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DE10061200A1 - Verfahren und Kit zur Diagnose spongiformer Encephalopathien - Google Patents

Verfahren und Kit zur Diagnose spongiformer Encephalopathien

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DE10061200A1
DE10061200A1 DE2000161200 DE10061200A DE10061200A1 DE 10061200 A1 DE10061200 A1 DE 10061200A1 DE 2000161200 DE2000161200 DE 2000161200 DE 10061200 A DE10061200 A DE 10061200A DE 10061200 A1 DE10061200 A1 DE 10061200A1
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prion
antibody
prion protein
protein
microparticles
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DE2000161200
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Niels Wedemeyer
Juergen Weidner
Heiko Wiebusch
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Individual
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Abstract

Ein Verfahren zum Nachweis spongiformer Encephalopathien sowie ein Diagnosekit mit Mikropartikeln, die einen gegen einen Erreger der Encephalopathien gerichteten Antikörper tragen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zum Nachweis übertragbarer spongiformer Encephalopathien.
Alls Übertragbare spongiforme Encephalopathien (transmissible spongiforme encephalopathy (TSE)) oder auch Prionen-Erkrankungen wird eine Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen bezeichnet, die im Gegensatz zu gene­ tisch bedingten ähnlichen Erkrankungen durch die Infektion mit pathogenen Proteinen (Prionen oder Prionproteinen) ausgelöst werden (Prusiner, 1982). Dazu gehören die Creutzfeld-Jakob Erkrankung beim Menschen (CJD), Kuru, Scrapie beim Schaf und die Bovine Spongiforme Encephalopathie (BSE) beim Rind.
Prionen (nachfolgend auch Prionproteine) sind infektiöse Isoformen nativer ubiquitär vorkommender Proteine (PrP), deren physiologische Bedeutung noch unbekannt ist. Von dem nativen Protein unterscheidet sie sich durch eine Abweichung in der Aminosäuresequenz, die sie unlöslich, hitzeresistent und zudem unzugänglich für einen vollständigen proteolytischen Abbau macht (Forloni et al., 1993).
Pathogene Prionproteine besitzen einen kleinen N-terminalen Abschnitt (PrP106-126), der - im Gegensatz zu dem nativen Protein mit einer α-Helix- Struktur - eine stabile β-Faltblattstruktur aufweist. Sie neigen zur Aggregation mit weiteren gleichartigen Peptiden zu so genannten Fibrillen (Tagliavini et al., 1991). Diese Fibrillen sind nach Infektion einer Zelle in der Lage, native Proteine in ihrer Struktur zu konvertieren, die damit ihrerseits ebenfalls pathogen werden (Horwich und Weissman, 1997). Es kommt auf diese Weise zur Verklumpungen einer Vielzahl pathogener Proteine. Diese Ver­ klumpungen sind auch als amyloide Plaques im Hirn erkrankter Individuen bekannt und stellen - ähnlich wie bei vergleichbaren neurodegenerativen Erkrankungen wie z. B. Altzheimer oder Veitstanz (Chorea Huntington) - die primäre Ursache für das Absterben essentieller Hirnregionen dar (Tagliavini et al., 1991).
Bei allen Säugern verläuft die Pathologie der Prionen-Erkrankungen ver­ gleichbar. Aufgrund der hochkonservierten Struktur der Prionen können Prione aus Plaques erkrankter Individuen nicht nur Individuen der eigenen, sondern auch einer fremden Spezies infizieren. Dies wurde durch Versuche mit Rindern und Primaten (Makake) gezeigt (Collinge et al., 1996). Die Übertragung der Prionen-Erkrankung (Scrapie) vom Schaf auf das Rind sowie von Rind (BSE) auf den Menschen gilt daher als sehr wahrscheinlich.
Beim Menschen wird dieser Übertragungsweg mit der neuen Variante der Creutzfeld-Jacob-Erkrankung in Verbindung gebracht, die im Gegensatz zur klassischen Erkrankung bereits bei jungen Erwachsenen auftritt. Dabei sind vor allem Personen anfällig, dessen PrP-Protein an der Position 129 ein Methionin aufweist. Diese Gruppe stellt einen Anteil von ca. 11% der Gesamtbevölkerung dar.
Nach dem vermehrten Auftreten von BSE-Fällen in Großbritannien Mitte der 80er Jahre existieren strenge Kontrollen über Herkunft und Verwendung von Schlachtvieh in Europa. Eine vollständige epidemiologische Kontrolle spon­ giformer Encephalopathien ist jedoch nur durch die lückenlose Untersuchung kompletter Tierbestände und des gesamten Schlachtviehs möglich. Daher wird ein Schnelltest gefordert, mit dem routinemäßig alle Schlachttiere auf spongiforme Encephalopathien untersucht werden, bevor das Fleisch in den Handel gelangt.
Zum Nachweis spongiformer Encephalopathien sind post mortem-Verfahren bekannt, während zuverlässige in vivo-Tests noch nicht zur Verfügung ste­ hen. Die post mortem-Verfahren basieren im wesentlichen auf einem immu­ nologischen Nachweis der Prionproteine, der mittels prionprotein-spezifi­ scher monoklonaler Antikörper erbracht wird. Als Referenz dazu dienen mikroskopische Untersuchung von Hirnschnitten, wobei insbesondere die Elektronenmikroskopie (Scott et al., 1992; Stack et al., 1991) und die Immunohistochemie an formalinfixierten Proben (Schulz-Schaeffer et al., 2000; Van Eversbroeck et al., 1999) erfolgreich eingesetzt werden. Die bei­ den letztgenannten Methoden bringen hoch präzise und zuverlässige Ergeb­ nisse. Aufgrund der erforderlichen Arbeitsintensität und der notwendigen Qualifikation des Personals sind sie als Standardmethode im Rahmen einer routinemäßigen Massenabfertigung jedoch ungeeignet.
Daneben gibt es Bestrebungen, BSE-Detektionssysteme auf der Basis fluo­ reszenzspektroskopischer Methoden zu etablieren. Dazu wird beispielsweise die als fluorescence correlation spectroscopy (FCS) bekannte Methode her­ angezogen, die üblicherweise der Untersuchung dynamischer Prozesse monomerer Proteine dient (Bieschke et al., 2000). Erste Ergebnisse deuten auf eine hohe Sensitivität dieses Verfahren auch bei der Diagnose von Prio­ nen-Erkrankungen hin. Auch dieses Verfahren bedarf jedoch eines geschul­ ten Personals und steht derzeit für den routinemäßigen Einsatz in der Praxis nicht zur Verfügung stehen.
Alternativ werden auch ELISA-Verfahren zur Diagnose von Prionen- Erkrankungen, insbesondere BSE eingesetzt (Grathwohl et al., 1997; Meyer et al., 1999). Dazu werden die Antigene, also Prionproteine, Fibrillen oder Abschnitte davon aus der aufbereiteten Gehirn- oder Spinalflüssigkeitsprobe der Rinder zunächst auf Oberflächen z. B. von Mikrotiterplatten immobilisiert werden. Anschließend erfolgt der immunologische Nachweis über einen ersten spezifischen und einen zweiten Enzym-gekoppelten Antikörper, oder andere Farbreaktionen. Hierbei handelt es sich um einen indirekten Test, da die Prionenproteine selbst nicht detektiert werden.
Derzeit wird der Nachweis von BSE bei Rindern zu Zwecken der veterinär­ medizinischen Kontrolle zumeist über Western Blot-Verfahren geführt (Rubenstein et al., 1987; Doi et al., 1988; Lee et al., 2000). Das Nachweisprinzip macht sich dabei die Tatsache zunutze, daß das native Prion­ protein PrPc durch Proteasen abbaubar ist, während nach einer Protease- Behandlung das pathogene Prionprotein PrPsc als verdauungsresistentes Fragment übrigbleibt. Anschließend wird das Fragment über einen Immuno­ blot detektiert, d. h. nach einer elektrophoretischen Auftrennung der Probe in einem Polyacrylamidgel wird das verbliebene PrPsc-Fragment auf eine Membran übertragen und mit einem Prionprotein-spezifischen Antikörpers gebunden. Der endgültige Nachweis des zweiten Antikörpers ist üblicherweise mit einem Enzym gekoppelt, das eine Farbreaktion vermittelt oder ist radioaktiv markiert.
Das bekannte Immunoblot-Verfahren setzt eine ausreichend hohe Konzen­ tration pathogener Prionproteine in der Untersuchungsprobe voraus, die - nach derzeitigen Erkenntnissen - etwa 6 Monate vor dem Auftreten erster klinischer Symptome, frühestens aber 30 Monate nach der Infektion des Tie­ res in Gehirnproben oder in der Spinalflüssigkeit erreicht ist. Aufgrund der für den Immunoblot erforderlichen nachweisbaren Anreicherung kann demnach BSE erst zu einem Zeitpunkt sicher nachgewiesen werden, wenn das erkrankte Tier bereits schon lange infektiös ist und daher eine Gefahr für den Konsumenten darstellt. Für die betroffenen Verbraucher und vor allem für die Landwirte ist dies ein erheblicher Nachteil.
Darüber hinaus beträgt die Bearbeitungszeit für einen dieser - derzeit als Schnelltest bekannten - Immunoblots etwa 6 bis 7 Stunden und setzt zudem geschultes Personal voraus. Dieser zeitliche Faktor stellt vor allem aufgrund der neuen gesetzlichen Verpflichtung zur Überprüfung tatsächlich jeden Schlachttieres ein erhebliches Hindernis für eine schnelle, zuverlässige und vollständige veterinärmedizinische Routinekontrolle dar. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nicht für parallele Untersuchungen einer Vielzahl von Pro­ ben und für die Automatisierung geeignet. Letztes ist besonders bei hoch infektiösem Material aus Gründen der Arbeitssicherheit wünschenswert.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die bekannten immunologi­ schen Nachweisverfahren von Prionen-Erkrankungen, insbesondere von BSE, zu verbessern und damit ein Verfahren und ein Untersuchungspaket (nachfolgend auch Kit) bereitzustellen, das möglichst sensitiv, einfach zu handhaben und schnell durchzuführen ist. Das Verfahren sollte dabei mög­ lichst auch ohne langwierige Schulung des Personals durchführbar und daher einer Automatisierung weitgehend zugänglich sein.
Die Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren gemäß dem Hauptanspruch. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Der Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, die prionprotein-spezifi­ schen Antikörper an Mikropartikel zu binden und eine Antikör­ per/Prionprotein-Bindung mit einem zweiten prionprotein-spezifischen Anti­ körper nachzuweisen.
Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt dabei darin, die Prionproteine auf der Oberfläche der Mikropartikel anreichern zu können. Mit dieser Anreicherung wird die Nachweisgrenze der pathogenen Prionpro­ teine in den Untersuchungsproben erniedrigt und somit die Sensitivität des Test deutlich erhöht. Durch die Verwendung von Mikropartikeln können zudem auch kleinste Probenvolumina analysiert werden, was wiederum der Arbeitssicherheit dient.
Bei Mikropartikeln (auch microbeads oder microspheres) handelt es sich um bereits seit fast zwei Jahrzehnten bekannte Instrumente der Biochemie, die erfolgreich zum Nachweis extrazellulärer Proteine eingesetzt werden (Lisi et al., 1982; Kempfer et al., 1999; lannelli et al., 1997). Sie stellen feste oder halbfeste Partikel mit einem Durchmesser von bis maximal 100 µm, vor­ zugsweise bis zu 10 µm dar. Besonders geeignet sind Mikropartikel eine Größe bis zu 8 µm. Sie bestehen üblicherweise aus Polystyrol oder Latex; auch Mikropartikel auf der Basis von Silikaten sind möglich. An ihren Oberflächen können Proteine - so auch Antikörper - beispielsweise über Car­ boxylgruppen kovalent gebunden sein. Zur Bindung spezifischer Antikörper an Mikropartikel steht die bekannte sog. Carbodiimid-Methode zur Verfügung (Molday et al., 1975). Daneben ist erfindungsgemäß jedoch auch der Einsatz von unmodifizierten Mikropartikeln oder von Mikropartikeln mit spezifischen Liganden möglich.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden erfindungsgemäß paramagnetische Mikropartikel eingesetzt, die beispielsweise Eisenionen in Form von Fe2O3 oder Fe3O4 enthalten. Sie ermöglichen eine einfache und leichte Handhabung, die mit Hilfe entsprechender Magneten automatisiert werden kann. Die Automatisierung von Arbeitsschritten ist insbesondere bei hochinfektiösem Material bedeutsam. So wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Einsatz eines Robotors möglich, mit dem zum Beispiel über elektromagnetische Stifte, die in Probelösungen eintauchen, die paramagnetischen Mikropartikel in eine jeweils nächste Probenlösung transferiert werden können. Mit fortschreitender Automatisierung sinkt dabei der Bedarf an qualifiziertem Personal.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper mit einer Spezifität gegen Epitope der nativen oder pathogenen Prionproteine oder der Fibrillen eingesetzt werden. Sofern ein zweiter Antikörper zum Nachweis des ersten Antikörpers oder der Bindung des Prionproteins an den ersten Antikörper erforderlich ist, kann dieser ent­ weder mit einem durch eine Enzymreaktion detektierbaren Chromogen, oder einer direkt detektierbaren Chromophore oder fluoreszente Proteine, wie Phycoerythrin oder Allophycocyanin gekoppelt sein. Auch eine radioaktive Markierung oder andere Markierungen sind möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in Anlehnung an das bekannte ELISA-Verfahren durchgeführt werden. Dabei ist allerdings eine Immobilisie­ rung der Antigene auf einer Membran oder Oberfläche der Reaktionsgefäße (üblicherweise also der Mikrotiterplatten) nicht mehr erforderlich. Vielmehr können die mit Antikörpern gekoppelten Mikropartikel in die wells der Mikro­ titerplatten aufgenommen und dort mit dem aufbereiteten Probenmaterial inkubiert werden. Nach ggf. der Behandlung mit einem zweiten Antikörper und der anschließenden Farbreaktion kann die Detektion mit Hilfe eines übli­ chen Auswertegeräts erfolgen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind prionprotein-spezifi­ sche Antikörper an paramagnetische Mikropartikel gebunden (Fig. 1) Die Antikörper sind dabei vorzugsweise gegen die fibrillären Prionproteine gerichtet. Mit einem zweiten Fluoreszenz-markierten Antikörper, der gegen ein anderes Epitop der Fibrillen gerichtet ist, erfolgt der qualitative Nachweis der Prionproteine. Hiermit ist gewährleistet, daß unspezifisch an den Mikro­ partikeln gebundene Proteine nicht erfaßt werden. Die quantitative Erfas­ sung der gebundenen Prionen erfolgt durch die Auswertung der Fluo­ reszenzsignale in einem Fluoreszenzdetektionsgerät, z. B. einem Durchfluß­ zytometer.
Die Verwendung eines Durchflußzytometers stellt eine besonders bevor­ zugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Die Vorteile der Durchflußzytometrie liegen insbesondere darin, daß schon mit einfachen Geräten 100 Fluoreszenzmoleküle pro Partikel erfaßt werden, was etwa der hohen Empfindlichkeit eines radioaktiven Assays entspricht. Zum anderen können bis zu 1000 Partikel pro Sekunde gemessen werden. So kann die Messung einer hohen Anzahl von Proben innerhalb kürzester Zeit gewährlei­ stet werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann eine interne Kontrolle mitgeführt werden. Diese kann darin bestehen, daß zusätzlich zu den Mikro­ partikeln zum Nachweis der pathogenen Prionproteine Mikropartikel mit Anti­ körpern gegen das native Prionprotein verwendet werden. Diese dienen der Kontrolle einer vollständigen Proteolyse des nativen Prionproteins. Sofern nämlich nach einer Inkubation mit einem zweiten, ebenfalls gegen das native Protein gerichteten, fluoreszenz-markierten Antikörpers im eine Fluoreszenz zu detektieren ist, ist der Nachweis einer unvollständigen Proteolyse erbracht. Dies ist bedeutsam für die Beurteilung möglicher falsch positiver Ergebnisse, die auf eine unvollständige Verdauung zurückgehen. Die Zuverlässigkeit des Tests kann durch diese internen Kontrollen somit deut­ lich erhöht werden.
Zum Zwecke der internen Kontrolle können für die Auswertung in der Durch­ flußzytometrie auch verschiedene Mikropartikel verwendet werden, die sich ggf. in ihrer Größe oder Färbung unterscheiden. Der Vorteil der Durchfluß­ zytometrie liegt dabei darin, daß diese Mikropartikel in einem Verfahren gleichzeitig aber getrennt voneinander analysiert werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren in der Ausführungsform mit paramagneti­ schen Mikropartikel und der Durchflußzytometrie als Detektionsverfahren fluoreszenz-markierter prionprotein-spezifischer Antikörper bietet zudem den Vorteil der einfachen und leichten vollständigen Automatisierung.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines in den Zeichnungen darge­ stellten Ausführungsbeispieles des nähren erläutert. Darin zeigen:
Fig. 1 schematische Darstellung des Nachweises von Prionproteinen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und
Fig. 2 Histogramm einer Fluoreszenzdetektion nach der erfindungsge­ mäßen Verfahrens mittels einer Durchflußzytometrie
Fig. 1. zeigt ein Schema eines bevorzugten Ausführungsbeispiels des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens. Danach werden prionprotein-spezifische Anti­ körper an einen paramagnetischen Mikropartikel gebunden, die ihrerseits an das Prionprotein binden. Mittels eines zweiten fluoreszenz-markierten spezifischen Antikörpers erfolgt der Nachweis der Bindung des Prionproteins an den ersten Antikörper. Anschließend erfolgt die quantitative Auswertung in einem Durchflußzytometer.
Fig. 2. zeigt das Beispiel einer durchflußzytometrischen Auswertung. Dazu wurden paramagnetische Mikropartikel mit gekoppelten Anti-Prion-Antikörper nach der Zugabe von BSA (A) und nach der Zugabe von prionischen Fibril­ len (B) im Durchflußzytometer gemessen. Die Fluoreszenzfärbung erfolgte durch die Zugabe eines weiteren Anti-Prion-Antikörpers, der mit Phy­ coerythrin gekoppelt war.
Die pro Mikropartikel gemessene Orange-Fluoreszenz ist als Histogramm dargestellt. Ist sie gering, so erscheint ein Histogramm am linken Rand. Ist sie hingegen hoch, wandert sie nach rechts.
Beispiel 1. Aufbereitung des Probenmaterials
100 mg einer Hirnprobe eines geschlachteten Rindes werden in 900 µl Lysispuffer (100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5% Natrium­ desoxycholat, 10 mM Tris pH 7.4) und 100 µl Proteinase K (1 mg/ml) übertragen. Die Probe wird anschließend 5 sec. im Ultrathorax (Sigma, St. Louis, IL, USA) homogenisiert. Der proteolytische Verdau erfolgt bei 37°C für 30 min. Zum Stoppen der enzymatischen Reaktion wird 10 µl 0.5 M PMSF (pH 6.8) hinzugegeben und der Probenansatz für 10 min gekocht.
2. Kopplung der Antikörper an die Mikropartikel 2.1. Monoklonale Antikörper
Magnetische Mikropartikel. Monoklonale Antikörper 3F4 (M 7216, Dako, Hamburg) werden mit Hilfe eines Kopplungs-Kits (Cat. No. 19539) der Firma Polysciences (Warringden, PA, USA) in einem Verhältnis 2 : 1 kovalent an die magnetischen Mikropartikel (CM-30-10) der Fa. Spherotech Inc. Libertyvill, IL, USA gebunden. Die Mikropartikel weisen einen Durchmesser von 3,5 µm auf.
2.2. Polyklonale Antikörper
Für einen qualitativen Nachweis der Fibrillen wird ein polyklonaler (Kaninchen-)Antikörper (PA 1-750, Dianova, Hamburg) verwendet. Dazu werden die Mikropartikel (siehe Ziffer 2.1.) mit 10 µl 1 : 50 verdünntem Antikörper versetzt und 30 min bei 4°C inkubiert
3. Inkubation der Mikropartikel mit Probenansatz
100 µl des Probenansatzes werden mit 10 µl der nach Ziffer 2.1. oder nach Ziffer 2.1. behandelten Mikropartikel inkubiert. Die Inkubationszeit beträgt 1 h bei 4°C. Anschließend werden die Mikropartikel zweimal mit 1 ml PBS plus 0.1% BSA zur Sättigung der freien Bindungsstellen gewaschen. Der Austausch der Inkubationslösungen erfolgt jeweils durch Verwendung eines Magnetständers (Fa. Promega).
4. Fluoreszenzmarkierung
Die Fluoreszenzmarkierung erfolgt nach wiederholtem Waschen mit PBS/BSA durch Zugabe von 5 µl Phycoerythrin-(PE)-konjugiertem Anti- Rabbit-Antikörper (RD I-711116152; Research Diagnostics, Flandern, NL) und einer 30 minütigen Inkubation bei 4°C. Nach einmaligem Waschen mit 1 ml PBS und Aufnahme in 1.5 ml PBS können die Proben im Durchflußzytometer gemessen werden.
5. Fluoreszenzdetektion
Hierzu wird ein PAS III Durchflußzytometer der Firma Partec (Münster) mit FlowMax-Software verwendet. Das Gerät enthält einen 25 mW- Argon-Laser, der eine Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Die Orange- Emission wird mit einem 575-605 nm Bandpass-Filter gemessen. Die Daten werden als Fluoreszenzhistogramm dargestellt, wobei die durch­ schnittliche Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Partikel aufge­ tragen ist. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität ist dabei propor­ tional zur gebundenen Prionenmenge (Abb. 2).
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Abbildungstext Abb. 1
Schema des Verfahrens zum Nachweis von Prionen mit Hilfe von Mikroparti­ keln.
Abb. 2
Durchflußzytometrischer Nachweis von Prionen. Paramagnetische Mikropar­ tikel mit gekoppelten Anti-Prion-Antikörper wurden nach Zugabe von BSA (A) und nach Zugabe prionischer Fibrillen (B) im Durchflußzytometer gemessen. Die Fluoreszenzfärbung erfolgte durch die Zugabe eine weiteren Anti-Prion- Antikörpers, der mit Phycoerythrin konjungiert war.

Claims (20)

1. Immunologisches Verfahren zur Bindung von Prionproteinen oder Abschnitten davon beinhalten die Kopplung eines ersten prionprotein­ spezifischen Antikörpers an einen Mikropartikel.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Inkubation des Mikropartikels mit einer Prionproteine bzw. Prionproteinabschnitte ent­ haltenden Probe zur Ausbildung eines Antikörper/Prionprotein-Komple­ xes.
3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch einen Nachweis des Antikörper/Prionprotein-Komplexes durch einen zweiten nachweis­ baren prionprotein-spezifischen Antikörper.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper einen Fluoreszenzmarker aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch eine Quantifizie­ rung des Fluoreszenzmarkers durch ein Fluoreszenzlesegerät.
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine Durchfluß­ zytometrie.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch paramagnetische Mikropartikel.
8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 8 µm.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine interne Kontrolle.
10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch einen weiteren Antikörper gegen ein natives Prionprotein.
11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch mindestens zwei Arten in Größe oder Farbe verschiedener Mikro­ partikel.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch polyklonale prionprotein-spezifische Antikörper.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch monoklonale prionprotein-spezifische Antikörper.
14. Mikropartikel mit einem prionprotein-spezifischen Antikörper.
15. Mikropartikel nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch einen PrPsc-spezifischen Antikörper.
16. Verwendung eines Mikropartikels nach Anspruch 14 oder 15 zum Nach­ weis von Prionen.
17. Verwendung eines Mikropartikels nach Anspruch 14 oder 15 zum Nach­ weis spongiformer Encephalopathien.
18. Verfahren zum Nachweis von Prionproteinen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die Verwendung von Blut, Muskel, Spinalflüssigkeit, Urin oder Hirnproben.
19. Diagnosekit nach Anspruch 17, gekennzeichnet durch einen zweiten prionproteinspezifischen Antikörper.
20. Diagnosekit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper einen Fluoreszenzmarker aufweist.
DE2000161200 2000-12-08 2000-12-08 Verfahren und Kit zur Diagnose spongiformer Encephalopathien Withdrawn DE10061200A1 (de)

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