DE10043224A1 - Device for marking gels, e.g. electrophoresis gels used for genomic or proteomic analyses, comprises a markable substrate and an anchoring device - Google Patents
Device for marking gels, e.g. electrophoresis gels used for genomic or proteomic analyses, comprises a markable substrate and an anchoring deviceInfo
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Abstract
Description
Die Fortschritte in der modernen Biotechnologie beruhen ganz wesentlich auf den inzwischen zur Verfügung stehenden analytischen und präparativen Techniken, bei denen in ganz besonderem Maße sogenannte Gele eingesetzt werden. Diese Gele beruhen typischerweise auf einem Polysaccharid wie Agarose oder auf Polyacrylamid. Die Gele dienen dabei als Matrix, auf oder in der die in Proben enthaltenen Verbindungen entsprechend ihren physikochemischen Eigenschaften wie Molekülgewicht, Molekülgröße, isoelektrischer Punkt und dergleichen, aufgetrennt werden. In der Mehrzahl der Fälle wird dabei an die Matrix eine elektrische Spannung angelegt, die zu einer Wanderung der Moleküle führt. Die Sichtbarmachung der aufgetrennten Moleküle kann vor, während und nach Abschluß der eigentlichen Auftrennung erfolgen. Dabei wird zwischen spezifischer und unspezifischer Färbung unterschieden. Typische Beispiele unspezifischer Färbung umfassen die Verwendung von Ethidiumbromid im Falle von Nukleinsäuren und Coomassie Blau oder Silberfärbung im Falle von Peptiden bzw. Proteinen. Eine spezifische Färbung kann durch geeignete Nachweissysteme erreicht werden, im Falle der Auftrennung von Nukleinsäuren durch Verwendung von beispielsweise radioaktiven oder mit Fluoreszenzmarkern versehenen Sonden, im Falle von Peptiden bzw. Proteinen durch Verwendung von gleichermaßen markierten Antikörpern. Eine Übersicht über die verschiedenen Färbe- und Markierungstechniken findet sich bei Westermeier, Reiner: Electrophoresis in practice: a guide to methods and applications of DNA and protein separations/Reiner Westermeier in collab. with Neil Barne - 2. ed. - Weinheim: VCH, 1997; Proteomics in functional genomics: protein structure analysis 1 ed. by P. Jolles; H. Jörnvall. - Basel, Boston, Berlin: Birkhäuser, 2000; Patton F. W.: A thousand points of light: The application of fluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics, Electrophoresis 2000, 21, 1123-1142, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.The advances in modern biotechnology are based to a large extent on the analytical and preparative techniques that are now available, in which so-called gels are used to a very special extent. These gels are typically based on a polysaccharide such as agarose or on polyacrylamide. The gels serve as a matrix on or in which the compounds contained in samples are separated according to their physicochemical properties such as molecular weight, molecular size, isoelectric point and the like. In the majority of cases, an electrical voltage is applied to the matrix, which leads to a migration of the molecules. The separated molecules can be visualized before, during and after completion of the actual separation. A distinction is made between specific and non-specific coloring. Typical examples of non-specific staining include the use of ethidium bromide in the case of nucleic acids and Coomassie blue or silver staining in the case of peptides or proteins. A specific staining can be achieved by means of suitable detection systems, in the case of the separation of nucleic acids by using, for example, radioactive or fluorescent-labeled probes, in the case of peptides or proteins by using equally labeled antibodies. An overview of the different staining and marking techniques can be found at Westermeier, Reiner: Electrophoresis in practice: a guide to methods and applications of DNA and protein separations / Reiner Westermeier in collab. with Neil Barne - 2nd ed. - Weinheim: VCH, 1997; Proteomics in functional genomics: protein structure analysis 1 ed. By P. Jolles; H. Jörnvall. - Basel, Boston, Berlin: Birkhäuser, 2000; Patton FW: A thousand points of light: The application of fluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics, Electrophoresis 2000 , 21 , 1123-1142 , the disclosure of which is incorporated herein by reference.
Mit der Analyse zunehmend komplexer Proteinmuster, wie sie im Rahmen von Proteomics erforderlich wird, werden hochauflösende zweidimensionale Gele(IPG-DALT) verwendet, die bis zu mehreren tausend Gelpunkte aufweisen. Die Identifizierung und Charakterisierung der durch einen jeden Punkt dargestellten Biomoleküle ist sowohl aus analytischen als auch aus präparativen Gründen erforderlich. Entsprechend wurden Vorrichtungen und Verfahren entwickelt, um dies, typischerweise unter Verwendung des Computers oder Roboters, zu bewerkstelligen. Entsprechende Verfahren und Vorrichtungen sind beispielsweise beschrieben in der internationalen Patentanmeldung WO 98/23950.By analyzing increasingly complex protein patterns, such as those used in proteomics high-resolution two-dimensional gels (IPG-DALT) are used, that have up to several thousand gel points. Identification and characterization The biomolecule represented by each point is both analytical and required for preparative reasons. Devices and methods have been developed accordingly designed to do this, typically using the computer or robot accomplish. Corresponding methods and devices are, for example described in international patent application WO 98/23950.
Allgemein wird bei der systematischen Analyse derartiger komplexer Gelmuster ein oder mehrere im Gel sichtbare Punkte, sogenannte "Spots" oder Banden anhand von Landmarken für die weiterführende Analyse identifiziert. Die Bedeutung der Landmarken ist dabei insoweit entscheidend, als dass beim Vergleich mehrerer einzelner Gele mit Proteinen derselben Provinienz, zum Beispiel bei einer Serie von Patientenproben oder bei Proben aus einem "gesunden" oder "pathologischen" System, somit eine eindeutige Identifizierung der einzelnen Spots oder Banden und damit erst vergleichende Aussagen möglich werden. In general, a or several points visible in the gel, so-called "spots" or bands based on landmarks identified for further analysis. The importance of the landmarks is there decisive insofar as that when comparing several individual gels with proteins the same provinces, for example for a series of patient samples or for samples from a "healthy" or "pathological" system, thus a clear identification of the individual spots or bands and thus only comparative statements are possible.
Zwar werden routinemäßig in Gelen geeignete molekulare Marker eingesetzt, die eine Angabe des oder der einzelnen interessierenden Spots oder Banden relativ dazu erlauben, jedoch ist deren Verwendung nicht uneingeschränkt möglich, insbesondere dann nicht, wenn beispielsweise Proteinspots abschließend unter Verwendung massenspektroskopischer Verfahren (MALDI-TOF) analysiert werden. So ist eine Sichtbarmachung der Spots oder der Bande durch eine unspezifische Silberfärbung bei nachfolgender Anwendung von MALDI- TOF nur unter Verwendung spezifischer Protokolle möglich. Darüber hinaus ist die Silberfärbung in so weit mit Nachteilen verbunden, als dass eine Modifikation der zu färbenden Proteine auftreten kann und die Färbung mit Silber generell eine zu geringe dynamische Bandbreite, d. h. eine nicht ausreichende Linearität zwischen Signalintensität bzw. Spotvolumen und Proteinmenge aufweist. Gleiches gilt für die Verwendung von Coomassie blau. Ebenfalls nicht befriedigende Ergebnisse werden erhalten, wenn die Färbung unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen erfolgt, die zwar sehr empfindlich sind und wie im Falle von bspw. SyproRuby® auch eine hohe dynamische Bandbreite aufweisen, aber im sichtbaren Licht nicht erkennbar sind. Dies ist beispielsweise dann problematisch, wenn die Spots aus dem Gel ausgeschnitten werden sollen, z. B. unter Zuhilfenahme von Automaten, was in der Regel unter sichtbarem Licht erfolgt.Suitable molecular markers are used routinely in gels Allow indication of the individual spot or band of interest relative to however, their use is not possible without restriction, especially not if for example protein spots finally using mass spectroscopic Procedure (MALDI-TOF) can be analyzed. So is a visualization of the spots or the Band through an unspecific silver staining with subsequent use of MALDI TOF only possible using specific protocols. In addition, the Silver coloring in so far associated with disadvantages as a modification to it staining proteins can occur and the staining with silver is generally too low dynamic bandwidth, d. H. insufficient linearity between signal intensity or has spot volume and amount of protein. The same applies to the use of Coomassie blue. Unsatisfactory results are also obtained when staining using fluorescent dyes, which are very sensitive and as in the case of SyproRuby® also have a high dynamic range, but are not visible in visible light. This is problematic, for example, if the spots are to be cut out of the gel, e.g. B. with the help of Automatic machines, which is usually done under visible light.
Die vorstehend insbesondere unter Hinweis auf komplexe Proteinmuster gemachten Ausführungen gelten sinngemäß auch für Nukleinsäuren bzw. deren Analyse.The above made particularly with reference to complex protein patterns The explanations also apply analogously to nucleic acids and their analysis.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, welches eine eindeutige Identifizierung einzelner Spots oder Banden oder Gruppen davon in einem Gel erlaubt. Dabei ist es insbesondere eine Aufgabe, dass die Identifizierung möglich ist, ohne dass die nachfolgende Bearbeitung des Gels oder Teilen des Gels Einschränkungen unterworfen wird.The present invention is therefore based on the object of providing a means which uniquely identifies individual spots or bands or groups thereof allowed a gel. It is particularly a task that the identification is possible is without the subsequent processing of the gel or parts of the gel restrictions is subjected.
Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches die schnelle und zuverlässige Analyse von Gelen erlaubt.Another object is to provide a method which is fast and reliable analysis of gels allowed.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch eine Vorrichtung zum Markieren von Gelen umfassend einen Markierungsträger und ein Verankerungsmittel. According to the invention, the object is achieved by a device for marking gels comprising a marker carrier and an anchoring means.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Verankerungsmittel einen Stiel umfaßt.In one embodiment it is provided that the anchoring means comprises a stem.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Verankerungsmittel weiterhin eine Platte umfaßt.In a further embodiment it is provided that the anchoring means continue comprises a plate.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass die Ebene der Platte senkrecht ist zu der Längsachse des Verankerungsmittels. Dabei ist besonders bevorzugt, wenn die Platte nicht lösbar mit dem Stiel verbunden ist.In a particularly preferred embodiment, it is provided that the level of the The plate is perpendicular to the longitudinal axis of the anchoring means. It is special preferred if the plate is not releasably connected to the stem.
In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass der Markierungsträger eine Seite des Verankerungsmittels, insbesondere des Stiels, ist.In a further embodiment it can be provided that the marking carrier is a Side of the anchoring means, especially the stem.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Markierungsträger eine Platte umfaßt. Dabei kann in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen sein, dass die Platte durchsichtig ist. Dabei ist weiterhin besonders bevorzugt, dass die Ebene der Platte senkrecht zur Längsachse des Verankerungsmittels, insbesondere des Stiels, ist.In a still further embodiment it is provided that the marking carrier is a Plate includes. It can be provided in a preferred embodiment that the Plate is transparent. It is also particularly preferred that the plane of the plate perpendicular to the longitudinal axis of the anchoring means, in particular the stem.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann bei der Vorrichtung die Platte relativ zur Längsachse des Verankerungsmittels, insbesondere des Stiels, verschiebbar sein.According to the present invention, in the device, the plate can be relative to the longitudinal axis of the anchoring means, in particular the stem, to be displaceable.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Markierungsträger eine Markierung trägt.In one embodiment it is provided that the marking carrier carries a marking.
Gemäß der Erfindung kann vorgesehen sein, dass das Verankerungsmittel eine Markierung trägt.According to the invention it can be provided that the anchoring means is a marking wearing.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Markierungsträger und/oder das Verankerungsmittel eine Abgabestelle für die Markierung umfaßt, wobei desweiteren vorgesehen sein kann, dass die Markierung in einem Reservoir enthalten ist, wobei eine Verbindung zwischen dem Reservoir und der Abgabestelle besteht.In a still further embodiment it is provided that the marking carrier and / or the anchoring means comprises a delivery point for the marking, furthermore it can be provided that the marking is contained in a reservoir, wherein a There is a connection between the reservoir and the delivery point.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Farbmarkierungen, radioaktive Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen und magnetische Markierungen umfaßt. In a further embodiment it is provided that the marking is selected from the group, the color labels, radioactive labels, fluorescent labels and includes magnetic markers.
Bevorzugterweise ist die Vorrichtung, zumindest teilweise, aus einem Material hergestellt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Kunststoffe, Glas und Metalle umfaßt. Bevorzugterweise ist der Kunststoff ausgewählt aus der Gruppe, die PU, PE, PVC und PET umfasst. Weiterhin ist bevorzugt, wenn das Metall ausgewählt ist aus der Gruppe, die Aluminium, Titan und Stahl umfaßt.The device is preferably, at least partially, made of a material, which is selected from the group consisting of plastics, glass and metals. The plastic is preferably selected from the group consisting of PU, PE, PVC and PET includes. It is further preferred if the metal is selected from the group consisting of Includes aluminum, titanium and steel.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Gel umfassend die erfindungsgemäße Vorrichtung.In a further aspect, the object is achieved by a gel comprising the device according to the invention.
Gemäß der Erfindung ist das Gel bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe, die Agarosegele, Polyacrylamidgele, eindimensionale Gele, mehrdimensionale Gele, gefärbte Gele und nicht gefärbte Gele umfaßt.According to the invention, the gel is preferably selected from the group which Agarose gels, polyacrylamide gels, one-dimensional gels, multi-dimensional gels, colored Gels and non-stained gels.
Schließlich wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Analyse von Gelen, wobei das Gel mit mindestens einer der erfindungsgemäßen Vorrichtungen versehen wird.Finally, the object is achieved according to the invention by a method for analyzing Gels, the gel being provided with at least one of the devices according to the invention becomes.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Position der Vorrichtung im Gel relativ zur Position eines Referenzmittels im Gel bestimmt wird. Dabei kann vorgesehen sein, dass das Referenzmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die die erfindungsgemäße Vorrichtung und einen im Gel enthaltenen Marker umfaßt, wobei der Marker bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe, die molekulare Größen-, Gewichts- oder sonstige Marker umfaßt.In a preferred embodiment it is provided that the position of the device in the Gel is determined relative to the position of a reference agent in the gel. It can be provided be that the reference agent is selected from the group that the invention Device and a marker contained in the gel, the marker is preferably selected from the group consisting of molecular size, weight or includes other markers.
Schließlich wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Analyse von Gelen.Finally, the object is achieved according to the invention by using the Device for analyzing gels according to the invention.
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass eine für sowohl analytische als auch präparative Bearbeitung von Gelen erforderliche Referenzbeziehung des im Gel ersichtlichen bzw. vorhandenen Musters von Spots bzw. Banden zueinander bzw. zu einem oder mehreren Referenzpunkten nicht dadurch bereitgestellt werden muß, dass ein geeigneter molekularer Marker im Gel enthalten ist, sondern dass auch eine Vorrichtung, wie die erfindungsgemäße Vorrichtung, zur Markierung bzw. zum Ansprechen und damit Identifizieren von Spots oder Banden im Gel zu diesem Zwecke verwendet werden kann. Dies erlaubt eine einfache Prozessierung und Analyse von Gelen und stellt weitere Freiheitsgrade bei der Anfertigung oder Bearbeitung von Gelen insoweit bereit, als dass die Auswahl der zur Sichtbarmachung der Spots bzw. Banden im Gel verwendeten Färbe- oder Markierungstechnik nicht durch die Erfordernisse der Bestimmung der Relativbeziehung der Spots oder Banden relativ zueinander oder relativ zu einem molekularen Marker eingeschränkt wird.The invention is based on the surprising finding that one for both analytical as well as preparative processing of gels required reference relationship of the in the gel apparent or existing pattern of spots or bands to each other or to one or several reference points need not be provided by the fact that a suitable molecular marker is contained in the gel, but that is also a device like that device according to the invention, for marking or for addressing and thus Identifying spots or bands in the gel can be used for this purpose. This allows easy processing and analysis of gels and provides additional degrees of freedom in the preparation or processing of gels to the extent that the selection of the for Visualization of the spots or bands used in the gel dyeing or Marking technique not by the requirements of determining the relative relationship of the Spots or bands relative to each other or relative to a molecular marker is restricted.
Dabei ist es sowohl möglich, dass die Vorrichtung in das Gel eingebracht oder an diesem befestigt wird, bevor die aufzutrennenden Proben entsprechend ihren physikochemischen Eigenschaften aufgetrennt werden, als auch dass die Vorrichtung, nachdem die Proben der Auftrennungsprozedur unterzogen worden sind. Die jeweilige Verwendung, d. h. der Zeitpunkt, zu dem die Vorrichtung in das Gel eingebracht wird bzw. vorhanden ist, ergibt sich für den Fachmann im Lichte der hierin gemachten Offenbarung. So ist ein nachträgliches Einbringen der Vorrichtung dann ausreichend, wenn es gilt, die Relativbeziehung der Spots bzw. Banden untereinander zu bestimmen.It is possible for the device to be introduced into or on the gel is attached before the samples to be separated according to their physicochemical Properties are separated, as well as that the device after the samples of the Separation procedure have been subjected. The respective use, i.e. H. the The point in time at which the device is introduced or is present in the gel results for those skilled in the art in light of the disclosure made herein. So is an afterthought Introducing the device sufficiently, if the relative relationship of the spots applies or to determine bands among themselves.
Hinsichtlich des Zeitpunktes des Einbringens der erfindungsgemäßen Vorrichtung in das Gel relativ zum Zeitpunkt der Färbung ist festzuhalten, dass das Einbringen grundsätzlich vor oder nach dem Färben des Gels/der Spots oder Banden mit Fluoreszenzfarbstoff erfolgen kann. Bevorzugt ist dabei, dass das Einbringen der Markierung mittels der erfindungsgemäßen Einrichtung nach dem Färben des Gels erfolgt, wenn man typischerweise unter UV-Licht die Spots erkannt hat bzw. überhaupt erkennen kann. Dabei wird nachfolgend der einzelne Spots oder Banden aufnehmende "Picking Robot" nur mit sichtbarem Licht arbeiten, wobei die mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten Proteinspots praktisch nicht zu sehen sind. Eine Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in dem Sinn, dass sie vor dem Färben in das Gel eingebracht wird, kann bei der Qualitätskontrolle angezeigt sein, beispielsweise um eine Verzerrung des Gels zu erkennen.With regard to the time of insertion of the device according to the invention into the gel Relative to the time of the coloring, it should be noted that the introduction is fundamentally before or after staining the gel / spots or bands with fluorescent dye can. It is preferred that the marking is introduced by means of the device according to the invention takes place after staining the gel, if one typically recognized the spots under UV light or can even recognize them at all. It will be as follows the single picking robot picking up spots or gangs only with visible light work, the protein spots stained with fluorescent dyes practically not are seen. An application of the device according to the invention in the sense that it is introduced into the gel after staining may be indicated during quality control, for example to detect a distortion of the gel.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist darin zu sehen, dass damit eine eindeutige Ansprechbarkeit der Spots bzw. Banden zuverlässig möglich und somit eine Qualitätssicherung gewährleistet wird, was besonders bei mehreren aufeinanderfolgenden Schritten im Rahmen der Behandlung eines Geles angezeigt scheint, da es im Rahmen der Weiterverarbeitung oftmals zu einem Verzerren der Gelmatrix und dergleichen kommt, was eine eindeutige Zuordnung nicht mehr erlauben würde.Another advantage of the device according to the invention is that it is a clear responsiveness of the spots or gangs reliably possible and thus a Quality assurance is guaranteed, which is particularly the case with several successive ones Steps in the treatment of a gel appear to appear as part of the Further processing often leads to a distortion of the gel matrix and the like, which would no longer allow a clear assignment.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfolgt typischerweise so, dass diese in das Gel eingebracht wird und bei Aufsicht auf bzw. Durchsicht durch das Gel die vom Markierungsträger getragene Markierung der Detektion zugänglich ist und diese Markierung sodann als Ausgangspunkt für ein Referenzsystem dient, das die Spots und Banden des Gels erfaßt.The device according to the invention is typically used in such a way that it is in the gel is introduced and, when the gel is supervised or viewed, Marker carrier-worn marker is accessible to detection and this marker then serves as the starting point for a reference system that the spots and bands of the gel detected.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann das Verankerungsmittel eine Platte umfassen. Der Begriff "Platte" soll hierin insbesondere so verstanden werden, dass er eine im wesentlichen zweidimensionale Fläche definiert. Die Fläche kann dabei selbst rund, oval, eckig oder in sonstiger beliebiger Form gestaltet sein, wobei die runde bzw. ovale Form naturgemäß insoweit mit Vorteilen verbunden ist, als dass dadurch eine besonders leichte Handhabbarkeit und geringe Verletzung des Gels, insbesondere dessen Struktur, erfolgt.In the device according to the invention, the anchoring means can comprise a plate. The term “plate” is to be understood here in particular to mean that in the essential two-dimensional surface defined. The surface can itself be round, oval, be square or in any other shape, the round or oval shape is naturally associated with advantages in that it makes it particularly easy Manageability and minor damage to the gel, in particular its structure, takes place.
Die von der Platte des Verankerungsmittels aufgespannte Ebene ist bevorzugterweise so angeordnet, dass diese Ebene parallel zur Oberfläche des Gels angeordnet ist. Gleichzeitig ist diese Anordnung bevorzugt, wenn diese Ebene senkrecht zur Längsachse des Verankerungsmittels angeordnet ist, da dann die Platte des Verankerungsmittels typischerweise auf dem Gel aufliegt und der damit verbundene Stiel des Verankerungsmittels nur vergleichsweise kurz in die Gelmatrix eindringt. Damit wird insbesondere auch die Entfernung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ohne wesentliche Beschädigung der Gelmatrixstruktur möglich. Andererseits kann eine Relativanordnung des eine Platte umfassenden Verankerungsmittels in einem stumpfen oder spitzen Winkel, d. h. verschieden von 90°, relativ zur Längsachse des Verankerungsmittels, insbesondere des Stiels, insoweit von Vorteil sein, als dass bei besonders dünnen Gelen damit eine längere Strecke zur Verankerung der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Gel zur Verfügung steht.The plane spanned by the plate of the anchoring means is preferably so arranged that this plane is arranged parallel to the surface of the gel. At the same time this arrangement is preferred if this plane is perpendicular to the longitudinal axis of the Anchoring means is arranged, since then the plate of the anchoring means typically rests on the gel and the associated stem of the anchor penetrates the gel matrix only comparatively briefly. This is especially the Removal of the device according to the invention without significant damage to the Gel matrix structure possible. On the other hand, a relative arrangement of the one plate extensive anchoring means at an obtuse or acute angle, d. H. different of 90 °, relative to the longitudinal axis of the anchoring means, in particular the stem, in this respect be of advantage than that with particularly thin gels a longer distance Anchoring of the device according to the invention in the gel is available.
Die Platte des Verankerungsmittels dient wie auch der Stiel des Verankerungsmittels der Verankerung im Gel, insbesondere an der Unterseite des Gels oder direkt im Gel. Die Platte ist dabei typischerweise nicht lösbar mit dem Stiel des Verankerungsmittels verbunden, es ist jedoch auch denkbar, dass diese lösbar mit dem Stiel verbunden ist, und insbesondere auch, dass die Platte relativ zur Längsachse des Verankerungsmittels verschoben werden kann.The plate of the anchoring means serves as well as the stem of the anchoring means Anchoring in the gel, especially on the underside of the gel or directly in the gel. The plate is typically not detachably connected to the stem of the anchoring means, it is however, it is also conceivable that it is releasably connected to the handle, and in particular also, that the plate can be moved relative to the longitudinal axis of the anchoring means.
Der Markierungsträger der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine Seite des Verankerungsmittels, insbesondere des Stiels, sein. Im einfachsten Falle ist somit denkbar, dass ein Ende des Verankerungsmittels als Markierungsträger dient.The marker carrier of the device according to the invention can one side of the Anchoring means, especially the stem. In the simplest case it is conceivable that one end of the anchoring means serves as a marker carrier.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass der Markierungsträger eine Platte umfaßt bzw. diese ausbildet, die mit dem Verankerungsmittel verbunden ist. Der Markierungsträger ist dabei wiederum in Form einer Platte ausgebildet, die prinzipiell ebenso gestaltet werden kann wie die Platte des Verankerungsmittels. Im allgemeinen ist jedoch bevorzugt, dass die Platte des Markierungsträgers einen größeren Durchmesser aufweist als die Platte des Verankerungsmittels. Mit besonderen Vorteilen ist dabei verbunden, wenn die Ebene der Platte des Markierungsträgers senkrecht bzw. 90° zur Längsachse des Verankerungsmittels, insbesondere des Stiels, angeordnet ist, was darin begründet liegt, dass ein einfaches Aufdrücken der Markierungsplatte auf das Gel möglich ist und somit die vom Gel aufgespannte Ebene parallel ist zu der von der Platte des Markierungsträgers aufgespannten Ebene, was die Genauigkeit der Analyse insoweit erhöht, als dass eine Verschiebung der durch den Markierungsträger in das Gel eingebrachten Markierung relativ zu den Spots bzw. Banden des Gels nicht eintritt. Ein weiterer Vorteil liegt darin begründet, dass bei einer weitgehend automatisierten Analyse bzw. Visualisierung des Gels, wie z. B. UV-Scannen oder durch Abbilden mittels CCD-Kamera ein Koordinatensystem relativ zu der erfindungsgemäßen Vorrichtung aufgespannt werden kann, welches keiner Korrektur bedarf, da die Markierungsebene praktisch mit der Ebene des Gels zusammenfällt.In a further aspect of the present invention it is provided that the Marking carrier comprises a plate or forms this, with the anchoring means connected is. The marker carrier is in turn in the form of a plate which can in principle be designed in the same way as the plate of the anchoring means. in the in general, however, it is preferred that the plate of the marking carrier has a larger one Has diameter as the plate of the anchoring means. With special advantages connected when the plane of the plate of the marker carrier is perpendicular or 90 ° to Longitudinal axis of the anchoring means, in particular of the stem, is arranged in what the reason for this is that it is possible to simply press the marking plate onto the gel and thus the plane spanned by the gel is parallel to that of the plate of the Marker carrier spanned plane, which increases the accuracy of the analysis to the extent than that a shift in the gel introduced through the marker carrier Marking relative to the spots or bands of the gel does not occur. Another advantage lies is based on the fact that with a largely automated analysis or visualization of the Gels such as B. UV scanning or by imaging using a CCD camera Coordinate system can be spanned relative to the device according to the invention, which requires no correction, since the marking level is practically the same as the level of the gel coincides.
Ist die Platte des Markierungsträgers relativ zur Längsachse des Verankerungsmittels verschiebbar, ist es somit leicht möglich, nach dem Eindrücken der erfindungsgemäßen Vorrichtung in das Gel diese Platte auf dem Stiel gegen das Gel zu verschieben und damit eine Fixierung des Markers von der Geloberseite her vorzunehmen, ggf. zusätzlich zu der Fixierung des Markierungsträgers durch die Platte des Verankerungsmittels. Damit werden die vorstehend beschriebenen Vorteile im Zusammenhang mit der Parallelität der Gelebene und Teilen der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch hier realisiert. In einem derartigen Zustand wären dann beide Planen, d. h. die Platte des Markierungsträgers ebenso wie diejenige des Verankerungsmittels, parallel zueinander ausgerichtet.Is the plate of the marking carrier relative to the longitudinal axis of the anchoring means displaceable, it is thus easily possible after pressing in the invention Device in the gel to move this plate on the stem against the gel and thus fix the marker from the top of the gel, possibly in addition to the Fixation of the marking carrier by the plate of the anchoring means. With that the advantages described above in connection with the parallelism of the gel plane and parts of the device according to the invention also realized here. In such a The condition would then be both tarpaulins. H. the plate of the marker carrier as well that of the anchoring means, aligned parallel to each other.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass der Markierungsträger und/oder das Verankerungsmittel eine Markierung trägt, wobei die Markierung auch über eine Abgabestelle, die sich an oder auf oder in dem Markierungsträger und/oder dem Verankerungsmittel befinden kann, abgegeben wird. In der Folge trägt der Markierungsträger eine Markierung, die mittels eines geeigneten Detektionssystems erfaßt werden kann, und liefen damit die eigentliche Grundlage für die Bestimmung der Relativposition zu den Spots und Banden. Gleiches gilt für eine durch das Verankerungsmittel getragene Markierung. Die Anordnung der Markierung auf bzw. an dem Markierungsträger und/oder dem Verankerungsmittel erlaubt, dass darunter- bzw. darüberliegende Gele mit der Markierung versehen werden können.According to the present invention, it is possible for the marking carrier and / or the Anchoring means carries a mark, the mark also over a Delivery point located on or on or in the marking carrier and / or the Anchoring means can be dispensed. As a result, the marker carrier a marking which can be detected by means of a suitable detection system, and ran the actual basis for determining the relative position to the spots and gangs. The same applies to a marking carried by the anchoring means. The Arrangement of the marking on or on the marking carrier and / or the Anchoring means allows the gels with the marking above or above can be provided.
Die Markierung kann in einem Reservoir enthalten sein, wobei das Reservoir selbst an oder in oder auf der Vorrichtung angebracht sein kann. Ein bevorzugter Bereich, der das Reservoir ausbildet bzw. umfaßt, ist die Platte des Markierungsträgers, der Stiel des Verankerungsmittels oder die Platte des Verankerungsmittels. Die Übertragung der Markierung aus dem Reservoir zu der jeweiligen Abgabestelle wird typischerweise durch Ausbilden eines geeigneten Kanales erfolgen, wobei dieser bevorzugterweise so dimensioniert ist, dass infolge von Kapillarkräften ein kontinuierlicher Strom der Markierung, die bevorzugterweise in flüssiger Form vorliegt, gewährleistet ist.The marking can be contained in a reservoir, the reservoir itself on or in or can be attached to the device. A preferred area of the reservoir forms or includes, is the plate of the marker carrier, the stem of the Anchoring means or the plate of the anchoring means. The transfer of the Marking from the reservoir to the respective delivery point is typically done by Form a suitable channel, which is preferably so is dimensioned that as a result of capillary forces a continuous flow of the marking, which is preferably in liquid form, is guaranteed.
Bei der Markierung kann es sich um eine solche handeln, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Farbmarkierungen, radioaktive Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen und magnetische Markierungen umfaßt. Alle Markierungen sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Patton, W. F. (aaO), dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.The marking can be one selected from the group the color labels, radioactive labels, fluorescent labels and magnetic Marks included. All of the markings are known to those skilled in the art and described, for example, in Patton, W.F. (loc. cit.), the disclosure of which is hereby incorporated by reference Reference is made.
Die Markierung kann, beispielsweise im Falle einer Farbmarkierung, auf dem Markierungsträger in Form eines Farbtropfens aufgebracht werden. Dabei ist es nicht entscheidend, zu welchem Zeitpunkt die Markierung aufgebracht werden kann, d. h. bevor die erfindungsgemäße Vorrichtung in das Gel eingebracht wird oder danach, und im letzteren Falle auch unabhängig davon, ob die unter Verwendung des Gels durchgeführte Auftrennung bereits erfolgt ist oder nicht. Im Falle der radioaktiven Markierung, beispielsweise bei der Autoradiographie unter Verwendung von 32P oder 35S, kann dies beispielsweise dadurch bewerkstelligt werden, dass eine radioaktive Verbindung auf den Markierungsträger aufgebracht wird, der ggf. dann weiter beschichtet wird, um eine Verteilung des radioaktiven Materials zu vermeiden. Unter den Fluoreszenzfarbstoffen sind besonders jene von Vorteil und werden entsprechend angewandt, die in der nachfolgenden Liste angegeben sind: SYPRO® Ruby; SYPRO® Orange; SYPRO® Red, SYPRO® Tangerine, SYPRO® Rose. Eine besondere Form der Markierung kann darin bestehen, dass eine Beschichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit kovalenten Farbstoffen wie Monobrombimane, Cy3 oder Cy5 oder mit kovalent gebundenen Farbstoffen erfolgt.The marking can, for example in the case of a color marking, be applied to the marking carrier in the form of a drop of color. It is not important at which point in time the marking can be applied, ie before or after the device according to the invention is introduced into the gel, and in the latter case also regardless of whether or not the separation carried out using the gel has already taken place. In the case of radioactive labeling, for example in autoradiography using 32 P or 35 S, this can be accomplished, for example, by applying a radioactive compound to the label carrier, which may then be coated further in order to distribute the radioactive material to avoid. Among the fluorescent dyes, those are particularly advantageous and are used accordingly, which are given in the list below: SYPRO® Ruby; SYPRO® Orange; SYPRO® Red, SYPRO® Tangerine, SYPRO® Rose. A special form of marking can be that the device according to the invention is coated with covalent dyes such as monobromobimane, Cy3 or Cy5 or with covalently bound dyes.
Hinsichtlich der Auswahlkriterien für die Markierung gilt, dass diese gut vom Scanner bzw. einer CCD-Kamera detektierbar und im CCD Bild zu erkennen sein muß. Durch eine unterschiedliche Markierung der einzelnen/jeweiligen erfindungsgemäßen Vorrichtung, beispielsweise durch Nummerierung, ist eine eindeutige Zuordnung der Marker beim Matchen von Gelbildern möglich.With regard to the selection criteria for the marking, it is important that the marking is a CCD camera must be detectable and must be recognizable in the CCD image. By a different marking of the individual / respective device according to the invention, for example by numbering, the markers are clearly assigned to the Matching gel pictures possible.
Eine spezielle Form der Markierung stellt die Verwendung von Material für die Ausbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen oder Teilen davon dar, das verglichen mit dem Gel eine andere optische Durchlässigkeit aufweist und somit bereits sowohl von einer CCD- Kamera als auch von einem Scanner erkannt wird. Zu diesem Zweck kann beispielsweise der Stiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung optisch undurchlässig und die Platte optisch durchlässig sein.A special form of marking represents the use of material for training of the devices according to the invention or parts thereof, that compared to the gel has a different optical permeability and is therefore already available from a CCD Camera as well as being recognized by a scanner. For this purpose, the Handle of the device according to the invention optically opaque and the plate optically be permeable.
Das erfindungsgemäße Mittel kann vollständig oder teilweise aus Kunststoff hergestellt werden, obwohl auch andere Materialien, wie beispielsweise insbesondere Glas oder Metall geeignet sind. Als Kunststoff eignen sich insbesondere die folgenden: PU, PVC, PE, PET. Geeignete Metalle können Aluminium, Titan oder Stahl sein.The agent according to the invention can be made entirely or partially of plastic are, although other materials, such as in particular glass or metal are suitable. The following are particularly suitable as plastics: PU, PVC, PE, PET. Suitable metals can be aluminum, titanium or steel.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Gel, welches mindestens eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält. Es ist jedoch auch möglich, dass das Gel mehrere der erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfaßt und die Relativbeziehungen der Spots bzw. Banden zu einer oder mehreren der Vorrichtungen bestimmt wird, was zu einer Erhöhung der Analysegenauigkeit bzw. Genauigkeit bei dem Entfernen der Spots bzw. Banden (beispielsweise durch Extraktion, Ausstanzen) führt. Ein derartiges Gel kann dabei ausgewählt sein aus der Gruppe, die Agarosegele, Poylacrylamidgele, eindimensionale und mehrdimensionale Gele, gefärbte Gele, nicht gefärbte Gele, denaturierte oder native Gele und dergleichen mehr umfaßt. Die verschiedenen Formen von Gelen sind beispielsweise beschrieben in Westermeier (aaO) oder Jolles (aaO), deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Grundsätzlich ist festzuhalten, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung nicht auf einen speziellen Geltyp beschränkt ist.In a further aspect, the present invention relates to a gel which has at least one contains device according to the invention. However, it is also possible that the gel has several of the comprises devices according to the invention and the relative relationships of the spots or Bands to one or more of the devices is determined, causing an increase in Analysis accuracy or accuracy when removing the spots or bands (for example by extraction, punching). Such a gel can be selected from the group consisting of agarose gels, polyacrylamide gels, one-dimensional and multidimensional gels, colored gels, non - colored gels, denatured or native gels and the like includes more. The different forms of gels are, for example described in Westermeier (loc. cit.) or Jolles (loc. cit.), the disclosure of which is described herein Reference is made. Basically, it should be noted that the use of the The device according to the invention is not limited to a specific type of gel.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Gelen. Wie bereits oben ausgeführt, kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Markierung des Gels sowohl zu Zwecken der Analyse als auch Patternanalyse bzw. Spotisolierung/Extraktion verwendet werden, wobei der Zeitpunkt, zu dem die Vorrichtung in das Gel eingeführt wird, je nach beabsichtigtem Zweck und speziellem Verfahren, entweder vor oder nach der Durchführung der unter Verwendung des Gels erfolgten Auftrennung der zu analysierenden Probe oder Präparates erfolgt, wobei die Frage der Markierung unabhängig vom Zeitpunkt der Verwendung der Vorrichtung ist, mithin die Markierung auf dem Markierungsträger vor oder nach dem Einbringen der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfolgen kann unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Techniken.In a further aspect, the invention relates to a method for analyzing gels. How Already stated above, the device according to the invention for marking the gel both for the purposes of analysis as well as pattern analysis or spot isolation / extraction used, the time at which the device is inserted into the gel depending on the intended purpose and special procedure, either before or after Carrying out the separation of those to be analyzed using the gel Sample or preparation takes place, the question of the marking regardless of the time of the Use of the device is therefore the marking on the marking carrier in front of or after introducing the device according to the invention can be done using techniques known to those skilled in the art.
Auf der Grundlage einer oder mehrerer mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung in das Gel eingebrachten Markierungen werden zum einen die Relativpositionen der verschiedenen Banden bzw. Spots zu der Markierung bestimmt, oder aber, wie bei einer bevorzugten Ausführungsform realisiert, im Falle mehrerer der erfindungsgemäßen Vorrichtungen, die Beziehung der Markierungen untereinander und die Beziehung einzelner Spots oder Spuren zu einer oder mehreren der Markierungen. Bei diesem Verfahren fungiert somit eine zumindest zweite, in das Gel eingebrachte Vorrichtung als Referenzmittel. In Ergänzung bzw. alternativ dazu, kann auch ein im Gel enthaltener Marker als Referenzmittel zur Bestimmung der Relativposition herangezogen werden. Ein derartiger Marker kann ein Molekülgrößenmarker, Molekülgewichtsmarker oder sonstiger Marker sein, der sich durch distinkte physikochemische Eigenschaften wie Größe, Gewicht, Ladungseigenschaften (pI), Glycosylierungsmuster etc. auszeichnet. Diese Relativbeziehungen erlauben somit eine eindeutige Zuordnung der Spots bzw. Banden des zu analysierenden Geis zu einem durch die Vorrichtung(en) definierten Referenzsystem, unter Zuhilfenahme dessen beispielsweise Automaten dann die interessierenden Spots bzw. Banden aus dem Gel entfernen können. Ein so markiertes Gel kann mit einem Scanner (UV-, Fluoreszenz) bzw. einer CCD-Kamera im sichtbaren oder auch ultraviolettem Licht aufgenommen werden. Konkret erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung die Übertragung der 2D-Koordinaten der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Gel aus dem Bild einer CCD-Kamera (beispielsweise eingebaut in einen Roboter) auf das Bild eines Scanners, die Berechnung der Koordinaten einzelner Spots bzw. Banden und dann den Export dieser Koordinaten zurück in eine Datenbank, in der das Bild der CCD-Kamera als Referenz mit abgelegt wird. Durch die Transformation der Markerkoordinaten bzw. der Koordinaten de erfindungsgemäßen Vorrichtung(en) aus dem Bild der CCD-Kamera auf die Markerpositionen bzw. Positionen der erfindungsgemäßen Vorrichtung(en) im Bild des Scanners und die dadurch berechnenbaren Koordinaten von Spots bzw. Banden ist gewährleistet, dass das Gerät nunmehr diese Spots bzw. Banden ausstanzen kann. Dies erlaubt eine Plattform-übergreifende eindeutige Zuordnung der Spots bzw. Banden und die Anwendung von bildanalytischer Auswertungssoftware. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung bei dem Verfahren zur Analyse von Gelen ist darin zu sehen, dass die Kamera des Roboters, die CCD-Kamera, eine geringere Auflösung aufweisen kann bzw. über keinen UV-Filter verfügen muß, da sie lediglich die Marker bzw. die erfindungsgemäße(n) Vorrichtung(en) detektieren muß. Das zweite Gelbild inklusive den Markern bzw. den erfindungsgemäßen Vorrichtungen, kann damit mit einem anderen hochauflösenden Scanner aufgenommen werden.Based on one or more in the gel by means of the device according to the invention Markings introduced are, on the one hand, the relative positions of the various Bands or spots determined for the marking, or, as in a preferred Embodiment realizes, in the case of several of the devices according to the invention, the Relationship between the markings and the relationship between individual spots or tracks to one or more of the marks. In this process, one functions at least second device inserted into the gel as a reference. In addition or alternatively, a marker contained in the gel can also be used as a reference for determination the relative position can be used. Such a marker can be a Molecular size markers, molecular weight markers or other markers that are characterized by distinct physicochemical properties such as size, weight, charge properties (pI), Characterized glycosylation pattern, etc. These relative relationships thus allow one clear allocation of the spots or bands of the Geis to be analyzed to one by the Device (s) defined reference system, for example Automatic machines can then remove the spots or bands of interest from the gel. On Gel marked in this way can be scanned with a scanner (UV, fluorescence) or a CCD camera visible or ultraviolet light. Specifically, it allows device according to the invention the transmission of the 2D coordinates of the invention Device in the gel from the image of a CCD camera (for example installed in a Robot) on the image of a scanner, the calculation of the coordinates of individual spots or Gangs and then export these coordinates back to a database where the image the CCD camera is also stored as a reference. By transforming the Marker coordinates or the coordinates of the device (s) according to the invention from the Image of the CCD camera on the marker positions or positions of the invention Device (s) in the image of the scanner and the coordinates of Spots or bands is guaranteed that the device now has these spots or bands can punch out. This allows a clear assignment of the spots across platforms or gangs and the use of image analysis software. Another Advantage when using the device according to the invention in the method for Analysis of gels can be seen in the fact that the robot's camera, the CCD camera, is a may have lower resolution or need not have a UV filter, since it only has to detect the markers or the device (s) according to the invention. The second gel image including the markers or the devices according to the invention so that it can be recorded with another high-resolution scanner.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die erfindungsgemäßen Vorrichtungen über ein vorgegebenes Koordinatensystem in einem vorher definierten Muster im Gel angebracht werden. Dies erlaubt neben den vorstehend genannten Vorteilen auch die Kontrolle der Gelkongruenz über die Messung der Relativpositionen zu den erfindungsgemäßen Vorrichtungen. Eine derartige Gelkongruenzkontrolle ist besonders dann erforderlich, wenn sich die Bearbeitung des Gels über einen längeren Zeitraum erstreckt bzw. dieses gelagert wird oder aber infolge der Arbeiten am Gel eine Relativverschiebung eintritt.In the method according to the invention, the devices according to the invention can be used a predetermined coordinate system is attached to the gel in a previously defined pattern become. In addition to the advantages mentioned above, this also allows control of the Gel congruence by measuring the relative positions to those according to the invention Devices. Such a gel congruence check is particularly necessary if the processing of the gel extends over a longer period of time or it is stored or a relative shift occurs due to work on the gel.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren und Beispielen weiter erläutert werden, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigt The invention is further explained on the basis of the following figures and examples from which further features and advantages of the invention result. It shows
Fig. 2 Fig. 1 ergänzt durch eine Angabe der Gelebene; Fig. 2 Fig. 1 supplemented by an indication of the gel level;
Fig. 3 eine Aufsicht auf die erfindungsgemäße Vorrichtung; Fig. 3 is a plan view of the inventive device;
Fig. 4 ein Bemaßungsbeispiel für die erfindungsgemäße Vorrichtung; Fig. 4 is a Bemaßungsbeispiel for the inventive device;
Fig. 5 die erfindungsgemäße Vorrichtung in typischer Anordnung in einem 2D-Gel (IPG- DALT); Figure 5 shows the device according to the invention in a typical arrangement in a 2D gel (IPG DALT).
Fig. 6 die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer typischen zweiten Anordnung in einem 2D-Gel (IPG-DALT); Fig. 6 shows the device according to the invention in a typical arrangement in a second 2D gel (IPG-DALT);
Fig. 7 die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer typischen dritten Anordnung in einem 2D- Gel (IPG-DALT); Figure 7 shows the inventive device in a third typical arrangement in a 2D gel (IPG-DALT).
Fig. 8 eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in ihren Einzelbestandteilen und bei bestimmungsgemäßer Verwendung befestigt in einem Gel. Fig. 8 shows a further embodiment of the device according to the invention in its individual components, and if used properly secured in a gel.
In Fig. 1 ist eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 5 dargestellt, wobei die Vorrichtung eine Deckplatte 1 umfaßt, die als Markierungsträger fingiert und auf ihrer Oberfläche eine Markierung 2 in Form eines farbigen Kreuzes trägt, die mit einem Stiel 3 verbunden ist, der Gegenplatte 4 an dem zur Deckplatte 1 gegenüberliegenden Ende aufweist. Stiel 3 und Gegenplatte 4 bilden zusammen das Verankerungsmittel. Deckplatte 1 wird typischerweise aus einem durchsichtigen Material angefertigt.In Fig. 1 is a perspective view of an embodiment of the device 5 according to the invention, the apparatus comprises a deck plate 1, which pretends as marking carrier and on its surface a marking 2 wears a colored cross in shape, which is connected to a stem 3, the counter plate 4 at the end opposite to the cover plate 1 . Handle 3 and counter plate 4 together form the anchoring means. Cover plate 1 is typically made of a transparent material.
Die Vorrichtung 5 wird von oben in ein Gel hineingedrückt und fixiert sich aufgrund der speziellen Konstruktion von selbst. Dies wird insbesondere dadurch bewerkstelligt, dass Deckplatte 1 nicht fest mit Stiel 3 verbunden ist, sondern entlang dessen Längsachse verschoben werden kann. Wird nun Vorrichtung 5 beginnend mit Gegenplatte 4 und Stiel 3 in ein Gel eingeführt bzw. hineingedrückt, so fixiert sich Stiel 3 und insbesondere Gegenplatte 4 darin. Deckplatte 1 mit Markierung 2 wird anschließend auf dem Stiel gegen das Gel verschoben, bevorzugt auf der Geloberseite angedrückt und fixiert somit Vorrichtung 5 von der Geloberseite.The device 5 is pressed into a gel from above and fixes itself due to the special construction. This is achieved in particular by the fact that the cover plate 1 is not firmly connected to the handle 3 , but rather can be displaced along its longitudinal axis. If device 5 is now inserted or pressed into a gel starting with counter plate 4 and stem 3 , stem 3 and in particular counter plate 4 are fixed therein. Cover plate 1 with marking 2 is then shifted against the gel on the stem, preferably pressed on the top of the gel, and thus fixes device 5 from the top of the gel.
Fig. 2 zeigt im wesentlichen die gleiche Darstellung wie Fig. 1, wobei hier jedoch durch den angegebenen Pfeil die Ebene des Geis angezeigt wird. Daraus ist ersichtlich, dass sowohl Deckplatte 1 mit Markierung 2 als auch Gegenplatte 4 parallel zur Ebene des Gels angeordnet sind. Fig. 2 shows essentially the same representation as Fig. 1, but here the plane of the Geis is indicated by the arrow indicated. It can be seen from this that both cover plate 1 with marking 2 and counterplate 4 are arranged parallel to the plane of the gel.
Fig. 3 zeigt eine Aufsicht auf Deckplatte 1, die Markierung 2 trägt. Markierung 2 ist dabei in Form eines Kreuzes ausgebildet. Fig. 3 shows a top view of cover plate 1 , which carries mark 2 . Mark 2 is in the form of a cross.
Fig. 4 zeigt eine schematische Seitenansicht von Vorrichtung 5, wobei in diesem Falle die Bemaßung von Vorrichtung 5 bzw. der sie aufbauenden einzelnen Bestandteile beispielhaft angegeben ist. FIG. 4 shows a schematic side view of device 5 , in which case the dimensions of device 5 or the individual components making up it are given by way of example.
Im konkreten Beispiel mißt der Durchmesser von Deckplatte 1 etwa 5 mm, der Durchmesser von Stiel 3 etwa 0,6 mm und der Durchmesser von Gegenplatte 4 etwa 1,2 mm. Die Gesamthöhe von Vorrichtung 5 beträgt ca. 4 mm, gemessen von dem einen Ende von Stiel 3, das Gegenplatte 1 trägt, bis zum distalen Ende, das im vorliegenden Falle durch Gegenplatte 4 bestimmt wird. Allgemein empfiehlt es sich, dass der Durchmesser von der die Markierung fragenden Deckplatte 1 größer ist als derjenige von Gegenplatte 4.In the specific example, the diameter of cover plate 1 measures approximately 5 mm, the diameter of stem 3 approximately 0.6 mm and the diameter of counter plate 4 approximately 1.2 mm. The total height of device 5 is approximately 4 mm, measured from one end of stem 3 , which supports counterplate 1 , to the distal end, which is determined by counterplate 4 in the present case. In general, it is recommended that the diameter of the cover plate 1 questioning the marking is larger than that of the counter plate 4 .
Fig. 5 zeigt sechs Stück der Vorrichtung 5 in typischer Anordnung in einem 2D-Gel (IPG- DALT), das mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt ist. Deutlich sind die Markierungen 2, ausgebildet durch auf Deckplatte 1, in allen fünf Fällen ersichtlich. FIG. 5 shows six pieces of the device 5 in a typical arrangement in a 2D gel (IPG-DALT) which is colored with fluorescent dye. The markings 2 , formed by on the cover plate 1 , are clearly visible in all five cases.
Fig. 6 zeigt fünf Stück der Vorrichtung 5 in typischer Anordnung in einem 2D-Gel (IPG- DALT), wobei das Gel mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt wurde, im sichtbaren Licht. Dieses Bild entspricht demjenigen der CCD-Kamera, die für die Ablichtung derartiger Gele verwendet werden kann. Aus der Darstellung ist deutlich erkennbar, dass unter diesen Bedingungen der Fluoreszenzfarbstoff nicht detektierbar ist, das als solches außer den fünf Vorrichtungen keine weiteren Informationen zu tragen scheint. Fig. 6 shows five pieces of the device 5 in a typical arrangement in a 2D gel (IPG DALT), the gel was stained with fluorescent dye in the visible light. This image corresponds to that of the CCD camera, which can be used to image such gels. It can be clearly seen from the illustration that under these conditions the fluorescent dye cannot be detected, which as such does not appear to carry any further information apart from the five devices.
Schließlich zeigt Fig. 7 insgesamt fünf Stück der Vorrichtung 5 in typischer Anordnung in einem 2D-Gel (IPO-DALT), wobei das Gel mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt ist und mit UV- Licht gescannt wurde. Deutlich sind die verschiedenen Proteinspots und die Vorrichtungen 5 zu erkennen. Dabei handelt es sich um das gleiche Gel, welches bereits in den Fig. 5 und 6 dargestellt wurde, nun jedoch nach dem Ausstanzen von Proteinspots im sichtbaren Licht mittels eines "Picking-Roboters".Finally, FIG. 7 shows a total of five pieces of the device 5 in a typical arrangement in a 2D gel (IPO-DALT), the gel being colored with fluorescent dye and scanned with UV light. The different protein spots and the devices 5 can be clearly seen. This is the same gel that has already been shown in FIGS. 5 and 6, but now after the protein spots have been punched out in visible light by means of a “picking robot”.
Insbesondere der Vergleich der Fig. 5 bis 7 zeigt deutlich die Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und deren Verwendung bei der Analyse von Gelen. Von besonderem Vorteil ist es, wenn die Markierung der Vorrichtung 5 unter verschiedenen Bedingungen (im sichtbaren Licht, im UV, bei Fluoreszenzfarbstoff-spezifischer Wellenlänge) detektiert werden kann, da somit in jedem Fall die als Referenzpunkt verwendete Vorrichtung auf den Gelen sichtbar ist. Dies kann beispielsweise dadurch bewerkstelligt werden, dass der Markierungsträger und/oder das Verankerungsmittel mehr als eine Markierung trägt.In particular, the comparison of FIGS. 5 to 7 clearly shows the advantages of the device according to the invention and its use in the analysis of gels. It is particularly advantageous if the marking of the device 5 can be detected under different conditions (in visible light, in UV, at fluorescent dye-specific wavelength), since the device used as the reference point is thus visible on the gels in any case. This can be accomplished, for example, in that the marking carrier and / or the anchoring means carries more than one marking.
Aus dem vorstehend Geschilderten zeigt sich auch die Möglichkeit der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Rahmen der Bearbeiten von Gelen, bei der Isolierung von Substanzen nach Auftrennen eines Substanzgemisches, insbesondere, wenn dieses Auftrennen mittels eines Gels erfolgt ist. Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung stellt die Auswertung, insbesondere die optische Auswertung von Gelen und Gelmustern dar. Mit anderen Worten, die erfindungsgemäße Vorrichtung kann im Rahmen der Genomforschung (engl.: "genomics") und der Proteom-Forschung (engt.: "proteomics") verwendet werden.From the above also shows the possibility of using the Device according to the invention in the context of processing gels, in the isolation of Substances after separating a mixture of substances, especially when separating them by means of a gel. Another use of the device according to the invention represents the evaluation, especially the optical evaluation of gels and gel samples. In other words, the device according to the invention can be used within the Genomics (English: "genomics") and proteome research (narrowly: "proteomics") be used.
Eine typische Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird im folgenden Beispiel erläutert. A typical application of the device according to the invention is shown in the following example explained.
Das hier beschriebene System besteht in seiner Grundkonfiguration aus einem "Flexys" Roboter System mit entsprechender Steuersoftware ("Flexys Proteomics Picker") und einem weiteren Softwarepacket ("BioImage®2-D Analyzer"), mit dem die analytische Auswertung erfolgt.The basic configuration of the system described here consists of a "Flexys" Robot system with appropriate control software ("Flexys Proteomics Picker") and one Another software package ("BioImage®2-D Analyzer") with which the analytical evaluation he follows.
Das "Flexys" Roboter System besteht im wesentlichen aus einem horizontal und vertikal beweglichen Schlitten, an dem eine CCD-Kamera sowie eine Stanze angebracht sind und einer unterhalb des Schlittens befindlichen Ablage (Glasplatte), auf der das zu untersuchende Gel plaziert werden kann. Diese Platte ist von unten beleuchtet. Das System wird von einer Software ("Flexys Proteomics Picker") angesteuert, die auf einem Personalcomputer installiert ist. Die Auswertesoftware "BioImage® 2-D Analyzer" ist auf einer Workstation installiert. Ein Datenaustausch zwischen beiden Rechnern ist über eine Vernetzung gewährleistet.The "Flexys" robot system essentially consists of a horizontal and vertical movable carriage on which a CCD camera and a punch are attached and a shelf underneath the slide (glass plate) on which the object to be examined Gel can be placed. This plate is illuminated from below. The system is one Software ("Flexys Proteomics Picker") driven on a personal computer is installed. The evaluation software "BioImage® 2-D Analyzer" is on a workstation Installed. Data exchange between the two computers is via networking guaranteed.
Nach entsprechender Auftrennung eines Proteingemisches mittels Gelelektrophorese (1D bzw. 2D) erfolgt die Färbung der nunmehr separierten Proteinspots mittels Silber. Es resultiert ein gut sichtbares Verteilungsmuster der einzelnen Proteine in dem Gel, wie dies auch aus Fig. 5 ersichtlich ist. Dieses Gel wird nun auf die Ablage des "Flexys" Roboter System plaziert und von unten belichtet. Der Schlitten fährt nun über das Gel, wobei die CCD- Kamera insgesamt 42 Teilbilder dieses Gels aufnimmt. Aus diesen Teilbildern wird anschließend von der "Flexys Proteomics Picker" Software ein Gesamtbild des Gels generiert. Dieses Gesamtbild kann von der Auswertesoftware "BioImage® 2-D Analyzer" eingelesen werden. Die einzelnen Proteinspots sind auf diesem Bild als dunkle Spots auf einem mehr oder weniger hellen Hintergrund erkennbar. Durch entsprechende Einstellung unterschiedlicher Filter ist die Software in der Lage, diese Spots vom Hintergrund zu unterscheiden und zu erkennen. Dies erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Graustufen (dunkel/hell) von Spots und Hintergrund. Neben der automatischen Spoterkennung kann dieses aber auch manuell erfolgen. Sollen nun bestimmte Spots aus dem Gel ausgestanzt werden (für weitere Analysen etc.), so können diese Spots nunmehr mit der Auswertesoftware aus der Gesamtheit der erkannten Spots selektiert werden. Diese Auswahl wird in Form eines Files an die Steuersoftware des "Flexys" Roboter Systems weitergeleitet. Neben einer Vielzahl möglicher Spotinformationen enthält dieses File die Koordinaten des Zentrums jedes einzeln zu pickenden Spots auf dem Gel. Dies ist möglich, da die Kamera über eine definierte Auflösung (Pixel in x- und y-Richtung) verfügt, eine Ecke des ersten Teilbildes der Kamera die Pixelkoordinaten 0,0 zugewiesen bekommt und diese Pixelwerte im Gesamtbild erhalten bleiben. Aus diesen Koordinaten kann die Stanze nunmehr die genaue Lage jedes einzelnen Spots auf dem Gel berechnen, ausstanzen und automatisch in entsprechende Auffanggefäße überführen.After appropriate separation of a protein mixture using gel electrophoresis ( 1 D or 2 D), the now separated protein spots are stained using silver. A clearly visible distribution pattern of the individual proteins in the gel results, as can also be seen from FIG. 5. This gel is now placed on the shelf of the "Flexys" robot system and exposed from below. The sledge now moves over the gel, with the CCD camera taking a total of 42 partial images of this gel. The "Flexys Proteomics Picker" software then generates an overall image of the gel from these partial images. This overall picture can be read in by the "BioImage® 2-D Analyzer" evaluation software. The individual protein spots can be seen in this picture as dark spots on a more or less light background. By setting different filters accordingly, the software is able to distinguish and recognize these spots from the background. This is due to the different grayscale (dark / light) spots and background. In addition to automatic spot detection, this can also be done manually. If certain spots are now to be punched out of the gel (for further analyzes etc.), these spots can now be selected from the totality of the recognized spots using the evaluation software. This selection is forwarded in the form of a file to the control software of the "Flexys" robot system. In addition to a variety of possible spot information, this file contains the coordinates of the center of each spot to be picked on the gel. This is possible because the camera has a defined resolution (pixels in the x and y directions), a corner of the first field of the camera is assigned the pixel coordinates 0.0 and these pixel values are retained in the overall image. From these coordinates, the punch can now calculate the exact position of each individual spot on the gel, punch it out and automatically transfer it to the corresponding collecting vessels.
Die in diesem System eingesetzte CCD-Kamera arbeitet lediglich im sichtbaren Frequenzbereich des Lichts und ist auf einen deutlichen Kontrast zwischen dem zu erkennenden Spot und entsprechendem Hintergrund angewiesen. Diese Anforderung wird bei einer Proteinfärbung mit Silber ohne Probleme erfüllt. Die bei dieser Färbemethode eingesetzten Reagenzien (insbesondere Formaldehyd) führen jedoch zu einer unkontrollierten chemischen Modifizierung der entsprechenden Proteine. Dies ist für nachfolgende Analysen der Proteine problematisch. Daher wird der Einsatz von Fluoreszensfarbstoffen, der nicht zu einer unkontrollierten chemischen Modifizierung von Proteinen führt, immer stärker zur gängigen Praxis in der Proteinanalytik. Die hiermit angefärbten Proteine sind im sichtbaren Frequenzbereich des Lichts jedoch nicht detektierbar und können somit auch nicht von dem beschriebenen System erkannt werden. Ein automatisches Spotpicking ist daher nicht möglich.The CCD camera used in this system only works in the visible Frequency range of light and is towards a clear contrast between that directed spot and background. This requirement is met at protein staining with silver without any problems. The one with this staining method reagents used (especially formaldehyde) lead to an uncontrolled chemical modification of the corresponding proteins. This is for subsequent analysis of the proteins problematic. Therefore, the use of fluorescent dyes is not too an uncontrolled chemical modification of proteins leads increasingly to common practice in protein analysis. The proteins stained with this are visible Frequency range of the light, however, is not detectable and therefore cannot be derived from that described system can be recognized. Automatic spot picking is therefore not possible.
Diese mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen angefärbten Spots sind dann mit Hilfe eines speziellen Fluoreszensscanners sichtbar.These spots are then stained with appropriate fluorescent dyes using a special fluorescence scanner visible.
Wird ein mit Fluoreszensfarbstoff gefärbtes Gel mit einem Fluoreszensscanner gescannt, so erhält man ein Bild, auf dem die einzelnen Proteine wiederum als Spots erkennbar sind. Ein solches Bild kann in die Auswertesoftware "BioImage® 2-D Analyzer" eingelesen werden. If a gel stained with fluorescent dye is scanned with a fluorescent scanner, then you get an image on which the individual proteins are recognizable as spots. On Such an image can be read into the "BioImage® 2-D Analyzer" evaluation software.
Die vorhandenen Proteinspots können nunmehr analog zu Silber gefärbten Proteinspots erkannt werden. Wird ein solches Gel auf die Ablage unterhalb des Schlittens plaziert, ist ein automatisches Spotpicking jedoch nicht möglich, da den von der Software erkannten Spots keine Koordinaten auf dem Gel zugeordnet werden können. Dies ist nur möglich, wenn ein entsprechendes Spotbild von der CCD-Kamera aufgenommen wurde.The existing protein spots can now be analogous to silver-colored protein spots be recognized. If such a gel is placed on the shelf underneath the slide, is a however, automatic spot picking is not possible because of the spots recognized by the software no coordinates can be assigned on the gel. This is only possible if one Corresponding spot picture was taken by the CCD camera.
Auf das mit einem Fluoreszensfarbstoff gefärbte Gel werden die nunmehr platzierten erfindungsgemäßen Vorrichtungen, im folgenden auch als "Marker" bezeichnet. Die Platzierung dieser "Marker" erfolgt derart, dass der zu pickende Bereich von diesen "Markern" umgeben ist und sich ebenfalls "Marker" im Zentrum dieses Bereiches befinden können. Hierzu werden die "Marker" durch das Gel durchgestochen und aufgrund ihrer Form auf der Unterseite des Gels arretiert. Auf der Oberseite des Gels werden/können sie außerdem durch eine lichtdurchlässige Scheibe fest in dem Gel positioniert werden. Diese Scheibe gestattet es ebenfalls, diese "Marker" entsprechend zu kennzeichnen bzw. zu nummerieren. Eine schematische Veranschaulichung hierzu findet sich in Fig. 8.The devices according to the invention which have now been placed are also referred to below as "markers" on the gel stained with a fluorescent dye. These "markers" are placed in such a way that the area to be picked is surrounded by these "markers" and "markers" can also be located in the center of this area. For this purpose, the "markers" are pierced through the gel and, due to their shape, locked on the underside of the gel. On the top of the gel, they can also be firmly positioned in the gel through a translucent disk. This disc also allows these "markers" to be marked or numbered accordingly. A schematic illustration of this can be found in FIG. 8.
Wird ein solches Gel nunmehr mit einem Fluoreszensscanner gescannt, dann sind neben den entsprechenden Proteinspots ebenfalls die "Marker" bzw. Scheiben mit entsprechender Beschriftung sichtbar. Dieses Bild kann nun in die Auswertesoftware "BioImage® 2-D Analyzer" eingeladen und eine entsprechende Spoterkennung durchgeführt werden. Das Gel wird nun auf die Ablage (Glasscheibe) unterhalb des Schlittens platziert und durch die CCD- Kamera abgelichtet. Es resultiert dabei ein Gelbild, auf dem lediglich die "Marker" zu sehen sind. Dieses Bild wird ebenfalls in die Auswertesoftware eingelesen. Mit Hilfe der Software können nun diese beiden Gelbilder übereinander geschoben werden, so dass die "Marker" genau übereinander liegen. Durch dieses "Matching" wird nunmehr ein neues Bild generiert, das die Informationen beider vorherigen Bilder integriert. Es enthält zum einen die Koordinaten der "Marker", die aus der Aufnahme mit der CCD-Kamera stammen als auch die Informationen über die Proteinspots. Außerdem werden den Proteinspots zusätzlich Koordinaten zugeordnet, die aus dem relativen Vergleich zu den Positionen der "Marker" berechnet werden. Diese Spots können nun ausgestanzt werden, obwohl die CCD-Kamera sie nicht detektieren konnte. If such a gel is now scanned with a fluorescence scanner, next to the corresponding protein spots also the "markers" or slices with the corresponding Label visible. This image can now be used in the "BioImage® 2-D Analyzer "and a corresponding spot detection can be carried out. The gel is now placed on the shelf (glass pane) underneath the slide and through the CCD Camera shot. The result is a gel image on which only the "markers" can be seen are. This image is also read into the evaluation software. With the help of the software these two gel pictures can now be pushed over each other so that the "markers" lie exactly on top of each other. This "matching" now generates a new image, that integrates the information from both previous images. On the one hand, it contains the Coordinates of the "markers" that originate from the recording with the CCD camera as well as the Information about the protein spots. It also adds protein spots Coordinates assigned from the relative comparison to the positions of the "markers" be calculated. These spots can now be punched out even though the CCD camera does them could not detect.
Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, stellt die erfindungsgemäße Vorrichtung somit eine Kopplung zwischen zwei nebeneinander existierenden Systemen bei der Analyse und Bearbeitung von Gelen dar, dem "Flexys" Roboter System mit der Steuersoftware "Flexys Proteomics Picker" und der Auswertesoftware "BioImage® 2-D Analyzer" einerseits und einem Fluoreszenzscanner andererseits.As can be seen from the above, the device according to the invention thus represents a Coupling between two coexisting systems for analysis and Processing of gels, the "Flexys" robot system with the control software "Flexys Proteomics Picker "and the evaluation software" BioImage® 2-D Analyzer "on the one hand and a fluorescence scanner on the other hand.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein. Those disclosed in the above description, the claims and the drawings Features of the invention can be used both individually and in any combination for the Realization of the invention in its various embodiments may be essential.
11
Deckplatte
cover plate
22
Markierung
mark
33
Stiel
stalk
44
Gegenplatte
counterplate
55
Vorrichtung
contraption
Claims (19)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000143224 DE10043224A1 (en) | 2000-09-01 | 2000-09-01 | Device for marking gels, e.g. electrophoresis gels used for genomic or proteomic analyses, comprises a markable substrate and an anchoring device |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000143224 DE10043224A1 (en) | 2000-09-01 | 2000-09-01 | Device for marking gels, e.g. electrophoresis gels used for genomic or proteomic analyses, comprises a markable substrate and an anchoring device |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10043224A1 true DE10043224A1 (en) | 2002-03-28 |
Family
ID=7654715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000143224 Ceased DE10043224A1 (en) | 2000-09-01 | 2000-09-01 | Device for marking gels, e.g. electrophoresis gels used for genomic or proteomic analyses, comprises a markable substrate and an anchoring device |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10043224A1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4136007A (en) * | 1977-05-21 | 1979-01-23 | Olympus Optical Co., Ltd. | Sample applying position marking device for film for electrophoresis |
-
2000
- 2000-09-01 DE DE2000143224 patent/DE10043224A1/en not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4136007A (en) * | 1977-05-21 | 1979-01-23 | Olympus Optical Co., Ltd. | Sample applying position marking device for film for electrophoresis |
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