DE10044384A1 - Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziierten Virus (rAAV), die mindestens eine Kopie eines ersten Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Rep-Proteins und mindestens eine Kopie eines weiteren Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Cap-Proteins enthält. Weiterhin betrifft die Erfindung Helferkonstrukte zur Expression wenigstens eines AAV Rep-Proteins und AAV Cap-Proteins in einer Wirtszelle, Vektorkonstrukte, welche ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren aufweisen sowie Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziierten Virus (rAAV) und die Verwendung der Wirtszelle zur Herstellung von rAAV.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Wirtszelle zur Verpackung von rekombi­ nantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), die mindestens eine Kopie eines er­ sten Helferkonstruktes zur stabilen Expression mindestens eines AAV Rep- Proteins und mindestens eine Kopie eines weiteren Helferkonstruktes zur stabilen Expression mindestens eines AAV Cap-Proteins enthält. Weiterhin betrifft die Erfindung Helferkonstrukte zur stabilen Expression wenigstens eines AAV Rep- Proteins und AAV Cap-Proteins in einer Wirtszelle, ein Vektorkonstrukt, welches ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren aufweist sowie Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno- assoziiertem Virus (rAAV) und die Verwendung der Wirtszelle zur Herstellung von rAAV.

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) gehört zur Familie der Parvoviren. Diese Virusfamilie ist gekennzeichnet durch ein icosaedrisches, nicht umhülltes Capsid mit einem Durchmesser von ca. 18-30 nm, das eine lineare und einzelsträngige DNA von ca. 5 kb enthält. Für eine effiziente Vermehrung von AAV, insbesonde­ re der Untergruppe der defekten Parvoviren (Dependoviren) ist eine gleichzeitige Infektion der Wirtszelle mit Helferviren, beispielsweise mit Adenoviren, Herpes­ viren oder Vacciniaviren erforderlich. In Abwesenheit eines geeigneten Helfervi­ rus geht AAV in einen Latenzzustand über, wobei das Virusgenom in der Lage ist, dauerhaft (= stabil) in das Genom der Wirtszelle zu integrieren. Diese Eigenschaft von AAV macht es als Transduktionsvektor für Säugetierzellen besonders interessant. Für die Vektorfunktion genügen im allgemeinen die beiden ca. 145 bp langen invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR: "Inverted Terminal Repeats"). Sie tragen die notwendigen Signale für Replikation, Verpackung und Integration in das Wirtszellgenom. Zur Verpackung in rekombinante AAV- Partikel (rAAV-Partikel) wird ein Helferplasmid, das die Gene für die nicht strukturellen viralen Proteine (Rep-Proteine) und für die strukturellen viralen Proteine (Cap-Proteine) trägt, sowie ein Vektorplasmid, welches die zu verpac­ kenden Gene flankiert von den AAV ITRs trägt in für die Verpackung geeignete Zellen, z. B. HeLa- oder 293-Zellen transfiziert, die danach mit einem geeigneten Helfervirus infiziert werden. Nach einigen Tagen wird ein Lysat erhalten, das rAAV-Partikel enthält.

Das Capsid der Adeno-assoziierten Viren besteht natürlicherweise in einem Anteil von 1 : 1 : 10 aus den drei Proteinen VP1, VP2 und VP3. Die AAV-Capsid Gene sind am rechten Ende des AAV-Genoms lokalisiert und werden durch überlap­ pende Sequenzen innerhalb desselben offenen Leserahmens (ORF) kodiert, wobei für ihre Expression verschiedene Startcodons sowie eine Spleißdonor- und zwei Spleißakzeptorstellen verwendet werden. Das VP1-Gen enthält die gesamte VP2- Gensequenz, welche wiederum die gesamte VP3-Gensequenz mit einem spezifi­ schen N-terminalen Bereich enthält. Die Tatsache, daß die überlappenden Le­ serahmen für alle drei AAV-Capsid Proteine kodieren, ist für die obligatorische Expression aller Capsid Proteine, wenn auch zu unterschiedlichen Anteilen, ver­ antwortlich.

Es sind verschiedene AAV-Serotypen bekannt, von denen der menschliche AAV- Serotyp 2 (AAV2) am besten analysiert ist. Alle Serotypen stellen Virusvektoren mit vorteilhaften Eigenschaften für die somatische Gentherapie dar. Die wesentli­ chen Vorteile sind die stabile Integration viraler DNA in das zelluläre Genom in Gegenwart der großen Rep-Proteine Rep 68 und Rep 78, die Fähigkeit Zellen zu infizieren, die sich nicht in der Zellteilung befinden (= ruhende Zellen), die Stabilität des Viruscapsids, was die Aufreinigung zu hohen Titern (10¹³-10¹⁴ Partikel pro ml) ermöglicht, die geringe Pathogenität sowie das komplette Fehlen viraler Gene und Genprodukte im rekombinanten AAV-Vektor. Gerade der letztgenannte Aspekt erklärt, warum keine zelluläre Immunantwort gegen AAV spezifische Genprodukte in in vivo Anwendungen beobachtet wird, so daß Langzeitexpressio­ nen (länger als ein Jahr) von mit AAV übertragenen therapeutischen Genen mög­ lich sind. Daher sind AAV-Vektoren besonders für die Verwendung in der Gentherapie sehr gut geeignet: Für einen solchen Einsatz wurden im allgemeinen replikationsdefiziente Viren entwickelt, die zwar eine gewünschte Zielzelle infi­ zieren und die in ihnen kodierte Nukleinsäure auf die Zelle übertragen können, sich in dieser Zelle jedoch nicht mehr selbst vermehren. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß man für die Virusvermehrung wichtige Gene, wie die für die Strukturproteine kodierenden Gene, deletiert und gegebenenfalls an deren Stelle die zu übertragende fremde Nukleinsäure einbaut. Bei der Herstellung größerer, für die gentherapeutische Verwendung geeigneter Mengen von nicht vermeh­ rungsfähigen Viren müssen die deletierten Gene als sogenannte Helfergene in "trans" zur Verfügung gestellt werden, um den Defekt bei einem nicht mehr ver­ mehrungsfähigen Virus in der Zelle zu kompensieren.

Für die Verwendung von AAV als viralen Transduktionsvektor werden im allge­ meinen größere Mengen an rekombinanten AAV-Partikeln benötigt. Ein geeig­ netes Verfahren zur Herstellung dieser großen Mengen an rAAV-Partikeln ist die Co-Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit zwei rekombinanten AAV- Plasmiden und anschließender Infektion mit einem Helfervirus (Chiorini J. A. et al. (1995) Human Gene Therapy, 6, 1531). Das erste rAAV-Plasmid (= Vektor­ konstrukt) enthält die zu übertragende fremde Nukleinsäure, welche von den bei­ den ITR-Regionen begrenzt, d. h. flankiert wird. Das zweite rekombinante AAV- Plasmid (= Helferplasmid) enthält die AAV-Gene, die für die Herstellung der Partikel benötigt werden (rep- und cap-Gene). Das Fehlen der ITR-Regionen im Helferkonstrukt soll die Verpackung der rep- und cap-Gene im AAV-Partikel und damit die Entstehung von unerwünschtem Wildtyp-AAV verhindern. Anschließend werden geeignete Zellen, die sowohl für die rekombinanten AAV- Konstrukte als auch für ein geeignetes Helfervirus permissiv, d. h. zugänglich sind, mit den beiden AAV-Konstrukten transfiziert. Nach Infektion der transfizierten Zellen (= Produktionszellen), mit beispielsweise Adenovirus als geeignetem Hel­ fervirus, erfolgt die Expression von AAV-Genen, die Replikation der übertrage­ nen fremden Nukleinsäure und die Verpackung sowie der Zusammenbau der re­ kombinanten AAV-Partikel. Die rAAV-Partikel enthalten die fremde Nukleinsäu­ re, beidseitig flankiert von den ITR-Regionen, in Form von einzelsträngiger DNA. Gleichzeitig repliziert das Helfervirus in diesen Zellen, was im Falle von Adeno­ viren als Helferviren nach einigen Tagen mit der Lyse (= Zerstörung) und damit verbunden dem Tod der infizierten Zellen endet. Die entstandenen rAAV-Partikel sowie die Helferviren werden hierbei teilweise in den Zellkulturüberstand freige­ setzt oder bleiben mit Strukturen der lysierten Zellen verhaftet. Eine Übersicht über die Verwendung von AAV als allgemeiner Transduktionsvektor für Säuger­ zellen gibt beispielsweise Muzyczka N. (1992), Current Topics in Microbiology and Immunology, 158, 97.

Ein wesentlicher Nachteil bei der Herstellung von rAAV-Partikeln ist die beglei­ tende Entstehung von replikationskompetenten Wildtyp-AAV (rcAAV) und die Anwesenheit von Helferviren, beispielsweise Adenovirus. Im Hinblick auf die Sicherheit bei der Verwendung rekombinanter AAV-Partikel beispielsweise in der Gentherapie, ist es jedoch notwendig, daß die Präparationen im wesentlichen frei von Helferviren und Wildtyp-AAV sind, weil zum Beispiel Adenoviren als Hel­ ferviren die infizierten Zellen lysieren und außerdem zelluläre Immunantworten gegen adenovirale Proteine verursachen. Zudem sind Adenoviren für den Men­ schen pathogen, sie rufen unspezifische Erkältungssymptome hervor. Wildtyp- AAV können sich bei der Anwesenheit eines Helfervirus vermehren und sich im Körper ausbreiten. Zudem würden unter solchen Bedingungen rep- und cap-Gene exprimiert, welche wiederum rAAV-Genome in derselben Zelle amplifizieren und zu neuen rAAV-Partikeln führen würden. Hierdurch könnten sich die rAAV- Genome im gesamten Körper ausbreiten.

Mit Hilfe der somatischen Gentherapie können neben der Korrektur genetischer Defekte auch neue Funktionen auf normale oder erkrankte Zellen im Rahmen ei­ ner Therapie übertragen werden. So wurden bisher verschiedenste Vektorsysteme entwickelt, um fremde Nukleinsäuren in eine Vielzahl von Zelltypen einzubrin­ gen. Unter den viralen Systemen wird AAV als das vielversprechendste Vektorsy­ stem verstanden, weil es einen breiten Wirtszelltropismus besitzt und sequenzspe­ zifisch bevorzugt in Chromosom 19 integriert (Kotin (1994) Human Gene The­ rapy 5, 793-801). So konnte in jüngster Zeit an Hand verschiedener Tiermodellsy­ steme gezeigt werden, daß die in vivo Verabreichung von rAAV zu einer langen AAV-vermittelten Genexpression führt, ohne dabei in den erfolgreich transdu­ zierten Zellen spezifische Immunantworten oder Entzündungsreaktionen hervor­ zurufen (Daly et al. (1999) Human Gene Therapy 10, 85-94; Herzog et al. (1999) Nature Medicine 5, 56-63; Lo et al. (1999) Human Gene Therapy 10, 201-213; Snyder et al. (1999) Nature Medicine 5, 64-70).

Ermutigt durch die Erfolge der beschriebenen Tierversuche wurden HeLa- basierende Verpackungszellinien entwickelt, die Kopien des gesamten AAV- Genoms ohne die flankierenden ITRs aufwiesen und in denen sich die rep- und cap-Gene unter der Kontrolle der nativen viralen Promotoren befanden. Die vira­ len Promotoren P5, P19 und P40 sind in der Abwesenheit von Helfervirus- Infektion nicht aktiv (Inoue und Russell (1998) J. Virol. 72, 7024-7031; Gao et al. (1998) Human Gene Therapy 9, 2353-2362). Nach Helfervirus-Infektion wird in diesen stabil transfizierten HeLa-Zellen die Expression von AAV Genen indu­ ziert. Der Vorteil dieser Zellinien liegt darin, daß in großem Maßstab und repro­ duzierbar rAAV-Partikel gebildet werden können, was insbesondere für einen kommerziellen Herstellungsprozeß notwendig ist (Allen et al. (1997) J. Virol. 71, 6816-6822; Wang et al. (1998) J. Virol. 72, 5472-5480).

Ein Nachteil bei der Verwendung dieser Zellinien ist die Tatsache, daß nur ein Rekombinationsereignis mit dem Vektorgenom für die Entstehung von Wildtyp- AAV erforderlich ist, weshalb solche Zellinien für den Einsatz in der Gentherapie aufgrund des unüberschaubaren Risikos nicht in Frage kommen.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Wirtszellen in Form von Verpackungs- und Produktionszellen, sowie für die Herstellung von rAAV geeignete Helfer- und Vektorkonstrukte bereitzustellen, welche die Pro­ duktion von rAAV in großem Maßstab erlauben, dabei aber die Entstehung von Wildtyp-AAV im wesentlichen verhindert wird.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich mit Hilfe einer HeLa- basierten Verpackungszellinie, in der die rep- und cap-Gene von AAV funktionell getrennt sind sowie das cap-Gen unter der Kontrolle der homologen Promotoren P5, P19 und P40 stehen hohe Ausbeuten an rAAV-Partikeln erzielen lassen, ohne daß dabei jedoch rcAAV-Partikel gebildet werden. Dabei können die funktionell getrennten rep- und cap-Gene transient, also episomal, transfiziert vorliegen, an derselben Stelle beispielsweise als Konkatemere oder an verschiedenen Stellen in das zelluläre Genom integrieren. Der Vorteil liegt darin, daß für die Rekonstituie­ rung von rcAAV-Partikel jeweils mindestens zwei unabhängige Rekombinations­ ereignisse notwendig sind.

Im Rahmen der durchgeführten Versuche wurde u. a. ein cap-Gen Expressions­ konstrukt verwendet, das neben dem für die Expression des cap-Gens unbedingt benötigten Promotor P40 zusätzlich die regulatorischen Sequenzen der Promoto­ ren P5 und P19 enthält. In diesem Zusammenhang konnte festgestellt werden, daß durch die Klonierung des cap-Gens ausschließlich unter der Kontrolle des Promotors P40 zwar eine starke Expression des Cap-Proteins erreicht wird, diese aber nicht mehr regulierbar (= konstitutiv) und somit auch nicht mehr durch Hel­ ferviren induzierbar ist. Ein derartiges cap-Expressionskonstrukt, welches nur die Promotorregion von P40, nicht aber von P5 und P19 aufwies, wurde in den Wirts­ zellen nicht stabil integriert. Erklärt wird dieses Phänomen mit der Toxizität des konstitutiv exprimierten Cap-Proteins für die Wirtszelle.

Somit wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Expressionskonstrukte für das Cap-Protein hergestellt und verwendet, in denen die Promotorregionen der Promotoren P5, P19 und P40 durch Mutagenese derart verändert wurden, daß zwar die Promotorfunktion hinsichtlich des Starts der Transkription intakt blieb, durch diese Konstrukte aber kein Rep-Protein exprimiert werden konnte. So mußten für die Adenovirus-induzierbare Transaktivierung des Promotors P40 die beiden großen Rep-Proteine Rep 68 und Rep 78 von einer zweiten Quelle (= in trans) zur Verfügung gestellt werden. Mit Hilfe solcher Cap- Expressionskonstrukte konnte nun die stabile Integration in das Genom der Wirts­ zellen erreicht werden. Diese Konstrukte besitzen somit den Vorteil, daß in Ab­ wesenheit eines Helfervirus keine toxischen Mengen an Cap-Protein exprimiert werden und dennoch eine sehr starke, durch Helferviren induzierbare Cap- Proteinexpression gewährleistet ist.

Ein Gegenstand der Erfindung ist daher zunächst eine Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV) enthaltend mindestens eine Kopie eines ersten Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Rep-Proteins und mindestens eine Kopie eines weiteren Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Cap-Proteins. Dabei sind die für das Rep- Protein und das Cap-Protein kodierenden Nukleinsäuren funktionell voneinander getrennt sowie operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV verbunden. Dies sind insbesondere die natürlichen Promotoren von AAV.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform enthält die Wirtszelle zusätzlich mindestens eine Kopie eines Vektorkonstruktes. Eine solche Wirtszelle wird im folgenden auch als Produktionszelle bezeichnet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Wirtszelle zusätzlich mindestens eine Kopie eines Nukleinsäurekonstrukts für mindestens ein Genprodukt eines Helfervirus und/oder eines zellulären Gens, das für die Produktion von rAAV notwendig ist.

Ferner beinhaltet die Erfindung eine Helfervirus-unabhängige Produktionszelle von rAAV. Diese enthält zusätzlich zur Produktionszelle die zur Herstellung von rAAV notwendigen Gene eines Helfervirus und/oder regulierte zelluläre Helfer­ gene, so daß diese Zellen zur Produktion von rAAV nicht mit Helferviren infiziert werden müssen.

Dadurch daß die für das Rep-Protein und das Cap-Protein kodierenden Nuklein­ säuren operativ mit den drei natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, insbesondere mit den natürlichen Promotoren von AAV, verbunden sind, wird erreicht, daß große Mengen an rAAV erhalten werden, dabei aber die Entstehung von Wildtyp-AAV im wesentlichen verhindert wird.

Die Begriffe "Protein" und "Polypeptid" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym gebraucht und beziehen sich auf ein Polymer von Aminosäu­ ren beliebiger Länge. Diese Begriffe schließen ebenso Proteine mit ein, die post­ translationale Modifikationsschritte durchlaufen haben, wie beispielsweise Glyko­ sylierung, Acetylierung oder Phosphorylierung.

Unter den Begriffen "Nukleinsäure", "DNA" und "Polynukleotide" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind polymere Formen von Nukleotiden jeder Länge zu verstehen, wobei sich der Begriff nur auf die Primärstruktur des Moleküls bezieht. Daher sind einzel- und doppelsträngige DNA-Moleküle ebenso von diesem Be­ griff umfaßt wie modifizierte Polynukleotide wie beispielsweise methylierte oder geschützte (= capped) Polynukleotide.

Die Begriffe "Gene" bzw. "Gensequenzen" beziehen sich auf ein Polynukleotid, das mindestens einen offenen Leserahmen aufweist und das die Fähigkeit besitzt, durch Transkription und Translation ein bestimmtes Protein zu bilden.

Unter dem Begriff "regulatorische Sequenz" wird eine genomische Region ver­ standen, welche die Transkription eines Genes, mit dem es verbunden ist, regu­ liert. Transkriptionell regulatorische Sequenzen, so wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, schließen wenigstens einen transkriptionell aktiven Promotor ein, können aber auch einen oder mehrere Enhancer und/oder Termina­ toren der Transkription umfassen.

Der Begriff "operativ verbunden" bezieht sich auf die Anordnung von zwei oder mehr Komponenten. Da die Komponenten in einer Beziehung zueinanderstehen, wird ihnen erlaubt, ihre Funktion in einer koordinierten Weise auszuüben. Bei­ spielsweise ist eine transkriptionell regulatorische Sequenz oder ein Promotor operativ mit der kodierenden Sequenz verbunden, wenn die transkriptionell regu­ latorische Sequenz bzw. der Promotor die Transkription der kodierenden Sequenz reguliert bzw. startet. Ein operativ mit einem zu transkribierenden Gen verbunde­ ner Promotor wird generell als "cis"-Element zu der kodierenden Sequenz be­ zeichnet, aber er befindet sich nicht notwendigerweise in direkter räumlicher Nähe zu dem zu transkribierenden Gen.

Unter den Ausdrücken "funktionell unabhängige Einheiten" oder "funktionell getrennt" wird verstanden, daß zwei oder mehrere Gene nicht mit dem Promo­ tor/den Promotoren des/der jeweils anderen Gens/e überlappen. Konkret heißt dies für das rep und das cap Gen, daß das rep Gen nicht mit dem p40 Promotor über­ lappt, der das cap Gen kontrolliert. Dies kann verschiedene Anordnungen der Ge­ ne in einem Genom bedeuten. Zum einen können die Gene an verschiedenen Or­ ten im Genom lokalisiert sein, sei es an verschiedenen Stellen in das Genom inte­ griert oder auf unterschiedlichen Plasmiden lokalisiert oder eine Mischung aus diesen. Zum anderen können die Gene auch nebeneinander auf dem selben DNA- Molekül, beispielsweise einem Chromosom oder einem Plasmid, lokalisiert sein, wobei jedoch jedes Gen von seinem eigenen Promotor aus kontrolliert wird. Eine derartige Anordnung ist zum Beispiel dann wahrscheinlich, wenn zwei Gene auf unterschiedlichen DNA-Molekülen gemeinsam transfiziert werden. Diese Mole­ küle können während der Transfektion Konkatemere bilden, die dann an einer Stelle in das Genom integrieren, jedoch nach wie vor funktionell unabhängige Einheiten bilden.

Der Ausdruck "rekombinant", so wie er im Rahmen dieser Erfindung gebraucht ist, bezieht sich auf eine genetische Einheit, die gegenüber jener Einheit, die na­ türlicherweise gefunden wird, verändert ist. Wenn der Begriff auf ein Adeno- assoziiertes Virus angewendet wird, bedeutet dies, daß das Virus Nukleinsäure/n trägt, die durch eine Kombination von Klonierungs-, Restriktions- und/oder Liga­ tionsschritten hergestellt wurden und die natürlicherweise nicht in dem Adeno- assoziierten Virus vorkommt/vorkommen.

Die Begriffe "natürlicher Promotor" bzw. "homologer Promotor", so wie sie im Rahmen der Erfindung gebraucht werden, bedeuten, daß die genetische Einheit des Promotors bzw. der regulatorischen Sequenz aus tet ein "heterologer" oder "nicht natürlicher Promotor", daß der Promotor von seiner natürlichen kodierenden Sequenz getrennt wurde und operativ mit einer anderen kodierenden Sequenz verbunden wurde.

"Die stabile Expression" eines Proteins in einer Zelle bedeutet, daß die für das Protein kodierende DNA in das Genom der Wirtszelle integriert ist und daher sta­ bil bei der Zellteilung auf die Tochterzellen weitergegeben wird. Obwohl auch Episomen, wie beispielsweise Plasmide, unter bestimmten Bedingungen an die nächste Generation weitergegeben werden können, geht genetisches Material, das episomal in der Wirtszelle vorliegt, schneller verloren als chromosomal integrier­ tes Material. Beispielsweise ist es möglich, die Aufrechterhaltung und Weitergabe des interessierenden genetischen Materials durch den Einbau eines selektierbaren Markers in unmittelbarer Nähe zu dem interessierenden Polynukleotid einzubauen, so daß die Wirtszellen, die das Polynukleotid tragen, unter Selektionsdruck gehalten werden können.

Unter dem Begriff "Helferkonstrukte" werden im Rahmen der vorliegenden Er­ findung rekombinante AAV-Plasmide verstanden, die entweder die AAV rep- Gene oder die AAV cap-Gene enthalten.

Unter dem Begriff "Vektorkonstrukt" wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes AAV-Plasmid verstanden, das fremde DNA (= Transgen), die von ITR-Regionen begrenzt wird, tragen.

Unter dem Begriff "Verpackungszelle" wird im Rahmen der vorliegenden Erfin­ dung eine Wirtszelle verstanden, die zwar ein oder mehrere Helferkonstrukte, aber kein Vektorkonstrukt enthält.

Unter dem Begriff "Produktionszelle" wird im Rahmen der vorliegenden Erfin­ dung eine Wirtszelle verstanden, die sowohl ein oder mehrere Helferkonstrukte, als auch ein oder mehrere Vektorkonstrukte enthält. Diese Produktionszelle kann Helfervirus-abhängig sein, wenn sie zur Herstellung von rAAV mit einem Helfer­ virus infiziert werden muß. Sie kann jedoch auch Helfervirus-unabhängig sein, wenn die Zelle die notwendigen Gene für die Induktion der rAAV-Produktion beispielsweise unter der Kontrolle eines oder mehrerer induzierbarer Promotoren trägt und somit für die Produktion von rAAV nicht mit Helfervirus infiziert wer­ den muß.

Unter dem Begriff "Vektorzelle" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle verstanden, die zwar ein oder mehrere Vektorkonstrukte, aber kein Helferkonstrukt enthält.

Die einen Helferkonstrukte, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus verwendet werden, enthalten Nukleinsäuresequenzen kodierend für mindestens ein Rep-Protein, wobei unter Rep-Proteinen die Proteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40, ins­ besondere Rep 68, Rep 52 und Rep 40, vor allem Rep 68 und Rep 52 verstanden werden. Die anderen Helferkonstrukte enthalten Nukleinsäuresequenzen, die für wenigstens eines der bekannten Cap-Proteine kodieren, wobei die Cap-Proteine die Proteine VP1, VP2 und VP3 sind. Die Gene für diese Proteine sowie die ITR- Sequenzen können aus Wildtyp-AAV isoliert werden, die in Form von Klonen allgemein erhältlich sind. So ist beispielsweise der Klon pSM620 bei Samulski, et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2077; der Klon pAV1 bei Laughlen et al. (1983), Gene 23, 65 und der Klon sub201 bei Samulski (1987) J. Virol. 61, 3096 beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Hel­ ferkonstrukte zur Expression des Rep-Proteins und des Cap-Proteins als funktio­ nell unabhängige Einheiten in das Genom der Wirtszelle integriert. Dadurch wird die Bildung von Wildtyp-AAV (rcAAV) wirkungsvoll verhindert, weil zur Bil­ dung von Wildtypviren zwei Rekombinationsereignisse notwendig wären, die mit einer Häufigkeit von je 10^-7 pro Zellteilung, also insgesamt mit 10^-14 durchaus selten sind. In der Tat konnte in einer rekombinanten Viruspräparation, die 2 × 10¹⁰ genomische Partikel enthielt, kein rcAAV nachgewiesen werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des Rep- Proteins durch den natürlichen AAV Promotor P5 und die Expression des Cap- Proteins durch den natürlichen AAV Promotor P40, insbesondere durch die na­ türlichen AAV Promotoren P19 und P40, vor allem durch die natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 kontrolliert.

Vorhergehende Versuche hatten gezeigt, daß die Verwendung heterologer Pro­ motoren für die Rep-Expression nicht zu einer adäquaten Regulation für eine hohe Ausbeute an rAAV führte (Hölscher C. et al. (1994) J. Virol. 68, 7169-7177; Yang Q. et al. (1994) J. Virol. 68, 4847-4856). In der bevorzugtesten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Cap-Expressionsplasmid die AAV Promotoren P5, P19 und P40, um eine regulierte Expression in Abhängig­ keit sowohl von Helfervirus-Infektion oder von Helfervirus-Genprodukten als auch von Rep-Protein Expression zu erlauben, da diese Anordnung am besten den natürlichen lytischen AAV-Lebenszyklus widerspiegelt. Diese Anordnung erwies sich für eine strikt regulierte Cap-Protein Expression als sehr geeignet. Obwohl bisher in der Literatur zahlreiche Studien publiziert sind, die heterologe Promoto­ ren für die Expression großer Mengen an Cap-Proteinen verwendeten (Gao et al. (1998), supra, Grimm D. (1998) Human Gene Therapy 9, 2745-2760) wurden im Rahmen dieser Erfindung die natürlichen Promotoren P5, P19 und P40 für die Cap-Protein Expression verwendet, weil festgestellt wurde, daß der P40 Promotor, wenn er sich nicht mehr in der natürlichen Umgebung der weiteren Promotoren P5 und P19 befindet, als konstitutiver Promotor wirkt. Durch die Verwendung der natürlichen AAV-Regulationssequenz konnte sichergestellt werden, daß Tran­ skriptionsfaktoren, die für die regulierte Expression der cap-Gene benötigt wer­ den, alle Bindestellen in der natürlichen Promotorregion vorfinden, um ihre regu­ latorischen Funktionen auszuüben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Expression des Rep- Proteins und des Cap-Proteins in der Wirtszelle voneinander abhängig reguliert. Dieser Ansatz wurde gewählt, weil herausgefunden wurde, daß für eine effiziente Verpackung von rAAV in stabilen Zellinien zunächst eine schwache Cap- Expression erforderlich ist, da andernfalls hohe Cap-Mengen toxisch auf die Zel­ len wirken. Zum Zeitpunkt der Verpackung muß hingegen eine starke Cap- Expression erfolgen. Diese beiden Kriterien kann ein konstitutiver, heterologer Promotor nicht gleichzeitig erfüllen. Dies kann zwar durch die Verwendung von induzierbaren, heterologen Promotoren verbessert werden, die exakte zeitliche Regulation sowie die Cap-Expressionsstärke durch derartige Promotoren sind in der Praxis jedoch äußerst schwer umzusetzen. Durch die Verwendung der natürli­ chen homologen Promotoren ist die Expression von Cap an die Aktivierung durch Helfervirus-Genprodukte und/oder zelluläre Helfergene sowie Rep gekoppelt und somit zeitlich genau wie in der Wildtyp-Situation gesteuert.

Besonders vorteilhaft erfolgt die Termination der Transkription der für die Rep- Proteine und die Cap-Proteine kodierenden Nukleinsäuren durch die natürlichen regulatorischen Sequenzen, insbesondere durch das natürliche AAV Poly-A- Signal. Ähnlich wie bei der Initiation der Transkription verstärkt auch die Ver­ wendung der homologen Sequenzen zur Termination der Transkription der AAV cap- und rep-Gene die Menge der durch das AAV-Vektorsystem produzierten rAAV-Partikel.

Geeigneterweise wird als Wirtszelle eine Säugetierzelle, insbesondere eine menschliche Zervixkarzinomzelle, vor allem eine HeLa-Zelle verwendet. HeLa- Zellen haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen, weil der AAV P5 Promotor in HeLa-Zellen nahezu inaktiv ist und es deshalb möglich ist, in ihr Genom stabil eine Expressionskassette für das AAV Rep-Protein unter der Kontrolle der natür­ lichen regulatorischen Elemente zu integrieren, so daß das Rep-Protein in diesen Zellen nicht toxisch wirkt (Clarke et al. (1995) Human Gene Therapy 6; 1229-1341; Tamayose et al. (1995) Human Gene Therapy 7, 507-513; Inoue & Russell (1998) supra, Gao et al. (1998) supra).

Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen ein erstes Helferkon­ strukt zur stabilen Expression wenigstens eines AAV Rep-Proteins in einer Wirts­ zelle, wobei die für das Rep-Protein kodierende Nukleinsäure operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, insbesondere mit den natürli­ chen AAV Promotoren P5 und P19 verbunden ist, sowie ein zweites Helferkon­ strukt zur stabilen Expression wenigstens eines AAV Cap-Proteins in einer Wirts­ zelle, wobei die für das Cap-Protein kodierende Nukleinsäure operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, vorzugsweise mit dem natürli­ chen AAV Promotor P40, insbesondere mit den natürlichen AAV Promotoren P19 und P40, vor allem mit den natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 verbunden ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Helferkonstrukt ent­ haltend Nukleinsäuresequenzen kodierend für mindestens ein Rep-Protein, wobei die Rep-Proteine Rep 68, Rep 52 und/oder Rep 40, nicht aber Rep 78 sind, weil überraschenderweise festgestellt werden konnte, daß neben Rep 52, Rep 40 sowie den drei Cap-Proteinen VP1, VP2 und VP3 die zusätzliche Expression nur des Rep 68 für die Verpackung von AAV Vektoren ausreichend ist. Der Vorteil dieser Rep 78-defizienten Helferkonstrukte liegt darin, daß das größte Rep-Protein, das für die Verpackungszellen am meisten toxisch ist, überhaupt nicht exprimiert wird. Ferner wurde herausgefunden, daß Rep 78 unter den Rep-Proteinen die größte hemmende Aktivität auf zelluläre Abläufe wie beispielsweise die Tran­ skription besitzt. Daher kann bei Verwendung dieses Helferkonstruktes aufgrund der Abwesenheit von Rep 78 die Verpackungseffizienz gesteigert werden. Sowohl Rep 68 als auch Rep 78 werden im natürlichen System durch den Promotor p5 exprimiert. Die Verwendung des Rep 78-defizienten Helferkonstrukts ist weiter­ hin deshalb vorteilhaft, weil Rep 68 im Vergleich zu Rep 78 in Adenovirus- infizierten Zellen den stärkeren Transaktivator der AAV Promotoren P19 und P40 darstellt (Hörer et al. (1995) J. Virol. 69, 5485-5496; Weger et al. (1997) J. Virol. 71, 8437-8447). Daher führt die Verwendung dieses Rep 78-dezifienten Helfer­ konstruktes zu einer gesteigerten Expression der kleineren Rep-Proteine Rep 40 und Rep 52 sowie der Capsidproteine und damit der gewünschten höheren Ver­ packungseffizienz.

Für die Herstellung des Rep 78-defizienten Helferkonstruktes pUC"Rep68,52,40Cap"(RBS)Δ37 (vgl. Fig. 12) wurden die AAV Sequenzen von Nukleotid 201 bis Nukleotid 4497 einschließlich der Deletion der Intronsequenz sowie von Nukleotid 658 bis Nukleotid 4460 in das bakterielle Expressionsplas­ mid pUC19 kloniert, wobei die Bindestellen für das Rep-Protein in der pUC19- Sequenz deletiert wurden (vgl. Fig. 6). Durch Anwendung dieser Strategie sind zwei rep- sowie wenigstens zwei cap-Gene mit jeweils einer eigenen Poly(A)- Sequenz für die Termination der Transkription hintereinander angeordnet. Ausge­ hend vom ersten Abschnitt (AAV-Sequenz Nukleotid 201 bis Nukleotid 4497) können die Rep-Proteine Rep 68 und Rep 40 sowie die Cap-Proteine VP2 und VP3 exprimiert werden, während ausgehend vom zweiten Abschnitt (AAV- Sequenz Nukleotid 658 bis Nukleotid 4460) die Rep-Proteine Rep 52 und Rep 40 sowie die Cap-Proteine VP1 VP2 und VP3 exprimiert werden. Insgesamt werden damit alle AAV-2 Proteine mit Ausnahme von Rep 78 kodiert.

Für die Herstellung des ebenfalls Rep 78-defizienten Helferkonstrukts pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37 (vgl. Fig. 13) wurden die genannten AAV- Sequenzen (nt 201-2310; nt 658-4460 einschließlich der Deletion der Intronse­ quenz) ebenfalls in das bakterielle Expressionsplasmid pUC19 kloniert (vgl. Fig. 6). Dabei wurde wiederum die Bindestellen für das Rep-Protein in der pUC19- Sequenz deletiert. Auf diese Weise wurde das rep-Gen partiell dupliziert. Das so entstandene Helferkonstrukt enthält nur eine Poly(A)-Sequenz, so daß alle mRNA-Transkripte dasselbe 3'-Ende besitzen. Ausgehend vom ersten Abschnitt (AAV-Sequenz Nukleotid 201 bis Nukleotid 2310) können die Rep-Proteine Rep 68 und Rep 40 exprimiert werden, während ausgehend vom zweiten Abschnitt (AAV-Sequenz Nukleotid 658 bis Nukleotid 4460) die Rep-Proteine Rep 52 und Rep 40 sowie die Cap-Proteine VP1 VP2 und VP3 exprimiert werden. Insgesamt werden damit auch durch dieses Vektorkonstrukt alle AAV-2 Proteine mit Aus­ nahme von Rep 78 kodiert.

Zur Herstellung eines Helferkonstruktes pUC"ΔRep78ΔCap"(RBS)Δ37 zur Ex­ pression der Rep-Proteine Rep68, Rep52 und Rep40 wurden die AAV-Nukleotide 2945 bis 4046 aus dem cap-Gen (Nukleotide 2203 bis 4410) des Helferkonstrukts pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37 deletiert. Durch diese Deletion können keine funk­ tionellen Cap-Proteine mehr exprimiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Vektorkonstrukte ent­ haltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, die von ITR- Sequenzen flankiert werden, wobei die 5'-lokalisierte ITR-Sequenz eine Deletion im Bereich des C-Palindroms aufweisen.

Diese Vektorkonstrukte enthalten die AAV-Sequenzen 1-60/83-191 (ΔC-Arm ITR als linken ITR-Erklärung hierzu im folgenden) und 4498 bis 4671 (als rechten ITR).

Es ist bekannt, daß die ITR-Sequenzen von AAV-2, welche 145 Basenpaare lang sind, aus einem großen Palindrom (A) und zwei kleineren Palindromen (B und C) aufgebaut sind. Dabei bilden die ersten 125 Basen der ITR-Sequenz eine Haarna­ delstruktur in T-Form (siehe z. B. Muzyczka, N. (1992), supra). Hierbei kann die terminale Sequenz in einer von zwei Konfigurationen vorliegen. Bei der ersten Konfiguration, auch "Flip" genannt, ist das B-Palindrom näher am 3'-Ende und bei der zweiten Konfiguration, auch "Flop" genannt, ist das C-Palindrom näher am 3'-Ende (siehe auch Svivstava, A. et al. (1983) J. Virol. 45(2), 555). Dabei wechseln die beiden Konfigurationen durch ein Rekombinationsereignis häufig ihre Konfiguration, was eine Destabilisierung der entsprechenden Vektorkon­ strukte bewirkt.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine Deletion innerhalb der 5'- flankierenden ITR-Sequenz, die in einer bevorzugten Ausführungsform 80 Nu­ kleotide, insbesondere 40 Nukleotide, vor allem 22 Nukleotide im Bereich von Nukleotid 61 bis 82 umfaßt, eine Stabilisierung dieser Vektorkonstrukte bewirkt, weil eine Konfigurationswechsel zwischen Flip-Flop-Orientierungen nicht mehr möglich ist (vgl. Fig. 8).

Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, daß sich Vektorkonstrukte, die eine derartige Deletion im C-Palindrom der 5'-ITR-Sequenz aufweisen, ebenso effizient verpacken lassen wie Vektorkonstrukte mit intakten ITR-Sequenzen.

Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Vektorkon­ strukt, enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, die von ITR-Sequenzen flankiert werden, wobei die 5'-lokalisierte ITR-Sequenz eine De­ letion im Bereich des C-Palindroms aufweist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Vektorzelle, enthaltend ein Vektorkonstrukt, wobei die 5'-lokalisierte ITR-Sequenz eine Dele­ tion im Bereich des C-Palindroms aufweist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Vektorkonstrukt enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, insbesondere eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein ausgewählt aus einem Zytokin, insbeson­ dere IL2, IL4, IL12 und/oder GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierender Faktor) und/oder ein co-stimulierendes Molekül, insbesondere B7, vor allem B7.1 und/oder B7.2. Als heterologe Nukleinsäuresequenz kann gemäß der vorliegenden Erfindung jedoch jede beliebige kodierende wie auch nicht ko­ dierende Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Vorzugsweise wird eine oder mehrere heterologe Nukleinsäuresequenz(en) in ein replikationsdefizientes Vek­ torkonstrukt durch herkömmliche, dem Fachmann bekannte Klonierungstechniken eingebracht (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.).

Weitere geeignete Nukleinsäuresequenzen sind kodierende Sequenzen für Che­ mokine wie Lymphotactin, Rantes, MCP-1 oder Mip 1α, Cytokine wie IL12, IL7, IL18, IL2, GM-CSF, IL1, IL6, Interferon γ oder IL-10, oder Antikörper, Antikör­ perfragmente oder Einzelstrang-Antikörper, beispielsweise gerichtet gegen ICOS, ferner gegen den ICOS-Rezeptor, CD40, CD40-Liganden, VEGF, IL-1, TNF-α, gegen Tumor-Antigene wie beispielsweise Her-2/neu, GD3 oder CA125, gegen virale Antigene oder gegen IgE; des weiteren gegen lösliche Rezeptorformen wie ICOS FC, ICOS-Ligand FC, CD40L FC, TNF-α Rezeptor FC, gegen Apoptose- induzierende Moleküle wie Proteine der BCL-X-Familie, BAX, BAD oder Caspa­ sen, Necrose-induzierende Peptide wie Perforine, Toxine, beispielsweise abgelei­ tet von Bakterien, viralen Tumorantigenen wie HPV E6 oder E7, nicht-viralen Tumorantigenen wie B Lymphom-spezifische Idiotyp-Antikörper, BCRA-1, CA 125, α-Fetoprotein, CEA, p53 sowie Blutgerinnungsfaktoren wie Faktor VIII oder Faktor IX.

Des weiteren eignen sich nicht kodierende Sequenzen zum Einsatz als Ribozyme oder Antisense-RNAs.

Aus der WO 98/06746 ist bekannt, daß eine gentechnisch veränderte Melanom- Zellinie, die GM-CSF exprimiert, als Vaccine verwendet werden kann. Aus der WO 94/16716 ist die Verwendung eines rekombinanten Virus in der Krebsthera­ pie unter Verwendung mindestens eines Zytokins, beispielsweise GM-CSF oder B7 und/oder eines tumor-assoziierten Antigens bekannt. Das B7-Gen bezieht sich hierbei auf das sogenannte B7.1-Gen. In der WO 94/04196 ist ein DNA-Konstrukt zur Behandlung von Tumorerkrankungen offenbart, das für ein Zytokin und des weiteren für B7 kodiert, wobei auch hier B7.1 gemeint ist. Aus der WO 92/00092 ist eine Nukleinsäuresequenz kodierend für B7.1, aus der WO 94/03408 bzw. WO 95/06738 ist eine Nukleinsäuresequenz kodierend für B7.2 und aus der EP-B1-0 188 479 ist eine Nukleinsäuresequenz kodierend für GM-CSF bekannt.

In Verbindung mit dem Vektorkonstrukt ist die Verwendung von B7.2 besonders vorteilhaft, weil in vitro Untersuchungen gezeigt haben, daß im Gegensatz zu In­ terferon γ oder IL12 das B7.2 Protein im Zusammenhang mit B7.1 inhibitorische Wirkung auf die Aktivierung von T-Lymphozyten besitzt (Rudy et al. (1997) Int. Immunol., 9, 853). In Anwesenheit einer zweiten Nukleinsäure, die für GM-CSF kodiert, kann die tumorzerstörende Wirkung eines B7-Moleküls (wobei hier B7.1 oder B7.2 verwendet werden können) gesteigert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher das genannte Vek­ torkonstrukt enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, ins­ besondere eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein ausgewählt aus einem Zytokin, insbesondere IL2, IL4, IL12 und/oder GM-CSF und/oder einem co­ stimulierenden Molekül, insbesondere B7, vor allem B7.1 und/oder B7.2. Auf­ grund der einfacheren Handhabbarkeit sind sogenannte Doppelvektoren, die so­ wohl die Nukleinsäuresequenz kodierend für GM-CSF wie auch die Nukleinsäu­ resequenz kodierend für B7 enthalten, besonders bevorzugt (vgl. Fig. 7). Die Verwendung von Doppelvektoren reduziert insbesondere die Zahl der Verpac­ kungsvorgänge. Überraschenderweise erlauben die erfindungsgemäßen Doppel­ vektoren eine vergleichbar effiziente Expression beider fremder Nukleinsäuren wie die Co-Infektion mit zwei Einzelvektoren (vgl. ebenfalls Fig. 7). Insbesondere werden die heterologen Nukleinsäuren von AAV ITR-Sequenzen flankiert, und ihre Expression wird von einem zu AAV heterologen Promotor und/oder Enhan­ cer, insbesondere von dem Major Immediate Early Enhancer/Promotor (MIEP) des Cytomegalovirus (CMV) reguliert. Als Promotoren eignen sich alle zu AAV heterologen Promotoren, die in eukaryotischen Zellen, vorzugsweise Säugerzel­ len, aktiv sind. Dies sind beispielsweise der SV40-Promotor (Samulski et al. (1989) J. Virol. 63, 3822), der genannte CMV-Enhancer/Promotor (Vincent et al. (1990) Vaccine, 90, 353) oder der LTR-Promotor von Retroviren (Lipkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 3988). Der CMV-MIEP ist jedoch aufgrund seiner sehr starken Expression, die nur geringsten Schwankungen unterworfen ist, be­ sonders bevorzugt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her­ stellung einer Wirtszelle zur Verpackung und/oder Produktion von rekombinan­ tem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), das die Schritte umfaßt:

• a) Herstellung eines Rep-Helferkonstruktes sowie eines Cap-Helferkon­ struktes,
• b) Einbringen des Rep-Helferkonstruktes in eine Wirtszelle,
• c) Selektion einer das Rep-Helferkonstrukt enthaltenden Wirtszelle,
• d) Einbringen des Cap-Helferkonstruktes in die selektionierte Wirtszelle und
• e) Selektion einer das Rep-Helferkonstrukt und das Cap-Helferkonstrukt ent­ haltenden Verpackungszelle.

Die Reihenfolge des Einbringens von Rep-Helferkonstrukt und Cap- Helferkonstrukt kann auch umgekehrt sein. Ebenso kann das Einbringen eines Rep-Helferkonstrukts und eines Cap-Helferkonstrukts im wesentlichen gleichzei­ tig erfolgen.

Ferner kann eine Helfervirus-unabhängige Verpackungszelle von rAAV herge­ stellt werden, umfassend die zusätzlichen Schritte

• 1. (e/d) Einbringen von mindestens einem Helfergen der Helferviren und/oder ei­ nem regulierten zellulären Helfergen in die Produktionszelle,
• 2. (f/e) Selektion einer das/die Helfergene enthaltenden Vektorzelle.

Eine derartige Zelle hätte den Vorteil, daß zur rAAV-Produktion keine Helfervirus- Infektion notwendig ist, sondern die rAAV-Produktion beispielsweise durch In­ duktion der Promotoren der Helfergene initiiert werden könnte. Unter Helferge­ nen werden dabei die Gene der Helferviren von AAV und/oder zelluläre Gene verstanden, deren Genprodukte für die Replikation der AAV notwendig sind bzw. diese fördern. Bei Adenoviren beispielsweise sind die Helfergene E1A, E1B, E4, E2A und VA. E1A ist dabei für die Transaktivierung des AAV p5 Promotors er­ forderlich. Die Genprodukte E1B und E4 dienen hierbei zur Verstärkung der AAV mRNA-Akkumulation. Die Genprodukte E2A und VA dienen der Verstär­ kung des AAV mRNA-Spleißens sowie der Translation. Die Verwendung des Helfervirus an Stelle der einzelnen Helfergene, beispielsweise des Adenovirus- Typ 5 (Ad5), ist besonders vorteilhaft, weil dies der natürlichen Situation der AAV-Vermehrung in Gegenwart von Helferviren am nächsten kommt und somit die Verpackung von rAAV-Partikeln sehr effizient ist. Andere Helferviren sind beispielsweise Herpesviren oder Vacciniaviren.

Ein Bestandteil der Erfindung ist die Herstellung einer Vektorzelle von rAAV, umfassend die Schritte:

• a) Herstellung eines Vektorkonstruktes,
• b) Einbringen des Vektorkonstruktes in eine Wirtszelle und
• c) die anschließende Selektion einer das Vektorkonstrukt enthaltenden Vek­ torzelle.

Ferner kann eine Helfervirus-unabhängige Vektorzelle von rAAV hergestellt wer­ den, umfassend die zusätzlichen Schritte:

• a) Einbringen von mindestens einem Helfergen der Helferviren und/oder ei­ nem regulierten zellulären Helfergen in die Produktionszelle,
• b) Selektion einer das/die Helfergene enthaltenden Vektorzelle.

Die Vorteile dieser Helfervirus-unabhängigen Vektorzelle entsprechen denen der Helfervirus-unabhängigen Verpackungszelle.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Produktionszelle von rAAV, das die Schritte umfaßt:

• a) Herstellung einer Verpackungszelle wie zuvor beschrieben,
• b) Einbringen mindestens eines Vektorkonstukts in die Verpackungszelle,
• c) Selektion einer das/die Vektorkonstrukte enthaltenden Produktionsszelle.

Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung einer Produktionszelle besteht aus den Schritten:

• a) Herstellung einer Vektorzelle wie zuvor beschrieben,
• b) Einbringen mindestens eines zuvor beschriebenen Helferkonstrukts in eine Vektorzelle; bei mehreren Helferkonstrukten kann dies gemeinsam oder sequentiell erfolgen,
• c) Selektion einer das/die Helferkonstrukte enthaltenden Produktionszelle.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Herstellung einer Helfervirus- unabhängigen Produktionszelle von rAAV, das die zusätzlichen Schritte umfaßt:

• a) Einbringen von mindestens einem Helfergen der Helferviren und/oder ei­ nem regulierten zellulären Helfergen in die Produktionszelle,
• b) Selektion einer das/die Helfergene enthaltenden Produktionszelle.

Die Vorteile dieser Helfervirus-unabhängigen Produktionszelle entsprechen denen der Helfervirus-unabhängigen Verpackungszelle.

Unter Einbringen von Konstrukten wird im Rahmen dieser Erfindung im allge­ meinen eine Transfektion verstanden. Dabei kann das Konstrukt nicht dauerhaft in das Genom der Wirtszelle integriert vorliegen, was generell als transiente Trans­ fektion bezeichnet wird. Alternativ dazu kann das Konstrukt, insbesondere das Vektorkonstrukt, aber auch stabil in das Genom der Wirtszelle integriert werden. Derartige integrierte Konstrukte werden gemäß der DNA-Replikation des Wirts­ zellgenoms vermehrt und anschließend auf die Tochterzellen weitergegeben.

In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt das Einbringen des Konstruktes/der Konstrukte, insbesondere des/der Vektorkon­ strukte durch Infektion mit Viren. Hierbei sind rekombinante Viren bevorzugt, wobei beispielsweise rAAV, Adenoviren, Herpesviren, Vacciniaviren, Baculovi­ ren und/oder Phagen, insbesondere Bakteriophagen verwendet werden können.

Des weiteren bietet sich für die oben genannten Verfahren zur Herstellung von Verpackungs-, Vektor- und/oder Produktionszellen zur Selektion von Zellen mit stabil integrierten Konstrukten eine Vorselektion auf Zellen mit Integrationsereig­ nissen an. Beispielsweise kann man dem zu transfizierenden Rep- oder Cap- Helferkonstrukt ein Reporterkonstrukt in dem Verhältnis 10 : 1 beimischen und gemeinsam in die Wirtszelle einbringen, beispielsweise kotransfizieren. Anschließend erfolgt eine Selektion bezüglich des Reporters, da man annehmen kann, daß in Zellen, in denen das Reporterkonstrukt integriert hat, auch das jeweilige Hel­ ferkonstrukt mit hoher Wahrscheinlichkeit integriert wurde.

Die Selektion der entsprechenden Zellen kann jeweils über den Nachweis der Proteinexpression beispielsweise mittels Westernblot erfolgen. Ebenfalls geeignet wäre der quantitative Nachweis einer Konstrukt-spezifischen Nukleinsäure in den Zellen, beispielsweise über eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einen Southern- oder Northernblot.

Eine bevorzugte Nachweisform für geeignete Zellen ist auch der direkte Nachweis der Verpackung von rAAV in diesen Zellen, indem für die Verpackung fehlende Konstrukte in die jeweilige Zelle eingebracht werden und die Verpackung durch Infektion mit einem Helfervirus initiiert wird.

Für die Verpackungszelle enthaltend das Rep- oder Cap-Helferkonstrukt wird jeweils das andere Helferkonstrukt sowie ein Vektorkonstrukt, beispielsweise mit einem Farbmarker wie GFP als Transgen, benötigt. Für eine Verpackungszelle mit Rep- und Cap-Helferkonstrukten ist hingegen nur ein Vektorkonstrukt erforder­ lich. Für eine Vektorzelle werden Rep- und Cap-Helferkonstrukte benötigt. Für eine Produktionszelle ist weder ein Helfer- noch ein Vektorkonstrukt notwendig. Diese Zellen können anschließend durch einbringen der viralen Helfergene, insbe­ sondere durch Infektion mit einem Helfervirus zur rAAV-Produktion induziert werden. Im Gegensatz dazu benötigen die Helfervirus-unabhängigen Verpac­ kungs-, Vektor- oder Produktionszellen kein Einbringen von Helfergenen, sofern sie bereits sämtliche notwendigen Helfergene beinhalten bzw. nur das Einbringen einzelner Helfergene. Für diese Zellen müssen lediglich die Helfergene induziert werden, um die rAAV-Produktion zu starten.

Anschließend kann der AAV-Titer nach gängigen Methoden bestimmt werden, der dann als Maß für eine optimale Cap- bzw. Cap/Rep-Expression dient. Dieses Vorgehen hat den Vorteil, daß bei der Selektion der entsprechenden Zellen nicht nur auf absolute Expressionsmengen selektioniert wird, sondern auch auf das op­ timale Verhältnis der Cap zu Rep Expression. Zudem hat dieses Verfahren den Vorteil, daß hier zusätzlich eine Selektion auf intakte Rep und Cap-Gene erfolgt, da Mutanten von Rep und/oder Cap, die zwar noch Protein bilden, das sich jedoch nicht mehr für eine Verpackung von rAAV eignet, bei den anderen erwähnten Nachweisverfahren nicht erkannt würden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Rep- Helferkonstrukts und/oder eines Cap-Helferkonstrukts und/oder eines Vektorkon­ struktes, beziehungsweise einer Verpackungszelle, einer Vektorzelle oder einer Produktionszelle, insbesondere einer Herfervirus-unabhängigen Produktionszelle zur Herstellung von rAAV.

Die rAAV-Vektorkonstrukte enthalten eine oder mehrere zu AAV heterologe Nu­ kleinsäuren. Für den Fall, daß als heterologe Nukleinsäure, wie bereits oben be­ schrieben, GM-CSF und B7.1 und/oder B7.2 verwendet werden, kann das aus dem Verpackungsvorgang resultierende rAAV-Partikel, das die beiden immun­ stimulatorischen Gene trägt, als effizienter Transduktionsvektor zur Behandlung verschiedener Tumorerkrankungen, beispielsweise Melanom oder Ovarkarzinom, verwendet werden.

Die Figuren und die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläu­ tern, ohne sie jedoch einzuschränken.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1A zeigt eine schematische Darstellung einiger erfindungsgemäßer Helfer­ konstrukte im Vergleich zu Wildtyp-AAV. Die natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 sind ebenso gezeigt, wie das "Major Intron" des AAV-Genoms ("I") und das natürliche Poly(A)-Signal des AAV-Genoms ("pA"). Weiterhin sind die kodierenden Sequenzen für das rep- und das cap-Gen von AAV gezeigt.

Fig. 1B zeigt eine schematische Darstellung drei verschiedener Vektorkonstruk­ te, wobei die ITRs am linken und rechten flankierenden Ende gezeigt sind. Die Bezeichnung "CMV" steht für den "major early promotor" des Cytomegalovirus. Die Bezeichnung "I" weist auf ein Intron hin, das in dem Plasmid pCI der Firma Promega enthalten ist. Die Bezeichnung "pA" weist auf das Poly(A)-Signal des Simian Virus 40 (SV40) hin. Die Abkürzung "GFP" steht für grünes Fluoreszenz­ protein (engl.: green fluorescent protein), "B7.2" für das Immun-co- stimulatorische Protein B7.2, "GM-CSF" für Granulozyten/Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor, und "nLacZ" steht für die nukleär lokalisierte Form des Enzyms β-Galaktosidase.

Fig. 2 stellt die Identifizierung der stabilen Rep-Zellinien mittels Western-Blot Experiment dar. HeLa-Zellen wurden mit dem Rep-Helferkonstrukt (P5 Rep) transfiziert, wobei die Rep-Expression durch die natürlichen AAV Promotoren P5 und P19 kontrolliert ist. Nicht dargestellt ist der Selektionsmarker Hygromycin, der zu dem gezeigten Rep-Helferkonstrukt im Verhältnis 1 : 19 transfiziert wurde. Anschließend wurden mehrere Hygromycin-resistente Zellklone gepickt und die Rep-Expression mit Adenovirus als Helfervirus induziert (Spur 1-8). Die gesamte zelluläre Proteinmenge wurde gewonnen und mittels Western-Blot unter Ver­ wendung eines spezifischen Rep-Antiserums analysiert. Die Zahlen 78/68/52/40 beziehen sich auf die Rep-Proteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. "M" steht für Molekulargewichtsstandard, "+" für Positivkontrolle und "-" für Negativkon­ trolle.

Fig. 3 zeigt die induzierbare cap-Genexpression ausgehend von verschiedenen Konstrukten. Die im unteren Bereich dargestellten Cap-Helferkonstrukte wurden verwendet, um die Rep exprimierende Zellinie R84 zu transfizieren. Anschließend wurden die Zellen mit Adenovirus (MOI5) (Spuren 1 bis 4 und wt mit "+" gekennzeichnet) oder zur Kontrolle nicht infiziert (Spuren 1 bis 4 und wt mit "-" gekennzeichnet). Nach 72 Stunden wurde der gesamte zelluläre Proteingehalt mittels Western-Blot Analyse auf die Expression der drei Cap-Proteine VP1, VP2 und VP3 untersucht.

Fig. 4 zeigt die induzierbare Expression der Rep- und Cap-Proteine in der stabi­ len Verpackungszellinie C97 nach Adenovirus-Infektion. C97-Zellen oder HeLa- Kontrollzellen wurden entweder mit Adenovirus (MOI5) infiziert oder als Kon­ trolle nicht infiziert. 72 Stunden nach der Infektion wurde gesamtzelluläres Pro­ tein extrahiert und mittels Western-Blot unter Verwendung von für die Cap- und Rep-Proteine spezifischen Antikörpern auf deren Anwesenheit analysiert. Nach Adenovirus-Infektion sind in der Verpackungszellinie C97 deutlich die vier Rep- Proteine, Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40 sowie in geringerem Anteil die Cap-Proteine VP1 und VP2 sowie in größerem Anteil das Cap-Protein VP3 deut­ lich zu erkennen.

Fig. 5 zeigt die Replikation von rekombinantem AAV (rAAV) in C97-Zellen, wobei der Nachweis der rAAV-Replikationsintermediate als DNA mit niedrigem Molekulargewicht erfolgte, die aus C97-Zellen isoliert wurde, die zuvor mit rAAV und Adenovirus (MOI5) infiziert wurden. Typischerweise konnte 72 Stun­ den nach der Infektion ein vollständiger zytopathischer Effekt beobachtet werden, wobei die Zellen zu diesem Zeitpunkt gesammelt wurden. Die Hälfte der Zellen wurde verwendet, um DNA mit einem niedrigen Molekulargewicht zu isolieren (erste Runde der Amplifikation), und die andere Hälfte der Zellen wurde dreimal eingefroren und wieder aufgetaut, sowie anschließend abzentrifugiert, um Zellbe­ standteile zu entfernen. Anschließend wurde der Überstand bei 56°C für 30 min behandelt, um intakte Helferviren zu inaktivieren. Anschließend wurde der Über­ stand verwendet, um frische C97-Zellen zusammen mit neuen Helferviren (MOI5) zu infizieren. Es konnte wieder ein deutlicher zytopathischer Effekt beobachtet werden, wobei DNA mit einem niedrigen Molekulargewicht isoliert wurde (zweite Runde der Amplifikation). Die isolierte DNA aus der ersten und zweiten Amplifikationsrunde wurde mittels Southern-Blot analysiert, wobei das erfin­ dungsgemäße Vektorkonstrukt als Sonde für die Anwesenheit der Replikations­ intermediate der AAV-Genome verwendet wurde, um einen infektiösen Titer ei­ nes Original AAV-Stocks zu erhalten.

Fig. 6 zeigt schematisch weitere Helferkonstrukte, die alle von dem Klonie­ rungsvektor pUC19 abgeleitet sind.

Fig. 7 zeigt schematisch Einzel- und Doppel-Expressionsvektoren.

Fig. 8 zeigt schematisch die 5'-lokalisierte ITR-Sequenz der AAV Vektorkon­ strukte mit den Konfigurationen Flip, Flop und Deletion des C-Palindroms, die als "Δ(C-Arm)" bezeichnet ist.

Fig. 9 zeigt schematisch die Nukleotidabfolge der 5'-lokalisierten ITR-Sequenz der unterschiedlichen Konfigurationen aus Fig. 8.

Fig. 10 zeigt die Nukleotidabfolge der 5'-lokalisierten ITR-Sequenz mit und oh­ ne Deletion sowie der 3'-lokalisierten ITR-Sequenz.

Fig. 11 zeigt schematisch die ebenso effiziente Verpackung eines Vektorkon­ struktes mit deletierter 5'-lokalisierter ITR-Sequenz [pAAV-(B7.2free+GM-CSF)] im Vergleich zu einem Vektorkonstrukt mit einer 5'-lokalisierten ITR-Sequenz in Flop-Orientierung Konfiguration [(pAAV-(B7.2+GM-CSF)].

Fig. 12 zeigt schematisch ein Rep 78-defizientes Helferplasmid mit der Bezeich­ nung pUC"Rep68,52,40Cap"(RBS)Δ37.

Fig. 13 zeigt schematisch ein weiteres Rep 78-defizientes Helferplasmid mit der Bezeichnung pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37.

Beispiele 1. Plasmidkonstruktion

Die Plasmide (Vektorkonstrukt, Helferkonstrukte), die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, wurden unter Anwendung von Standardklonierungstechniken, wie sie bei Sambrook et al. (1989), supra nachzulesen sind, hergestellt. Die funktionell relevanten Ausschnitte dieser Plasmide sind in den schematischen Darstellungen der Fig. 1 bis 3, 6, 7, 12 und 13 gezeigt. Das Plasmid P5 Rep (Fig. 1A) wurde durch Deletion eines DNA-Fragments hergestellt, das die Nukleotide 2300-4170 des AAV-Genoms enthielt (Ruffing et al. (1994) J. Gen. Virol. 75, 3385-3392 (Gene Bank Accession No. AF 043303). P5 RepΔ37 wurde durch Deletion der AAV-Basen 4461-4497 aus P5 Rep gewonnen. Das Plasmid P5P19P40Cap (Fig. 1A) wurde durch Deletion des DNA-Abschnitts zwi­ schen den Nukleotiden 350 bis 650 und 1045 bis 1700 erhalten. P5P19P40CapΔ37 wurde durch Deletion der AAV-Basen 4461-4497 aus P5P19P40Cap gewonnen. Die Plasmide 1-4, die in der Fig. 3 gezeigt sind, enthalten verschiedene Deletionen des AAV-Genoms. Plasmid 1 fehlt die Sequenz zwischen der BcII- und der HindIII-Schnittstelle des AAV2- Genoms. Plasmid 2 fehlt die Sequenz zwischen der NruI- und der BstEII- Schnittstelle, Plasmid 3 fehlt die Sequenz zwischen der BamHI- und der BstEII-Schnittstelle. Plasmid 4 entspricht dem Plasmid P5P19P40Cap aus Fig. 1A. Die Vektorkonstrukte für rAAV-B7.2-GM-CSF und rAAV-GFP wurden mit Hilfe des pCI-Plasmids der Firma Promega (Deutschland) konstruiert und anschließend in ein pUC19-basiertes Plasmid, welches die ITR-Sequenzen aufwies, überführt (vgl. PCT/EP 00/01090). Das ebenfalls zur Kontrolle verwendete Vektorkonstrukt nLacZ ist bereits in der Litera­ tur beschrieben (Bertran et al. (1996) J. Virol. 70, 6759-6766).

2. Verpackung verschiedener Vektorkonstrukte

Um den Einfluß der Deletion des C-Palindroms im 5'-lokalisierten-ITR von bestimmten Vektorkonstrukten auf die Expression der Fremd-DNA (= Transgene) sowie die Verpackung dieser Vektorkonstrukte in rAAV zu untersuchen, wurden vergleichende Transfektions- und Verpackungsexpe­ rimente durchgeführt. Hierfür wurden mehrere Klone eines Vektorkon­ struktes mit intaktem 5'-ITR (beispielsweise pAAV-(B7.2/GM-CSF) - vgl. Fig. 11) und Klone eines Vektorkonstruktes mit einer Deletion im C- Palindrom des 5'-ITR (ΔC-Arm - beispielsweise pAAV-(B7.2free/GM- CSF) - vgl. Fig. 9 und 11)) in HeLa-t Zellen transfiziert, wobei je 6 µg Plasmid für 4 × 10⁵ HeLa-t Zellen verwendet wurde. 40 Stunden nach Transfektion wurde sowohl der Anteil an B7.2 exprimierenden Zellen mittels FACS-Analyse, als auch die Expression von GM-CSF im Kultur­ überstand mittels ELISA-Technik ermittelt. Die in der Tabelle angegebe­ nen Werte stellen Mittelwerte aus Duplikaten zu je 4 verschiedenen Klo­ nen desselben Plasmidtyps dar. Im ersten Experiment wurde aus unbe­ kannten Gründen nur eine Transfektionsrate erreicht, welche etwa um den Faktor hundert unterhalb der Effizienz des zweiten Experiments lag. Dies erklärt, warum in Experiment 1 die ermittelten Werte für GM-CSF in den Zellkultur-Überständen um zwei logarithmische Stufen niedriger lagen als in Experiment 2. Dadurch konnten in Experiment 1 nur etwa 40% der Zellen transfiziert wurden, während in Experiment 2 nahezu alle Zellen das Protein B7.2 exprimierten.

Tabelle 1

Wie aus Tabelle 1 deutlich zu entnehmen ist, werden mit beiden Vektor­ plasmiden gleich gute Transfektionseffizienzen erzielt, so daß die Deletion im C-Palindrom des 5'-lokalisierten ITR keinen negativen Einfluß auf die Expressionsstärke der zwischen die ITRs klonierten Expressionskassetten für die Transgene besitzt.

Anschließend wurden mit den gleichen Vektorplasmiden Versuche zur Verpackung in rAAV durchgeführt. Hierfür wurden je 4 µg Vektorplasmid mit 12 µg Helferplasmid (pUC"rep/cap"(RBS)Δ37 - vgl. Fig. 6) in 10⁶ HeLa-t Zellen transfiziert. Dabei wurde ebenfalls beobachtet, wie bereits oben beschrieben, daß die Transfektionseffizienzen um zwei logarithmi­ sche Stufen variierten. Nach zwei Tage wurden die Zellen mit Ad-5 (MOI2) infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Zellen in 3 ml Zell­ kulturmedium durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen aufgeschlos­ sen, die Zellbestandteile durch Zentrifugation pelletiert und das rAAV- Lysat 10 min bei 60°C inkubiert, wodurch Helferviren inaktiviert wurden. Mit 500 µl Lysat in Experiment 1 (niedrige Transfektionsrate) bzw. 5 so­ wie 25 µl Lysat in Experiment 2 wurden 3 × 10⁵ bestrahlte (100 Gy) HeLa-t Zellen infiziert. 40 Stunden nach Infektion wurde sowohl der Anteil an B7.2 exprimierenden Zellen mittels FACS-Analyse, als auch die Expressi­ on von GM-CSF im Zellkultur-Überstand mittels ELISA-Technik ermittelt. Die in der nachfolgenden Tabelle 2 angegebenen Werte stellen Mit­ telwerte aus Duplikaten zu je 4 verschiedenen Klonen desselben Plasmid­ typs dar:

Tabelle 2

Wie aus Tabelle 2 zu entnehmen ist, werden mit beiden Vektorplasmiden sehr hohe Mengen an rAAV erhalten, wobei die Menge an rAAV, die bei Verwendung des Vektorplasmids mit der Deletion im C-Palindrom des 5'- lokalisierten ITR erhalten wird zusätzlich über der Menge liegt, die bei Verwendung des Vektorplasmids B7.2/GM-CSF erhalten wird.

3. Herstellung von Helferkonstrukten

Aus Wildtyp-AAV-DNA wurden mittels PCR die AAV-Basen 190 bis 1060 amplifiziert. Dabei wurde der 5'-Primer so gewählt, daß an Position 199 eine singuläre XbaI-Schnittstelle eingeführt wurde. Das PCR- Fragment wurde mit XbaI und BamHI nachgeschnitten und in den ebenso geschnittenen Vektor pUC19 kloniert. Position 199 im AAV-Genom wur­ de gewählt, um sicherzustellen, daß alle wichtigen P5-Promotorelemente im Helferkonstrukt vorhanden sind. Nach einer Kontrollsequenzierung wurde Wildtyp-AAV-DNA mit BamHI und SnaBI geschnitten und das Insert-Fragment anschließend in die BamHI und SmaI-Position des Zwi­ schenproduktes einkloniert. Auf diese Weise wurde das Basis- Helferkonstrukt pUC "rep/cap" gewonnen (Fig. 6). Dieses Helferkonstrukt enthält die AAV-Sequenzen 201 bis 4497, während das Vektorkonstrukt die AAV-Sequenzen 1 bis 191 bzw. 1-60/83-191 (linker ITR) und 4498 bis 4671 (rechter ITR) trägt (vgl. Fig. 7). Auf diese Weise wurde sicherge­ stellt, daß keine homologen AAV-Sequenzüberlappungen auf den Plasmi­ den existieren. Anschließend wurde vom 3'-Ende des AAV-Genoms in pUC "rep/cap"Δ37 Basen deletiert, die für eine optimale Expression der AAV-Rep und Cap-Gene nicht benötigt werden. Das resultierende Helfer­ konstrukt wird mit pUC "rep/cap"Δ37 bezeichnet und enthält die minima­ lisierte AAV-Sequenz von Position 201 bis 4460 (Fig. 6).

Anschließend wurde die Rep-Bindungsstelle (RBS) im Vektorrückgrat pUC19 (Position 684 bis 708 einschließlich; Sequenz:

deletiert, um eine nicht- homologe Rekombination an dieser Position zu vermeiden. Das Konstrukt trägt die Bezeichnung pUC "rep/cap" (RBS)Δ37 (vgl. Fig. 6). In einigen Plasmiden wurden zudem die drei RBS im Rep-Gen (P5- und P19- Promotor) einzeln und in verschiedenen Kombinationen mutiert, ohne die Aminosäuresequenzen des Rep-Proteins zu verändern (Fig. 6).

In einem weiteren Helferkonstrukt wurde eine sog. "functional separati­ on"-Sequenz (fs) von 638 Basenpaaren Länge zwischen das Rep- und Cap- Gen eingeführt. Hierzu wurde zuerst die AAV-Sequenz 1691 bis 2328, die den Rep C-Terminus bzw. den AAV P40-Promotor einschließlich Cap- Sequenzen und alle für P40 essentiellen regulatorischen Sequenzen ent­ hält, verdoppelt und hinter das Stop-Kodon für die gespleißten Rep- Versionen (Position 2329) kloniert. Dadurch wurde der AAV P40- Promotor, welcher das cap-Gen kontrolliert, verdoppelt und hinter das rep- Gen inseriert. Anschließend wurde der P40-Promotor im rep-Gen zerstört, ohne die Rep-Aminosäuresequenz zu verändern. Dies wurde durch eine Mutation der P40 TATA-Box gewährleistet. Insgesamt wurden für die er­ forderlichen Klonierungsschritte folgende AAV-Nukleotide verändert, oh­ ne dabei jedoch die Aminosäuresequenz von Rep und Cap zu verändern: 1693(T → A), 1694(T → G), 2330(G → C), 2331(G → T), 2332(G → A), 1625(C → T), 1628(A → G), 1826(A → C), 1827(A → T) und 1828(G → C). Das resultierende Helferkonstrukt wird mit pUC "rep/fs/cap" Δ37 bezeichnet (Fig. 6).

Analog wurde eine zusätzliche Sequenz in pUC "rep/cap" (RBS) Δ37 ein­ gefügt, wobei ein Helferkonstrukt mit der Bezeichnung pUC "rep/fs/cap" (RBS) Δ37 resultierte (Fig. 6).

Die weiteren Rep 78-defizienten Helferkonstrukte wurden hergestellt, in­ dem im Helferkonstrukt pUC"rep/cap" (RBS)Δ37 (vgl. Fig. 6) die AAV Nukleotide 1907 bis 2227, die dem rep-Intron entsprechen, durch Doppel­ strangmutagenese deletiert wurden, wodurch das Plasmid pUCAAVSpleiß als Zwischenprodukt erhalten wurde. Das Plasmid pUCAAVSpleiß wurde mit dem Restriktionsenzym NdeI linearisiert, mit einer Exonuklease, bei­ spielsweise Mung Bean Nuclease (Boehringer Mannheim, Deutschland) behandelt und anschließend mit dem Restriktionsenzym SphI versetzt. Das so erhaltene Fragment mit einer Länge von 4222 bp wurde mit einem Vektorfragment zum Rep78-defizienten Helferkonstrukt pUC"Rep68,52,40Cap"(RBS)Δ37 (10657 bp) durch Ligation verbunden (vgl. Fig. 12). Für die Gewinnung dieses Vektorfragments kann beispiels­ weise pUC"rep/cap"(RBS)Δ37 (vgl. Fig. 6) verwendet werden, das nach einer Behandlung mit den Restriktionsenzymen NruI und SphI in einer Länge von 6435 bp erhalten wird.

Dasselbe Vektorfragment kann weiterhin zur Herstellung eines weiteren Rep78-defizienten Helferkonstruktes pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37 ver­ wendet werden (vgl. Fig. 13). Hierfür wurde das Zwischenprodukt pUCAAVSpleiß mit den Restriktionsenzymen AseI, BsrBI sowie SphI be­ handelt. Das 1808 bp lange BsrBI-SphI-Fragment wurde mit dem 6435 bp langen Vektorfragment zu besagtem Helferkonstrukt pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37 mit einer Gesamtlänge von 8243 bp durch Ligation verbunden. Durch diese Klonierungsstrategie wird in beiden Rep78-defizienten Helferkonstrukten das rep Gen teilweise dupliziert, so daß eine verstärkte Expression der Rep-Proteine Rep 68, Rep 52 und Rep 40 von beiden rep Genen ermöglicht wird. Die oben beschriebenen und in Fig. 6 schematisch dargestellten Helferplasmide besitzen alle in etwa ver­ gleichbare Verpackungskapazitäten.

Tabelle 3

Rep78-defiziente Helferkonstrukte zeigen bei sequentieller Transfektion von Helfer- und Vektorkonstrukt (Experimente 1 und 3, in der nachfolgenden Ta­ belle 4 dargestellt, sowie ein weiteres Experiment in Tabelle 5) in etwa gleich gute Verpackungseffizienzen verglichen mit Rep78-kodierenden Helferkon­ strukten. Bei Experiment 2 wurden Ko-Transfektionen durchgeführt, wodurch andere Versuchsbedingungen gewählt wurden und Experiment 2 daher auch hinsichtlich der Verpackungseffizienzen nicht mit Experiment 1 und 3 vergli­ chen werden kann.

Tabelle 4

Werden die erfindungsgemäßen Rep-Helferkonstrukte p5RepΔ37 (kodiert alle 4 Rep-Proteine, aber kein Cap) bzw. pUC"ΔRep78ΔCap"(RBS)Δ37 (kodiert ausschließlich für die Rep-Proteine Rep68, 52 und 40) zusammen mit dem Cap-Konstrukt p5p19p40CapΔ37 im Verhältnis 1 : 1 in geeignete Verpackungs­ zellen kotransfiziert, so lassen sich bei nachfolgender sequentieller Transfektion eines Vektorkonstruktes und Überinfektion mit Adenoviren wiederum ver­ gleichbare rAAV-Titer erzielen, wie wenn ein einziges Helferkonstrukt, wel­ ches für sowohl rep als auch cap kodiert, in die Zellen transfiziert wird (pUC"rep/cap"(RBS)Δ37, pUC"Rep68,52,40Cap"(RBS)Δ37, pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37). Daten hierzu sind in Tabelle 5 dargestellt. Über­ raschenderweise konnten in derart hergestellten rAAV-Lysaten bislang keiner­ lei rcAAV-Verunreinigungen gefunden werden.

Tabelle 5

Im Rahmen der Transfektionsexperimente wurden 4 µg Vektorkonstrukt (pAAV-GFP) mit 12 µg Helferkonstrukt in 1 × 10⁶ HeLa-t Zellen ko­ transfiziert. Lediglich im Falle der mit (seq) bezeichneten Experimente wurden zunächst 16 µg Helferkonstrukt, einen Tag darauf 16 µg Vektorkonstrukt sequentiell transfiziert. In den Verpackungsansätzen, in denen rep und cap als getrennte Helfergene transfiziert wurden (p5RepΔ37, pUC"ΔRep78ΔCap"(RBS)Δ37 und p5p19p40CapΔ37), wurden rep und cap im Verhältnis 1 : 1 (also 8 µg rep und 8 µg cap) kotransfiziert. Zwei Tage nach (der ersten) Transfektion wurden die Zellen mit Ad-5 (MOI2) infiziert. Drei Tage später wurden die Zellen im Medium durch Frier/Tau- Lyse aufgeschlossen, Zellbestandteile pelletiert und das rAAV-Lysat 10 min bei 60°C Hitze-inaktiviert. Mit verschiedenen Verdünnungen des Ly­ sats wurden 3 × 10⁵ bestrahlte HeLa-t Zellen (100 Gy) infiziert. 40 Stunden nach Infektion der Zellen mit rAAV wurden die Zellen im FACS-Flow (siehe unten) hinsichtlich der GFP Expression analysiert und hieraus die transduzierenden Titer der rAAV Rohlysate ermittelt. Jedes Helferkon­ strukt wurde in mindestens fünf unabhängigen Experimenten getestet.

4. Zellkultur

Die HeLa-Ausgangszellen und alle davon abgeleiteten Verpackungszelli­ nien wurden als "Monolayer"-Zellkulturen in Dulbecco's Modified Eag­ le's Medium (DMEM), das 10% fötales Kälberserum aufwies, gehalten. Zusätzlich wurden verschiedene Selektionsmittel verwendet, um aus den transfizierten Zellen stabile Zellinien zu erhalten. Dabei wurde Hy­ gromycin B in einer Konzentration von 500 µg/ml, Neomycin in einer Konzentration von 800 µg/ml und/oder Puromycin in einer Konzentration von 1 µg/ml verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre angezogen. Die Transfektionen wurden mit Hilfe her­ kömmlicher Calcium-Phosphat-Präzipitations-Techniken (Ca₃(PO₄)₂) und Endotoxin-freier Plasmid-DNA durchgeführt, die unter Verwendung von Kits der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland), gewonnen wurde. Um sta­ bile Zellinien nach der Ko-Transfektion des zu integrierenden Plasmids und dem Resistenzplasmid zu erhalten, wurde ein Mischungsverhältnis der beiden Plasmide von 20 : 1 gewählt.

5. Herstellung einer stabilen Rep-exprimierenden Zellinie

Ein Rep-kodierendes Plasmid wurde unter Entfernung der Cap- kodierenden Sequenzen aus dem Genom von AAV2, das keine ITR- Sequenzen, aber alle weiteren AAV regulatorischen Elemente aufwies, hergestellt (Fig. 1). Anschließend wurden HeLa-Zellen mit dem Rep- Expressionskonstrukt transfiziert, und Zellklone, die das Rep-Protein nach Adenovirus-Infektion exprimierten, wurden mittels Western-Blot, wie in Fig. 2 gezeigt, identifiziert. Es wurde ein einzelner Klon ausgewählt und hinsichtlich seiner Fähigkeit, ein eingeführtes rAAV-Genom in der Ge­ genwart von Helfervirus zu replizieren, näher charakterisiert. Nach Identi­ fizierung einer Rep-Zellinie und dem Nachweis der Funktionalität der Rep-Proteine wurde diese Zellinie verwendet, um in sie ein Cap- Helferkonstrukt einzuführen.

6. Identifizierung eines Helferkonstrukts, das für die Herstellung einer stabi­ len Cap-Zellinie geeignet war

Es wurden einige Plasmide konstruiert, in denen die Expression des Cap- Proteins durch die natürlichen AAV regulatorischen Elemente kontrolliert wurde. Zunächst wurde ein Plasmid konstruiert, welches das cap-Gen un­ ter der Kontrolle des P5 Promotors aufwies. Dieses Plasmid führte ledig­ lich nach der Helfervirus-Infektion mit Adenovirus zu einer nachweisbaren Expression von Cap-Protein, aber die nachweisbaren Proteinmengen wa­ ren vergleichsweise gering. Daher wurde ein zweites Plasmid konstruiert, in dem die DNA-Sequenzen zwischen dem P5 und dem P19 Promotor ent­ fernt wurden. Dieses Plasmid exprimierte nicht nur die Cap-Proteine, son­ dern auch das P19-Rep-Protein. Mit Hilfe dieses Cap-Expressions- Plasmids konnte nach Helfervirus-Infektion nur eine sehr geringe Cap- Proteinmenge nachgewiesen werden. Anschließend wurde eine ganze Rei­ he von Cap-Plasmiden konstruiert, die schematisch in Fig. 3 dargestellt sind. Alle diese Plasmide führten zu einer signifikanten Cap- Proteinexpression, wobei die erzielten Proteinmengen vergleichbar waren mit der Proteinmenge von einem Plasmid, welches das gesamte AAV- Genom mit Ausnahme der ITR-Sequenzen enthielt (vgl. Fig. 3 "wt"). Für alle folgenden Versuche wurde das Plasmid P5P19P40Cap, wie in Fig. 1 gezeigt, verwendet, weil es in verschiedensten Experimenten stets gering­ fügig höhere Mengen an Cap-Protein lieferte als die weiteren Cap- Konstrukte (vgl. Fig. 3).

7. Herstellung einer stabilen Zellinie, die Rep- und Cap-Proteine exprimiert

Die unter Beispiel 5 beschriebene, das Rep-Protein stabil exprimierende Zellinie wurde anschließend mit dem Plasmid P5P19P40Cap transfiziert. Anschließend wurde ein Zellklon identifiziert, der nach Adenovirus- Infektion hohe Mengen sowohl an Rep- als auch an Cap-Proteinen expri­ mierte (vgl. Fig. 4). Anschließend wurde die Funktionalität der Rep- und Cap-Proteine in der ausgewählten Zellinie in einem Infektiösitäts-Versuch mit zwei Amplifikationsrunden untersucht. Die Versuchsergebnisse in Fig. 5 zeigen deutlich, daß sowohl die Rep- als auch die Cap-Proteine in der ausgewählten Zellinie funktionell sind und daß in diesen Zellen infektiöses rAAV gebildet wird. Weiterhin zeigen diese Daten, daß diese Zellinie verwendet werden kann, um einen infektiösen Titer für einen rAAV-Stock zu erhalten. Ein Southern-Blot Experiment mit genomischer DNA bewies, daß die Rep- und Cap-Expressionskassetten vollständig an zwei verschie­ denen chromosomalen Orten integriert waren.

8. Transiente Herstellung von rAAV mit Hilfe dieser Verpackungszellinie

Anschließend wurde bestimmt, wie hoch der Anteil von rAAV war, der mit dieser erfindungsgemäßen Verpackungszellinie erreicht werden konn­ te, wenn ein Vektorkonstrukt in einem transienten Transfektionsexperi­ ment zur Verfügung gestellt wurde. Deshalb wurden Vektorkonstrukte, die entweder für GFP oder B7.2-GM-CSF (Fig. 1B) kodieren, in die stabile Zellinie transfiziert. 24 bis 48 Stunden später wurde Adenovirus in einer Infektionsmultiplizität von 5 (MOI5) hinzugefügt. Nach 72 Stunden wur­ de ein virales Lysat erhalten, gereinigt und verwendet, um HeLa-Zellen zu transduzieren. In neun unabhängigen Experimenten konnte gezeigt wer­ den, daß C97-Zellen tatsächlich in der Lage sind, rAAV zu produzieren, wenn ein Vektorplasmid und Adenovirus-Helferfunktion anwesend sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt.

Tabelle 6

Ein entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Zellinie ist, daß kein Wildtyp-AAV (rcAAV) zu erwarten ist. Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, rcAAV-Kontaminationen zu detektieren, aber es konnten bisher keine rcAAV-Partikel in Virusstocks, die aus diesen Zellinien her­ gestellt wurden, nachgewiesen werden. Dabei wurden 1-2 ml Virus mit etwa 5 × 10⁷ transduzierenden Partikeln/ml getestet.

9. Herstellung einer stabilen Verpackungszellinie für rAAV

In einem nächsten Schritt sollten stabile Zellinien für die Produktion von rAAV hergestellt werden, die für die rAAV Produktion keine Transfektion des Vektorkonstrukts mehr benötigen und dadurch eine Produktion von rAAV in großem Maßstab erlauben. Hierzu wurden in mehreren unabhän­ gigen Transfektionsschritten Vektorkonstrukte in C97-Zellen transfiziert. Primär wurden Klone nach der Expression der Fremd-DNA, die in den rAAV-Genomen enthalten waren, gescreent. Sekundär wurde auch hin­ sichtlich der Virusausbeute durch die Rep- und Cap-Expression eine Aus­ wahl zwischen den Klonen getroffen. Nach dem Screening wurden 72 Klone für das Vektorkonstrukt GFP, 31 Klone für das Vektorkonstrukt B7.2-GM-CSF und 34 Klone für das Vektorkonstrukt nLacZ identifiziert, die nur nach Adenovirus-Infektion in der Lage waren, rAAV in unter­ schiedlichen Größenordnungen zu bilden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7

10. Herstellung von rAAV

Um rAAV herzustellen, wurde Adenovirus Typ 5 mit einer MOI von 5 verwendet, um HeLa-Zellen zu infizieren. Teilweise wurde die Transfekti­ on des Vektorkonstruktes 48 Stunden vor der Adenovirus-Infektion durch­ geführt, wobei die Transfektionseffizienz regelmäßig durch Fluoreszenz- aktiviertes-Zellsortieren (engl.: fluorescence activated cell sorting = FACS), welches nachfolgend noch beschrieben wird, überwacht wurde. 72 Stunden nach der Adenovirus-Infektion wurden die Zellen und der Über­ stand geerntet, wobei die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 Upm für 5 min abzentrifugiert wurden und ca. 10⁷ Zellen/ml in einem Teil des Über­ standes resuspendiert wurden. Der restliche Teil des Überstandes wurde für 30 min bei 56°C behandelt und anschließend bis zur Verwendung ein­ gefroren. Die Zellsuspension wurde einem dreimaligen "Einfrier-Auftau"- Zyklus unterworfen, wobei der Einfriervorgang bei -80°C und der Auftau­ vorgang bei 37°C erfolgte. Anschließend wurden Zellteile durch Zentrifu­ gation in einer Mikrofuge für 5 min bei voller Leistung entfernt. Verblei­ bendes Adenovirus wurde durch eine Inkubation bei 56°C für 30 min in­ aktiviert. Der daraus resultierende Überstand wurde im Rahmen der vor­ liegenden Erfindung als Virusstock für weitere Reinigungen verwendet.

11. Virustitration

Es wurde stets ein Titer des Virusstocks erreicht, der funktionell für die Transduktion ausreichend war. HeLa-Zellen wurden mit UV-Licht (35 J/m²) in einem Stratalinker™ (herkömmlicherweise zu beziehen bei der Firma Stratagene Deutschland) in Phosphat-gepufferter Salzlösung behan­ delt. Unmittelbar nach der Bestrahlung wurden die Zellen der rAAV Sus­ pension ausgesetzt. Es wurden stets verschiedene Volumina einer gegebe­ nen Präparation verwendet, um verschiedene Mengenanteile an transduzierten Zellen zu erhalten. Ausgehend von der daraus bekannten Zahl der Zielzellen wurde rechnerisch die Zahl der transduzierenden Einheiten er­ mittelt. Der Anteil der transduzierten Zellen verhielt sich bei hohen Trans­ duktionsraten nicht mehr linear, er war jedoch annähernd linear, wenn Transduktionsraten von unter 10% gewählt wurden. Die Titrationen wur­ den in 12-Lochplatten durchgeführt, wobei 2 × 10⁵ HeLa-Zellen pro Loch infiziert wurden. Diese Infektionen wurden in 500 µl Puffer durchgeführt.

Weiterhin wurden einige Virusstocks, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet wurden, unter Verwendung eines speziellen Infektionsversuchs titriert, wobei zwei Amplifikationsrunden der Verpackungszellen durchge­ führt wurden, um die infektiösen Titer der Präparationen zu ermitteln. Ein­ zelheiten zu diesem Versuch sind beispielsweise nachzulesen bei Clark et al. (1996) Gene Therapy 3, 1124-1232. Hierzu wurden die Virusstocks se­ riell in serumfreiem Medium verdünnt, anschließend wurden Teilmengen, die bekannte Volumina der Ausgangsvirusstocks enthielten, verwendet, um die Verpackungszellinie C97 im Rahmen dieser Erfindung zusammen mit einer konstanten Menge an Adenovirus (MOI5) zu transduzieren. Nach 72 Stunden wurden die Zellen und der Überstand geerntet, einem dreima­ ligen "Einfrier-Auftau"-Zyklus unterworfen, abzentrifugiert, um Zellteile zu entfernen, bei 56°C behandelt, um Adenovirus zu inaktivieren und an­ schließend auf eine Zellkulturschale mit frischen C97-Zellen zusammen mit frischen Adenoviren (MOI5) gegeben. Nach weiteren drei Tagen wur­ den die Zellen geerntet und ihre DNA mit Hilfe der Hirt-Lyse unter Ver­ wendung eines Standardprotokolls (Hirt (1967) J. Mol. Biol. 26, 365-369) gewonnen. Die DNA wurde nach ihrer Größe in einem Agarosegel aufge­ trennt, geblottet und mit einer Sonde, die entweder einen Teil des Vektor­ konstrukts zur Identifikation der Replikationsformen von rAAV enthielt oder einen Teil des Wildtyp-AAV Genoms, um die Rep- und Cap- enthaltenden infektiösen Partikel zu identifizieren, inkubiert.

Es wurden weitere Titrationen der Vektorpräparationen zur Bestimmung der genomischen Titer durchgeführt. Die erhaltene Virussuspension wurde mit DNAseI behandelt und anschließend bei 68°C für 30 min unter Hinzu­ fügen von 5 mM EDTA inkubiert, und in Capsid eingeschlossene DNA wurde durch eine anschließende Inkubation mit ProteinaseK (0,5 mg/ml) in 0,5% SDS freigesetzt. Die DNA wurde anschließend über eine Phe­ nol/Chloroform-Extraktion gereinigt, anschließend einer Ethanolpräzipita­ tion unterworfen und auf eine Nylonmembran unter Verwendung eines Dot-Blot Apparates geblottet, anschließend mit Sonden hybridisiert, die spezifisch waren für rAAV oder Wildtyp-AAV. Das Verhältnis zwischen genomischen Partikeln und infektiösen Partikeln betrug 100 bis 1000 zu 1, abhängig jeweils von der Präparation, die untersucht wurde.

Das Helfervirus Adenovirus Typ 5, das im Rahmen der vorliegenden Er­ findung verwendet wurde, wurde durch Plaquereinigung erhalten. Nach der Vermehrung in HeLa-Zellen und der Reinigung über doppelte CsCl- Gradientenzentrifugation, wurde Adenovirus nochmals auf HeLa-Zellen titriert, um die benötigte Anzahl von plaquebildenden Einheiten (engl.: plaque forming units = PFU) pro ml (PFU/ml) zu erhalten. Vor der Ver­ wendung wurde eine geringe Teilmenge der erhaltenen Adenovirusstocks auf die Anwesenheit von Wildtyp-AAV getestet, die aber stets negativ war.

12. Protein- und DNA-Analyse

Die DNA mit niedrigem Molekulargewicht als auch die genomische DNA wurden unter Verwendung von Standardisolierungsverfahren gewonnen (Sambrook et al. (1989) supra; Hirt (1967) supra). Für Southern-Blot Analysen von genomischer DNA wurden 15 µg DNA mit dem gewünsch­ ten Restriktionsenzym versetzt, der Ansatz anschließend im Agarosegel aufgetrennt und die DNA auf eine Nylonmembran unter Verwendung eines Vakuumblotters (Firma Pharmacia, Erlangen, Deutschland) transfe­ riert. Bei Verwendung von DNA, die mittels Hirt-Lyse gewonnen wurde, wurde pro Spur eine Menge, die 10⁵ Zellen entsprach, geladen. Als Sonden für die AAV-Genome wurden ein 1,5 kb-HincII Cap-spezifisches Frag­ ment oder ein 655 bp BamHI-BstEII Rep-spezifisches Fragment verwen­ det. Für die rAAV-Genome, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, diente als Sonde eine Probe, die dem CMV Promotor entsprach. Die Sonden wurden mit Digoxigenin markiert, das herkömmli­ cherweise als Kit bei der Firma Boehringer Mannheim, Deutschland er­ hältlich ist, und nach den Angaben des Herstellers verwendet wurde. Für den Nachweis wurde ein alkalischer Phosphatase-konjugierter Anti- Digoxigenin Antikörper verwendet, woran sich eine Inkubation mit dem Substrat CDP Star™ und eine Autoradiographie anschloß. Für Dot-Blot Experimente wurden die Proben auf eine Endkonzentration von 0,4 N NaOH eingestellt und unter Verwendung des bereits genannten Vakuum­ blotters auf eine Membran transferiert.

Für Proteinanalysen wurden die Proben in Laemli-Probenpuffer, der 100 mM DTT aufwies, resuspendiert und anschließend für 15 min aufgekocht, bevor sie in einer SDS-PAGE analysiert wurden. Anschließend wurden die Proteine entweder unter Verwendung eines "Liquid-Transfer-Systems" (Firma Sigma, Deutschland) oder eines "Semi-Dry-Systems" (Firma Hö­ fer, Deutschland) geblottet. Der Nachweis erfolgte mit dem Rep- spezifischen Antikörper 303.9 sowie dem Cap-spezifischen Antikörper B1 (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1353).

13. FACS-Analysen

Die B7.2-Expression wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältli­ chen FITC-konjugierten Antikörpers, der gegen B7.2 gerichtet war (Firma Pharmingen International, USA), untersucht. Um unspezifische Färbungen auszuschließen, wurde ein Isotyp-Kontroll-Antikörper sowie die Färbung von Mock-transduzierten Zellen mit einem B7.2 Antikörper durchgeführt. Die Zellen wurden mit dem Antikörper für 30 min auf Eis inkubiert, an­ schließend zweimal in Phosphat-gepufferter Salzlösung inkubiert, bevor sie analysiert wurden. Die Antikörperfärbung wurde in D10-Puffer durch­ geführt, die Zellen wurden nach den Waschschritten in D10-Puffer resus­ pendiert und der FACS-Analyse unterworfen. Die Fluoreszenz wurde mit einem "Beckton Dickinson FACS Vantage flow cytometer" bei einer Ex­ tinktionswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 ± 15 nm durchgeführt. Der Anteil der positiven Zellen wurde definiert als der Teil, dessen Fluoreszenzintensität größer als 99% der Kontrollzellen war.

Claims (28)

1. Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno- assoziiertem Virus (rAAV) enthaltend mindestens eine Kopie eines Hel­ ferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Rep-Proteins und mindestens eines AAV Cap-Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Rep-Protein und das Cap-Protein kodierenden Nukleinsäuren funktio­ nell getrennt vorliegen und operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, insbesondere mit den natürlichen Promotoren von AAV verbunden sind.

2. Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich mindestens eine Kopie eines Vektorkonstruktes enthält (Produktionszelle).

3. Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie min­ destens eine Kopie eines Nukleinsäurekonstruktes für mindestens ein Gen­ produkt eines Helfervirus und/oder eines zellulären Gens, das für die Pro­ duktion von rAAV notwendig ist, enthält.

4. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich die für das Rep-Protein und das Cap-Protein kodierenden Nukleinsäu­ ren auf zwei unterschiedlichen Helferkonstrukten befinden.

5. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Helferkonstrukte zur Expression des Rep-Proteins und des Cap- Proteins an zwei verschiedenen Stellen in das Genom der Wirtszelle inte­ griert sind.

6. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Rep-Proteins durch den natürlichen AAV Promotor P5 kontrolliert ist.

7. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Cap-Proteins durch den natürlichen AAV Promotor P40, insbesondere durch die natürlichen AAV Promotoren P19 und P40, vor allem durch die natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 kon­ trolliert ist.

8. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Rep-Proteins und des Cap-Proteins in der Wirtszelle voneinander abhängig reguliert ist.

9. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Termination der Transkription der für das Rep-Protein und das Cap- Protein kodierenden Nukleinsäuren durch die natürlichen regulatorischen Sequenzen, insbesondere durch das natürliche AAV Poly-A-Signal, kon­ trolliert ist.

10. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Säugetierzelle, insbesondere eine menschliche Zervix­ karzinomzelle, vor allem eine HeLa Zelle ist.

11. Helferkonstrukt zur Expression wenigstens eines AAV Rep-Proteins in einer Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Rep-Protein ko­ dierende Nukleinsäure operativ mit den natürlichen regulatorischen Se­ quenzen von AAV, insbesondere mit dem natürlichen AAV Promotor P5, verbunden ist.

12. Helferkonstrukt nach Anspruch 11 enthaltend Nukleinsäuresequenzen ko­ dierend für mindestens ein Rep-Protein, dadurch gekennzeichnet, daß die Rep-Proteine Rep 68, Rep 52 und/oder Rep 40, nicht aber Rep 78 sind.

13. Helferkonstrukt zur Expression wenigstens eines AAV Cap-Proteins in einer Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Cap-Protein ko­ dierende Nukleinsäure operativ mit den natürlichen regulatorischen Se­ quenzen von AAV, vorzugsweise mit dem natürlichen AAV Promotor P40, insbesondere mit den natürlichen AAV Promotoren P19 und P40, vor allem mit den natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 verbunden ist.

14. Vektorkonstrukt enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nuklein­ säure/n, die von ITR-Sequenzen flankiert werden, dadurch gekennzeich­ net, daß die 5'-lokalisierte ITR-Sequenz eine Deletion im Bereich des C- Palindroms aufweist.

15. Vektorkonstrukt nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die De­ letion der 5'-lokalisierten ITR-Sequenz 150 Nukleotide, bevorzugt 80 Nu­ kleotide, insbesondere 40 Nukleotide, vor allem 22 Nukleotide des C- Palindroms beträgt.

16. Vektorkonstrukt enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nuklein­ säuren, insbesondere eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein ausge­ wählt aus einem Zytokin, insbesondere IL2, IL4, IL12 und/oder GM-CSF und/oder einem ko-stimulierenden Molekül, insbesondere B7, vor allem B7.1 und/oder B7.2, welche insbesondere von AAV ITR-Sequenzen flan­ kiert werden und die Expression der heterologen Nukleinsäure/n von ei­ nem zu AAV heterologen Promotor und/oder Enhancer, insbesondere von CMV MIEP kontrolliert sind.

17. Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle zur Verpackung und/oder Pro­ duktion von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), das die Schritte umfaßt:

• a) Herstellung eines Rep-Helferkonstruktes gemäß Anspruch 10 oder 11 und eines Cap-Helferkonstruktes gemäß Anspruch 12,
• b) Einbringen des Rep-Helferkonstruktes in eine Wirtszelle,
• c) Selektion einer das Rep-Helferkonstrukt enthaltenden Wirtszelle,
• d) Einbringen des Cap-Helferkonstruktes in die selektionierte Wirts­ zelle aus Schritt (c) und
• e) Selektion einer das Rep-Helferkonstrukt und das Cap- Helferkonstrukt enthaltenden Wirtszelle.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Cap- Helferkonstrukt vor dem Rep-Helferkonstrukt in die Wirtszelle einge­ bracht wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Rep- und das Cap-Helferkonstrukt im wesentlichen gleichzeitig in die Wirtszelle eingebracht werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Cap-Helferkonstrukt, mindestens ein Rep- Helferkonstrukt, mindestens ein Vektorkonstrukt und/oder mindestens ein Helfergen in die Wirtszelle eingebracht wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Konstrukte und/oder Gene transfiziert, insbesondere stabil transfi­ ziert werden.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Konstrukte und/oder Gene mit Viren, insbesondere mit rekombi­ nanten Viren, vor allem rAAV, Adenoviren, Herpesviren, Vacciniaviren Baculoviren, Phagen und/oder Bakteriophagen in die Wirtszelle einge­ bracht werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorselektion auf Zellen mit Integrationsereignissen durchgeführt wird, insbesondere durch das gemeinsame Einbringen eines Reporterkon­ struktes mit einem der Konstrukte und/oder Gene in eine Wirtszelle und anschließende Selektion bezüglich des Reporters.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion der Konstrukte- und/oder Gene-enthaltenden Wirtszelle über den Nachweis der Proteinexpression, insbesondere mittels Western­ blot erfolgt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion der Konstrukte- und/oder Gene-enthaltenden Wirtszelle über den Nachweis spezifischer Nukleinsäuren, insbesondere mittels Southernblot, Northernblot und/oder quantitativer PCR erfolgt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion der Konstrukte- und/oder Gene-enthaltenden Wirtszelle über den Nachweis der rAAV-Partikelbildung erfolgt, in dem in die Wirts­ zelle die zur rAAV-Partikelbildung fehlenden Konstrukte eingebracht werden und/oder mit Helferviren infiziert werden.

27. Verwendung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder mindestens eines Rep-Helferkonstrukt nach Anspruch 11 oder 12 und mindestens eines Cap-Helferkonstruktes gemäß Anspruch 13 und/oder eines Vektorkonstruktes nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Herstel­ lung von rAAV.

28. Verwendung von rAAV gemäß Anspruch 27 zum Transfer von Genen in Zellen, insbesondere von immunstimulatorischen Genen, vor allem GM- CSF, B7.1 und/oder B7.2.