DE10044353A1 - Unkompetitive Inhibitoren der Helikase-Primase - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren des viralen Helikase-Primase-Enzymkomplexes mit anti-Herpes-Aktivität sowie Medikamente, die diese Verbindungen in geeigneter Formulierung enthalten. Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von anti-viral wirksamen Substanzen, um Herpes-Infektionen bei Mensch und Tier zu behandeln.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren des viralen Helikase-Primase Enzym­ komplexes mit anti-Herpes Aktivität sowie Medikamente, die diese Verbindungen in geeigneter Formulierung enthalten. Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von anti-viral wirksamen Substanzen, um herpes Infektionen bei Mensch und Tier zu behandeln.

Die Wirkung der Verbindungen beruht im wesentlichen auf der unkompetitiven Hemmung der viralen Helikase-Primase, der simultanen Bindung der Substanzen an die Helikase und die Primase Untereinheit des Enzymkomplexes, der Inhibition der Virusreplikation in vitro und in vivo sowie nicht zuletzt auf den sehr guten pharmakokinetischen und pharamakodynamischen Eigenschaften, die zu einer bislang nicht erreichten Wirkung im Tiermodell führen.

Im folgenden werden die einzelnen Aspekte wie der virale Replikationsassay in Zellkultur, die Bindung eines Moleküls an zwei Targets, die Herpes Viren sowie das Forschungsumfeld, der Stand der Technik und die Erfindung selbst beschrieben.

In dieser Anmeldung ist ein viraler Replikationsassay beschrieben, der es erlaubt, wirksame und verträgliche antivirale Verbindungen zu identifizieren. Die Strategie basiert auf der simultanen Auswahl von Molekülen nach 2 wesentlichen Kriterien und zwar erstens mit Bezug zur anti-mikrobiellen Wirkung (das Molekül bindet funktionell an ein relevantes Target (Positivselektion)) und zweitens müssen die Verbindungen verträglich sein, d. h. die Moleküle binden oder modulieren dann keine unerwünschten (Wirts-)Targets (Negativselektion).

Zahlreiche Medikationen und Therapien wurden erfunden und in der jüngeren Vergangenheit werden diese Methoden zunehmend kombiniert, um die therapeu­ tische Wirksamkeit zu erhöhen, weil Monotherapien in einigen Fällen nicht den gewünschten profunden Nutzen bei der Applikation am Patienten gezeigt haben.

Leider werden bei der Anwendung der Kombinationstherapie in einigen Fällen neben der erwünschten Potenzierung des Therapieeffektes auch verstärkt Nebenwirkungen beobachtet, die auf eine geringe Verträglichkeit zurückzuführen sind. Als ein klassi­ sches Beispiel der Kombinationtherapie kann hier die Behandlung der HIV-Infizier­ ten bzw. das Therapieschema der AIDS Patienten aufgeführt werden.

Im Bereich der Antiinfektiva Forschung zum Beispiel, kann ein Wirkstoff, der simultan zwei essentielle Targets im Vermehrungszyklus eines Pathogens inhibiert, einen verstärkten Therapieeffekt entfalten. Diese Wirkungsverstärkung basiert auf kumulativen, inhibitorischen Effekten wie das in der Vergangenheit für den analogen Fall der Kombinationstherapie, die häufig der (ein Molekül Chemo-)Monotherapie, bei welcher der Wirkstoff des Therapeutikums in der Regel nur eine relevante Bindungstasche eines Proteins oder einer Untereinheit eines Proteinkomplexes moduliert, überlegen ist, gezeigt wurde. Bindet der Wirkstoff im Bereich der Kon­ taktstelle von zwei Targets so kann häufig eine stärkere Bindung aufgrund von Aviditätseffekten festgestellt werden. Die besseren Bindungseigenschaften und oder die kummulativen inhibitorischen Effekte resultieren in einer überlegenen therapeu­ tischen Wirkung, die sich idealerweise ohne Nebenwirkungen entfaltet, d. h. durch eine sehr gute Verträglichkeit auszeichnet. Für den Patienten bedeutet das erfreu­ licherweise in der Konsequenz niedrigere Dosen.

Die Herpesviridae entwickelten sich in der Evolution über Millionen von Jahren und sind in der Natur sehr weit verbreitet. Mitglieder dieser Familie wurden im Men­ schen, nicht-humanoiden Primaten und den meisten anderen Säugetieren und Verte­ braten nachgewiesen (Virology, 1996, Fields et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA 19106, USA). Bei den Herpesviren handelt es sich um umhüllte, doppelsträngige DNA Viren, die permissive Zellen infizieren, welche auf ihrer Zelloberfläche neben negativen Ladungen des Heparansulfates und oder der Glykosaminoglycane zusätzlich noch den sogenannten herpes viral entry mediator tragen. Eine bemerkenswerte Eigenschaft der Viren ist ihre Fähigkeit, eine lebenslange Latenz im infizierten Wirt auszubilden und bei endogenen oder externen Stimuli aus dem Pool der latent infizierten Zellen mehr oder weniger häufig zu reaktivieren und rekurrente Infektionen auszulösen.

Acht humane Herpesvirusen (HHV1 to HHV8) wurden bislang beschrieben. Die viralen Genome (~ 125-230 kbp Information) wurden sequenziert und in den gängigen Datenbanken, die auch über das Internet verfügbar sind, hinterlegt (GeneBank, EMBL database etc.). Hohe Sequenzhomologien wurden beim Vergleich der Genome identifiziert. Im besonderen trifft dieses auf die für die Helikase und Primase kodierenden Gene zu; das bedeutet, daß die Replikationsmaschinerie unter den Herpes Viren hochkonserviert ist aber beim Vergleich mit eukaryontischen Genen klar von der DNA Replikation des Wirtes abgegrenzt werden kann. Die Genome kodieren für mehr als 50 Leserahmen, die für den Vermehrungszyklus der Viren in vitro und oder in vivo essentiell sind. Zahlreiche Publikationen diskutieren die Relevanz oder die Eignung dieser potentiellen Targets für eine erfolgreiche antivirale Therapie. Die Funktion des Helikase-Primase Enzymkomplexes im Replikationszyklus und dessen Eignung als Target für eine effiziente antivirale (Chemo) Therapy einer Herpes-viralen Infektion ist bereits veröffentlicht (Herpes Simplex Virus Replication, 1997, Annual review of Biochemistry, Boehmer PE & Lehmann IR, 66, 347-384; The Structure and function of the HSV DNA replication proteins: defining novel antiviral targets, 1993, Antiviral Research, Matthews JT, Terry BJ, Field AK, 20, 89-114).

Aufgrund von ähnlichen biologischen Eigenschaften wurden die Herpesviren in 3 Subfamilien, und zwar in α-(HHV1 bis 3), β-(HHV5 bis 7), und γ-(HHV4 und HHV8) Herpesviren, eingeteilt. Trivialnamen wurden auf Grundlage der klinischen Symptome des Krankheitsbildes oder einfach aus historischen Gründen wie folgt abgeleitet: Herpes simplex virus 1 und 2 (HSV-1 und -2 verursachen Herpes labialis und genitalis) stehen auch für HHV1 und 2, das Varicella Zoster Virus (VZV ist der Erreger der Windpocken und der Gürtelrose) wird synonym mit HHV3 und das Epstein-Barr-Virus (EBV) und das Cytomegalievirus (HCMV) werden synonym mit der Bezeichnung HHV4 und 5 benutzt.

Innerhalb einer Population liegt der Anteil der mit einem oder mehreren Herpes Viren Infizierten zwischen weniger als 10 und mehr als 90% abhängig von der Altersgruppe, dem Geschlecht, dem sozialen Status, geographischen Aspekten und natürlich davon welches Herpesvirus untersucht wird. Gerade weil es sich bei einigen Herpesviren um ubiquitär vorkommende Pathogene handelt, die eine Reihe von Krankheiten auslösen, welche von leichten Symptomen, die nur die normalen Tagesaktivitäten beeinträchtigen, bis hin zu Visus oder lebensbedrohlichen Erkrankungen reichen kann; insbesondere seien hier die bei immunsupprimierten Patienten die Keratitis, eine generalisierte Virämie oder bei AIDS Patienten eine Retinitis, bei Schwangeren der Abort und bei Neugeborenen eine Hepatitis, Enczephalitis oder Taubheit genannt; ist ein starker medizinischer Bedarf an einer sicheren und wirksamen Medikation vorhanden und es wurden umfangreiche Forschungsprogramme aufgelegt, um neue, effektivere Virustherapeutika zu finden.

Zovirax™ (Acyclovir), ein selektiver und spezifischer Inhibitor der Herpes Virus Replikation, war Ende der 70iger Jahre des 20. Jahrhunderts der erste Meilenstein in der Entwicklung antiviraler Wirkstoffe. Neue Abkömmlinge dieses kommerziell sehr erfolgreichen Nukleosids sind Penciclovir oder die or pharmakokinetisch optimierten Pro-drugs Valacyclovir und Famciclovir, die dem Patienten bequemere Dosis oder Therpieregime eröffnen, wurden Mitte bis Ende der 90iger Jahre ausgeboten. Nukleoside sind heute in Ermangelung einer Alternative in der Tat die Therapeutika der Wahl bei Herpes Infektionen. Bei den Nukleosiden handelt es sich jedoch um sogenannte Pro-drugs, die zuerst durch die virale Thymidin-Kinase (TK) phosphoryliert und dann nachfolgend von zellulären Kinasen umgesetzt werden müssen, damit der eigentliche Wirkstoff das Nukleosidtriphosphat die Aktivität der viralen DNA-polymerase hemmen kann. Weist der Virus keine funktionell aktive TK auf, wie das zum Beispiel bei resistenten HHV1 Mutanten, bei TK negativen Viren wie HCMV oder Viren, die nicht über eine optimale Primärstruktur mit Bezug zur viralen DNA-Polymerase aufweisen, der Fall ist, so kann der Wirkstoff nicht sein volles Potenital entfalten, der Selektivitätsindex ist deutlich reduziert und höhere Dosen müssen appliziert werden, die wiederum zu vermehrten Nebenwirkungen führen können. Da es sich bei den Nucleosiden und Nukelotiden um obligate oder nicht-obligate Terminatoren der DNA-Polymerization handelt, besitzen sie mutagenes Potential was für das Nucleosid Cymevene™ (Ganciclovir) umfangreich dokumentiert ist. Zusammengefast kann man feststellen, daß eine mögliche Breitbandspektrum anti-Herpes Aktivität, die Wirksamkeit der Medikamente besonders bei spät einsetzender Therapie, die Arzneimittelsicherheit und das Auftreten von Nukleosid-resistenten Viren, die anvisierten Ziele für die nächste Generation von Therapeutika, die auf neuen Wirkmechanismen beruhen, klar umreissen.

Eine neue Option, der ternäre Herpes Helikase Primase Komplex bestehend aus UL5, UL8 und UL52, ist bekannt (Ann. Ref. Biochem. 1990, 59, 289-329), ebenso wie seine Eignung als Anti-Herpes-Target (Antiviral Research 20, 1993, 89-114. Inhibitoren der Herpes-Helicase-Primase sind ebenfalls bekannt aus J. Med. Chem. 1995, 38, 1811-1819.

Die Patentanmeldung WO 97/24343 beschreibt eine Methode, um Inhibitoren mit anti-herpes Eigenschaften zu identifizieren, die dadurch gekennzeichnet ist das Verbindungen ausgewählt werden, die, sofern sie and den DNA-Helikase-Primase Komplex binden, den DNA-Enzymkomplex stabilisieren. Es wird angenommen, daß diese Inhibitoren an allosterische Bindungsstellen auf dem UL5 oder UL52 Genprodukt der HSV Helikase-Primase oder homologer herpes viraler Enzym­ komplexe binden, und somit den Stabilisierungseffekt auslösen. Diese allosterische Bindungstasche soll im Bereich der A-B Sequenz auf der UL52 Untereinheit lokalisiert sein und die Inhibition wird durch Blockierung eines terminalen Zinkfingers auf einer katalytischen Untereinheit des Herpes Helikase-Primase vermittelt. Ein entscheidender Nachteil dieser Methode ist es, daß häufig Verbindungen identifiziert werden, die nicht den notwendigen Selektivitätsindex in vitro oder die gewünschte Verträglichkeit in vivo aufweisen, und in der Konsequenz in der Regel nicht für die Behandlung von Herpes Infektionen aufgrund der nicht gewährleisteten Arzneimittelsicherheit eingesetzt werden können.

Die Anmeldung WO 99/42455 und die Veröffentlichung von Spector, F. C., Journal of Virology 1998, Vol 72, No 9, pages 6979-6987 beschreibt Verbindungen die exklusiv an die UL5 Untereinheit des Helikase-Primase Enzymkomplexes binden, was durch umfangreiche Mutationsanalyse von mindestens 25 unterschiedlichen UL5 Mutanten nachgewiesen wird. Es wird weiterhin festgestellt, daß z. B T157602 als Verteter dieser Verbindungsklasse weder ATP noch DNA kompetitiv vom Enzymkomplex verdrängt. Substituierte Thiazolylphenylderivate sind bemerkens­ werterweise auch als essentielles und zentrales Strukturmotiv für die Verbindungen der oben zitierten Anmeldung WO 97/24343 beschrieben.

Obwohl der Helicase-Primase-Komplex schon geraume Zeit bekannt ist und ein dringendes Bedürfnis nach neuen antiviralen Targets vorherrscht (Antiviral Research, 20, 1993, 89-114), konnte trotz diverser Patentanmeldungen auf diesem Gebiet bisher keine Klasse von geeigneten Verbindungen identifiziert werden, die es bis zur Marktreife geschafft hätte. Dies ist neben mangelnder Aktivität zum großen Teil auf das Auftreten starker Nebenwirkungen zurückzuführen.

Ziel dieser Erfindung ist es deshalb ein Verfahren bereitzustellen, mit dem nicht nur alternative oder wirksamere Verbindungen identifiziert werden können, sondern vor allem Wirkstoffe mit einem verbesserten Selektivitätsindex in vitro und einer überlegenden Verträglichkeit mit Bezug zum Stand der Technik gefunden werden können. Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist es Wirkstoffe zu identifizieren und bereitzustellen, die zur Therapie von Infektionen eingesetzt werden können, die durch Nukleosid/Nukleotid resistente Herpes Viren ausgelöst werden.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass sich Arzneimittel, die die nachfolgend aufgeführten Merkmale bzw. Eigenschaften aufweisen und den Herpes-Helikase- Primase Komplex in einer hier beschriebenen neu gefundenen Art und Weise inhibiieren zur Behandlung von Herpes-Infektionen geeignet sind.

Die vorliegende Erfindung löst die oben beschriebene Problemstellung indem Arzneimittel, die unkompetitive Inhibitoren der Herpes-Helicase-Primase enthalten, zur Verfügung gestellt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel nach dadurch gekennzeichnet, daß die Helicase-Primase mindestens 50% homolog sind zur Helicase-Primase des Herpes-Simplex-Virus 1, bezogen auf die Nukleotid-Sequenz oder die Aminosäure-Sequenz, je nachdem was höher ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Helikase-Primase tragenden Virus um Herpes- Simplex-Virus 1 handelt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, gleichzeitig an die Helikase und die Primase Untereinheit des Helikase-Primase Komplexes zu binden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die DNA-abhängige NTPase Aktivität der Helikase-Primase zu inhibieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Herpes Virus zu inhibieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Herpes Virus in Zellkultur bei einer Konzentration von 10 µM um mindestens 50% zu inhibieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen die Replikation eines Herpes Virus in Zellkultur bei einer Konzentration von ≦ 500 nM um mindestens 50% zu inhibieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Helikase-Primase tragenden Viren um PRV oder BHV handelt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen mit Anti-Herpes-Aktivität beschrieben, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß die Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Helikase-Primase zu inhibieren, getestet werden und solche Verbindungen ausgewählt werden, die den Helikase- Primase Enzymkomplexes unkompetitiv inhibieren.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbindungen, die nach irgendeiner hier beanspruchten Methode oder Verfahren identifiziert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Verbindung kein Nukleosid oder Nukleotid ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbin­ dungen, die zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prophylaxe von Herpes Infektionen verwendet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel oder pharmazeutische Formulierungen, die Verbindungen entsprechend den oben aufgeführten Methoden oder Verfahren enthalten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Herpes Infektionen in Säugern, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Säuger, der eine derartige Therapie benötigt, eine therapeutisch wirksame Menge des hier beanspruchten Arzneimittels oder der pharmazeutischen Formulierung verabreicht wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Verbindungen enthalten, die folgende allgemeine Strukturformel (I) aufweisen,

Y-A-X-SO₂NR¹R² (I)

worin
Y für (C₆-C₁₀)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen ge­ sättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
A für eine Gruppe der Formeln -CR^4'R^5'-C(O)-CR⁴R⁵-, -CR^4'R^5'-C(O)-NR⁹-, -NR^9'-C(O)-CR⁴R⁵- oder -NR⁹'-C(O)-NR⁹- steht,
worin
R⁴, R^4', R⁵, R^5', R⁹ und R^9' gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₂-C₆)-Alkenyl oder (C₃-C₈)-Cycloalkyl stehen,
X für (C₆-C₁₀)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Hetero­ cyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebunde­ nen 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aroma­ tischen Heterocyclus steht,
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl oder (C₃-C₈)-Cycloallcyl stehen,
wobei der Winkel A-X-SO₂, 153° +- 15% beträgt und die Verbindung eine Molmasse von kleiner als 500 g/mol aufweist,
und deren Salze.

Die hier dargelegte Erfindung löst die oben aufgeführten Probleme bzw. erfüllt die gesteckten Ziele für neue Therapeutika, indem Verfahren zur Identifizierung neuer (nicht-nukleosidischer) Wirkstoffe, die direkt die enzymatische Aktivität des Herpes Helikases Primase Komplexes auf eine neue hier erstmalig beschriebene Art und Weise inhibieren, beschrieben werden. Die Inhibition dieses essentiellen Enzym­ komplexes führt bei geeigneter Struktur der Verbindung, die hier durch ein gene­ risches Pharmakophormodel neben Beispielhaft konkret aufgeführten Wirkstoffen offenbart wird, nicht nur zur Inhibition der DNA replication sondern auch insbesondere zur Inhibition der Herpesvirus Replikation in vitro und in vivo. Darüber hinaus, gerade weil der Enzymkomplex der Helikase-Primase bei der Familie der Herpes viridae hoch konserviert ist, konnten mit der vorliegenden Erfindung eine Breitbandspektrum anti-Herpesvirus Aktivität der Verbindungen zeigen (Tabelle 1). Die selektive Wirkung der Inhibitoren auf Mitglieder der Familie der Herpesviren und insbesondere gegen Acyclovir-resistente Herpesvirusen, in Kombination mit einem geeigneten Sicherheitsprofil machen diese Wirkstoffe zu einem seit Jahren gewünschten Agens, um Herpes Infectionen zu behandeln.

Der Begriff "Herpes", sofern er im Kontext dieser Erfindung gebraucht wird, schließt alle Viren der Familie der Herpes Viren ein und umfaßt insbesondere die Herpesviren, die für Helikase-Primase Proteine kodieren. Dies gilt besonders für Proteine, die homolog sind mit Bezug zur Herpes Helikase-Primase des HSV Virus. Insbesondere gilt dies für solche, bei denen die Helikase oder Primase mindestens 50% homolog zur Helikase oder Primase des Herpes simplex Virus 1 ist, basierend auf der Nukleotid oder Aminosäure-Sequenz, je nachdem was höher ist. Zur Familie der Herpesviren gehören zum Beispiel HHV-1 bis HHV-8, EHV, BHV, PRV usw.

Die Herpes simplex Viren 1 and 2 werden entsprechend ihrem Serotyp bezeichnet die auf Basis spezifischer monoklonaler Antikörperreaktionen charakterisiert sind.

Der Begriff Helikase-Primase bezieht sich auf den Helikase-Primase Enzymkomplex, der zur Replikation der viralen DNA notwendig ist. Im Falle der Herpes simplex Viren besteht dieser Enzymkomplex aus den Proteinen der Gene UL5, UL8 und UL52 oder zumindest den (notwendigen oder essentiellen) UL5 und UL52 Gen­ produkten; handelt es sich um weitere Mitglieder der Herpesfamilie, so wird Bezug auf die korrespondierenden Homologe genommen.

Der Begriff Helikase bezeichnet die Untereinheit des Helikase-Primase Komplex der an der viralen DNA-Replikation beteiligt ist. Im Falle der Herpes simplex Viren handelt es sich hierbei um das UL5 Genprodukt; handelt es sich um weitere Mit­ glieder der Herpesfamilie, so wird Bezug auf die korrespondierenden Homologe genommen.

Der Begriff Primase bezeichnet die Untereinheit des Helikase-Primase Komplex der an der viralen DNA-Replikation beteiligt ist. Im Falle der Herpes simplex Viren handelt es sich hierbei um das UL52 Genprodukt; handelt es sich um weitere Mitglieder der Herpesfamilie, so wird Bezug auf die korrespondierenden Homologe genommen.

Die Abkürzung moi steht für "multiplicity of infection" und ist der Quotient der Zahl der infektiösen Partikel oder Zellen des Pathogens dividiert durch die Zellzahl der zu infizierenden Zellen.
(MOI = Zellzahl oder Zahl der infektiösen Partikel des Erregers/Zahl der Zellen, die infiziert werden).

Der Begriff IC₅₀ oder EC₅₀ beschreibt die Konzentration oder die Menge an Wirkstoff, die benötigt wird um eine 50%ige Inhibition in einem gegebenen Tes­ tsystem zu erreichen oder die effektive Konzentration, die benötigt wird um ein halbmaximales Signal in einem Assay zu erreichen.

Der Begriff Selektivitätsindex (SI) bezieht sich auf den Quotient der Konzen­ trationen, bei der die Zellvitalität auf 50% gegenüber der Zellkontrolle reduziert ist, dividiert durch die Konzentration, bei der die anti-mikrobielle Wirkung mindestens 50% einer maximal möglichen Inhibition der Erregervermehrung erreicht, d. h. SI = (CC₅₀/IC₅₀). Je größer diese Zahl ist, um so größer ist die Verträglichkeit der Ver­ bindung. Bevorzugt werden Verbindungen mit SI-Werten größer 10.

Der Begriff therapeutischer Index (TI; Verträglichkeit) bezieht sich auf einen Quotient der lethalen Dosis (LD; lethal dose) bei der 50% der Versuchstiere auf­ grund der Substanzwirkungen sterben und der effektiven Dosis (ED; effective dose) bei der 50% der Versuchtiere die Infektion überleben TI = (LD₅₀/ED₅₀).

Der Begriff Formulierung mit Bezug zu Wirkstoffen beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die aus nicht-toxischen, generell inerten Hilfsstoffen und Trägermaterialen, die keinen negativen Effekt auf die Wirkung des aktiven Bestandteil verursachen, besteht, sondern vielmehr eine optimale Applikation des Wirkstoffes mit Bezug zur Pharmakokinetik und Pharmakodynamik erlauben.

Der Begriff inhibieren beschreibt, wenn er im Zusammenhang mit der enzymatischen Aktivität Verwendnung findet, die Inhibition der maximal möglichen Enzymaktivität um mindestens 50% bei einer Konzentration von etwa IC₅₀ = 100 µM oder weniger und bevorzugt bei einer Konzentration die so niedrig wie möglich ist in einem entsprechenden in vitro Assay der zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eingesetzt wird.

Der Begriff unkompetitive Hemmung beschreibt einen seltenen Hemmtyp, bei welchem der Hemmstoff an den Enzym-Substrat-Komplex bindet Bei diesem Hemmtyp ändert sich die Maximalgeschwindigkeit, Km bleibt im Rahmen der experimentellen Unsicherheit unverändert. Der Begriff unkompetitiv schließt aus­ drücklich die partiell unkompetitiven Hemmtypen mit ein.

Der Begriff inhibieren beschreibt, wenn er im Zusammenhang mit dem in vitro viralen Replikationassay gebraucht wird, generell die Inhibition des Mikrobenwachs­ tums um ca. 50% bei einer Konzentration von IC₅₀ = 100 µM oder geringer und bevorzugt eine Konzentration, die so niedrig ist wie möglich, um den Wert zu erreichen.

Der Begriff Target bezieht sich hier in der Regel auf das Zielmolekül, welches gegebenenfalls durch Wirkstoffe in seiner Aktivität moduliert wird. Das Target ist allgemeiner gesprochen häufig ein Genprodukt, das essentiell an der Entstehung eines Krankheitsbildes beteiligt ist.

Der Begriff der Mutation in einem Target beschreibt eine Mutation in einem Gen, die zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des entsprechenden Protein führt.

Der Begriff Reduktion mit Bezug zum Verlust der Erhöhung oder Erniedrigung der Aktivität wird verwendet, wenn die Änderung der Aktivität signifikant ist, besser den Faktor 2 erreicht und bevorzugt sich um eine Größenordnung ändert.

(C₁-C₆)-Alkyl steht zweckmäßig für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (C₁-C₄). Beispielsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n- Hexyl. Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ((C₁-C₃)Alkyl).

(C₆-C₁₀)-Aryl steht im allgemeinen für einen aromatischen Rest mit 6 bis 10 Kohlen­ stoffatomen. Bevorzugte Arylreste sind Phenyl und Naphthyl.

(C₃-C₈)-Cycloalkyl steht im Rahmen der Erfindung für Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl. Bevorzugt seien genannt: Cyclopropyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl. Die Bedeutung von (C₃-C₆)Cycloalkyl steht entsprechend zweckmäßig für Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclo­ hexyl.

Ein 5- bis 6-gliedriger aromatischer Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, O und/oder N steht beispielsweise für Pyridyl, Pyrimidyl, Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, N-Triazolyl, Oxazolyl oder Imidazolyl. Bevorzugt sind Pyridyl, Furyl, Thiazolyl und N-Triazolyl.

Ein 5- bis 6-gliedriger aromatischer benzokondensierter Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, O und/oder N steht beispielsweise für Benz­ imidazolyl.

Ein gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundener 3- bis 8- gliedriger ge­ sättigter oder ungesättigter, nicht aromatischen Heterocyclus mit bis zu 3 Hetero­ atomen aus der Reihe S, N und/oder O schließt z. B. Morpholinyl, Piperidinyl, Piperazinyl, Methylpiperazinyl, Thiomorpholinyl oder Pyrrolidinyl ein sowie 3-, 7- und 8-gliedrige Heterocyclen, wie z. B. Aziridine (z. B. 1-Azacyclopropan-1-yl), Azetidine (z. B. 1-Azacyclobutan-1-yl) und Azepine (z. B. 1-Azepan-1-yl) ein. Die ungesättigten Vertreter können 1 bis 2 Doppelbindungen im Ring enthalten.

Die in dieser Patentanmeldung beschriebenen Verbindungen bzw. die Pharma­ kophorformel sowie der Wirkmechanismus der Substanzen ist neu und kann klar insbesondere gegen die Anmeldungen WO 97/24343, WO 99/42455 sowie alle bis zur Priorität veröffentlichten Publikationen abgegrenzt werden. Während die in der Anmeldung WO 97/24343 offengelegten Substanzen an eine allosterische Bindungsstelle auf dem UL5 oder dem UL52 Genprodukt der HSV Helikase Primase binden, und somit die Bindung Enzymkomplexes an das DNA-Substrat verstärken bzw. stabilisieren (den Autoren zufolge liegt diese allosterische Bindungsstelle innerhalb der sogenannten A-B Sequenz auf der UL52 Untereinheit und der inhibitorische Effekt wird durch Modulation eines terminalen Zinkfingermotivs auf einer katalytischen Untereinheit des Herpes Helikase-Primase Komplexes verursacht), binden die in der Anmeldung WO 99/42455 veröffentlichten Substanzen exklusiv an die UL5 Untereinheit des Komplexes, was explizit in der Veröffentlichung von Spector, F. C., Journal of Virology 1998, Vol 72, No 9, pages 6979-6987 festgestellt wird.

Geeignete Verbindungen, die entsprechend dem oben genannten Mechanismus den Helikase-Primase Komplex inhibieren, können identifiziert werden, indem die Fähigkeit der Substanzen auf Bindung an die Helikase (Untereinheit) und oder die Primase (Untereinheit) des Helikase-Primase Komplexes geprüft wird. Bevorzugt wird die Fähigkeit der Wirkstoffe die Enzymassoziierte DNA-abhängige NTPase Aktivität der Herpes Helikase-Primase (wie zum Beispiel Helikase-Primase des Herpes simplex virus) zu inhibieren geprüft, was vorteilhafterweise technisch mittels eines Hochdurchsatzscreenings (HTS, high throughput screening) durchgeführt wird. Alternativ kann auch die Fähigkeit der Substanzen die virale Replikation in einem in vitro Zellkultursystem zu inhibieren getestet werden und anschließend die Substanzen ausgewählt werden, die die DNA-abhängige Hydrolyse relevanter Nukleotide unkompetitiv inhibieren.

Zahlreiche Methoden sind beschrieben, um direkt die Bindung von Molekülen an Proteine zu messen, jedoch erfordern viele dieser Testsysteme, um zu quantitativen Ergebnissen zu gelangen, gereinigtes Protein oder zumindest eine angereicherte Fraktion. Es sollte an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben, daß nicht alle an das Protein oder Enzym bindenden Moleküle die Funktion des Targets in der ge­ wünschten Art und Weise modulieren.

Der enzymatische Assay kann einfach durchgeführt werden, aber das Enzym muß funktionell aus einer Herpes infizierten Zellkultur gereinigt werden. Alternativ kön­ nen die Gene des Enzymkomplexes mit gentechnologischen Methoden in ein ent­ sprechendes Expressionssystem kloniert und dann exprimiert werden. Wird das Enzym funktionell produziert, so muß es mit den gängigen Aufreinigungstechniken angereichert oder bevorzugt rein dargestellt werden.

Ein viraler Replikationsassay kann sehr einfach wie in dieser Anmeldung be­ schrieben in einem Zellkultursystem durchgeführt werden. Dieser Assay ist mög­ licherweise sensitiver als die genannten enzymatischen Testsysteme, weil die Virus­ vermehrung in Zellkultur das reale Infektionsgeschehen am besten simuliert und gegebenenfalls die Zahl der Enzymmoleküle niedriger ist mit Bezug zum Inhibitor als im Enzymassay. Werden Inhibitoren der Virusreplikation identifiziert, so müssen jedoch weitere Methoden wie z. B das Herstellen von Mutanten mit anschließender Genomsequenzierung in Kombination mit einer Komplementationsanalyse ange­ wendet werden, um den Wirkmechanismus aufzuklären bzw. das zugrundeliegende Target (im vorliegenden Beipiel die virale Helikase-Primase) zu identifizieren.

Wirkstoffe, die einen Effekt im Enzymassay zeigen oder die Virusreplikation im Zellkultursystem hemmen, können näher in einem Test charakterisiert werden, der Rückschlüsse auf die Bindungseigenschaften des Moleküls an den Helikase-Primase Komplex erlaubt. Andererseits können Verbindungen die einen Effekt im Bindungs­ test hervorrufen nachfolgend mittels eines Enzymtestes funktionell genauer unter­ sucht oder auf Hemmung der Virusreplikation in Zellkultur geprüft werden. Auch wenn die nachfolgend beschriebenen Testsyteme in einer möglichen Reihenfolge aufgeführt werden, so ist darunter nicht zu verstehen, daß alle Tests für eine erfolg­ reiche Identifizierung von Herpes Helikase-Primase Inhibitoren in exakt dieser Reihenfolge durchgeführt werden müssen, sondern daß vielmehr die Zahl der ver­ schiedenen Tests wie auch deren Reihenfolge im Ermessensbereich des Fachmannes liegt, um effizient zum Ziel zu gelangen.

Wiederum andere Testsysteme erlauben es festzustellen, ob ein gegebener Wirkstoff die Enzym-vermittelte RNA Primer Biosynthese inhibiert oder ob die Substanz die Helikaseaktivität des Komplexes moduliert.

DNA und zwar bevorzugt Einzelstrang-DNA mit einer entsprechenden Primase Konsensus Sequenz im Falle des Primase Assays oder ein DNA Substrat das eine Replikationgabel ähnliche Struktur ausbildet kann im Helikase Assay eingesetzt werden. Zahlreiche Optionen sind beschrieben und an dieser Stelle sei auf die Über­ sichtsliteratur (Boehmer PE & Lehmann IR 1997) oder die speziellen Publikationen (High-Throughput Screening Assay for Helicase Enzymes, 1998, Analytical Bio­ chemistry, M Sivaraja, H Giordano, MG Peterson, 265, 22-27) verwiesen

Bevorzugte oder geeignete Verbindungen, die in dieser Anmeldung beschrieben werden, interkalieren nicht in noch binden sie auf andere Weise direkt an doppelsträngige DNA.

In all den oben beschriebenen Verfahren kann die (nicht-nucleosidische) Verbindung auch auf die Fähigkeit geprüft werden, die Herpes Helikase-Primase vermittelte RNA Primer Biosynthese oder die or Helikase Aktivität zu inhibieren. Entscheidend ist jedoch, daß die in dieser Erfindung beschriebenen (nicht-nukleosidischen) Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit geprüft werden, die Virusreplikation in Zellkultur bei einer Konzentration von weniger als 10 µM um mindestens 50% zu inhibieren. Bevorzugt werden die Verbindungen ausgewählt, die bei so niedrigen Konzentrationen wie möglich die Virusreplikation hemmen. Es muß jedoch hierbei beachtet werden, daß diese Verbindungen auch die gewünschten pharmakokinetischen pharmakodyna­ mischen Eigenschaften aufweisen.

Es sollte nicht unerwähnt bleiben, daß die Verbindungen, die formulierten Wirkstoffe und die offenbarten Verfahren geeignet sind, um erfolgreich Herpesinfektionen, die nicht auf eine Nukleosidtherapie ansprechen und in der Regel durch Nukleosid­ resistente Herpesviren ausgelöst werden, zu behandeln.

Dieser Aspekt der Erfindung schließt natürlich das Verfahren ein, Acyclovir­ resistente Herpesinfektionen dadurch zu behandeln, daß dem infizierten Säugetier wirksame Dosen einer der offenbarten Verbindungen, die gegebenenfalls entspre­ chend formuliert sein kann, verabreicht werden.

Unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren konnten Inhibitoren der Herpes Helikase-Primase erfolgreich identifiziert werden. Die spezifische und selektive Wirkung der Verbindungen gegen Herpesviren in Kombination mit einem entspre­ chendem Sicherheitsprofil machen die Wirkstoffe zu dem gewünschten Agens um zukünftig Herpesinfektionen zu behandeln.

Anti-Herpes Aktivität und Testsysteme

Die antivirale Aktivität der Verbindungen kann mit biochemischen, microbiologi­ schen und biologischen Verfahren gezeigt werden.

Diese Erfindung offenbart die Inhibition der viralen Replikation der Herpes Viren in Zellkultur, was exemplarisch für Mitglieder der Herpesfamilie wie HSV, BHV und PRV gezeigt wird (siehe Tabelle 1).

Der in Zellkultur durchzuführende HTS fähige virale Replikationstest liefert auf effizientere Art und Weise analoge Daten wie der sogenannte Plaque Reduction Assay und ist nachfolgend beschrieben.

Ein biochemisches Verfahren, um die Wirksamkeit der Verbindung gegen das virale Target Helikase-Primase zu demonstrieren, wird im Abschnitt biochemische Assay beschrieben. Dieser ATPase Assay ist nur eine der zahlreichen Optionen die dem Fachmann zur Verfügung stehen und Beispielsweise in "High-Throughput Screening Assay for Helicase Enzymes, 1998, M. Sivaraja, H. Giordano and M. G. Peterson, Analytical Biochemistry, 265, 22-27" aufgeführt sind. Weitere Testsysteme die dort in diversen Konfigurationen aufgeführt sind, eignen sich um festzustellen, ob gegebenenfalls Verbindungen direkt die Helikase oder die Primase Aktivität des Helikase-Primase Komplexes hemmen.

Der Nachweis eines therapeutischen Effektes der Verbindungen wird mittels eines in vivo Modells geführt. Das so bezeichnete lethal challenge Tiermodel sowie die Applikationsdosen und Therapieregime sind unten detailiert zusammengefaßt.

Beschreibung der Tabellen

Tabelle 1 faßt die Hemmdaten des Helikase-Primase Enzymkomplexes (K_i Werte), Ergebnisse zum Wirkmechanismus, die IC₅₀ und EC₅₀ Hemmdaten der Virus­ replikation der Wildtyp und Therapie-resistenten HSV Stämme, die ED₅₀ Werte vom Wildtypvirus im Tiermodel und die relevanten Mutations- sowie Kreuzresistenz­ muster zusammen.

Ein direkter Vergleich der in Zellkultur gewonnenen IC₅₀ Werte zeigt, daß einige ausgewählte Verbindungen um mindestens eine Größenordnung potenter sind als der Marktstandard Acyclovir (Zovirax™). Die in vivo erzielten Daten zeigen klar, daß sich diese in vitro gefundene Wirkung der Verbindungen in einer überlegenden Potenz und Wirksamkeit im Tiermodel wiederspiegelt. Die Beispielverbindungen hemmen Acyclovir resistente HSV-1 (F) Mutanten und Wildtyp HSV-1 (F) mit nahezu identischen IC₅₀ Werten. Breitbandspektrum anti-Herpes Aktivität wird mit den ausgewählten Verbindungen Beispiel 1, 4, 5, 6 und 7, die so unterschiedliche Herpes Viren wie z. B. das humane Herpes simplex Virus genauso wie das schweine (PRV) und Rinder (BHV) Tierherpesvirus hemmen, gezeigt. Diese Verbindungen sind auch gegen alle bislang getesteten klinischen Isolate wirksam (geprüft wurden 39 HSV-1 und 19 HSV-2 Isolate). Erstmalig wird offenbart, daß Verbindungen, die die Kriterien der oben aufgeführten Merkmale erfüllen oder mit anderem Worten ausgedrückt unter die nachfolgend aufgeführten Ansprüche fallen, neu sind mit Bezug zum Stand der Technik und den Therapiestandard im Tiermodel um mindes­ tens eine Größenordnung übertreffen.

Assays und Testsysteme HSV-1 DNA-abhängiger ATPase Assay (dieser in vitro Assay erlaubt die Prüfung auf Inhibition der HSV-1 Helikase-Primase) a) Herstellung und Aufreinigung des Enzyms

Der HSV-1 Helikase-Primase Heterodimer Enzymkomplex wurde mit Hilfe des rekombinanten Baculovirus Expressionssystems in doppelinfizierten Sf9 (Spodoptera frugiperda) Zellen. Ein rekombinantes Baculovirus codiert für das Helicasegen UL5 und das zweite Virus für das manipulierte Primasegen UL52-6xHis.

Die Gene wurden mittels PCR aus dem HSV-1 (F) Genom amplifiziert (American Tissue Culture Collection ATCC VR-733) und in das Baculovirus kloniert (UL5 → pFASTBAC1; UL52 → pFASTHTb) wie dieses im Instruction Manual BAC-TO- BAC Baculovirus Expression Systems, Life-Technologies ausführlich beschrieben ist. Der Heterodimere Enzymkomplex wurde mit der sogenannten IMAC-Chromato­ graphy, wie in "Inhibition of Herpes Simplex Virus Replication by a 2-Amino Thiazole via interactions with the Helicase Component of the UL-5-UL8-UL52 Complex", 1998, Journal of Virology, F. C. Spector, L. Liang, H. Giordano, M. Sivaraja and M. G. Peterson, 74: 6979-6987 publiziert, aufgereinigt.

b) Der ATPase Assay

Der aufgereinigte heterodimere Helikase-Primase Komplex (200 ng) wurde mit 1 µg DNA (Sigma D3287 oder D8681) in 20 mM HEPES (pH 7.6; 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid), 5 mM MgCl₂, 0,2-5 mM ATP, 100 µg BSA (bovine serum albumin) per ml, 10% Glycerin, 1 mM DTT (DL-dithiothreitiol) und gegebenenfalls Inhibitor in der entsprechenden Konzentration für 60 min bei 37°C inkubiert. Das freigesetzte anorganische Phosphat wurde colorimetrisch bestimmt, wie dieses in "An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate", 1979, P. A. Lanzetta, I. J. Alvarez, P. S. Reinach and O. A. Candia, Analytical Biochemistry, 100: 95-97 veröffentlicht wurde.

Die Inhibition der DNA-abhängigen ATPase Aktivität wurde aus der Änderung der Absorption in Gegenwart und Abwesenheit von Inhibitor berechnet.

Die enzymkinetischen Auswertungen wurden entsprechend den Standardwerken der Literatur wie z. B. Enzymkinetik by Hans Bisswanger, Theorie und Methoden, VCH Verlagsgesellschaft, 1994 vorgenommen. Die Berechnung der K_i Werte erfolgte unter Zuhilfenahme der Sigma Plot Software 4.0 und der Methode der nicht-linearen Kurvenregression.

Die Tabelle 2 zeigt die Dosis abhängige Inhibition/Titration der ATPase Aktivität des HSV-1 Helikase-Primase Enzymkomplexes mit dem representativen Beispiel 6. Zu diesem Zweck, wurde die ATPase Aktivität des Helikase-Primase Heterodimers (Nachweis durch Bildung von anorganischem Phosphat (Pi)) in Gegenwart von gesättigten DNA Konzentrationen und variierenden ATP und Inhibitorkonzentra­ tionen, wie unter dem Punkt ATPase Assay erläutert, gemessen. Die Hemmung der ATPase Aktivität durch die Beispielverbindung 6 ist dosisabhängig und wird darüber hinaus von der ATP Konzentration beeinflußt.
(Die ATP Kontrolle wird ohne Enzym und ohne DNA durchgeführt).

Dieses läßt sich natürlich besser durch den Vergleich der mathematischen Modelle für diverse Inhibitionsmechanismen belegen. Die experimentellen Hemmdaten mit Bezug zum Hemmtyp werden am besten durch die nicht-lineare Regression basierend auf der Formeln für das unkompetitive Hemmverhalten abgebildet.

Viraler Replikationsassay in Zellkultur a) Virusvermehrung und Bestimmung der Virustiter

HSV (HSV-1 Walki, HSV-1F oder HSV-2G) wurde auf Vero-Zellen (ATCC CCL- 81) unter folgenden Bedingungen vermehrt: Die Zellen wurden in M199 Medium (5% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, 100 µg/ml strepto­ mycin) in Zellkulturflaschen bei 37°C und 5% CO₂ gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal pro Woche jeweils 1 : 4 gesplittet. Für die Infektion wurde das Medium abgenommen, die Zellen mit "Hank's solution" gewaschen, mit 0.05%Trypsin, 0.02%EDTA (Seromed L2143) abgelöst und mit einer Dichte von 4 × 10⁵ Zellen pro ml unter den oben genannten Bedingungen für 24 Stunden inkubiert. Dann wurde das Medium abgenommen und die Viruslösung mit einer m. o. i von < 0.05 in einem Volumen von 2 ml pro 175 cm² Oberfläche dazugegeben. Nach einstündiger Inkubation unter den genannten Bedingungen wurde das Medium auf ein Volumen von 50 ml pro 175 cm²-Flasche aufgefüllt. 3 Tage nach Infektion zeigten die Kulturen deutliche Zeichen eines zytopathischen Effektes. Das Virus wurde durch zweimaliges Frieren (-80°C) und Tauen (37°C) freigesetzt. Der Zelldebris wurde durch Zentrifugation (300 g, 10 min, 4°C) abgetrennt und der Überstand in Aliquots bei -80°C weggefroren.

Der Virustiter wurde über einen Plaque-Assay bestimmt. Dafür wurden Verozellen in einer Dichte von 4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in 24 well Platten ausgesät und nach 24 Stunden Inkubation (37°C, 5% CO₂) mit Verdünnungen des Virusstocks von 10^-2 bis 10^-12 (100 µl Inokulum) infiziert. 1 Stunde nach Infektion wurde das Medium abgenommen und die Zellen mit 1 ml Overlay-Medium (0.5% Methylcellulose, 0.225 Natriumbikarbonat, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, 100 µg/ml Strepto­ mycin, 5% fötales Kälberserum in MEM-Eagle Medium mit Earl's Salz) über­ schichtet und für 3 Tage inkubiert. Im Anschluß wurden die Zellen mit 4% Formalin für 1 Stunde fixiert, mit Wasser gewaschen, mit Giemsa (Merck) für 30 min gefärbt und im Anschluß gewaschen und getrocknet. Mit einem Plaque-viewer wurde der Virustiter bestimmt. Die für die Experimente verwendeten Virusstocks hatten einen Titer von 1 × 10⁶/ml - 1 × 10⁸/ml.

b) Messung der antiviralen Aktivität von Testsubstanzen im in vitro Zellkultursystem

Die Anti-HSV-Wirkung wurde in einem Screening-Testsystem in 96-Well-Mikro­ titerplatten unter Zuhilfenahme von diversen Zellinien neuronalen, lymphoiden und epithelialen Ursprungs wie zum Beispiel Vero (Nierenzellinie der grünen Meer­ katze), MEF (murine embryonale Fibroblasten), HELF (humane embryonale Fibroblasten), NT2 (humane neuronale Zellinie) oder Jurkat (humane lymphoide T- Zellinie) bestimmt. Der Einfluß der Substanzen auf die Ausbreitung des cytopatho­ genen Effektes wurde im Vergleich zu der Referenzsubstanz Acyclovir-Natrium (Zovirax^R), einem klinisch zugelassenen anti-Herpes-Chemotherapeutikum, bestimmt.

Die in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelösten Substanzen (50 mM) werden auf Mikrotiterplatten (z. B. 96-Well MTP) in Endkonzentrationen von 250-0,5 µM (mikromolar) in Doppelbestimmungen (4 Substanzen/Platte) untersucht. Bei poten­ ten Substanzen werden die Verdünnungen über mehrere Platten bis 0,5 pM (picomolar) weitergeführt. Toxische und cytostatische Substanzwirkungen werden dabei miterfaßt. Nach den entsprechenden Substanzverdünnungen (1 : 2) auf der Mikrotiterplatte in Medium wird eine Suspension von Zellen (1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung) wie zum Beispiel von Vero-Zellen in M199 (Medium 199) mit 5% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin oder MEF-Zellen in EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, oder HELF-Zellen in EMEM mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, oder NT2- und Jurkat-Zellen in DMEM (4,5 mg/l Glukose plus Pyridoxin) mit 10% fötalem Kälberserum 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, nicht essentiellen Aminosäuren und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin in jedes Näpfchen gegeben und die Zellen in den relevanten Vertiefungen mit einer entsprechenden Virusmenge infiziert (HSV-1 F oder HSV-2 G mit einer m. o. i (multiplicity of infection) von 0,0025 für HELF, Vero und MEF Zellen sowie einer m. o. i von 0,1 für NT2- und Jurkat-Zellen). Die Platten werden anschließend bei 37°C in einem CO₂-Brutschrank (5% CO₂) über mehrere Tage inkubiert. Nach dieser Zeit ist der Zellrasen von z. B. Vero-Zellen in den substanzfreien Viruskontrollen, ausgehend von 25 infektiösen Zentren, durch den cytopathogenen Effekt der HSV-Viren völlig lysiert bzw. zerstört (100% CPE). Die Platten werden zunächst optisch mit Hilfe eines Mikroskopes ausgewertet und dann mit einem Fluoreszenzfarbstoff analysiert. Hierzu wird der Zellkulturüberstand aller Näpfchen der MTP abgesaugt und mit 200 µl PBS-Waschlösung befüllt. Das PBS wird abermals abgesaugt und alle Wells mit 200 µl Fluoreszenzfarbstofflösung (Fluorescein-diacetate, 10 µg/ml in PBS) befüllt. Nach einer Inkubationszeit von 30- 90 min werden die Testplatten in einem Fluoreszenzmessgerät bei einer Anregungs­ wellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 538 nm vermessen.

Der IC₅₀ ist die Konzentration des Inhibitors, bei der die virale Replikation in Zellkultur um 50% gehemmt ist im Vergleich zur nicht infizierten Zellkontrolle oder alternativ zu einer mit der 20 fachen IC₅₀ Konzentration behandelten Acyclovir­ kontrolle. Die Reduktion wird hier dadurch bestimmt, daß das Fluoreszenzsignal des infizierten Näpfchens einer MTP 50% des Signals der oben aufgeführten Kontrolle erreicht.

Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 1 in der Zusammenfassung dargestellt.

c) Generierung und Sequenzierung der resistenten viralen Mutanten

Natürlich vorkommende, resistente virale Mutanten wurden in Gegenwart von 1 µM der Beispielsubstanz 7 oder mindestens der 100 fachen IC₅₀ Konzentration der weiteren Beispiele, wie in Tabelle 1 aufgeführt, mit Hilfe des viralen Replika­ tionsassay in Zellkultur selektiert. 10 000 Vero Zellen werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wie oben beschrieben ausgesäht und über Nacht inkubiert. Die Substanz wird in der entsprechenden Konzentration hinzugegeben und die Zellen werden dann mit 1000 PFU (plaque forming units; m. o. i. 0,1) infiziert. Mutanten traten mit einer Frequenz von 1 × 10-6 bis 5 × 10-6 im Falle des HSV-1 (F) auf. Die Mutanten wurden durch mikroskopische Beobachtung oder einfach durch Wegfrieren (-80°c) von 10 µl Aliquots und anschließender Analyse der 20-40 MTP mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeindiacetat wie oben beschrieben ermittelt. Befindet sich ein resistentes Virus in einer Vertiefung, so sink das korrespondierende Fluor­ eszenzsignal um mindestens den Faktor 3 gegenüber einer Mutantenfreien Vertiefung ab. Die positiv getesteten Überstände oder die eingefrorenen Aliquots wurden benutzt, um größere Mengen des resistenten Virus anzuziehen und dann den Titer zu bestimmen. Die Virus-DNA wurde entsprechend den Protokollen die im Metho­ denhandbuch "Herpes Simplex Virus Protocols, 1998, Ed. S. M. Brown & A. R. MacLean, Humana Press, Totowa, New Jersey" zu finden sind präpariert und nach dem Protokoll "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, 1977, Sanger F, Nicklen S, Coulson AR, PNAS, 74, 5463-5467" und Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Kit der Firma Applied Biosystems oder unter Verwednung des DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit der Firma Amersham (apbiotech) sequenziert. Die Analyse der Proben wurde auf einem der gängigen Sequenzier­ automaten ausgeführt.

Die gefundenen Mutationen der resistenten Viren sind beispielhaft in der Tabelle 1 zusammengestellt.

Bevorzugt sind Verbindungen, die im oben beschriebenen viralen Replikationsassay basierend auf dem Fluoreszenzsignal einen IC₅₀ (HSV-1 F/Vero Zellen) Wert von weniger als 50 µM aufweisen, bevorzugter sind natürlich Verbindungen mit einem IC₅₀ Wert von kleiner als 25 µM und die besten Verbindungen weisen in der Regel einen IC₅₀ Wert von kleiner als 10 µM auf.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen stellen somit wertvolle Wirkstoffe zur Be­ handlung und Prophylaxe von Erkrankungen dar, die durch Herpes-Viren, ins­ besondere Herpes Simplex-Viren ausgelöst werden. Als Indikationsgebiete können beispielsweise genannt werden:

• 1. Behandlung und Prophylaxe von Herpes-Infektionen, insbesondere Herpes Simplex-Infektionen bei Patienten mit Krankheitsbildern wie Herpes labialis, Herpes genitalis, und HSV bedingter Keratitis, Enzephalitis, Pneumonie, Hepatitis etc.
• 2. Behandlung und Prophylaxe von Herpes-Infektionen, insbesondere Herpes Simplex-Infektionen bei immunsupprimierten Patienten (z. B. AIDS-Patienten, Krebspatienten, Patienten mit genetisch bedingter Immundefiziens, Transplantationspatienten)
• 3. Behandlung und Prophylaxe von Herpes-Infektionen, insbesondere Herpes Simplex-Infektionen bei Neugeborenen und Kleinkindern
• 4. Behandlung und Prophylaxe von Herpes-Infektionen, insbesondere Herpes Simplex-Infektionen und Herpes-, insbesondere Herpes Simplex-positiven Patienten zur Unterdrückung der Rekurrenz (Suppressionstherapie)
• 5. In vivo-Aktivität/Tiermodelle

Tiere

6 Wochen alte weibliche Mäuse, Stamm BALB/cABom, wurden von einem kommerziellen Züchter (Bomholtgard Breeding and Research Centre Ltd.) bezogen.

Infektion

Die Tiere wurden in einem dichten Glasgefäß mit Diethylether (Merck) anästhesiert. 50 µl einer Verdünnung des Virusstocks (Infektionsdosis 5 × 10⁴ Pfu) wurden mit einer Eppendorfpipette in die Nase der anästhesierten Tiere eingebracht. Diese Infektions­ dosis führt bei 90-100% der Tiere durch eine generalisierte Infektion mit prominenten respiratorischen und zentralnervösen Symptomen im Mittel zwischen 5 und 8 Tagen zum Tode.

Behandlung und Auswertung

6 Stunden nach Infektion wurden die Tiere mit Dosen von 0,1-100 mg/kg Körper­ masse 3 mal täglich 7.00 Uhr, 14.00 Uhr und 19 Uhr über einen Zeitraum von 5 Tagen behandelt. Die Substanzen wurden in DMSO vorgelöst und in Tylose/PBS(Hoechst) resuspendiert (Endkonzentration 1,5% DMSO, 0,5% Tylose in PBS).

Nach der letzten Applikation wurden die Tiere weiter beobachtet und die Todeszeit­ punkte festgestellt.

Ein Vergleich der Überlebenskurven erbrachte für die Verbindung des Beispiels 7 z. B eine ED₅₀ von etwa 0,5 mg/kg für HSV-2, wobei ED₅₀ bedeutet, das bei dieser Dosis 50% der Tiere überleben.

Die aufgeführten Wirkstoffe Beispiel 1 bis 7 wurden entsprechend dem nachfolgend aufgeführten allgemeinen Schema synthetisiert (Abb. 2 zeigt das Schema zur Synthese der Thiazolylamide und Abb. 3 zeigt den Syntheseweg zu den Thiazolylharnstoffderivaten).

Der Wirkstoff kann systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann er auf geeignete Weise appliziert werden, wie z. B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat.

Für diese Applikationswege kann der Wirkstoff in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich bekannte, den Wirkstoff schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, wie z. B. Tabletten (nichtüberzogene sowie überzogene Tabletten, z. B. magensaftresistente Überzüge), Kapseln, Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan, oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u. a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten und sterilen Pulvern.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z. B. Inhalationsarzneiformen (u. a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen/-lösungen, Sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- und Augen-präparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, Milch, Pasten, Streupuder oder Implantate.

Die Wirkstoffe können in an sich bekannter Weise in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies geschieht unter Verwendung inerter nichttoxischer, pharmazeutisch geeigneter Hilfsstoffe. Hierzu zählen u. a. Trägerstoffe (z. B. mikrokristalline Cellulose), Lösungsmittel (z. B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren (z. B. Natriumdodecylsulfat), Dispergiermittel (z. B. Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Biopolymere (z. B. Albumin), Stabilisatoren (z. B. Antioxidantien wie Ascorbinsäure), Farbstoffe (z. B. anorganische Pigmente wie Eisenoxide) oder Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.

Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0,01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 0,1 bis 50 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,5 bis 15 mg/kg Körpergewicht.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt.

Claims (16)

1. Arzneimittel enthaltend unkompetitive Inhibitoren der Herpes-Helicase- Primase.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Helicase- Primase mindestens 50% homolog sind zur Helicase-Primase des Herpes- Simplex-Virus 1, bezogen auf die Nukleotid-Sequenz oder die Aminosäure- Sequenz, je nachdem was höher ist.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Virus ein Herpes-Simplex-Virus 1 ist.

4. Arzneimittel nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen ausgewählt werden, die gleichzeitig an die Helikase und die Primase Untereinheit des Helikase-Primase Komplexes binden.

5. Arzneimittel nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen die DNA-abhängige NTPase Aktivität der Helikase-Primase inhibieren.

6. Arzneimittel nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen die Fähigkeit besitzen die Replikation eines Herpes Virus zu inhibieren.

7. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen die Replikation eines Herpes Virus in Zellkultur bei einer Konzentration von 10 µM um mindestens 50% zu inhibieren.

8. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß solche Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Herpes Virus in Zellkultur bei einer Konzentration von ≦ 500 nM um mindestens 50% zu inhibieren.

9. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Herpes Virus um PRV or BHV handelt.

10. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen mit Anti-Herpes-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Helikase-Primase zu inhibieren, getestet werden und solche Verbindungen ausgewählt werden, die die NTP-Bindungstasche des Helikase Primase Enzymkomplexes kompetitiv inhibieren.

11. Verbindungen, die nach Verfahren nach Anspruch 10 identifiziert werden.

12. Verbindungen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung kein Nukleosid oder Nukleotid ist.

13. Die Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 11 oder 12 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prophylaxe von Herpes Infektionen.

14. Arzneimittel oder pharmazeutische Formulierungen die Verbindungen entsprechend den Ansprüchen 11 oder 12 enthalten.

15. Ein Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Herpes Infektionen in Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß dem Säuger, der eine derartige Therapie benötigt, eine therapeutisch wirksame Menge des Arzneimittels oder der pharmazeutischen Formulierung entsprechend Anspruch 14 verabreicht wird.

16. Arzneimittel irgend einem der Anprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen folgende allgemeine Strukturformel (I) aufweisen,
Y-A-X-SO₂NR¹R² (I)
worin
Y für (C₆-C₁₀)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
A für eine Gruppe der Formeln -CR^4'R^5'-C(O)-CR⁴R⁵-, -CR^4'R^5'-C(O)- NR⁹-, NR⁹'-C(O)-CR⁴R⁵- oder NR^9'-C(O)-NR⁹- steht,
worin
R⁴, R^4', R⁵, R^5', R⁹ und R^9' gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₂-C₆)-Alkenyl oder (C₃-C₈)-Cycloalkyl stehen,
X für (C₆-C₁₀)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (C₁-C₆)- Alkyl oder (C₃-C₈)-Cycloalkyl stehen,
wobei der Winkel A-X-SO₂, 153° ± 15% beträgt und die Verbindung eine Molmasse von kleiner als 500 g/mol aufweist,
und deren Salze.