für einen Rezeptor des stem cell factors, IL-1 (insbesondere Rezeptortyp I oder II), IL-3 (insbesondere Rezeptortyp α oder β), IL-6 oder GM-CSF, sowie intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die diese Spezifität aufweisen und Wachstumsfaktoren wie SCF, IL-1, IL-3, IL-6 oder GM-CSF sowie deren Fragmente, die an die zugehörigen Rezeptoren binden. Ein Ligand, der spezifisch an Leukämiezellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antikörper, Antikörperfragmente, Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die spezifisch an Membranstrukturen auf Leuk ämiezellen binden, wie CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, Sialosyl-Le, CD5, CD1e, CD23, M38, IL-2-Rezeptoren, T-Zell-Rezeptoren, CALLA oder CD19, sowie Wachstumsfaktoren oder davon abstammende Fragmente oder Retinoide. Ein Ligand, der spezifisch an vinasinfizierte Zellen bindet, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Antikörper, Antikörperfragmente, intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die spezifisch sind für ein Virusantigen, das nach Infektion durch das Virus auf der Zellmembran der infizierten Zelle exprimiert wird. Ein Ligand, der spezifisch an Bronchialepithelzellen, sinusoidale Zellen der Leber oder Leberzellen binden kann, kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Transferrin, Asialoglykoproteine, wie Asialoorosomucoid, Neoglykoprotein oder Galaktose, Insulin, endständig Mannose tragende Peptide, Proteine; Lipide oder Polysaccharide, intakte Immunglobuline oder Fc-Fragmente, die spezifisch an die Zielzellen binden und, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, aus Glykoproteinen aus der Hülle von Viren, die spezifisch an die Zielzellen binden. Weitere detaillierte Beispiele für Liganden sind z. B. in EP-A 0 790 312 und EP-A 0 846 772 offenbart.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten im allgemeinen zwischen 0,5 und 500 mg Polyamin pro Dosis als Wirksubstanz, vorzugsweise zwischen 20 und 100 mg pro Dosis.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können neben dem Polyamin als Wirksubstanz weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten, wie z. B. Parapox ovis (beispielsweise in der Form von BAYPAMUN®), Fragmente von Parapox ovis, CpG-enthaltende Oligonukleotide, Antibiotika, Cytostatika.

Die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Arzneimittel verwendbaren Polyamine bzw. die erfindungsgemäßen Arzneimittel selbst liegen vorzugsweise nach Reinigung und Lyophilisierung der Polyamine in fester Form vor und können dann unmittelbar vor der Applikation in einem geeigneten wässrigen Medium, vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung, gelöst oder direkt in einer geeigneten Formulierung unter Zusatz von Additiven appliziert werden, gegebenenfalls nach Dispergierung in wässrigen Medien, vorzugsweise in physiologischer Kochsalz lösung.

Als weitere Formulierungshilfsstoffe kommen biokompatible und bioabbaubare Polymere wie beispielsweise Polylactid, Polylactidcoglykolid, Polyacrylate, Polyorthoester, Polyanhydride, Polyamide, Polyaminosäuren, Cellulose-Derivate, Stärke-Derivate oder Chitosan-Derivate in Frage.

Je nach klinischer Fragestellung wird das Arzneimittel auf der Basis von Polyaminen systemisch (z. B. oral, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal, intravenös) oder lokal (z. B. in das betreffende Organ) appliziert.

Mehrere Applikationen oder Langzeitbehandlung nach Zeitschemen, die den Erfordernissen der klinischen Fragestellung entsprechen, können dabei notwendig sein.

Insbesondere aufgrund ihrer immunstimulierenden, anti-inflammatorischen und anti-apoptotischen Wirkung (Zytokininduktion, Überexpression anti-inflammatorischer und anti-apoptotischer Faktoren) können Polyamine zur Behandlung der folgenden Krankheiten/Läsionen bzw. zur Prophylaxe/Metaphylaxe vor den folgenden Krankheiten verwendet werden:

- Virale Infektionen
Unter Zugrundelegung der bekannten Zusammenhänge des Einflusses einer Th1-Immunantwort auf latente, chronische, persistente Virusinfektionen (Lucin et al., 1994; Smith et al., 1994) und einer dem Immunstimulator Parapox ovis vergleichbaren Wirkung der Polyamine ist der Einsatz von Polyaminen als Monotherapie oder in Kombination mit biologisch aktiven, z. B. antiviralen, niedermolekularen Verbindungen an Mensch und Tier möglich und von therapeutischem Nutzen zur antiviralen Therapie von Infektionen mit dem Hepatitis-B-Virus, dem Hepatitis-C-Virus oder allen anderen Erregern aus der Gruppe der Hepatitis-verursachenden Viren sowie anderen viralen Infektionen der inneren Organe, sowie Infektionen, auch in Begleitung anderer Erkrankungen, mit den verschiedenen Typen des Herpes simples-Virus (HSV), den verschiedenen Typen von humanem Papillomvirus (HPV), dem humanen Immundefizienzvirus (HIV), dem humanen Cytomegalievirus (HCMV), sowie den entsprechenden Viruserkrankungen des Tieres.
- Akute oder chronische virale Infektionen des Respirationstraktes und der inneren Organe
- Infektionen durch Stress oder nach einer Operation oder zahnärztlichen Behandlung
- Bakterielle Infektionen, insbesondere Infektionen durch intrazelluläre Bakterien
- Krebs, Tumore
- Organfibrosen, insbesondere Leberfibrose bzw. Leberzirrhose im Gefolge von Virushepatitis oder Ethanol-induzierten Lebererkrankungen sowie zystische Fibrose
- Erkrankungen, die mit erhöhter Kollagenablagerung einhergehen, wobei sowohl die inneren Organ, wie z. B. die Leber, als auch die Haut und ihre Anhangsgebilde betroffen sein können
- Entzündliche, degenerative und proliferative Erkrankungen der inneren Organe, der Haut, des Blutes, des Zentralnervensystems und seiner Anhangsgebilde einschließlich des Auges
- Allergischer Formenkreis, insbesondere zur Verhinderung des Ausbruchs systemischer Allergien bzw. zur Verwendung bei topischen Allergien oder Asthma.

Die Polyamine können auch als Adjuvantien verwendet werden.

Beispiele Beispiel 1 Synthese der linearen Polyethylenimine (LPEI)

Lineare Polyethylenimine wurden durch kationische ringöffnende Polymerisation von 2-Ethyloxazolin zu Poly(ethyloxazolin) (analog Rivas & Ananias, 1992) und anschließender saurer Hydrolyse durch Abspaltung von Propansäure synthetisiert. Bestimmte Vorläufer-Polymere (Poly(ethyloxazoline)) sind auch kommerziell erhältlich (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deutschland). Die Vorläufer-Polymere wurden durch Gelpermeationschromatographie, 1H-NMR und FT-IR charakterisiert.

Eine quantitative Hydrolyse gelang durch Umsetzung von beispielsweise 24,7 g Poly(ethyloxazolin) (Mw 200000 g/mol) in einer Mischung aus 40 ml Wasser und 40 ml konzentrierter Salzsäure bei 100°C. Nach 24 Stunden wurde der gebildete voluminöse Niederschlag durch Zusatz von 250 ml Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf 20°C wurde das Produkt unter Zusatz von 20%-iger NaOH auf pH 11 eingestellt und gefällt. Nach Absaugen und Waschen des Niederschlags (Waschwasser pH 7) wurde im Hochvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Das Rohprodukt wurde anschließend aus Ethanol umkristallisiert (Ausbeute 9,5 g/88%). Hochreine Chargen (Milligramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore-Wasser als Eluent und anschließender Gefriertrocknung erhalten.

Die linearen Polyethylenimine wurden durch 1H-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch die quantitative Hydrolyse bestätigt werden konnte.

Beispiel 2 Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am Beispiel der Einführung von 3 mol-% C18-Alkylgruppen in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol

Dazu wurden 0,5 g LPEI unter Argon in 10 ml Ethanol bei 60°C gelöst und nach langsamer Zugabe von 0,11 g (0,13 ml) Octadecylchlorid 17 Stunden gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde bei 20°C durch Zusatz von 20 ml Wasser gefällt, abfiltriert, mit Wasser gewaschen (Waschwasser pH 7) und im Hochvakuum über Phosphor pentoxid getrocknet (Ausbeute 0,48 g/96%). Hochreine Chargen (Milligramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore-Wasser als Eluent und anschließender Gefrier trocknung erhalten.

Die alkylierten linearen Polyethylenimine wurden durch 1H-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch der gewünschte Alkylierungsgrad bestätigt werden konnte.

Beispiel 3 Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am Beispiel der Einführung von 3 mol-% C18-Acylgruppen in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol

Dazu wurden 0,5 g LPEI unter Argon in 10 ml Ethanol bei 50°C gelöst und nach langsamer Zugabe von 0,11 g (0,12 ml) Octadecansäurechlorid 20 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde nach Filtration im Vakuum quantitativ eingeengt. Der Rückstand wurde in der Hitze in 4 ml Ethanol gelöst und das Produkt wurde bei 20°C durch Zusatz von 8 ml Wasser gefällt. Nach Filtration und Waschen mit Wasser (Waschwasser pH 7) wurde im Hochvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet (Ausbeute 0,38 g/76%). Hochreine Chargen (Milligramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Pharmacia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore-Wasser als Eluent und anschließender Gefriertrocknung erhalten.

Die acylierten linearen Polyethylenimine wurden durch 1H-NMR und FT-IR charak terisiert, wodurch der gewünschte Acylierungsgrad bestätigt werden konnte.

Beispiel 4 Synthese der hydrophob funktionalisierten linearen Polyethylenimine (H-LPEI) am Beispiel der Einführung von 3 mol-% Chenodesoxycholsäure (CDC)-Gruppen (3α,7α-Dihydroxy-5β-cholansäure) in LPEI mit einem Mw von 87000 g/Mol

Chenodesoxycholsäure (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) wurde dazu mit N-Hydroxy succinimid in eine Reaktivester-Verbindung überführt. 1 g Chenodesoxycholsäure und 0,32 g N-Hydroxysuccinimid wurden in 5 ml Dimethoxyethan gelöst und bei 0-5°C mit 0,63 g Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden gerührt, der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Reaktivester wurde im Hochvakuum getrocknet (stabiler Schaum) und durch 1H-NMR charakterisiert. Ohne weitere Reinigung wurden 179 mg des Chenodesoxycholsäure-Reaktivesters bei Raumtemperatur unter Argon zu einer Lösung von 0,5 g LPEI in 10 ml Ethanol gegeben. Anschließend wurde die Reak tionsmischung 20 Stunden bei 50°C gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Produkt durch Zusatz von 25 ml Wasser gefällt. Der Rückstand wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen (Waschwasser pH 7) und im Hochvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. (Ausbeute 0,41 g/82%). Hochreine Chargen (Milli gramm-Mengen) wurden durch Säulenchromatographie über Sephadex G25 (Phar macia disposable PD-10 desalting column) von gesättigten wässrigen Lösungen (pH 7) des Polyethylenimins mit Millipore-Wasser als Eluent und anschließender Gefriertrocknung erhalten.

Die mittels Reaktivester-Methode Acyl-funktionalisierten linearen Polyethylenimine wurden durch 1H-NMR und FT-IR charakterisiert, wodurch der gewünschte Acy lierungsgrad bestätigt werden konnte.

Beispiel 5 Zetapotentialmessungen

Zur Ermittlung der Ladung bzw. des Protonierungsgrades der linearen Polyethylen imine und der hydrophob funktionalisierten Polyethylenimine in wässriger Lösung bei physiologischem pH-Wert wurden Zetapotentialmessungen durchgeführt. Unab hängig vom mittleren Molekulargewicht und unabhängig vom Polymertyp ließ sich bei pH 7 ein mittlerer Protonierungsgrad von 50% ermitteln, d. h. ca. 50% der Stickstoffatome liegen in wässriger Lösung bei pH 7 protoniert vor.

Beispiel 6

Von allen Polyethyleniminen (LPEI, H-LPEI) wurden Stammlösungen in physiologischer Kochsalzlösung bei pH 7 mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml hergestellt. Dazu wurden 25 mg des LPEI bzw. des H-LPEI unter Erhitzen und Ultraschallbehandlung in 30 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung gelöst, mit 0,1 N HCl auf pH 7 eingestellt und auf ein Endvolumen von 50 ml aufgefüllt. Die Stammlösungen wurden steril filtriert (0,2 µm) und können bei 20°C über lange Zeit gelagert werden.

Um die Verwendbarkeit von Polyaminen, insbesondere von Polyethyleniminen als Immuntherapeutika zu belegen, wurde die Interferon-γ stimulierende Wirkung der Polyamine und anschließend der Wirksamkeitsnachweis in vivo demonstriert.

1. IFN-γ-Induktion in einem Maus-Milzzell-Assay a) Tierhaltung

Die NMRI-Mäuse (Auszuchtstamm, weiblich, Gewicht 18-20 g) wurden 8 Tage vor Beginn der Experimente von der Firma Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurden in einem künstlichen Tag-Nacht-Rhythmus gehalten (Beleuchtung von 07:00 bis 19:00 Uhr, Dunkelheit von 19:00 bis 07:00 Uhr).

b) Präparation von Maus-Milzzellen

Die Tiere wurden durch cervikale Dislokation getötet und dann die Milzen entnommen. Die Milzen wurden von anhängendem Bindegewebe befreit und nach folgender Vorschrift aufgearbeitet:
Die Milz wird auf ein Metallsieb (Maschenweite ca. 70 µm) gelegt (Petrischale) und mit einer Schere zerkleinert. Anschließend werden 5 ml PBS zugegeben und die Gewebestücke mit einem Glaspistill durch das Sieb gedrückt. Das Sieb wird mehrmals mit PBS nachgespült, die Zellen in insgesamt 50 ml PBS in ein Falcon-Röhrchen überführt und anschließend für 10 Minuten bei 300 × g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, die Zellen in 20 ml PBS resuspendiert und dann erneut für 10 Minuten bei 300 × g zentrifugiert. Nach resuspendieren der Zellen in 5-10 ml Medium wird die Zellzahl bestimmt und mit Medium auf 2,5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt.

c) Stimulation von Maus-Milzzellen

Die Stimulationen erfolgten in einem Volumen von 1 ml in 24-Lochplatten bei 37°C und 5% CO₂ für 72 Stunden. In einem Gesamtvolumen von 1 ml (0,8 ml Medium: RPMI, 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin) wurden 2 × 10⁶ Milzzellen stimuliert. Pro Ansatz wurde, je nach Anzahl der Stimulantien, folgendes zusammengegeben:
800 µl Medium mit 2,5 × 10⁶ Zellen/ml
100 µl Stimulanz (Polyethylenimin, 0,5 mg/ml)
100 µl PBS.

Alle Milzzellstimulationen wurden als Doppelbestimmung angesetzt.

Nach Ende der Stimulation wurden die Überstände in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt, die restlichen Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 Minuten abgetrennt. Die zellfreien Überstände wurden abgenommen und bis zur Messung von IFN-γ durch ELISA bei -20°C gelagert.

d) Messung der IFN-γ Konzentrationen

Die Bestimmung der IFN-γ-Konzentrationen in den Stimulations-Überständen erfolgte mit dem "Mouse IFN-γ OptEIA®-ELISA Set" (Firma Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) nach Angaben des Herstellers.

Ergebnis gemäß Abb. 1

Die getesteten Polyethylenimine zeigen eine signifikante IFN-γ-Induktion im Maus-Milzzell-Assay.

2. In vivo IFN-γ-Induktion a) Maushaltung

NMRI-Mäuse (Auszuchtstamm HdsWin:NMRI, weiblich, Gewicht 18-20 g, bezogen über Harlan/Winkelmann, Borchen, Deutschland) wurden in autoklavierbaren, mit Sägespänen ausgelegten Polycarbonatkisten, im S2-Isolierstall bei 20-22°C (Luftfeuchtigkeit 50-60%) und in einem künstlichen Tag/Nacht Rhythmus gehalten (Beleuchtung von 06 : 30 bis 18 : 30 Uhr, Dunkelheit von 18 : 30 bis 06 : 30 Uhr). Sie hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.

b) Versuchsdurchführung

Die Tiere wurden randomisiert und in zwei Gruppen zu jeweils 6 Tieren aufgeteilt. Nach der Anlieferung wurden die Mäuse zunächst ohne weitere Behandlung für 3 Tage im Tierstall gehalten.

Die zu analysierenden Substanzen wurden in einem Volumen von 0,2 ml intraperitoneal appliziert. Folgendes Behandlungsschema wurde angewandt:
Gruppe 1: Placebo: PBS
Gruppe 2: Polyethylenimin, H-LPEI, M_W: 87000, C18 Acyl, 3 mol%, gemäß Beispiel 3 (0,1 mg pro Maus).

9 Stunden nach der Behandlung wurden die Mäuse getötet und die Peritonealzellen durch eine Bauchspülung mit 5 ml eiskaltem PBS gewonnen.

Die Zellen wurden über einen Zentrifugationsschritt (30 Sekunden bei 16.000 × g, Raumtemperatur) aufkonzentriert, der Überstand dekantiert und die zelluläre Gesamt-RNA mittels des NucleoSpin RNA II Kits (Machery-Nagel, Düren, Deutschland) extrahiert.

Dazu wurde das Zellpellet in 400 µl RA1-Puffer (aus dem NucleoSpin RNA II Kit) resuspendiert und bei -80°C eingefroren. Nach dem Auftauen auf 37°C wurde der Ansatz zur Reduktion der Viskosität auf einen NucleoSpin Filter aufgetragen und für 1 Minute zentrifugiert (16.000 × g, Raumtemperatur). Das Filtrat wurde mit 300 µl Ethanol versetzt und die Mischung auf eine NucleoSpin RNA-Säule aufgetragen.

Nach Zentrifugation (30 Sekunden 8.000 × g), Entfernung des Filtrats und anschließender Trockenzentrifugation der Säule (1 Minute 16.000 × g) erfolgte die Spaltung der DNA durch DNase I. Dazu wurden 90 µl DNase Reaktionspuffer mit 10 µl DNase I (beides aus dem NucleoSpin RNA II Kit) vermischt und 95 µl dieser Lösung auf den trockenen Filter aufgetragen. Nach Inkubation für 15 Minuten (Raumtemperatur) wurde der Filter zunächst mit 500 µl RA2, dann mit 600 µl RA3 und anschließend mit 250 µl RA3 (aus dem NucleoSpin RNA II Kit) gewaschen. Dazu wurden die Waschpuffer aufgetragen und die Säule jeweils für 30 Sekunden bei 8.000 × g und nach dem letzten Waschschritt für 2 Minuten bei 16.000 × g zentrifugiert. Anschließend wurde die RNA in 60 µl RNase freiem, destilliertem Wasser eluiert (1 Minute 16.000 × g).

Die Qualität der RNA wurde durch photometrische Messung überprüft.

Die Synthese der cDNA erfolgte durch reverse Transkription der RNA unter Verwendung von "Random Hexamers" als Primer für die Polymerasereaktion. Dabei wurden die TaqMan Reverse Transkription Reagents (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Der Synthese wurde in 100 µl durchgeführt. Der Syntheseansatz setzte sich wie folgt zusammen:

- 1300-1500 µg RNA
- 10 µl RT Buffer (10 ×)
- 22 µl MgCl₂ (25 mM)
- 5 µl Random Hexamers
- 2,5 µl MultiScribe RT
- 2 µl RNase Inhibitor
- 20 µl dNTP
- RNase freies Wasser (ad 100 µl Gesamtvolumen).

Der Ansatz wurde in dem Thermocycler GeneAmp 2400 (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) zunächst für 10 Minuten bei 25°C, dann für 30 Minuten bei 48°C inkubiert und anschließend auf +4°C gekühlt. Die auf diese Weise synthetisierte cDNA wurde bei -20°C aufbewahrt.

Die quantitative PCR wurde mit dem ABI PRISM® 5700 (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt. Dazu wurde das PDAR-Kit (Pre-Developed TaqMan® Assay Reagens) für murines IFN-γ eingesetzt (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland).

Die Mengen der cDNAs wurden mittels eines "housekeeping" Genes (18S RNA), unter Verwendung des PDAR-Kits "Endogenious Control Ribosomal RNA Control (18S RNA)" normalisiert.

Für die Standardisierung und die Induktionsberechnung wurde eine Kalibrator-cDNA eingesetzt. Diese bestand aus einem Gemisch der cDNA 11 verschiedener Mäuse, die ensprechend der Gruppe 1 behandelt wurden.

Die Amplifikationen erfolgten jeweils in einem Volumen von 50 µl und setzten sich wie folgt zusammen:
Endogene 18S RNA Kontrolle:

- 1 ng cDNA
- 25 µl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix
- 2,5 µl 18S RNA
- RNase freies Wasser (ad 100 µl Gesamtvolumen)

IFN-γ Nachweis:

- 10 ng cDNA
- 25 µl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix
- 2,5 µl IFN-γ Primer
- RNase freies Wasser (ad 100 µl Gesamtvolumen).

Nach Inkubation für 2 Minuten bei 50°C und der anschließenden initialen Denaturierung (95°C 10 Minuten), folgten 45 Zyklen Denaturierung (94°C 15 Sekunden) und Annealing/Extension (60°C, 1 Minute). Zur Analyse der Produkte wurde die GeneAmp® 5700 Sequence Detection System Software (v. 1.3) verwendet.

Folgende Ergebnisse wurden erhalten

Die Expression von Interferon-γ wird in vivo 9 Stunden nach Behandlung mit Polyethylenimin H-LPEI, M_W: 87000, C 18 Acyl, 3 mol% induziert (vgl. Abb. 2). Diese Induktion ist je nach Tier 16-120 fach höher als der Kalibrator. Hingegen zeigen die unbehandelten bzw. die mit PBS behandelten Tiere eine Schwankung in der Interferon-γ-Expression von 0,9 fach geringerer bis zu einer 7 fachen Erhöhung gegenüber dem Kalibrator an.

3. Nachweis der immunstimulatorischen Wirkung im Aujeszky-Maus-Modell

Das Aujeszky-Maus-Modell ist ein in vivo Belastungsmodell zum Nachweis der Wirkung von verschiedenen Immunstimulatoren (z. B. BAYPAMUN®, CpG-Oligonukleotiden).

a) Maushaltung

Die NMRI-Mäuse (Auszuchtstamm HdsWin:NMRI, weiblich, Gewicht 18-20 g, bezogen über Harlan/Winkelmann, Borchen, Deutschland) wurden in autoklavierbaren, mit Sägespänen ausgelegten Polycarbonatkisten, im S2-Isolierstall bei 20-22°C (Luftfeuchtigkeit 50-60%) und in einem künstlichen Tag/Nacht Rhythmus gehalten (Beleuchtung von 06:30 bis 18:30 Uhr, Dunkelheit von 18:30 bis 06:30 Uhr). Sie hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.

b) Belastungsmodell

Für die Untersuchungen wurden Mausgruppen mit 10 Mäusen pro Gruppe gebildet. Die Tiere einer Gruppe erhielten jeweils die selbe Testsubstanz.

Die Mäuse wurden nach der Anlieferung für 2-3 Tage im Tierstall gehalten. Anschließend wurden die Polyethylenimine (Ausgangskonzentration 0,5 mg/ ml) mit physiologischer NaCl-Lösung (pH-Wert 7,6) 1 : 10 und 1 : 100 verdünnt. Von diesen Lösungen wurde 0,2 ml pro Maus intraperitoneal appliziert.

24 Stunden nach der Behandlung wurden die Mäuse durch intraperitoneale Applikation von Pseudorabiesvirus, Stamm Hannover H2, belastet. Dazu wurde das Virus in PBS bis zu einem Belastungstiter von 10^3,8-10^4,1 TCID₅₀/ml verdünnt und 0,2 ml dieser Suspension appliziert.

Als Negativkontrolle wurde eine Gruppe von Mäusen mit physiologischer NaCl-Lösung behandelt und anschließend belastet.

Die Mäuse dieser Gruppe starben 3-8 Tage nach der Belastung. Die mit Polyethyleniminen behandelten Mäuse überlebten zu einem großen Anteil die Pseudorabiesvirus-Infektion. 10 Tage nach Belastung wurde der Versuch beendet.

Die Stärke der induzierten Immunstimulation ergab sich aus dem Vergleich der gestorbenen Mäuse in der NaCl-Kontrollgruppe und den Testgruppen und wurde durch den Wirkungsindex quantifiziert. Dieser gibt den prozentualen Anzahl der Mäuse an, die aufgrund der Immunstimulation durch die zu testende Substanz vor der letalen Wirkung des Aujeszky-Virus geschützt sind. Er wird mit der Formel

WI = (b-a)/b × 100

berechnet. Dabei gibt b den prozentualen Anteil der toten Mäuse in der Kontrollgruppe, a den prozentualer Anteil der toten Mäuse in der Testgruppe an. Ergebnisse (vgl. Abb. 3):

Die Prüfung unterschiedlicher Konzentrationen von Polyethyleniminen im Aujeszky Maus Modell zeigt überraschenderweise:

1. Nach der Behandlung der Mäuse mit 0,1 bzw. 0,01 mg H-LPEI, M_W: 87000, C18 Acyl, 3 mol% oder H-LPEI, M_W: 87000, CDC Acyl, 3 mol% wurde mit Wirkungsindizes von ≧ 60% jeweils eine signifikante Immunstimulation nachgewiesen.
2. Bei Einsatz unterschiedlicher Konzentrationen der beiden Polyethylenimine H-LPEI, M_W: 87000, C18 Acyl, 3 mol% und H-LPEI, M_W: 87000, CDC Acyl, 3 mol% wurde jeweils eine Dosis/Wirkungsbeziehung nachgewiesen.

4. Analyse der Wirkung der Polyethylenimine H-LPEI, M_W: 87000, C18 Acyl, 3 mol%, und H-LPEI, M_W: 87000, CDC Acyl, 3 mol% auf die Genexpression in murinen Peritonealzellen (in vivo) mittels des PIQOR™-cDNA-Array-Systems a) Tierhaltung

b) Versuchsdurchführung

Die Tiere wurden randomisiert und in drei Gruppen zu jeweils 4 Tieren aufgeteilt. Die zu analysierenden Substanzen wurden in einem Volumen von 0,2 ml intraperitoneal appliziert. Folgendes Behandlungsschema wurde angewandt:
Gruppe 1: Placebo: Physiologische NaCl-Lösung.
Gruppe 2: Polyethylenimin, H-LPEI, M_W: 87000, C 18 Acyl, 3 mol% (0,1 mg pro Maus).
Gruppe 3: Polyethylenimin, H-LPEI, M_W: 87000, CDC Acyl, 3 mol% (0,1 mg pro Maus).

6 Stunden nach der Behandlung wurden die Mäuse getötet und die Peritonealzellen durch eine Bauchspülung mit 10 ml Medium (DMEM, 5% FCS) gewonnen.

Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation (10 Minuten bei 300 × g, Raumtemperatur) aufkonzentriert und dann entweder sofort in die RNA-Extraktion eingesetzt oder zunächst einer Erythrozyten-Lyse unterzogen.

Erythrozyten-Lyse

Für die Erythrozyten-Lyse wurden die pelletierten Peritonealzellen in 1 ml PBS resuspendiert, mit 10 ml Lysis-Puffer (10 ml 0,17 M Tris, pH 7,2 + 90 ml 0,16 M NH₄Cl, pH 7,2) versetzt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 10 Minuten bei 300 × g. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen mit 10 ml PBS gewaschen und erneut zentrifugiert (10 Minuten bei 300 × g).

Gesamt-RNA-Präparation

Die Präparation von gesamt-RNA aus den Peritonealzellen erfolgte mit dem RNeasy Mini-Kit (Firma QIAGEN, Hilden, Deutschland) nach den Angaben des Herstellers. Dabei wurden jeweils zwei Ansätze für eine Aufarbeitung gemischt.

Die Ausbeuten an gesamt-RNA aus den Peritonealzellen von jeweils vier Tieren betrugen zwischen 10 und 20 µg RNA.

Zwischenamplifikation der RNA

Für die Zwischenamplifikation der RNA wurde basierend auf dem Protokoll von Eberwine et al. (1992) verfahren. Hierbei erfolgt die Amplifikation der mRNA aus der gesamt-RNA-Präperation.

cDNA Array

Für die Analyse der induzierten und reprimierten Gene wurde das PIQOR™-cDNA-Array-System der Firma Memorec Stoffel GmbH (Köln, Deutschland) eingesetzt. Dabei wurde die cDNA immunologisch relevanter Gene (Interleukine, Differenzierungscluster (CDs), Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren etc.) auf einen Chip aufgetragen.

Für die Hybridisierung wurde die amplifizierte RNA eingesetzt. In einer RT-Reaktion wurden je 2 µg der amplifizierte RNA in cDNA umgeschrieben und dabei die fluoreszenzmarkierten Nukleotide eingebaut. Die Kontrollen wurden mit Cy3 und die Proben mit Cy5 markiert.

Folgende Hybridisierungen wurden nach dem vom Hersteller angegebenen Protokoll (PIQOR™-cDNA-Array-System, Edition 2.6, February 2000) durchgeführt und ausgewertet:

Für die Auswertung der Hybridisierungssignale wurden ausschließlich solche Signale analysiert, bei denen mindestens eine der jeweils zu vergleichenden Proben (Cy3 bzw. Cy5-Signal) ein mindestens 2fach stärkeres Signal aufweist als der Mittelwert der beiden negativ-Kontrollen (Salz und Heringssperma-DNA). Zur Bestimmung der Genexpression wurden ausschließlich die Signale der Gene einbezogen, die größer als zweifach differentiell exprimiert wurden.

Ergebnisse

Die nachstehende Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der cDNA-Analyse. Werte über 2,0 zeigen eine spezifische Erhöhung der Expression der jeweiligen mRNA an (A), während Werte < -2,0 Suppression anzeigen (B). Nach Stimulation mit den Polyethyleniminen sind insbesondere anti-inflammatorische bzw. anti-apoptotische Faktoren überexprimiert. Extrem hoch ist die Steigerung der Expression von Interleukin-1-Rezeptor Typ 2, dem in der Literatur eine stark anti-inflammatorische Wirkung zugeordnet wird (Brown et al., 1996; Bossu et al., 1995). Anti-inflammatorisch bzw. anti-apoptotisch wird die Expression von FERHA (ferritin heavy chain mRNA) beschrieben (Weiss et al., 1997; Oberle & Schroder, 1997). Die Erhöhung von MCL-1 auf 2,88 weißt zusätzlich auf eine anti-apoptotische Wirkung der Polymere hin (Fujise et al., 2000).

Analyse der Wirkung der Polyethylenimine H-LPEI, M_W: 87000, C18 Acyl, 3 mol%, und H-LPEI, M_W: 87000, CDC. Acyl, 3 mol% auf die Genexpression in murinen Peritonealzellen (in vivo) mittels des PIQOR™-cDNA-Array-Systems

A) Induzierte Gene

B) Suprimierte Gene

Literaturverzeichnis

Bossu, P., Visconti, U., Ruggiero, P., Macchia, G., Muda, M., Bertini, R., Bizzarri, C., Colagrande, A., Sabbatini, V. & Maurizi, G. (1995) Transfected type II interleukin-1 receptor impairs responsiveness of human keratinocytes to interleukin-1. Am. J. Pathol., 147, 1852-1861.
Brown, E. A., Dare, H. A., Marsh, C. B. & Wewers, M. D. (1996) The combination of endotoxin and dexamethasone induces type II interleukin 1 receptor (IL-1r II) in monocytes: a comparison to interleukin 1 beta (IL-1 beta) and interleukin 1 receptor antagonist (IL-1ra). Cytokine., 8, 828-836.
Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M. & Coleman, P. (1992) Analysis of gene expression in single live neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 3010-3014.
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Claims

1. Arzneimittel enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz.

2. Arzneimittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin hydrophobe Substituenten aufweist.

3. Arzneimittel gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten als Seitenketten oder endständig angeordnet sind.

4. Arzneimittel gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten Alkylketten, Acylketten oder Steroid-artige Substituenten sind, sowie hydrophobe Substituenten, die durch Addition der Stickstofffunktionen der Polyaminhauptkette an Isocyanate oder an α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen eingeführt werden können.

5. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin ein Polyethylenimin darstellt.

6. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R² Alkyl mit 1 bis 23 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin
R³ und R⁴ (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder eine vom Initiator ab hängige Struktur aufweisen,
wobei R⁵ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a × P mit 0,001 < a < 0,1, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.

7. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet und
R² Alkyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin
R³ und R⁴ (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder eine vom Initiator ab hängige Struktur aufweisen,
wobei R⁵ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a × P mit 0,001 < a < 0,1, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.

8. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹, R² und R³ Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten,
und worin
R⁴ und R⁵ (Endgruppen) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Gallen säuren bedeuten, oder eine vom Initiator abhängige Struktur auf weisen,
wobei R⁶ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a × P mit 0,01 < a < 0,1, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.

9. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹ OR⁴ oder NR⁴R⁵ bedeutet,
wobei
R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeuten,
und worin
R² und R³ (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R⁶ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a × p mit 0,001 < a < 0,1, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.

10. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit
R¹ Alkyl mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen bedeutet,
und worin
R² und R³ (Endgruppen) unabhängig voneinander den Substituenten der Stickstoffatome der Polymerhauptkette entsprechen oder eine vom Initiator abhängige Struktur aufweisen,
wobei R⁴ (Endgruppe) ein von der Abbruchreakion abhängiger Substituent ist,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt und n = a × P mit 0,001 < a < 0,1, wobei die Einheiten m und n statistisch im Polymer verteilt sind.

11. Arzneimittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin in jeder einzelnen [CH₂-CH₂-N]-Einheit der Rest R entweder Wasserstoff oder ein Rest der Formel
sein kann und worin R^x entweder Wasserstoff oder ebenfalls wieder ein Rest des Typs R sein kann,
und worin jede einzelne [CH₂-CH₂-N]-Einheit und die Endgruppen die in einem der Ansprüche 8 bis 13 genannten Substituenten tragen können,
und wobei der mittlere Polymerisationsgrad P = (m+n) im Bereich 45 bis 5250 liegt.

12. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin ein Molekulargewicht unter 220000 g/Mol aufweist.

13. Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin ein Molekulargewicht von 2000 bis 100000 g/Mol aufweist.

14. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamin an einen zellspezifischen Liganden gekoppelt ist.

15. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Formulierungshilfsstoffe enthält.

16. Polyamin, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Verwendung als Arzneimittel.

17. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines immunstimulierenden Arzneimittels.

18. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von viralen Infektionen oder für die Prophylaxe vor viralen Infektionen.

19. Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Infektionen mit Papilloma-Viren, Viren der Herpes-Gruppe, Hepatitis-Viren oder HIV handelt.

20. Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Infektionen um Infektionen des Respirationstraktes oder der inneren Organe handelt.

21. Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Prophylaxe um die Vorbeugung einer Infektion durch Stress oder nach einer Operation oder zahnärztlichen Behandlung handelt.

22. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung bakterieller Infektionen.

23. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krebs oder Tumoren.

24. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneirnittels für die Behandlung von Organfibrosen oder für die Prophylaxe vor Organfibrosen.

25. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen, die mit erhöhter Kollagenablagerung einhergehen.

26. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von entzündlichen, degenerativen und proliferativen Erkrankungen der inneren Organe, der Haut, des Blutes, des Zentralnervensystems und seiner Anhangsgebilde einschließlich des Auges.

27. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung eines Arzneirnittels für die Behandlung von Erkrankungen des allergischen Formenkreises, insbesondere für die Behandlung von Asthma.

28. Verwendung eines Polyamins, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, als Adjuvans.