DE10058690C1 - Objektträgersystem für die Labordiagnostik und Mikroskopie - Google Patents

Abstract

Multifunktionelles Objektträgersystem für die Untersuchung von biologischen Proben auf einem transparenten Material mit steifer Grundplatte (1), an dessen Oberseite (2) sich sechs strukturelle Vertiefungen als Kammern (3) mit je zwei Stichkanälen (4) befinden; dazu existiert eine komplementäre Platte mit Ausbuchtungen auf den Längsseiten, die geeignet sind, beim Übereinanderlegen der beiden Platten die Stichkanäle zu verschließen und somit sechs geschlossene Kammern zu bilden. Bauartbedingt ergibt sich die Patenfähigkeit durch die kommerzielle Nutzung des Objektträgersystems bei der Durchführung von Mikroarrays zur allgemeinen Immun- und/oder Tumordiagnostik, der gewerblichen Nutzung des Objektträgersystems in der Zellkultur oder für Hybridisierungen von genetischem Material. Das Objektträgersystem kann manuell oder automatisch, d. h. programmgesteuert, bestückt und ausgewertet werden.

Description

Beschrieben wird ein Objektträgersystem für die Labordiagnostik und Mikroskopie. Die Erfindung betrifft ein multifunktionelles, transparentes Objektträgersystem und beschreibt ein bisher noch nicht verfügbares, frei verwendbares Objektträgersystem für unterschiedliche Applikationen in Forschung, Klinik und pharmazeutischer Industrie.

Bauartbedingt ergeben sich durch den Gegenstand dieser Erfindung, also durch das Objektträgersystem, für die Benutzer Vorteile erheblicher Art dadurch, dass 2 Objektträger miteinander kombiniert werden können. Bisher beschrieben wurden Zählkammern, bestehend aus einer strukturierten Grundplatte und einem dünnen Deckplättchen, für die Partikelzählung in kleinen, exakt definierten Flüssigkeitsmengen.

Die Erfindung ist ein Objektträger für die Labordiagnostik mit einer rechteckigen Grundplatte (2) und einer gleichgroßen Deckplatte (1). In der Grund- und Deckplatte sind 6 gleichgroße, nebeneinander liegende Vertiefungen oder Segmente vorhanden, die beim Verbinden jeweils einen Untersuchungsbereich festlegen. Die Wände der Längsseiten von Grund- und Deckplatte sind mit je 6 zueinander komplementären Elementen versehen, die eine exakte und passgenaue Verbindung beider Platten gewährleisten. Auf den Seitenwänden der Grundplatte (2) befinden sich Erhebungen oder Nocken, jeweils zwei pro Kammersegment.

Durch die Kombination von Deck- (1) und Grundplatte (2) entsteht ein geschlossener Kammertyp.

In der Deckplatte (1) sind in den Wänden der Längsseiten Vertiefungen oder Nuten ausgebildet, jeweils zwei pro Segment. Durch die Kombination zweier Deckplatten (1) entsteht ein Kammertyp mit Kanälen für die Zu- bzw. Abfuhr von Flüssigkeiten.

Das neuartige Objektträgersystem grenzt sich schon allein bauartbedingt von den bisher verfügbaren Objektträgern deutlich ab; daneben ist der vielseitige Verwendungszweck, u. a. der Einsatz zur Herstellung von Mikroarrays, ein anderer als der in den bisherigen Schriften beschriebene für Objektträger, die in Verbindung mit einem Deckglas für die Mikroskopie eingesetzt werden, und ein Zähl- oder Beobachtungsystem darstellen. Bisherige, bekannte Objektträger (DE 33 33 674 C2, US 4722598, DE 36 50 701 T2, DE 44 03 308 C2) waren also der allgemeinen Mikroskopie und einer Partikelzahlbestimmung, sowie einer immunhistologischen Präparateuntersuchung vorbehalten. Darin eingebrachtes, flüssiges Probenmaterial verteilt sich durch Kapillarwirkung auf einer fein strukturierten Grundplatte, die mit einer dünnen Abdeckplatte versehen ist.

Bei dem hier beschriebenen System lassen sich die Plattentypen einzeln nutzen oder in einer Weise kombinieren, dass aus zwei Deckplatten (1) ein seitlich offenes Kammersystem entsteht, hingegen aus einer Deck- (1) und einer Grundplatte (2) ein "geschlossenes" System, in das bis zu 380 µl Flüssigkeit eingebracht werden können. Einen Objektträger zur Untersuchung von flüssigen Proben beschreibt die Patentschrift DE 36 50 701 T2 "Mikroskop-Objektträger"; hierbei handelt es sich jedoch wiederum um ein sehr flaches Kammersystem zur Beobachtung und Auszählung von Partikeln in kleinen Flüssigkeitsmengen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine Vorrichtung zur Kultivierung oder molekulargenetischen Untersuchung von Geweben, z. B. kryoskopischen Gewebeschnitten oder Blutzellen.

Eine Erfindung für immunhistochemische Gewebsuntersuchungen in einem sehr flachen, 50 µm hohen Kammersystem ist durch DE 36 35 013 C2 bekannt. Aus der sehr unterschiedlichen Bauart und der überwiegend histologischen Nutzung des Patents DE 36 35 013 C2 ergibt sich jedoch eine Abgrenzung der hier beschriebenen Erfindung, u. a. durch den Ablauf und die Verfahrensweise einer Untersuchung, sowie die unterschiedlichen Möglichkeiten der Nutzung im temporär fest verschlossenen Kammersystem wie die Vervielfältigung von genetischem Material - ähnlich einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR).

Der vorgesehene Zweck - und damit die Nutzung dieses Patentes - ist auch der Einsatz bei der Herstellung sogenannter Mikroarrays. Das hier beschriebene Objektträgersystem bietet die Möglichkeit, vorgefertigte Mikroarrays aufzunehmen oder vorher an Kammeroberflächen "Sonden" zu fixieren, um daran spezifisch Moleküle aus zu untersuchenden Lösungen zu binden und nachzuweisen. Mikroarrays werden in zunehmendem Maß in der Labordiagnostik eingesetzt; vor allem dann, wenn in Proben viele Parameter parallel untersucht und miteinander verglichen werden sollen, z. B. bei Expressionsmuster-Analysen von genetischem Material aus Normal- und Tumorgewebe.

Mikroarrays bzw. die Chip-Technologie sind bekannt und nehmen in der Labordiagnostik an Bedeutung zu; jedoch Gegenstand dieser Erfindung ist nicht ein Mikroarray als solcher, sondern ein Objektträgersystem, das zur Aufnahme von Mikroarrays bzw. zur Herstellung frei wählbarer Arrayformate innerhalb vorgegebener Flächen genutzt werden kann.

Mikroarrays können mit Hilfe dieses hier beschriebenen Objektträgersystems sehr variabel konfiguriert werden. Per Definition sind Arrays zunächst nur "Punkte" in einem definierten Raster, deren Koordinaten bekannt sind. An unterschiedlich vielen Positionen lassen sich z. B. Biomoleküle (= Sonden) direkt an voraktivierten Kammeroberflächen oder durch Vermittlung einer Membran (Matrix) fixieren. Unter Biomolekülen sind Oligonukleotide, Peptide, Proteine, Antikörper oder ganze Zellen zu verstehen, die in der molekularen Diagnostik und Forschung eingesetzt werden können. Einzelsträngige Nukleinsäuren aus Zell- oder Gewebeextrakten binden an ihre komplementären Basen, die auf dem Objektträger fixiert wurden, so dass nach diesem Hybridisierungsschritt doppelsträngige Nukleinsäurenpaare bzw. -Stränge entstehen, die direkt oder indirekt nachgewiesen werden können. Polymorphe Nukleinsäuresequenzen (Allele) oder Mutationen lassen sich ebenfalls durch eine geeignete Sondenwahl detektieren.

Ferner können Antikörper oder Antigene in Seren, Plasmen oder Blut in kurzer Zeit kostengünstig bestimmt werden. Bisherige, handelsübliche Tests werden im Mikrotiterplatten-Format als sogenannte Enzyme-linked-Immunoassays (ELISAs) angeboten; diese arbeiten nach einem ähnlichen Prinzip, sind jedoch wesentlich kosten- und arbeitsintensiver und bieten nicht die Vorteile, die miniaturisierte Parallelbestimmungen vieler Parameter haben. Der Endnutzer ist in der Wahl der Auswertesysteme - z. B. Mikroskop, Scanner oder ELISA-Reader - relativ frei.

Mikroskopische Objektträger werden bevorzugt auch in der Chip-Array- Technologie eingesetzt; das Okjektträgersystem mit den äußeren Abmessungen 25 mm × 75 mm ist deshalb kompatibel mit Auswertegeräten unterschiedlicher Hersteller, mit denen Fluoreszenzen oder elektrooptische Signale gemessen werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und als Massenprodukt preisgünstig herstellbares, multifunktionelles, zum Teil mehrfachverwendbares Objektträgersystem zu schaffen, das so verändert werden kann, dass es sich z. B. zur Analyse genetischen Materials aus Zellen oder Antikörpern aus Seren eignet.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst; vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Das Objektträgersystem ist ohne biologische Moleküle sterilisierbar; es besteht aus licht- und wärmebeständigem, transparentem Material.

Das Objektträgersystem wird in der Regel durch Spritzgußtechnik aus Kunststoff gefertigt, kann aber auch durch Zerspanen o. ä. (Verfahren der Oberflächenbearbeitung), photolithographisch oder durch Lasertechniken industriell hergestellt werden; hierfür können auch andere Materialien, wie z. B. Glas oder Keramik, eingesetzt werden.

Durch Verwendung zweier komplementärer Objektträgerplatten, die eine mit Vertiefungen (Nuten) in den Wänden der Längsseiten - in dieser Schrift als Deckplatte (1) bezeichnet; die andere mit dazu passenden Nocken - in dieser Schrift als Grundplatte (2) bezeichnet, ergeben sich im Wesentlichen drei Möglichkeiten der Verwendung:

• 1. Die Grundplatte (2) kann einzeln in der Labordiagnostik verwendet werden.
• 2. Bei Verwendung zweier, komplementärer Platten, also Grund- (2) und Deckplatte (1), entsteht ein geschlossenes 6-Kammersystem, das zum Transport oder zur Archivierung von Untersuchungsmaterial eingesetzt werden kann.
• 3. Durch Kombination und temporärem Verschließen oder dauerhaftem Verschweißen zweier, gleicher Objektträger mit Nuten, genauer zweier Deckplatten (2), entsteht ein 6-Kammersystem mit Zu- und Abführkanälen in den Wänden der Längsseiten, durch die Flüssigkeiten eingebracht werden können.

Das Objektträgersystem ist universell, da es so beschaffen ist, dass je nach Untersuchungsanforderung eine spezielle Konfiguration vorgenommen werden kann. Einschränkungen bisheriger Trägertypen/Baureihen auf einzelne Untersuchungsmethoden entfallen. Gängige Verfahren aus der DNA- oder Protein- Chiptechnologie sind möglich, ferner der Einsatz als Hybridisierungs- oder Zellkammer.

Auf diesem Träger spezieller Bauart kann eine zeit- und probenmaterialsparende in-vitro- und in-situ-Diagnostik durchgeführt werden.

Zur Auswertung und Beobachtung, aber auch aus Gründen der Praktikabilität, besteht das Objektträgersystem aus transparentem Material, vorzugsweise aus Kunststoff.

Es soll ein teilweise strukturiertes, multifunktionelles Objektträgersystem von der Größe eines handelsüblichen, mikroskopischen Objektträgers zum Patent angemeldet werden. Für dessen äußere Abmessungen gibt es im Handel einige Spezialgeräte, wie z. B. Fluoreszenz-Scanner; daneben jedoch etliche Standardgeräte der Labordiagnostik, die u. a. die Möglichkeit bieten, mit Hilfe von Adaptoren und einer geeigneten Software, Messungen von Signalen in frei gewählten Formaten, d. h. in Rasteranordnung, durchzuführen und zu analysieren.

Das spritzgegossene Kunststoffteil hat die Abmessungen 25 mm × 75 mm × 2 mm (B × L ×H) und ist in 6 gleichgroße Segmente in Form von Vertiefungen unterteilt (20 mm × 9 mm × 1 mm, L × B × H). In den schmalen Wänden der Längsseiten befinden sich Nocken oder Nuten, so dass aus zwei aufeinander gelegten Teilen ein Kammersystem entsteht. An einem Ende des Kunststoffträgers befindet sich eine Schreibfläche oder eine maschinenlesbare Signatur und die Einprägung des Firmennamens ABST MOLECULAR DIAGNOSTICS, während am anderen Ende die Buchstaben A und B stehen, die einen oberen und einen unteren Objektträgerbereich symbolisieren.

Der transparente, glasklare, sterilisierbare Kunststoff hat gute optische Eigenschaften und eine geringe Autofluoreszenz, besonders dann, wenn er aus Polymethyl-Methacrylat oder co-polymeren Olefinen hergestellt wird. Für den Nachweis von Substanzen aus Untersuchungsmaterial werden empfindliche, fluoreszenzmarkierte Reagentien eingesetzt.

Dieses neu entwickelte, einfach strukturierte Objektträgersystem der Firma ABST MOLECULAR DIAGNOSTICS kann z. B. auch als Hybridisierungskammer für genetisches Material eingesetzt werden. In jede der 6 Kammern, an deren Oberfläche sich spezifische Fangmoleküle (Sonden) befinden, und die beispielsweise in dem Raster (Array) 4 × 8 angeordnet sind, lassen sich wahlweise Probengemische oder unterschiedliches, definiertes Untersuchungsmaterial, wie z. B. Nukleinsäuren aus (aufgereinigten) Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR), einbringen und mit Spezialreagentien nachweisen.

Eine Quantifizierung der an einzelne Sonden in den Objektträgerkammern gebundenen Moleküle erfolgt meistens spektral-photometrisch. Dazu wird der Mikroarray/­ Chip in eine geeignete Meßvorrichtung gelegt, dies kann z. B. ein Reader oder Scanner sein.

Durch Kombination zweier Deckplatten (1), die miteinander verschweißt werden (vermittels Spezialklebstoff oder Laserlicht), entstehen 6 Kammern mit jeweils 2 runden Kanälen in den Längsseiten, durch die Flüssigkeit geleitet werden kann. Dieses erfolgt manuell mit einer Spritze oder mechanisch mit Hilfe einer kleinen Pumpe, so dass ein Versorgungssystem für Zellkulturen entsteht.

Verwendungsbeispiele des Objektträgersystems

• 1. Als Mikroarray: Das in dieser Patentschrift beschriebene Objektträgersystem dient zur Aufnahme von Fangmolekülen (Sonden), die entweder direkt in einem Rasterformat (Array) auf aktivierte Oberflächen der Kammersegmente fixiert oder alternativ - nach externer Beschickung von Membranen - in die Kammern eingebracht werden. Als Sonden werden kurze Oligonukleotide, Nukleinsäurefragmente (cDNA, aRNA) oder andere Fangmoleküle, wie Peptide, Proteine oder Antikörper verwendet. Nach Einbringung von Körperflüssigkeiten lassen sich hieraus bekannte oder unbekannte Substanzen binden und anschließend nachweisen; im Besonderen können hiermit standardisierte Tests mit normalen und pathologischen Geweben bzw. daraus gewonnenen Extrakten durchgeführt werden.
• 2. Als Hybridisierungskammer: In dem hier beschriebenen Objektträgersystem können nach Oberflächenaktivierung und Modifizierung mit Sonden komplementäre Nukleinsäuren oder Antikörper aus Untersuchungsmaterial binden und nachgewiesen werden. Das Kammersystem wird hierzu temporär verschlossen und für definierte Zeiten erwärmt.
• 3. Als Zellkammer: In diesem Objektträgersystem können Gewebeschnitte oder Zellen, also mikrobiologische Organismen - wie z. B. humane Zellen, aber auch Bakterien - gelagert, transportiert oder kurzzeitig für Stunden oder Tage kultiviert werden.
• 4. Als Objektträger für die Mikroskopie: Die Erfindung kann auch als konventioneller Objektträger für die Mikroskopie genutzt werden.

Abmessungen

Grund- und Deckplatte haben die äußeren Maße 25 mm × 75 mm × 2 mm (B × L × H). In die Oberseiten der Objektträger sind sechs rechteckige Vertiefungen mit den Abmessungen 9 mm × 20 mm × 1 mm (B × L × H) eingelassen. Diese Segmente werden durch 1 mm breite und 1 mm hohe Stege voneinander getrennt und an den Seiten durch 1 mm hohe und 2,5 mm breite Wände begrenzt, in denen sich bei der Deckplatte (1) je 6 Nuten (Vertiefungen) und bei der Grundplatte (2) 6 Nocken (Erhebungen) pro Wand befinden.

Zeichnungen Zeichnungsblatt I Deckplatte (1) mit Nuten (Abbildung oben in Aufsicht, darunter im Querschnitt)

Alle Zahlen in den Abbildungen sind Angaben in Millimetern (mm). Die obere Zeichnung auf dem Zeichnungsblatt I zeigt die Deckplatte (1) in der Aufsicht mit je 6 Nuten in den Wänden der beiden Längsseiten. Die untere Zeichnung auf dem Zeichnungsblatt I zeigt den inneren Querschnitt einer Längswand dieser um 180 Grad gekippten Platte mit 6 Nuten (Vertiefungen) im Abstand von jeweils 10 mm vom jeweiligen Mittelpunkt aus gemessen. Die Deckplatte (1) hat die äußeren Maße 25 mm × 75 mm; die Dicke der Deckplatte (1) beträgt 2 mm, wobei die Vertiefung ab Boden eine Höhe von 1 mm bis zum Plattenrand aufweist. Die Nuten haben eine Tiefe von 0,5 mm unter dem Plattenrandniveau. Auf dem rechten Rand auf der Oberseite der Deckplatte (1), welcher 13,5 mm breit ist, befindet sich Platz für eine Beschriftung. Die Deckplatte (1) hat 6 rechteckige Vertiefungen oder Segmente auf ihrer Oberseite, die jeweils die Maße 9 mm × 20 mm × 1 mm haben. Die Vertiefungen oder Segmente der Deckplatte (1) haben einen Abstand zum Rand der Deckplatte (1) von 2,5 mm und zu sich selbst von 1 mm. Der Abstand der ersten Vertiefung zum linken Rand beträgt 2,5 mm; der Abstand der letzten Vertiefung zum rechten Rand der Platte beträgt 13,5 mm. Die Deckplatte (1) trägt am rechten Rand die Aufschrift "ABST MOLECULAR DIAGNOSTICS". Die Nuten oder Vertiefungen in den Wänden der Längsseiten der Deckplatte (1) haben eine Tiefe von 0,5 mm unter dem Plattenniveau der Seitenränder und befinden sich in einem Abstand von je 10 mm, d. h dass sich in den Wänden der Längsseiten eines Objektträgers jeweils 6 Nuten pro Wand befinden und 2 pro Vertiefung in einer Platte.

Zeichnungsblatt II Grundplatte (2) mit Nocken (Abbildung oben in Aufsicht, darunter im Querschnitt)

Alle Zahlen in den Abbildungen sind Angaben in Millimetern (mm).

Die obere Zeichnung auf dem Zeichnungsblatt II zeigt die Grundplatte (2) in der Aufsicht mit je 6 Nocken (nicht sichtbar) in den Wänden der beiden Längsseiten. Die untere Zeichnung auf dem Zeichnungsblatt II zeigt den inneren Querschnitt einer Längswand dieser um 180 Grad gekippten Platte mit 6 Nocken (Erhebungen) im Abstand von jeweils 10 mm vom jeweiligen Mittelpunkt aus gemessen. Die Grundplatte (2) hat die äußeren Maße 25 mm × 75 mm; die Dicke der Grundplatte (2) beträgt 2 mm, wobei die Vertiefung ab Boden eine Höhe von 1 mm bis zum Plattenrand aufweist. Auf dem rechten Rand auf der Oberseite der Grundplatte (2), welcher 13,5 mm breit ist, befindet sich Platz für eine Beschriftung. Die Grundplatte (2) hat sechs rechteckige Vertiefungen oder Segmente auf ihrer Oberseite, die jeweils die Maße 9 mm × 20 mm × 1 mm (B × L × H) haben. Diese Vertiefungen der Grundplatte (2) haben zum linken Rand der Grundplatte (2) einen Abstand von 2,5 mm und zu sich selbst von 1 mm. Der Abstand der ersten Vertiefung zum linken Rand beträgt 2,5 mm; der Abstand der letzten Vertiefung zum rechten Rand der Platte beträgt 13,5 mm. Die Grundplatte (2) trägt am rechten Rand die Aufschrift "ABST MOLECULAR DIAGNOSTICS". Die Erhebungen oder Nocken auf den Wänden der Längsseiten der Grundplatte (2) haben eine Höhe von 0,5 mm über dem Plattenniveau der Seitenränder. Jede Vertiefung oder jedes Segment dieser Platte ist an den Wänden der Längsseiten mit je einer Nocke ausgestattet, d. h. pro Vertiefung 2 und insgesamt 12 Stück.

Claims (9)

1. Objektträgersystem für die Labordiagnostik und Mikroskopie mit einer rechteckigen Grundplatte (2) und einer gleichgroßen, durchsichtigen Deckplatte (1), die zur Bildung des Objektträgersystems miteinander verbindbar sind,
wobei in der Grund- und Deckplatte mehrere gleichgroße, nebeneinander liegende Vertiefungen in gleicher Anzahl vorgesehen sind, die beim Verbinden der Grund- und Deckplatte jeweils einen Untersuchungsbereich zur Aufnahme der zu untersuchenden Proben festlegen und
wobei in der Grund- und Deckplatte mehrere zueinander komplementäre Verbindungselemente ausgebildet sind, die eine positionierte Verbindung der Grundplatte (2) mit der Deckplatte (1) gewährleisten,
dadurch gekennzeichnet,
dass in der Deckplatte (1) pro Vertiefung zwei zu den beiden Längsrändern der Platte führende, zueinander fluchtende und zur Grundplatte hin offene Nuten ausgebildet sind und
dass als Grundplatte eine zweite Deckplatte (1) wählbar ist, so dass beim Verbinden der beiden Deckplatten (1) für jede Vertiefung die Nuten der beiden Deckplatten (1) aufeinander zu liegen kommen und dabei in ihrem Querschnitt geschlossene Spülkanäle entstehen, über welche die Untersuchungskammern zugänglich sind, oder
dass alternativ als Grundplatte eine hinsichtlich der Nuten der Deckplatte (1) komplementär ausgebildete Platte mit erhabenen, den Nuten der Deckplatte angepaßten Erhebungen wählbar ist, so dass beim Verbinden dieser beiden Platten die Erhebungen die Nuten der Deckplatte verschließen und dabei in sich geschlossene Untersuchungskammern entstehen.

2. Objektträgersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vertiefungen mit probenspezifischen Sondenmolekülen aktiviert sind.

3. Objektträgersystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Grund- und Deckplatte aus einem zur Sterilisierung geeigneten Material bestehen und vorzugsweise spritzgegossen sind.

4. Objektträgersystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet dass das Material eine geringe Autofluoreszenz aufweist.

5. Objektträgersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektträgersystem beschriftbar ist.

6. Objektträgersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass pro Objektträgersystem insgesamt sechs Untersuchungskammern vorgesehen sind.

7. Objektträgersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektträgersystem zur Verwendung in einem automatisierten Auswertesystem mit vorzugsweise automatisierter Bildauswertung vorgesehen ist.

8. Objektträgersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Grund- und Deckplatte 2,5 cm breit und 7,5 cm lang sind.

9. Objektträgersystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass jede der 6 Untersuchungskammern ein Volumen von unter 400 µl aufweist.