DE10062302A1 - Sekretionssignalpeptide, deren DNA-Sequenzen, damit herstellbare Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen und deren Verwendung zur biotechnologischen Herstellung von Proteinen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft neue peptidische und nucleotidische Sekretionssignalsequenzen, Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen, die mit diesen Vektoren transfizierten Zellkonstrukte sowie die Nutzung der Vektoren und Zellkonstrukte zur effizienten biotechnologischen Herstellung von Proteinen mit eukaryotischen Zellen.

Description

Die Erfindung betrifft peptidische und nucleotidische Sekretionssignalsequenzen, Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen, die mit diesen Vektoren transfizierten Zellkonstrukte sowie die Nutzung der Vektoren und Zellkonstrukte zur biotechnologischen Herstellung von Proteinen.

Traditionell stehen für die Expression und Reinigung von Proteinen bakterielle Systeme wie die aus Escherichia coli oder Bacillus subtilis zur Verfügung. Sind die zu exprimierenden Proteine eukaryotischen Ursprungs, kann die Expression in einem prokaryotischen Wirt aber problematisch sein. Die Aktivität und Produktionsmenge vieler Proteine hängt zu einem erheblichen Teil von posttranslationalen Modifikationen, wie N-Glykosylierung, Phosphorylierung, oder Acetylierung ab, die nur höhere Organismen aufweisen.

Neben Systemen in Säugetier- (CHO, BHK, COS etc.) oder Insektenzellen (SF9- Zellen) haben Hefen als eukaryotische Expressionssysteme den Vorteil, dass sie sich ähnlich schnell wie Bakterien vermehren und sich im Labor kostengünstig ohne große Sicherheitsvorkehrungen kultivieren lassen. Auch stehen für Hefen mittlerweile eine Vielzahl genetischer Methoden zur Untersuchung von molekularbiologischen Fragestellungen zur Verfügung. So können Gene aus einem Genom leicht deletiert, oder fremde Gene durch Einschleusen extrachromosomaler Plasmide oder durch Integration in das Genom zusätzlich in die Zellen eingebracht werden. Durch die Verwendung verschiedener Promotoren wird die Expression dieser Gene auch in unterschiedlicher Stärke oder sogar regulierbar möglich.

Vor allem Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis und seit einiger Zeit auch Schizosaccharomyces pombe haben deshalb als Expressionsstämme Einzug in biotechnologische Labors bzw. Produktionsanlagen gehalten (Lu et al. 1997).

Im allgemeinen werden rekombinante Proteine nicht in das extrazelluläre Medium sezerniert sondern im Zytoplasma abgelagert. Zur Isolierung des gewünschten Proteins müssen die Zellen deshalb aufgeschlossen und von den so erhaltenen Zelltrümmern sowie dem Restproteom der Hefe abgetrennt werden. Dies stellt aber zeitlich und finanziell einen grossen Aufwand dar. Es ist also wünschenswert rekombinante Proteine aus einer Zelle zu sezernieren um die Produktion und Reinigung im großtechnischen Maßstab zu vereinfachen.

Proteine können nur sezerniert werden, wenn sie eine N-terminale, hydrophobe Sekretions- und Prozessierungsequenz beinhalten, die den Proteinimport in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER), dem wichtigsten Schritt der Sekretionsmaschinerie, sicherstellt. Hierfür werden bisher Signalsequenzen endogener Proteine, wie einer Invertase, einer sauren Phosphatase, oder dem Pheromon Faktor P mit dem zu exprimierenden Protein fusioniert. Auf diesem Weg konnten aber nur wenige medizinisch und pharmakologisch interessante Proteine in Hefen, wie α-Amylase der Maus, Antithrombin III des Menschen oder der humanen Alkalischen Phosphatase, in größeren Mengen aktiv in biologischer Form hergestellt werden (Bröker et al., 1987; Tokunaga et al., 1993; Sambamurti, 1997).

Ausgehend vom Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Vektoren für die effiziente sekretorische Expression von Genen in eukaryotischen Zellen und somit ein effizientes Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Proteinen zur Verfügung zu stellen.

Es konnte überraschend gezeigt werden, dass Fusionsproteine, die eine N-terminale Aminosäuresequenz des Präprotoxins (pptox) des im Zytoplasma von S. cerevisiae persistierenden Killervirus K28 mit der Sequenz

M E S V S S L F N I F S T I M V N Y K S L V L A L L S V S N L K Y A R G Seq. Id. No. 1

oder einer funktionellen Variante davon mit einer Homologie von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90%, enthalten, effizient unter Verwendung eukaryotischer Wirtszellen exprimiert und sezerniert werden können, wobei die Sequenz Seq. Id. No. 1 oder eine funktionelle Variante davon als Sekretionssignalsequenz wirkt. Weiterhin vorteilhaft ist, dass die beschriebenen Sekretionssignalsequenzen unabhängig von ihrer Herkunft in unterschiedlichen eukaryontischen Wirtszellen, insbesondere in Hefen, ihre sekretorische Wirkung entfalten. Besonders überraschend ist, dass Fusionsproteine, die aus einer Fusion der Signalsequenz Seq. Id. No. 1 des K28 Präprotoxins und einem heterologen Protein bestehen, mit einer höheren Ausbeute sekretiert werden als das reife Toxin im natürlich infizierten Hefewirt S. cerevisiae.

Unter funktionellen Varianten im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen werden im Sinne dieser Erfindung Aminosäuresequenzen mit einer Sequenzhomologie von mindestens 80% verstanden, die als Sekretionssignal geeignet sind. Insbesondere allele Varianten sind von dem Begriff der funktionellen Variante miteingeschlossen.

Weiterhin können die Fusionsproteine posttranslational modifiziert, z. B. glykosyliert, phosphoryliert oder acetyliert, sein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die für ein peptidisches Sekretionssignal gemäß Seq. Id. No. 1 oder einer seiner funktionellen Varianten kodierende DNA-Sequenz (S/P).

Bevorzugt sind DNA-Sequenzen gemäß Seq. Id. No. 2 oder einer funktionellen Variante dieser Sequenz.

Unter einer funktionellen Variante im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz wird im Sinne dieser Erfindung eine DNA-Sequenz mit einer Sequenzhomologie von mindestens 70%, bevorzugt von mindestens 90%, verstanden, die für ein peptidisches Sekretionssignal kodiert. Unter den Begriff der funktionellen Variante fallen insbesondere alle Sequenzvarianten sowie alle Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz Seq. Id. No. 2 hybridisieren.

Zur sekretorischen Expression von interessanten Genen (Zielgenen), werden Expressionsvektoren genutzt, die einen Promotor und die S/P- Sekretionssignalsequenz des pptox Gens des Virus K28 gemäß Seq. Id. No. 2 oder einer funktionellen Variante dieser Sequenz mit einer Sequenzhomologie von mindestens 70% enthalten, wobei die betreffende Zielsequenz in 3'-Richtung zum Promotor und im offenen Leseraster zur S/P-Sekretionssignalsequenz liegt.

Die Expressionsvektoren können neben der Sekretionssignalsequenz Seq. Id. No. 2 zusätzlich die α- und/oder β- und/oder γ-Untereinheit kodierenden Teilbereiche des K28-pptox Gens oder Teile davon enthalten. Von besonderem Interesse sind hier die Teilebereiche die proteolytische Spaltsignale enthalten.

Als Promotoren werden bevorzugt induzierbare Promotoren, wie z. B. der nmt1- Promotor benutzt. Aber es können darüber hinaus alle dem Fachmann bekannten Promotoren, bevorzugt Hefepromotoren genutzt werden. Bewährte Promotoren sind z. B. der ADH-2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674), der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (s. z. B. EP-B1-0127839) oder der frühe SV40-Promotor oder die LTR-Promotoren z. B. von MMTV (Mouse Mammary Tumour Virus; Lee et al. (1981) Nature, 214, 228).

Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können weitere funktionale Sequenzbereiche, wie z. B. einen Replikationsstartpunkt, Operatoren, Terminationssignale, wie z. B. das nmt1-Terminationssignal, oder Selektionsmarker, Repressoren, Aktivatoren kodierende Sequenzen enthalten.

Als geeignete Expressionsvektoren für Hefen haben sich z. B. der pREP-K28- Vektor, der pINT-K28-Vektor der pTZα/β-Vektor oder der pTZsp-Vektor erwiesen (Fig. 2 und 5), die auf frei erhältlichen Vektoren basieren, in die eine S/P- Signalsequenz des K28-Virus kloniert wurde. Weitere Beispiele für verwendbare eukaryotische Expressionsvektoren die sich für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sind z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren wie in EP-B1-0127839 oder EP-B1-0549721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen sind z. B. SV40-Vektoren geeignet, welche allgemein erhältlich sind.

In die erfindungsgemäßen Vektoren können heterologe oder homologe Gene kloniert werden, die in eukaryotischen Zellen exprimiert werden sollen (Zielgene). Diese Gene können entweder direkt im offenen Leseraster hinter der S/P- Signalsequenz des K28 Virus liegen oder in die α- oder β-Untereinheit des K28- pptox Gens eingebracht sein, so dass das Zielgenprodukt mit der S/P- Signalsequenz auf posttranslationaler Ebene zu einer ein Fusionsprotein kodierenden Sequenz prozessiert werden kann.

Interessante Zielgene sind vor allem eukaryotische Gene, wie z. B. eukaryotische Strukturproteine Enzyme, Rezeptoren, Repressoren, Transkriptionsfaktoren oder Ionenkanäle. Aber auch die Expression von künstlichen, künstlich veränderten oder mutierten Zielgenen ist denkbar.

Zum einen eröffnen die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren durch die Wahl einer homologen eukaryotischen Wirtszelle für die Expression bestimmter Proteine, Proteine mit ihren nativen posttranslationalen Modifikationsmuster einfacher und effizienter herzustellen, zum anderen kann die Expression von Zielgenen unter Verwendung bereits bekannter Wirtzzellen, wie z. B. S. cerevisiae, weiter verbessert werden. Ein bevorzugter Wirtsorganismus stellt die bisher kaum als Expressionsorganismus genutzte Hefe S. pombe dar. S. pombe steht den höheren Eukaryoten näher als z. B. S. cerevisiae darüber hinaus werden mit S. pombe sehr hohe Ausbeuten an sezerniertem Protein bezogen auf die Zelldichte erhalten.

Folglich sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Expressionssysteme aus eukaryotischen Wirtszellen, die mit den oben beschrieben eukaryotischen Expressionsvektoren transfiziert sind. Als Wirtszellen sind Hefen, insbesondere S. pombe bevorzugt. Aber auch die Verwendung anderer bewährter Hefen, wie z. B. die Gattungen Aspergillus, Schwanniomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, Arxula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Pichia, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces, Ustilago, Debaryomyces, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon, Kluyveromyces, Torulopsis oder Williopsis.

Verfahren zur Transfektion und Kultivierung der Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt. Im Vergleich zur zytoplasmatischen Expression rekombinanter Proteine ermöglicht die hier beschriebene Sekretion eine schnelle und kostengünstige Produktion interessanter Proteine, z. B. von medizinisch-pharmakologisch bedeutenden Proteinen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Vektorsysteme zur Klonierung von Zielgenen und zur Transfektion von eukaryotischen Zellen sowie die Verwendung so erzeugter Expressionssysteme zur Kultivierung und Herstellung von Proteinen.

Bei der sekretorischen Expression von Proteinen kann es vorteilhaft sein das Expressionsmedium mit Zusatzstoffen, wie z. B. Proteaseinhibitoren zu versetzen.

Zur Verdeutlichung der Erfindung dienen die Fig. 1 bis 7, die im folgenden kurz erläutert werden.

Fig. 1 Prozessierung des K28-Präprotoxins in Hefe.

Gezeigt ist die schematische Struktur des unprozessierten Toxin-Vorläufers. Des weiteren sind die Spaltstellen für eine Signal-Peptidase (S/P), und die Prozessierungstellen der Kex2p-, der Krp1p- und der Kex1p-Proteasen markiert. Potentielle N-Glykosylierungsstellen und eine Disulfidbrücke zwischen Cys⁵⁶ (α- Untereinheit) und Cys³⁴⁰ (β-Untereinheit) sind mit -CHO bzw. -S-S- gekennzeichnet.

Der K28 Toxin-Vorläufer besteht aus einer N-terminalen Signalsequenz (S/P), gefolgt von einer hydrophoben α-Untereinheit, die wiederum von einer eher hydrophilen β-Untereinheit über die N-glykosylierte γ-Untereinheit getrennt ist. Während der Passage durch den Sekretionsweg wird die Signalsequenz durch eine Signal-Peptidase entfernt. Das daraus entstehende Protoxin wird weiterhin durch die im Golgi-Apparat vorkommenden Kex1p/Kex2p Endoproteasen prozessiert, so dass schließlich ein aktives Toxin, bestehend aus einer α- und β-Untereinheit, die durch eine Disulfidbrücke verbunden sind, sekretiert wird.

Fig. 2 Schematische Darstellung der Expressionsvektoren pREP-K28 und pINT- K28.

Der Bereich des Spalthefen nmt1-Promotors für die Transkription-Initiation ist mit Pnmt1 und der für die Transkription-Termination mit Tnmt1 gekennzeichnet. S/P symbolisiert die Prozessierungs- und Sekretionssequenz des K28 Killertoxins. Dicke Linien repräsentieren Sequenzen aus Hefe, dünne Linien stellen Escherichia coli pUC19-Sequenzen dar (oriE, E. coli Replikationsursprung; AmpR, β-Lactamase Gen; ars1, autonome replizierende Sequenz aus S. pombe; LEU2, S. cerevisiae LEU2-Gen; S. pombe ura4⁺ und leu1⁺-Gene).

Fig. 3 Thiamin-regulierte Toxin-Expression der rekombinanten S. pombe Stämme.

Gezeigt ist der Filter eines Western Blots, auf dem das aktive Toxin mit einem polyklonalem Antiserum gegen die β-Untereinheit detektiert wird. Spuren 1 und 3, Kulturüberstände reprimierter S. pombe (pREP-K28 bzw. pINT-K28) Kulturen;

Spuren 2 und 4, Kulturüberstände induzierter S. pombe (pREP-K28 bzw. pINT-K28) Kulturen; Spuren R und I (negative Kontrolle), Überstände zweier S. pombe Transformanden, die entweder nur das pREP1- oder das pINT5-Plasmid tragen; Spur C Positivkontrolle, teilweise aufgereinigtes reifes K28 Toxin; Spur S, vorgefärbte Proteinfraktion zur Molekulargewichtsbestimmung. Der große Pfeil markiert das 21 kDa schwere aktive, heterodimere Toxin; die beiden kleinen Pfeile markieren das sich in einem SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen spontan bildende tetramere Derivat (α/β)₂ bzw. die monomere β-Untereinheit.

Fig. 4 Vergleich der rekombinanten bzw. homologen Toxin-Sekretion in S. pombe bzw. S. cerevisiae.

Gezeigt ist der Filter eines Western Blots, auf dem das aktive Toxin mit einem polyklonalen Antiserum gegen die β-Untereinheit detektiert wird (Fig. 4a). Das Auftragsschema ist wie folgt: Spuren 1 und 2, extrazelluläre Proben je einer induzierten Kultur des S. pombe Stammes, der das Toxin von dem episomal vorliegendem Plasmid (pREP-K28) bzw. dem chromosomal integriertem Plasmid sekretiert (pINT-K28); Spur 3 extrazelluläre Proben des S. cerevisiae Stammes, der das K28-pptox Genprodukt episomal exprimiert (pFR5-TPI) bzw. des Virus­ infizierten S. cerevisae Stammes MS 300c (ski2-2), der das Killertoxin überexprimiert. Spur 4, Positivkontrolle, konzentrierte und teilweise gereinigte Toxinfraktion einer S. cerevisiae K28 Killerhefe. Der große Pfeil markiert das 21 kDa schwere aktive, heterodimere Toxin; die beiden kleinen Pfeile markieren das sich in einer SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen spontan bildende tetramere Derivat (α/β)₂ bzw. die monomere β-Untereinheit.

Fig. 4b zeigt die relative Toxin-Sekretion der Hefestämme anhand des Vergleiches der Toxin-Signale mittels eines Laser-Scan-Densitometers.

Fig. 5 Schematische Darstellung der Expressionsvektoren pTZ/βGFP und pTZsp- GFP.

Der Bereich des Spalthefen nmt1-Promotors für die Transkription-Initiation ist mit Pnmt1 und der für die Transkription-Termination mit Tnmt1 gekennzeichnet. S/P symbolisiert die Prozessierungs- und Sekretionssequenz des K28 Killertoxins, GFP das grün-fluoreszierende Protein aus Aequorea victoria. Dicke Linien repräsentieren Sequenzen aus Hefe, dünne Linien stellen Escherichia coli pUC19-Sequenzen dar (oriE, E. coli Replikationsursprung; AmpR, β-Lactamase Gen; ars1, autonome replizierende Sequenz aus S. pombe; URA4, S. cerevisiae).

Fig. 6/7 Sekretion heterologer Fusionsproteine in S. pombe.

Gezeigt sind Filter von Western Blots, auf denen die Sekretion der jeweiligen Fusionen mit einem gegen das GFP-Protein gerichteten spezifischen Antikörper nachgewiesen wird. Die Belegung der beiden Filter ist die gleiche, wobei Fig. 6 die GFP-Sekretion vom Plasmid pTZα/β, und Fig. 7 die GFP-Sekretion vom Plasmid pTZsp zeigt.

Spuren 1 und 3; Kulturüberstände reprimierter S. pombe-Kulturen, die entweder als negative Kontrolle nur das Plasmid allein bzw. das Expressionsplasmid zur Sekretion des GFP tragen. Spuren 2 und 4; Kulturüberstände induzierter S. pombe Kulturen, die entweder als negative Kontrolle nur das Plasmid allein bzw. das Expressionsplasmid zur Sekretion des GFP tragen; Spur S, vorgefärbte Proteinfraktion zur Molekulargewichtsbestimmung; Spur C, Positivkontrolle, aufgereinigtes rekombinantes GFP Protein.

Im folgenden sind einige Ausführungsbeispiele beschrieben ohne die Erfindung darauf zu beschränken.

Expression rekombinanter Killertoxine in S. pombe

Die Plasmide zur episomalen bzw. chromosomal-integrierten Expression des K28 Killertoxins sind in Fig. 2 schematisch dargestellt. Zur Generierung wurde ein 1048 bp langes XhoI/BgIII-Fragment des K28 Killertoxin-kodierenden Hefe-Plasmids pPGK-M28-1 (Schmitt und Tipper, 1995) in die mit SaII/BamHI restringierten und linearisierten Expressionvektoren pREP1 und pINT5 aus S. pombe einkloniert. In beiden Konstrukten können damit die zu exprimierenden Proteine über den Thiamin­ regulierbaren Promotor nmt1 kontrolliert werden. Die Vektoren wurden darauf jeweils in die beiden Stämme der Wirtshefen S. pombe mittels Lithiumacetat-Methode transformiert. Die Transformanden wurden auf Minimalmedium ohne Uracil (bei pINT-K28) bzw. ohne Leucin (bei pREP-K28) selektiert. PINT-K28 bzw. pREP-K28 positive Hefetransformanden wurden auf ihren Killer-Phänotyp in einem Standardtest, dem Agar-Diffusions-Assay, auf Methylenblau gefärbten Agarplatten mit dem K28 toxinsensitiven S. cerevisae Stamm 192.2d getestet (Daten nicht gezeigt).

Über einen Western Blot konnte die induzierbare Toxin-Sekretion der rekombinanten S. pombe Stämme nachgewiesen werden (Fig. 3).

Hierfür wurden jeweils 600 µl Zellkulturüberstand des S. pombe Stammes mit dem episomal vorliegenden Plasmid (pREP-K28) bzw. des S. pombe Stammes mit dem chromosomal vorliegenden Plasmid (pINT-K28) bei einer Dichte von 5 × 10⁷ Zellen pro ml mit reprimierendem (Thiamin-haltigem, 25 µM) oder induzierendem (Thiamin­ freiem) Medium abgenommen, Ethanol gefällt und unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf einem 10-22.5%igen Gradientengel (SDS-PAGE) aufgetrennt. Nach dem Blot auf eine PVDF-Membran wurde das aktive Toxin durch ein polyklonales Kaninchenantiserum (Primärantikörper) gegen die β-Untereinheit des aktiven Toxins detektiert (Sekundärantikörper: Ziege anti Kaninchen IgG-Alkalische Phosphatase). Nach Inkubation der Membran mit einer NBT/BCIP-Färbelösung konnte die β-Untereinheit des Toxins über eine Färbereaktion sichtbar gemacht werden.

Bestimmung der Toxin-Sekretion eines K28 Virusinfizierten S. cerevisiae Stammes und der rekombinanten S. pombe Stämme.

Zur semiquantitativen Bestimmung der extrazellulären Toxinmengen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, je 600 µl zellfreie Kulturüberstände von einer induzierenden (Thiamin-freien) Kultur des S. pombe Stammes, der das pptox Gen episomal (pREP- K28) enthält und eines S. pombe Stammes, der das ppfox-Gen chromosomal (pINT- K28) enthält, genommen und mit je 600 µl zellfreien Kulturüberständen eines K28 infizierten überexprimierenden S. cerevisiae MS 300c (ski2-2)-Stammes und einem K28-Toxin episomal exprimierenden S. cerevisiae pFR5-TPI-Stammes verglichen (Fig. 4a). Diese Proben wurden Ethanol gefällt und unter nicht-reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die spezifische Detektion des aktiven Toxins wurde wiederum mit einem polyklonalen Antikörper gegen die β-Untereinheit durchgeführt (siehe Bsp. 1). Über die densitometrische Auswertung der gefärbten Banden mit einem Laser Scanner konnten die relativen Expressionstärken miteinander verglichen werden (Fig. 4b).

Killertoxin-vermittelte Sekretion heterologer Proteine in S. pombe.

Die Konstrukte zur episomalen Sekretion des grünen-fluoreszierenden-Proteins (GFP) sind in Fig. 5 schematisch dargestellt. Eine DNA, die für das GFP Protein aus Aequorea victoria kodiert wurde als BamHI/BamHI-Fragment mit einem BgIII/BgIII- Fragment des Expressionsvektors pTZα/β bzw. mit einem BgIII/BgIII-Fragment des Expressionsvektors pTZsp kloniert. Die Hybridplasmide pTZα/β und pTZsp sind aus Sequenzen des Expressionsvektors pREP4x und dem K28 pptox Gen bzw. des Expressionsvektors pREP4x und der Signalsequenz S/P des pptox Gens entstanden (Basi et al., 1993; Schmitt und Tipper, 1995).

Im ersten Fall wird damit ein Fusionsprotein, bestehend aus der α-, und der β- Untereinheit des aktiven Toxins und dem GFP-Protein (pTZα/β-GFP), in dem anderen Fall eine Fusion bestehend aus der Signalsequenz (S/P) und dem GFP- Protein exprimiert (pTZsp-GFP). Nach Prozessierung und Sekretion sollte man u. a. das rekombinante GFP-Protein im Überstand nachweisen können. Die Plasmide wurden mittels Lithiumacetat-Methode in S. pombe transformiert und auf Minimalmedium ohne Uracil selektioniert. In beiden Stämmen werden die zu exprimierenden Proteine wiederum über den Thiamin-regulierten Promotor nmt1 kontrolliert.

Für die aufgeführten Experimente wurden die rekombinanten Stämme zuerst 24 Stunden in Uracil-haltigem EEM-Medium und danach zur Repression 24 Stunden im gleichen Medium in Gegenwart von 25 µM Thiamin kultiviert (Fig. 6/7). Zur nachfolgenden Derepression und somit Expression der Fusionsproteine wurden die Kulturen für 36 Stunden in Thiaminfreiem EEM-Medium inkubiert.

Von den einzelnen Zellkulturen wurden 4.5 ml Kulturüberstand lyophilisiert, in 30 µl H₂O resuspendiert und gelelektrophoretisch auf einem reduzierenden SDS-PAGE analysiert. Nach Blot auf eine PVDF-Membran konnte sekretiertes GFP mittels einer Antikörperreaktion nachgewiesen werden (spezifischen Primärantikörper: anti GFP IgG der Maus; Sekundärantikörper: anti-Maus IgG-Peroxidase).

Durch Inkubation der Membran mit dem POD-BM Chemilumineszenz Blotting- Substrat der Firma Roche Diagnostics konnte die entstehende Chemilumineszenz mittels Exposition auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht werden.

Literaturhinweise zum Stand der Technik

Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. (1993) Gene 123: 131-136.
Bröker, M., Ragg, H., Karges, H. E. (1987) Biochemical Biophysical Acta 908: 203-213.
Lu, Y. Bauer, J. C., Greener, A. (1997) Gene 200: 135-144.
Sambamurti, K. (1997) In: Foreign gene expression in fission Yeast: S. pombe, Giga- Hama, Y. und Kumagai, H. (eds.) Springer Verlag: 149-158.
Schmitt, M. J. und Tipper, D. J. (1990) Molecular and Cellular Biology 10: 4807-4815.
Schmitt, M. J. und Tipper, D. J. (1995) Virology 213: 341-351.
Tokunaga, M., Kawamura, A., Yonekyu, S. (1993) Yeast 9: 379-387.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (23)

1. Sekretionssignalsequenz für eukaryotische Expressionssyteme mit der Aminosäuresequenz Seq. Id. No. 1 oder einer funktionellen Variante davon.

2. DNA-Sequenz, die für ein Sekretionssignal gemäß Anspruch 1 kodiert.

3. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 mit einer Nukleotidsequenz Seq. Id. No. 2 oder einer funktionellen Variante davon.

4. Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen enthaltend einen Promotor und die S/P-Sekretionssignalsequenz des pptox Gens des Virus K28 gemäß Seq. Id. No. 2 oder einer funktionellen Variante dieser Sequenz mit einer Sequenzhomologie von mindestens 70%, die 3'-wärts zum Promotor liegt.

5. Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen gemäß Anspruch 4 enthaltend eine zur S/P-Sekretionssequenz funktionelle Variante, die unter stringenten Bedingungen mit der S/P-Sekretionssignalsequenz (Seq. Id. No. 2) hybridisiert oder eine dazu allele Variante.

6. Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor zusätzlich die α- und/oder β- und/oder γ-Untereinheit des K28-pptox Gens oder Teile davon enthält.

7. Expressionsvektor für eukaryotische Zellen gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor die zum Spleißen des K28-ppfox- Gentranskripts nötigen Sequenzbereiche des pptox Gens oder eine funktionelle Variante davon mit einer Homologie von mindestens 70% enthält.

8. Expressionsvektor für eukaryotische Zellen gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor ein 3'-wärts zum Promotor liegendes Gen enthält.

9. Expressionsvektor für eukaryotische Zellen gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen ein heterologes Gen ist.

10. Expressionsvektor für eukaryotische Zellen gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen ein eukaryotisches Gen ist.

11. Expressionsvektor für eukaryotische Zellen gemäß einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsvektoren weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für Selektionsmarker, Repressoren oder Aktivatoren kodieren und/oder die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die als Replikationsstartpunkt, Terminationssignal oder Operator wirken.

12. Expressionsvektor für eukaryotische Zellen gemäß einem der Ansprüche 4 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor den Thiamin induzierbarer Promotor nmt1 enthält.

13. Expressionsvektor für eukaryotische Zellen gemäß Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor als Terminationssignal die Tnmt1- Nukleinsäuresequenz enthält.

14. Expressionsvektor für eukaryotische Zellen gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor ein pREP- K28-Vektor, ein pINT-K28-Vektor, ein pTZα/γ-Vektor oder ein pTZsp-Vektor ist.

15. Expressionssystem umfassend eine eukaryotische Zelle und einen Expressionsvektor gemäß dem Anspruch 8.

16. Expressionsvektor gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryotische Zelle eine Hefe ist.

17. Expressionssystem gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezelle aus der Gruppe Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae ausgewählt ist.

18. Fusionsproteine enthaltend eine S/P-Sekretionssignal (Seq. ID. No. 1) oder eine funktionelle Variante davon mit einer Sequenzhomologie von mindestens 80%.

19. Fusionsproteine enthaltend das S/P-Sekretionssignal (Seq. ID. No. 1) oder eine funktionellen Variante davon mit einer Sequenzhomologie von mindestens 80% erhältlich durch Expression eines Gens, das 3'-wärts zum Promotor eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 4 kloniert ist.

20. DNA-Sequenzen kodierend für ein Fusionsprotein gemäß den Ansprüchen 18 und 19.

21. Verwendung eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 4 zur Klonierung von Genen.

22. Verwendung eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 8 zur Transformation von eukaryotischen Zellen.

23. Verwendung eines Expressionssystems gemäß Anspruch 15 zur Herstellung von Proteinen.