DE10043845A1 - Method of measuring NO synthase activity - Google Patents
Method of measuring NO synthase activityInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Aktivität der NO-Synthase, ein entsprechendes Verfahren zur Identifizierung von NO-Synthase-Modulatoren, insbesondere zum Einsatz in einem HTS (high throughput screening), und die Verwendung der entsprechenden Kationenaustausch-Filterplattenmembranen.The invention relates to a method for measuring the activity of the NO synthase corresponding method for identifying NO synthase modulators, especially for use in an HTS (high throughput screening), and the Use of the appropriate cation exchange filter plate membranes.
Es gehört seit über 100 Jahren zum bekannten medizinischen Wissen, Nitroglycerin zur Behandlung koronarer Herzkrankheiten zu verwenden. Man hat allerdings erst vor 15 Jahren erkannt, daß diese Wirkung auf die Bildung von Stickoxid (NO) zurückzuführen ist. Seitdem ist die Bedeutung dieses Moleküls an einer ständig wachsenden Zahl von Publikationen ablesbar. Insbesondere in pharmakologischer Hinsicht sind daher die Synthesewege des NO und insbesondere die Auffindung die NO-Synthese modulierender Verbindungen von großer Bedeutung.It has been known medical knowledge, nitroglycerin, for over 100 years to treat coronary artery disease. You only have one recognized 15 years ago that this effect on the formation of nitric oxide (NO) is due. Since then, the importance of this molecule has been constant growing number of publications readable. Especially in pharmacological In this respect, the synthetic routes of the NO and in particular the discovery are the most important NO synthesis of modulating compounds of great importance.
NO wird durch die NO-Synthasen (EC: 1.14.13.39) gebildet (im weiteren manchmal
als NOS abgekürzt). Diese katalysieren die Oxidation von L-Arginin zu L-Citrullin
und NO über NO-Hydroxyarginin. Die NO-Synthasen haben in der monomeren Form
eine Molekülmasse zwischen 125 und 155 kDa, sind jedoch nur als Homodimer
aktiv. Die molekulare Struktur der NO-Synthasen ähnelt stark derjenigen der
Cytochrom-P450-Reduktasen. Es sind verschiedene Klassen von NO-Synthasen
bekannt:
NO is formed by the NO synthases (EC: 1.14.13.39) (hereinafter sometimes abbreviated as NOS). These catalyze the oxidation of L-arginine to L-citrulline and NO via NO-hydroxyarginine. The NO synthases have a molecular mass between 125 and 155 kDa in the monomeric form, but are only active as homodimers. The molecular structure of the NO synthases is very similar to that of the cytochrome P450 reductases. Different classes of NO synthases are known:
- - die durch Cytokine oder LPS induzierbare NOS = iNOS und- the NOS = iNOS and. Inducible by cytokines or LPS
-
- die durch Ca2+ aktivierte konstitutive cNOS, die weiter in die folgenden
Unterformen unterteilt wird:
- - endotheliale NOS = eNOS
- - neuronale NOS = nNOS.
- - endothelial NOS = eNOS
- - neural NOS = nNOS.
In der Literatur gibt es zahlreiche Beispiele, wie man die Aktivität der bekannten NOS-Isoenzyme bestimmen kann.In the literature there are numerous examples of how the activity of the known Can determine NOS isoenzymes.
Am bekanntesten sind folgende Verfahren:The best known are the following methods:
Die Enzymansätze werden nach beendeter Reaktion über separate
Kationenaustauschersäulen gegeben. Danach erfolgt Elution des [3H]L-Citrullin und
Bestimmung der Eluate am β-counter. Der Nachteil dieser Methode liegt darin, daß
pro Enzymansatz eine separate Säulenchromatographie stattfinden muß
(z. B. pro 96er Mikrotiterplatte (MTP) braucht man 96 Chromatographiesäulen).
Methode nach: D. S. Bredt u. S. H. Snyder, Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 682 (1990).After the reaction has ended, the enzyme batches are passed over separate cation exchange columns. This is followed by elution of the [ 3 H] L-citrulline and determination of the eluates on the β-counter. The disadvantage of this method is that a separate column chromatography must take place for each enzyme batch (e.g. 96 chromatography columns are required for each 96-well microtiter plate (MTP)).
Method according to: DS Bredt u. SH Snyder, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 682 (1990).
Neben L-Citrullin fällt bei der NOS-Reaktion (s. Reaktion 1.)) auch NO als
Endprodukt an, das jedoch instabil ist und somit weiterreagiert:
In addition to L-citrulline, NO is also obtained as the end product in the NOS reaction (see reaction 1.), but this is unstable and therefore continues to react:
2NO + O2 → 2NO2
2NO + O 2 → 2NO 2
2NO2 + H2O → NO2 - + NO3 - + 2H+ 2NO 2 + H 2 O → NO 2 - + NO 3 - + 2H +
Das entstandene NO3 - muß zu NO2 - reduziert werden. Dieses kann mit Cadmium oder enzymatisch durch Zugabe von Nitratreduktase geschehen. Da überschüssiges NADPH aus dem NOS-Ansatz die Griess-Reaktion mit NO2 - stört, müssen diese Reduktionsäquivalente entfernt werden. Das kann enzymatisch geschehen, indem Lactatdehydrogenase/Pyruvat hinzugegeben wird. Nach Zugabe des Griess- Reagenzes (1% Sulfanilamid; 0,1% Naphthylendiamin-Dihydrochlorid; 5% H3PO4) entsteht ein purpurfarbener AZO-Farbstoff, der bei 543 nm bestimmt werden kann.The resulting NO 3 - must be reduced to NO 2 - . This can be done with cadmium or enzymatically by adding nitrate reductase. Since excess NADPH from the NOS approach interferes with the Griess reaction with NO 2 - , these reduction equivalents must be removed. This can be done enzymatically by adding lactate dehydrogenase / pyruvate. After adding the Gries reagent (1% sulfanilamide; 0.1% naphthylenediamine dihydrochloride; 5% H 3 PO 4 ), a purple AZO dye is formed, which can be determined at 543 nm.
Die Griesssche Reaktion läuft wie folgt ab:
The Griess reaction proceeds as follows:
Literatur: L. C. Green, D. A. Wagner, J. Glogowski, P. L. Skipper, J. S. Wishnok, S. R. Tannenbaum, Anal. Biochem. 126, 131 (1982)Literature: L.C. Green, D.A. Wagner, J. Glogowski, P.L. Skipper, J.S. Wishnok, S. R. Tannenbaum, Anal. Biochem. 126, 131 (1982)
Der Nachteil dieser Meßmethode ist, daß zur Bestimmung der NOS-Aktivität mehrere Reaktionsschritte nötig sind, die getrennt nacheinander durchgeführt werden müssen.The disadvantage of this measurement method is that it determines the NOS activity several reaction steps are necessary, which are carried out separately one after the other Need to become.
Das neben L-Citrullin bei der NOS-Reaktion anfallende NO reagiert zu NO2 - und
NO3 - (s. Reaktion 2)). Für die Chemilumineszenzmessung müssen NO2 - und NO3 -
aber zu NO rücküberführt werden. Dann wird eine Reaktion mit Ozon durchgeführt:
The NO produced in addition to L-citrulline in the NOS reaction reacts to NO 2 - and NO 3 - (see reaction 2)). For the chemiluminescence measurement, NO 2 - and NO 3 - but be returned to NO. Then a reaction with ozone is carried out:
NO + O3 → NO2* + O2,
NO + O 3 → NO 2 * + O 2 ,
NO2* → NO2 + hv
NO 2 * → NO 2 + hv
Literatur: S. Archer, FASEB Journal 7, 349 (1993)Literature: S. Archer, FASEB Journal 7, 349 (1993)
Der Nachteil dieser Methode ist, daß zum einen auch hier mehrere Reaktionsschritte vorliegen, zum anderen Ozon wegen der geringen Halbwertzeit für die Reaktion aufwendig direkt hergestellt werden muß. The disadvantage of this method is that, on the one hand, there are also several reaction steps here on the other hand ozone due to the short half-life for the reaction must be manufactured directly.
Dabei wird aus der Menge an cGMP auf die Aktivität der Guanylatcyclase
geschlossen. Da die Guanylatcyclase durch NO aktiviert wird, kann so auf die
entstandene Menge an NO, die Aktivität der NOS, zurückgeschlossen werden.
Literatur: M. Feelisch, E:a: Noack, Eur. J. Pharmacol. 139, 19 (1987)
Mayer, Schmidt, Humbert, Böhme, Biochem. Biophys. Research
Commun. 164, 678 (1989)The activity of guanylate cyclase is concluded from the amount of cGMP. Since guanylate cyclase is activated by NO, the amount of NO, the activity of NOS, can be deduced.
Literature: M. Feelisch, E: a: Noack, Eur. J. Pharmacol. 139, 19 (1987)
Mayer, Schmidt, Humbert, Böhme, Biochem. Biophys. Research Commun. 164, 678 (1989)
Der Nachteil dieser Methode ist, daß es sich um eine gekoppelte Enzymreaktion handelt. Abgesehen davon, daß gekoppelte Enzymreaktionen die Messung einer Anfangsgeschwindigkeit meist nicht erlauben, müssen die Substrate für eine saubere lineare Bestimmung der Reakltionsgeschwindigkeit in Konzentrationen im Sättigungsbereich der Enzyme vorliegen (~ 100 Km). Das kann ein erheblicher Kostenfaktor sein. Bei dieser Reaktion ist im übrigen auch die Aktivität der Guanylatcyclase nicht konstant, da sie erst durch während der gekoppelten Reaktion gebildetes NO stimuliert wird.The disadvantage of this method is that it is a coupled enzyme reaction. In addition to the fact that coupled enzyme reactions usually do not allow the measurement of an initial speed, the substrates must be present in concentrations in the saturation range of the enzymes for a clean linear determination of the reaction speed (~ 100 K m ). This can be a significant cost factor. The activity of guanylate cyclase is also not constant in this reaction, since it is only stimulated by NO formed during the coupled reaction.
Aufgrund der Notwendigkeit, in der modernen Pharmaforschung eine erhebliche Anzahl von Messungen innerhalb kürzester Zeit durchzuführen, insbesondere auch große Mengen verschiedener Substanzen, sog. Libraries, auf einzelne interessante Substanzen mit möglicher physiologischer Wirkung hin zu untersuchen, werden sog. HTS-Verfahren (High-Throughput-Screening-Verfahren) durchgeführt. Dabei werden Testverfahren eingesetzt, die automatisierbar, möglichst einfach und schnell sind und daher insbesondere mit einem Minimum an einfachen automatisierbaren Verfahrensschritten und ohne manuelle Zwischenschritte auskommen. Es genügt ein "grobes Verfahren", das nur eine ja-nein Antwort liefern muß. Insofern sind Messungen im Bereich der linearen Anfangsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion nicht unbedingt einzuhalten. Zeitfressende Manipulationen wie Entnahme von aliquoten Teilmengen, weitere Inkubationen durch gekoppelte (Enzym)reaktionen, Zentrifugationsschritte, die nicht automatisierbar sind etc., scheiden für einen HTS- Betrieb von vornherein aus. Gleichzeitig müssen die Tests aber im Ergebnis zuverlässig sein. Daher ist für die Durchführung eines HTS-Laufes die Präzision des Assays von entscheidender Bedeutung, d. h. das "signal to noise ratio" sollte möglichst hoch sein, damit nicht die Präzision der Aussage durch eine doppel-, dreifach- oder gar vierfach-Bestimmung erkauft werden muß, was wiederum einem hohen Substanzdurchsatz entgegensteht.Because of the need to be significant in modern pharmaceutical research Number of measurements to be carried out within a very short time, in particular also large quantities of different substances, so-called libraries, on individual interesting ones To investigate substances with a possible physiological effect are so-called HTS procedure (high-throughput screening procedure) carried out. In doing so Test procedures used that can be automated, are as simple and quick as possible and therefore in particular with a minimum of simple automatable Process steps and do without manual intermediate steps. It is enough "Rough procedure" that only has to provide a yes-no answer. To that extent Measurements in the area of the linear initial speed of an enzyme reaction not necessarily to be observed. Time-consuming manipulations such as removal of aliquots, further incubations by coupled (enzyme) reactions, Centrifugation steps that cannot be automated, etc., are different for a HTS Operation from the start. At the same time, the tests must result to be reliable. Therefore, the precision of the Crucial assays, d. H. the "signal to noise ratio" should be as high as possible, so that the precision of the statement by a double, triple or even quadruple determination must be bought, which in turn one prevents high substance throughput.
Alle vorstehend aufgeführten Reaktionen 1)-4) sind aber nicht HTS-kompatibel, da hier gekoppelte Enzymreaktionen, Entnahme von aliquoten Teilen, Zentrifugationsschritte, säulenchromatographische Trennschnitte etc. einem high throughtput screening entgegenstehen. Der Aufwand an Zeit bzw. Verfahrensschritten, um die nötige Genauigkeit zu erzielen, ist für ein HTS- Verfahren zu erheblich, und die Verfahren sind weitgehend nicht automatisierbar.All reactions listed above 1) -4) are not HTS compatible because coupled enzyme reactions here, removal of aliquots, Centrifugation steps, column chromatography separations etc. a high oppose throughtput screening. The expenditure of time or Procedural steps to achieve the required accuracy is for a HTS Procedures too significant and the procedures are largely not automatable.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein vereinfachtes Verfahren zur Messung der Aktivität der NO-Synthase, insbesondere auch ein Verfahren zur Identifizierung von NO-Synthase-Modulatoren, zu entwickeln. Insbesondere sollte dieses Verfahren im HTS, dem High-Throughput-Screening, einsetzbar sein.The object of the present invention was therefore to provide a simplified method for Measurement of the activity of the NO synthase, in particular also a method for Identification of NO synthase modulators to develop. In particular, should this method can be used in HTS, high-throughput screening.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Messung der Aktivität der NO-Synthase
mit folgenden Verfahrensschritten gelöst:
This object is achieved by a method for measuring the activity of the NO synthase with the following method steps:
- a) Inkubation der NO-Synthase mit markiertem Arginin als Substrat in einem Reaktionsgefäß,a) Incubation of the NO synthase with labeled arginine as substrate in a reaction vessel,
- b) Trennung des markierten Arginins von dem gegebenenfalls als Produkt der enzymatischen Reaktion entstandenen, markierten Citrullin, zu einem Zeitpunkt, zu dem die Konzentration an Citrullin ansteigt,b) separation of the labeled arginine from the optionally as Labeled product of the enzymatic reaction Citrulline, at a time when the concentration of Citrulline increases
- c) Messung der Menge an jeweils abgetrenntem Arginin,c) measurement of the amount of arginine separated off,
wobei die Trennung über eine Filterplatten-Membran erfolgt.the separation takes place via a filter plate membrane.
Dabei versteht man im Sinne dieser Erfindung unter:
For the purposes of this invention,
- - Inkubation: das Einbringen und Belassen eines biologischen Objektes, hier eines Enzyms, NOS, in ein Medium, dem unter Umständen weitere Verbindungen zugesetzt werden oder worden sind wie z. B. das Enzymsubstrat. Dabei werden geeignete (meist den physiologischen nahe) Bedingungen gewählt, um einen bestimmten Effekt zu erreichen, hier den Ablauf einer Enzymreaktion, der durch NOS katalysierten Umwandlung von Arginin in Citrullin und NO. Die Bedingungen werden beispielsweise durch Kontrolle der Temperatur, des pH, der Coenzyme bzw. Cofaktoren und/oder der Reaktionszeit etc. erreicht.- Incubation: inserting and leaving a biological object, here one Enzyme, NOS, in a medium that may have additional compounds be added or have been such. B. the enzyme substrate. In doing so suitable (usually close to the physiological) conditions chosen to achieve a to achieve a certain effect, here the course of an enzyme reaction, which by NOS catalyzed conversion of arginine to citrulline and NO. The Conditions are determined, for example, by controlling the temperature, the pH, the coenzymes or cofactors and / or the reaction time etc. is reached.
- - Reaktionsgefäß: Darunter ist ein Gefäß zu verstehen, in dem eine chemische Reaktion unter kontrollierten Bedingungen aber auch eine auf Bindung oder anderen physikalischen Kräften beruhende Trennung ablaufen kann, beispielsweise ein Eppendorf-Cup, eine Kulturschale oder -flasche, ein Reagenzglas, ein Zentrifugenröhrchen oder ein "Well" einer Mikrotiterplatte. Dabei kann das Reaktionsgefäß auch durch selektiv durchlässige Membranen in Kompartimente unterteilt sein und/oder muß insbesondere nicht zwangsläufig flüssigkeitsundurchlässig verschlossen sein, auch nicht auf der Unterseite des Gefäßes. Damit können Reaktionsgefäße auch an einer Seite (meist der Unterseite) mit einer selektiv durchlässigen Membran, beispielsweise einer Filterplattenmembran, verschlossene Säulchen oder Mikrotiterplatten sein. In einem Reaktionsgefäß findet die Inkubation (Schritt a)) wie auch vorzugsweise die Trennung (Schritt b)) statt.- Reaction vessel: This is to be understood as a vessel in which a chemical Reaction under controlled conditions, but also on binding or separation based on other physical forces, for example an Eppendorf Cup, a culture dish or bottle Test tube, a centrifuge tube or a "well" of a microtiter plate. The reaction vessel can also pass through selectively permeable membranes Compartments must be divided and / or in particular not necessarily be impervious to liquids, not even on the underside of the Vessel. This means that reaction vessels can also be attached to one side (usually the Underside) with a selectively permeable membrane, for example one Filter plate membrane, sealed columns or microtiter plates. In The incubation (step a)) takes place as well as preferably in a reaction vessel the separation (step b)) instead.
- - Trennung: Damit ist die örtliche Trennung des Arginin vom Citrullin gemeint, so daß - im Gegensatz zu dem beide Substanzen homogen in einem bestimmten Verhältnis enthaltenden Inkubationsansatz - separate Bereiche entstehen, wobei in einem Bereich das Arginin fast vollständig konzentriert und das Citrullin im Verhältnis zur vorherigen Konzentration fast vollständig verschwunden ist und es sich in einem anderen Bereich umgekehrt verhält. Die Trennung kann z. B. physikalisch über Größen- bzw. Molekulargewichtsfilter, über die Ladung (Kationenaustauscher, chromatographisch oder durch Anlegung einer Spannung) oder z. B. durch Zentrifugation erfolgen. Im erfindungsgemäßen Fall erfolgt die Trennung über eine Filterplattenmembran.- Separation: This means the local separation of arginine from citrulline, see above that - in contrast to which both substances are homogeneous in one Incubation approach containing ratio - separate areas arise, whereby in one area the arginine is almost completely concentrated and the citrulline in Ratio to previous concentration has almost completely disappeared and it behaves the other way around in another area. The separation can e.g. B. physically via size or molecular weight filters, via the charge (Cation exchanger, chromatographically or by applying a voltage) or z. B. done by centrifugation. In the case according to the invention, the Separation via a filter plate membrane.
- - markiert: Unter Markierung versteht man die Messbarmachung eines Moleküls, beispielsweise durch Kopplung an ein anderes Molekül, das hilft, ein Meßsignal zu generieren (z. B. Fluoreszenz; Lumineszenz, Metallion), oder durch Verwendung von radioaktiven Atomen bei dessen Synthese (radioaktive Markierung).- Marked: Marking is the making of a molecule measurable, for example by coupling to another molecule that helps a measurement signal to generate (e.g. fluorescence; luminescence, metal ion), or by Use of radioactive atoms in their synthesis (radioactive Mark).
- - Zeitpunkt, zu dem die Konzentration an Citrullin ansteigt: Damit ist ein Zeitpunkt gemeint, bei dem die Reaktion noch in Richtung auf das Produkt Citrullin läuft, also kein Endpunkt erreicht ist.- Time when the concentration of citrulline increases: This is a time meant that the reaction is still in the direction of the product citrulline, no end point has been reached.
- - Messung: Unter einer Messung ist in diesem Sinne die Quantifizierung der markierten Substanz mit dem geeigneten Gerät zu verstehen.- Measurement: In this sense, a measurement is the quantification of the understand the labeled substance with the appropriate device.
- - Filterplattenmembran: Das ist eine flache Membran, also eine definiert durchlässige Grenzfläche, die in der Lage ist, Flüssigkeiten zu filtern, also bestimmte Inhaltsstoffe der Flüssigkeit zurückzuhalten.- Filter plate membrane: This is a flat membrane, i.e. one defined permeable interface, which is able to filter liquids, so retain certain liquid ingredients.
Hier wurde als Verfahren eine Trennung zwischen Substrat und, Endprodukt durch Einsatz einer Filterplatten-Membran gewählt, wobei durch einen einfachen Filtrationsschritt eine quantitative Separation zwischen Substrat und den Endprodukten stattfindet, ohne daß einzelne Elutionsfraktionen aufgefangen werden müssen. Durch diesen simplen "Filtrationschritt" wird eine hohe Präzision erlangt, wobei eine Doppel- oder Dreifach-Bestimmung überflüssig wird. Erst die Einführung dieser Filterplatten-Membran erlaubt den erfolgreichen Einsatz des Verfahrens beispielsweise in einem HTS, aber auch ganz allgemein für einfache unkomplizierte Bestimmungen der NOS-Aktivität. Als Substrat besonders bevorzugt ist markiertes L- Arginin, was u. a. zur Bildung von L-Citrullin als ein Produkt führt.A separation between substrate and end product was carried out here as a method Use of a filter plate membrane chosen, being by a simple Filtration step a quantitative separation between the substrate and the End products takes place without collecting individual elution fractions have to. This simple "filtration step" achieves high precision, a double or triple determination becomes superfluous. First the introduction This filter plate membrane allows the method to be used successfully for example in a HTS, but also in general for simple, uncomplicated Determinations of NOS activity. Labeled L- is particularly preferred as substrate. Arginine, what u. a. leads to the formation of L-citrulline as a product.
Es ist besonders bevorzugt, wenn das Verfahren so ausgeführt wird, daß in mindestens einem der Reaktionsgefässe dem Inkubationsansatz in Schritt (a) eine Substanz zugefügt wird, die daraufhin überprüft werden soll, ob sie ein Modulator, insbesondere Aktivator oder Inhibitor, vorzugsweise Inhibitor, der NO-Synthase ist. Damit ist der Einsatz in einem Screening-Assay umfaßt, mit dem Substanzen auf physiologische Wirksamkeit untersucht werden. Dabei versteht man unter Modulator ein Molekül, das das Verhalten - hier der NOS - beeinflußt, insbesondere zu einer erhöhten Aktivität (Aktivator) oder einer erniedrigten Aktivität (Inhibitor) bis hin zur. vollständigen Blockade führt. It is particularly preferred if the process is carried out so that in at least one of the reaction vessels to the incubation batch in step (a) Substance is added, which should then be checked whether it is a modulator, in particular activator or inhibitor, preferably inhibitor, which is NO synthase. This includes use in a screening assay that targets substances physiological efficacy to be examined. Here one understands by modulator a molecule that influences behavior - here the NOS - especially one increased activity (activator) or decreased activity (inhibitor) up to. complete blockade.
Insbesondere ist auch Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung
von NO-Synthase-Modulatoren mit folgenden Verfahrensschritten:
In particular, the invention also relates to a method for identifying NO synthase modulators with the following method steps:
- a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit NO-Synthase und markiertem Arginin in einem Reaktionsgefäß,a) Incubation of a substance to be tested under suitable Conditions with NO synthase and labeled arginine in one Reaction vessel,
- b) Trennung des markierten Arginins von dem gegebenenfalls als Produkt der enzymatischen Reaktion entstandenen, markierten Citrullin, zu einem Zeitpunkt, zu dem die Konzentration an Citrullin ansteigt,b) separation of the labeled arginine from the optionally as Labeled product of the enzymatic reaction Citrulline, at a time when the concentration of Citrulline increases
- c) Messung der Menge an jeweils abgetrenntem Arginin, wobei die Trennung über eine Filterplatten-Membran erfolgt.c) measurement of the amount of arginine separated off, the separation takes place via a filter plate membrane.
Dabei versteht man unter "einer zu testenden Substanz" insbesondere eine niedermolekulare Verbindung, deren Wirkung auf die NOS-Aktivität untersucht werden soll.Here, "a substance to be tested" is understood to mean in particular one low molecular compound, whose effect on NOS activity is examined shall be.
Der Gegenstand ist damit insbesondere ein Screeningverfahren, mit dem, beispielsweise aus einer Library, Substanzen identifiziert werden können, die Modulatoren der NOS und damit potentiell pharmakologisch interessante Verbindungen sind. Dabei versteht man unter "einer zu testenden Substanz" insbesondere niedermolekulare Verbindungen, deren Wirkung auf die NOS-Aktivität untersucht werden soll. Es ist dabei besonders bevorzugt, wenn das Verfahren zur Identifizierung eines Aktivators oder Inhibitors, vorzugsweise eines Inhibitors, der NO-Synthase dient.The subject is in particular a screening process with which For example, from a library, substances can be identified NOS modulators and thus potentially pharmacologically interesting Connections are. One understands "a substance to be tested" especially low molecular weight compounds, their effect on NOS activity to be examined. It is particularly preferred if the method for Identification of an activator or inhibitor, preferably an inhibitor that NO synthase is used.
Weiter wird in einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bei der Trennung gemäß Schritt (b) aus dem Reaktionsgefäß das Inkubationsmedium entfernt. Mit Inkubationsmedium ist das Medium gemeint, in dem die Inkubation gemäß Schritt (a) stattfindet und in dem das Substrat (markiertes Arginin), NOS, die entstehenden Produkte (also markiertes Citrullin und NO) und deren Folgeprodukte sowie Coenzyme bzw. Cofaktoren gelöst sind und das mit diesen gelösten oder evt. suspendierten Substanzen zusammmen den Inkubationsansatz nach Schritt (a) bildet. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn das Inkubationsmedium weitgehend, insbesondere fast vollständig, vorzugsweise vollständig, entfernt wird. Damit ist insbesondere auch eine Entfernung über die Filterplattenmembran gemeint, wobei weitgehend heißt, daß nur noch geringe Tropfmengen des Mediums verbleiben, fast vollständig heißt, daß nur die Filterplattenmembran geringe Mengen an Inkubationsmedium enthält und vollständig heißt, daß das Medium entweder aus der Filterplattenmembran ausgewaschen oder durch Trocknung entfernt wurde. Es ist weiter bevorzugt, daß bei der Entfernung des Inkubationsmediums das markierte Arginin von dem Inkubationsmedium getrennt wird. Unter den Folgeprodukten im Sinne dieser Erfindung versteht man aus den Produkten hervorgehende weitere Produkte, z. B. insbesondere NO2 - oder NO3 -. Ein Coenzym ist eine niedermolekulare, nicht proteinogene Verbindung, die als ein nur vorübergehend u. locker an ein Enzym gebundenes Co-Substrat benötigt wird, z. B.: NADPH. Cofaktoren ist eine Sammelbezeichnung für niedermolekulare Substanzen, deren Anwesenheit für enzymatische Reaktionen erforderlich ist oder sein kann, z. B.: Ca2+, Calmodulin.Furthermore, in a preferred embodiment of the method according to the invention, the incubation medium is removed from the reaction vessel in the separation according to step (b). Incubation medium means the medium in which the incubation according to step (a) takes place and in which the substrate (labeled arginine), NOS, the resulting products (i.e. labeled citrulline and NO) and their secondary products as well as coenzymes or cofactors are dissolved and that together with these dissolved or possibly suspended substances forms the incubation batch after step (a). It is particularly preferred if the incubation medium is largely, in particular almost completely, preferably completely removed. In particular, this also means a removal via the filter plate membrane, which largely means that only small drops of the medium remain, almost completely means that only the filter plate membrane contains small amounts of incubation medium and completely means that the medium either washed out of the filter plate membrane or was removed by drying. It is further preferred that when the incubation medium is removed, the labeled arginine is separated from the incubation medium. The follow-up products within the meaning of this invention are understood to mean further products resulting from the products, e.g. B. in particular NO 2 - or NO 3 - . A coenzyme is a low molecular weight, non-proteinogenic compound that is considered to be only temporarily and Co-substrate loosely bound to an enzyme is required, e.g. E.g .: NADPH. Cofactors is a collective name for low-molecular substances, the presence of which is or may be required for enzymatic reactions, e.g. E.g .: Ca 2+ , calmodulin.
Im Zusammenhang mit der Trennung nach Schritt (b) ist es weiter bevorzugt, wenn bei der Trennung gemäß Schritt (b) zusätzlich Cofaktoren bzw. Coenzyme, die NO- Synthase, NO und die Folgeprodukte und/oder die NO-Synthase von dem markierten Arginin getrennt werden. Damit ist die Abtrennung der dem lnkubationsmedium im Inkubationsansatz nach Schritt (a) zugegebenen Substanzen außer dem Substrat gemeint. Da diese Substanzen meist wasserlöslich sind, fällt dies überwiegend mit der Entfernung des Inkubationsmediums zusammen.In connection with the separation according to step (b), it is further preferred if in the separation according to step (b), additional cofactors or coenzymes which contain NO Synthase, NO and the derived products and / or the NO synthase from that labeled arginine can be separated. This is the separation of the Incubation medium in the incubation mixture after step (a) added substances other than the substrate. Since these substances are mostly water-soluble, falls this is mainly related to the removal of the incubation medium.
Es ist in Bezug auf die Filterplatten-Membran besonders bevorzugt, wenn die im Verfahren verwendeten Filterplatten-Membranen Kationenaustauscher sind. Kationenaustauscher sind Stoffe, die im Austausch äquivalente Mengen fremder Kationen aus Flüssigkeiten aufnehmen. Die Filterplatten-Membranen können weiter bevorzugt Papierfilter oder Textilfilter sein oder aus sonstigen porösen oder durchbrochenen Festmaterialien, beispielsweise Metall, Glas oder Keramik, bestehen oder diese enthalten. Unter ersterem werden Filter auf Papier- oder Textilbasis verstanden. Mit letzterem sind z. B. unbeschichtete oder mit z. B. Gel oder Harz beschichtete Metallfoliensiebe(-filter) oder Ton- bzw. Glasfilter gemeint. Weiter bevorzugt ist es auch, wenn die funktionellen Gruppen für den Kationenaustausch an den Filterplatten-Membranen fixiert sind. Dabei sind funktionelle Gruppen negative Gruppen, die als Bindungsstelle für die Kationen dienen und an den Träger, hier die Filterplatten-Membranen, gebunden sind, beispielsweise kovalent aber evt. auch über starke Ionenbindungen.It is particularly preferred in relation to the filter plate membrane if the Processes used filter plate membranes are cation exchangers. Cation exchangers are substances that exchange equivalent amounts of foreign ones Absorb cations from liquids. The filter plate membranes can continue preferably be paper filters or textile filters or from other porous or openwork solid materials, for example metal, glass or ceramic, exist or contain them. Among the former are filters on paper or Textile base understood. With the latter z. B. uncoated or with z. B. gel or Resin-coated metal foil screens (filters) or clay or glass filters are meant. Continue it is also preferred if the functional groups for the cation exchange are fixed to the filter plate membranes. There are functional groups negative groups, which serve as binding sites for the cations and to which Carrier, here the filter plate membranes, are bound, for example covalently but possibly also via strong ion bonds.
Bevorzugte funktionelle Gruppen, die in den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Kationenaustauscher-Filterplattenmembranen verwendet werden, sind Phosphat-, Carbonat-, Phosphonat-, Sulfat- und/oder Sulfonat-Gruppen, vorzugsweise Phosphat-Gruppen.Preferred functional groups in the in the inventive method used cation exchanger filter plate membranes are used Phosphate, carbonate, phosphonate, sulfate and / or sulfonate groups, preferably phosphate groups.
Dabei weisen die Filterplatten-Membranen, wenn es sich um Papierfilter handelt, insbesondere eine Dicke von 10,00 mm bis 0,10 mm, vorzugsweise 1,00 mm bis 0,15 mm, insbesondere 0,50 mm bis 0,20 mm, vorzugsweise 0,23 mm auf. Weiter bevorzugt ist es auch, wenn die Filterplatten-Membranen Kationenaustauscher mit einer Austauschkapazität von ≧ 1,0 µEq./cm2, insbesondere ≧ 10,0 µEq./cm2, vorzugsweise ≧ 18,0 µEq./cm2 sind. Dabei können diese Filterplatten eine Durchflußgeschwindigkeit von < 100 mm/ 30 min. vorzugsweise 125 mm/30 min haben.When it comes to paper filters, the filter plate membranes in particular have a thickness of 10.00 mm to 0.10 mm, preferably 1.00 mm to 0.15 mm, in particular 0.50 mm to 0.20 mm, preferably 0.23 mm. It is also more preferred if the filter plate membranes are cation exchangers with an exchange capacity of ≧ 1.0 µEq. / Cm 2 , in particular ≧ 10.0 µEq. / Cm 2 , preferably ≧ 18.0 µEq. / Cm 2 . These filter plates can have a flow rate of <100 mm / 30 min. preferably have 125 mm / 30 min.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt Schritt (a) parallel in mehreren Reaktionsgefäßen annähernd gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig, und/oder Schritt (b) parallel in mehreren Reaktionsgefäßen annähernd gleichzeitig, vorzugsweise gleichzeitig, insbesondere bezüglich des Inkubationsbeginns in Schritt (a) und/oder dem Beginn der Trennung nach Schritt (b). Dabei ist es besonders bevorzugt, daß die Reaktionsgefäße zusammenhängen, es sich insbesondere um Wells einer Mikrotiterplatte ~ handelt. Dabei versteht man unter "Well" die die Inkubationsansätze oder Proben aufnehmenden Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte. Als Mikrotiterplatten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind besonders solche geeignet, die < 96 "Wells", vorzugsweise 24 oder 48 "Wells", oder ≧ 96 "Welk", insbesondere 96, 384, 864 oder 1536 "Wells", aufweisen. In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention step (a) takes place in parallel in several reaction vessels approximately simultaneously, preferably simultaneously, and / or step (b) in parallel in several Reaction vessels approximately simultaneously, preferably simultaneously, in particular regarding the start of incubation in step (a) and / or the start of separation after step (b). It is particularly preferred that the reaction vessels related, it is in particular wells of a microtiter plate ~. "Well" means the incubation batches or samples receiving wells in a microtiter plate. As microtiter plates, which are in the Processes according to the invention can be used in particular suitable for the <96 "wells", preferably 24 or 48 "wells", or ≧ 96 "wilted", in particular 96, 384, 864 or 1536 "wells".
Weiter ist es bevorzugt, wenn die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Reaktionsgefäße für Schritt (a) und/oder Schritt (b) ein Volumen zur Aufnahme von ≦ 2 ml, insbesondere ≦ 1 ml, vorzugsweise ≦ 1 ml, ≦ 800 µl, ≦ 350 µl, ≦ 300 µl, ≦ 250 µl, ≦ 200 µl, ≦ 150 µl, ≦ 100 µl, ≦ 50 µl, ≦ 30 µl oder ≦ 5 µl aufweisen.It is further preferred if the in the inventive method used reaction vessels for step (a) and / or step (b) a volume for Intake of ≦ 2 ml, in particular ≦ 1 ml, preferably ≦ 1 ml, ≦ 800 µl, ≦ 350 µl, ≦ 300 µl, ≦ 250 µl, ≦ 200 µl, ≦ 150 µl, ≦ 100 µl, ≦ 50 µl, ≦ 30 µl or ≦ 5 µl exhibit.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Abtrennung gemäß Schritt (b) durch Absaugen des Inkubationsmediums aus Schritt (a) durch die Filterplatten-Membran. Dabei wird ein Unterdruck auf der dem lnkubationsansatz abgewandten Seite der Filterplattenmembran angelegt. Mit Inkubationsmedium ist das Medium gemeint, in dem die Inkubation gemäß Schritt (a) stattfindet und in dem Substrat, NOS, Produkte und Folgeprodukte sowie Coenzyme bzw. Cofaktoren gelöst sind. In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren wird nach der Abtrennung gemäß Schritt (b) die Fraktion, die das vom markierten Arginin getrennte markierte Citrullin enthält, verworfen. Dabei ist mit Fraktion eine Teilmenge des vor der Trennung bestehenden Inkubationsansatzes gemeint, in diesem Falle Inkubationsmedium mit bestimmten gelösten Anteilen. Hier ist das der Teil des Mediums, in dem das markierte Citrullin des Inkubationsansatzes weitgehend vollständig und das markierte Arginin des ursprünglichen Inkubationsansatzes (fast) nicht mehr vorliegt. Gerade diese beiden letzten Ausführungsformen erleichtern die Handhabung und Automatisierung des Tests weiter erheblich und machen ihn besonders geeignet für ein HTS.In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention the separation according to step (b) takes place by suctioning off the incubation medium from step (a) through the filter plate membrane. This creates a vacuum on the the side of the filter plate membrane facing away from the incubation approach. With Incubation medium means the medium in which the incubation according to step (a) takes place and in the substrate, NOS, products and secondary products as well as coenzymes or cofactors are solved. In another, particularly preferred Embodiment of the method according to the invention is after the separation according to step (b) the fraction which labeled the separated from the labeled arginine Contains citrulline, discarded. With fraction is a subset of before Separation of existing incubation approach is meant, in this case Incubation medium with certain dissolved parts. Here is the part of the Medium in which the marked citrulline of the incubation approach largely complete and the labeled arginine of the original incubation approach (almost) is no longer available. These last two embodiments make it easier Handling and automation of the test continues to be significant and make it particularly suitable for a HTS.
In einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren liegt das nach der Abtrennung gemäß Schritt (b) abgetrennte Substrat auf oder in der Filterplattenmembran vor, wobei es vorzugsweise gebunden ist.In a further preferred method according to the invention, this is based on Separation according to step (b) separated substrate on or in the Filter plate membrane before, wherein it is preferably bound.
Besonders bevorzugt ist es, wenn die Markierung die Messung des Substrats über Radioaktivität, Fluoreszenz, Lumineszenz oder Spektrums- bzw. Farbveränderung erlaubt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Messung des Substrats im Szintillationszähler nach Zugabe von Szintillationsflüssigkeit auf die Filterplatten-Membran. Damit ist insbesondere gemeint, daß in einem besonders bevorzugten Verfahrensschritt nach der Trennung gemäß Schritt (b) die Filterplattenmembran, auf der das markierte Arginin vorliegt, entweder einzeln oder als ganze mehrere Filterplattenmembranen umfassende Mikrotiterplatte getrocknet wird, beispielsweise im Trockenschrank. Mikrotiterplatten (MTP) werden anschließend auf der Rückseite versiegelt, einzelne Filtermembranen hingegen in Szintillationsgefäße überführt. Dann werden die Filtermembranen mit Szintillationsflüssigkeit übergossen, abgeschlossen (MTP auf der Vorderseite versiegelt) und in einem Counter, einem Szintillationszähler, gezählt.It is particularly preferred if the marking over the measurement of the substrate Radioactivity, fluorescence, luminescence or spectrum or color change allowed. In a particularly preferred embodiment, the measurement of the Substrate in the scintillation counter after adding scintillation liquid to the Filter plate membrane. This means in particular that in one particular preferred process step after the separation according to step (b) Filter plate membrane on which the labeled arginine is present, either individually or dried as a whole microtiter plate comprising several filter plate membranes is, for example in the drying cabinet. Microtiter plates (MTP) are then sealed on the back, individual filter membranes in Transferred scintillation vials. Then the filter membranes with Poured over scintillation fluid, completed (MTP on the front sealed) and counted in a counter, a scintillation counter.
In einer weiteren Variante des Verfahrens finden Schritt (a) und Schritt (b) nicht im gleichen Reaktionsgefäß statt. Auch diese Variante ist besonders gut für ein HTS geeignet. Damit ist insbesondere gemeint, daß der Inkubationsansatz gemäß Schritt (a) in ein weiteres Gefäß überführt wird, das beispielsweise die Filterplattenmembran enthält und in dem Schritt (b) stattfindet. So werden beispielsweise parallel die Inkubationsansätze aus einer Mikrotiterplatte in eine andere Mikrotiterplatte überführt, deren Wells am Boden eine Filterplattenmembran, beispielsweise in Form eines Kationenaustauschers, aufweisen, die durch ein flüssigkeitsdurchlässiges Sieb fixiert wird. Hier kann dann beispielsweise die Trennung über das Anlegen eines Unterdrucks auf der Unterseite der Filterplattenmembran erfolgen, wobei das Inkubationsmedium mit z. B. dem markierten Citrullin zusammen abgesaugt wird und das markierte Arginin auf oder in der Filterplattenmembran am Boden der Wells verbleibt.In a further variant of the method, step (a) and step (b) are not in the same reaction vessel instead. This variant is also particularly good for an HTS suitable. This means in particular that the incubation approach according to step (a) is transferred to another vessel, for example the Contains filter plate membrane and takes place in step (b). So be for example, the incubation approaches from a microtiter plate in parallel transferred another microtiter plate, whose wells have a filter plate membrane on the bottom, for example in the form of a cation exchanger, which are replaced by a liquid-permeable sieve is fixed. Here, for example, the Separation by applying a vacuum to the bottom of the Filter plate membrane take place, the incubation medium with z. B. the labeled citrulline is sucked together and the labeled arginine on or in the filter plate membrane remains at the bottom of the wells.
Eine weitere besonders interessante Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, daß nach der Abtrennung gemäß Schritt (b) ein Waschschritt erfolgt, vorzugsweise ≦ 3 mal, insbesondere 1 mal, vorzugsweise mit Wasser oder Puffer insbesondere mit einem Volumen ≦ 10 ml, insbesondere ≦ 5 ml, vorzugsweise ≦ 3 ml, insbesondere ≦ 2 ml. Das Volumen der Waschflüssigkeit bezieht sich auf die Menge pro getrenntem (Schritt b) Inkubationsansatz gemäß(Schritt a), vorzugsweise also pro Reaktionsgefäß. Auch dies kann den Einsatz im HTS verbessern und insbesondere eine größere Genauigkeit des Tests erlauben. Dabei kann das Waschvolumen deutlich höher sein als das Volumen der Reaktionsgefäße, sofern parallel zur Zugabe der Waschflüssigkeit diese wieder, beispielsweise durch Absaugen, entfernt wird. Wenn dies nicht der Fall ist, entspricht das Volumen der Waschfraktionen vorzugsweise dem maximalen des Reaktionsgefäßes, in dem Schritt (b) durchgeführt wird.Another particularly interesting variant of the method according to the invention provides for a washing step to take place after the separation in step (b), preferably ≦ 3 times, in particular 1 time, preferably with water or buffer in particular with a volume of ≦ 10 ml, in particular ≦ 5 ml, preferably ≦ 3 ml, especially ≦ 2 ml. The volume of the washing liquid refers to the Amount per separate (step b) incubation batch according to (step a), preferably per reaction vessel. This can also be used in HTS improve and in particular allow greater accuracy of the test. Here the wash volume can be significantly higher than the volume of the reaction vessels, if parallel to the addition of the washing liquid again, for example by Suction, is removed. If this is not the case, the volume corresponds to the Wash fractions preferably the maximum of the reaction vessel in which Step (b) is carried out.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens sieht vor, daß als NO-Synthase
rekombinante NO-Synthase verwendet wird, wobei die NO-Synthase insbesondere
subtypspezifisch ist, vorzugsweise eine human-, ratten- oder maus-spezifische
eNOS, iNOS oder nNOS, insbesondere auch α- bzw. β-nNOS ist. Dabei versteht
man unter rekombinanter NOS eine NOS, die unter Verwendung einer
gentechnologischen Manipulation hergestellt ist. Beispielsweise wird ausgehend von
der Sequenz eines klonierten NOS-Gens ein rekombinantes DNA-Konstrukt,
beispielsweise ein Klonierungs- oder besser Expressionsvektor, konstruiert. Mit dem
wird dann eine Zelle transfiziert, die anschließend unter besonderen
Kulturbedingungen das Gen exprimiert und das Protein, rekombinante NOS, bildet.
Dabei bedeuten:
A preferred embodiment of the method provides that recombinant NO synthase is used as the NO synthase, the NO synthase being in particular subtype-specific, preferably a human-, rat- or mouse-specific eNOS, iNOS or nNOS, in particular also α- or β-nNOS. Recombinant NOS is understood to be a NOS that is produced using genetic engineering manipulation. For example, starting from the sequence of a cloned NOS gene, a recombinant DNA construct, for example a cloning or better expression vector, is constructed. A cell is then transfected with it, which then expresses the gene under special culture conditions and forms the protein, recombinant NOS. Mean:
- - (rekombinantes) DNA-Konstrukt: Generelle Bezeichnung für jede Art von DNA- Molekülen, die durch die in vitro-Verknüpfung von DNA-Molekülen entstanden sind.- (Recombinant) DNA construct: general term for any type of DNA Molecules created by in vitro linking of DNA molecules are.
- - Klonierungsvektor: Generelle Bezeichnung für Nukleinsäure-Moleküle, die beim Klonieren als Träger von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen.- Cloning vector: General term for nucleic acid molecules that are used in Cloning serve as a carrier of foreign genes or parts of these genes.
- - Expressionsvektor: Bezeichnung für speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transkription und Translation des in den Vektor einklonierten Fremdgens erlauben.Expression vector: designation for specially constructed cloning vectors, which, after introduction into a suitable host cell, the transcription and Allow translation of the foreign gene cloned into the vector.
Es ist aber besonders bevorzugt, wenn die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte NO-Synthase Teil eines Rohextrakts (ab hier manchmal NOS- Rohextrakt genannt) aus Wirbeltier-, vorzugsweise Säugetier-, Gewebe ist. Dabei kann der Rohextrakt aus Nagetieren gewonnen werden, und/oder aus dem ZNS und/oder er kann der aus Homogenat gewonnene Überstand sein, insbesondere der Überstand eines Homogenats aus Ratten- oder Maus-Cerebellum. Dabei wird dem ZNS (zentralen Nervensystem) eines Nagetiers, vorzugsweise der Ratte oder Maus, Gewebe, vorzugsweise das Cerebellum, entnommen, dieses homogenisiert, zentrifugiert und der Überstand als neuronaler NOS-Rohextrakt verwendet. Ein Beispiel für ein entsprechendes Herstellungsverfahren findet sich in den Beispielen.However, it is particularly preferred if the in the inventive method NO synthase used as part of a crude extract (from here sometimes NOS- Called crude extract) from vertebrate, preferably mammalian, tissue. Here the crude extract can be obtained from rodents and / or from the CNS and / or it can be the supernatant obtained from homogenate, in particular that Supernatant of a homogenate from rat or mouse cerebellum. The CNS (central nervous system) of a rodent, preferably the rat or mouse, Tissue, preferably the cerebellum, removed, homogenized, centrifuged and the supernatant used as a neural NOS crude extract. A An example of a corresponding manufacturing process can be found in the examples.
Es ist weiter bevorzugt, daß die eingesetzte Proteinmenge im Inkubationsansatz im Verfahren gemäß Schritt (a) pro mm2 der in Schritt (b) eingesetzten Filterplattenmembran maximal ≦ 5,0 µg, insbesondere ≦ 2,5 µg, vorzugsweise ≦ 1,0 µg, sein darf. Die angegebenen Proteinmengen sind Erfahrungswerte, oberhalb von denen die Filterplattenmembran bei der Trennung, insbesondere beim Absaugen, verstopfen kann.It is further preferred that the amount of protein used in the incubation mixture in the process according to step (a) per mm 2 of the filter plate membrane used in step (b) does not exceed ≦ 5.0 µg, in particular ≦ 2.5 µg, preferably ≦ 1.0 µg, may be. The stated amounts of protein are empirical values above which the filter plate membrane can clog during separation, especially when suctioning.
Gereinigte NOS (auch z. B. rekombinantes Enzym) benötigt neben dem Substrat und Coenzym NADPH ferner noch weitere Coenzyme/Gofaktoren wie Tetrahydrobiopterin (BH4), FAD, FMN, Calmodulin (CaM) und Ca++ (A.J. Hobbs, A. Higgs, S. Moncada, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39, 191, 1999). Daher ist es zunächst bevorzugt, wenn bei einem erfindungsgemäßen Verfahren dem lnkubationsansatz gemäß Schritt a) Cofaktoren bzw. Coenzyme und/oder NADPH hinzugefügt werden. Insbesondere können dem lnkubationsansatz Calmodulin, Ca2+, Tetrahydrobiopterin, FAD und/oder FMN hinzugefügt werden.In addition to the substrate and coenzyme NADPH, purified NOS (also e.g. recombinant enzyme) also requires other coenzymes / gofactors such as tetrahydrobiopterin (BH 4 ), FAD, FMN, calmodulin (CaM) and Ca ++ (AJ Hobbs, A. Higgs , S. Moncada, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39, 191, 1999). It is therefore initially preferred if, in a method according to the invention, cofactors or coenzymes and / or NADPH are added to the incubation batch in step a). In particular, calmodulin, Ca 2+ , tetrahydrobiopterin, FAD and / or FMN can be added to the incubation batch.
Um die Kosten bei einer HTS-Kampagne so gering wie möglich zu halten, kann man alternativ auch mit dem bereits erwähnten NOS-Rohextrakt arbeiten, wobei auf die Zugabe eines großen Teils oben erwähnter Coenzyme verzichtet werden kann. Das heißt, daß bei Verwendung des oben erwähnten neuronalen NOS-Rohextraktes auf den Einsatz von BHq, CaM, FAD und FMN verzichtet werden kann. Daher ist es besonders bevorzugt, wenn bei Verwendung des oben beschriebenen NOS- Rohextraktes dem Inkubationsansatz NADPH und Ca2+, insbesondere als einzige Cofaktoren bzw. Coenzyme, hinzugefügt werden. Gerade diese Variante ist besonders kostengünstig. In order to keep the costs of an HTS campaign as low as possible, one can alternatively work with the aforementioned NOS crude extract, whereby the addition of a large part of the above-mentioned coenzymes can be dispensed with. This means that BHq, CaM, FAD and FMN can be dispensed with when using the above-mentioned neural NOS crude extract. It is therefore particularly preferred if, when using the crude NOS extract described above, NADPH and Ca 2+ , in particular as the only cofactors or coenzymes, are added to the incubation mixture. This variant is particularly cost-effective.
Es ist weiter bevorzugt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren der Inkubationsansatz in Puffer als Inkubationsmedium angesetzt wird, und ebenso, daß die Inkubation in Schritt (a) bei Raumtemperatur, 37°C, 25°C, 10°C oder 4°C, vorzugsweise Raumtemperatur, stattfindet.It is further preferred that the Incubation is set up in buffer as the incubation medium, and also that the incubation in step (a) at room temperature, 37 ° C, 25 ° C, 10 ° C or 4 ° C, preferably room temperature.
Weiter ist es besonders bevorzugt, wenn die Trennung gemäß Schritt (b) 1-600 min. insbesondere 3-120 min. vorzugsweise 5-60 min nach Beginn der Inkubation gemäß Schritt (a) stattfindet. Diese Zeiten hängen insbesondere von der Aktivität der eingesetzten NOS ab.It is furthermore particularly preferred if the separation according to step (b) 1-600 min. especially 3-120 min. preferably 5-60 min after the start of Incubation takes place according to step (a). These times depend in particular on the Activity of the NOS used.
Eine besonders bevorzugte Form des erfindungsgemäßen Verfahrens ist für ein HTS (High-Throughput-Screening) geeignet, d. h. insbesondere einfach, reproduzierbar und auch gut automatisierbar.A particularly preferred form of the method according to the invention is for a HTS (high throughput screening) suitable, d. H. especially simple, reproducible and easy to automate.
Ein entscheidendes Kriterium für die Qualität eines Testverfahrens (Assays), insbesondere für ein HTS, ist das "signal-to-noise-ratio", das Verhältnis zwischen den niedrigen Meßsignalen und dem durchschnittlichen Hintergrundrauschen (ohne Signal). Dort sollte ein besonders großes Verhältnis angestrebt werden. Dies trifft auf die erfindungsgemäßen Verfahren zu. Diese zeigen, insbesondere in bevorzugten Ausführungsformen, ein "signal-to-noise-ratio" von ≧ 4, insbesondere ≧ 5, vorzugsweise ≧ 6 oder ≧ 10.A decisive criterion for the quality of a test procedure (assays), especially for a HTS, the "signal-to-noise ratio" is the ratio between the low measurement signals and the average background noise (without Signal). A particularly large ratio should be sought there. This is true to the method according to the invention. These show, especially in preferred embodiments, a "signal-to-noise ratio" of ≧ 4, in particular ≧ 5, preferably ≧ 6 or ≧ 10.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Kationenaustausch-Filtermembran in einem Verfahren, in dem eine chemische Reaktion unter Beteiligung von NOS stattfindet. Damit sind insbesondere enzymatische Umsetzungen, beispielsweise von Arginin, gemeint, aber auch andere Reaktionen, an denen NOS als Enzym beteiligt sein kann.Another object of the invention is the use of a Cation exchange filter membrane in a process in which a chemical Response takes place with the participation of NOS. So that are particular enzymatic reactions, for example of arginine, but also others Reactions in which NOS can be involved as an enzyme.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn das Verfahren der Messung der Aktivität der NO-Synthase und/oder der Identifizierung von NO-Synthase-Modulatoren, insbesondere Aktivatoren oder Inhibitoren dient, insbesondere, wenn es sich um ein erfindungsgemäßes Verfahren handelt, ganz besonders, wenn es sich bei den Verfahren um ein Verfahren im Rahmen eines HTS (high-throughput-screening) handelt.It is particularly preferred if the method of measuring the activity the NO synthase and / or the identification of NO synthase modulators, especially activators or inhibitors, especially when it is a inventive method is, especially if it is in the Procedure for a procedure in the context of an HTS (high-throughput screening) acts.
Die folgenden Beispiele und Abbildungen sollen die Erfindung erläutern, ohne daß der Gegenstand der Erfindung darauf beschränkt wäre.The following examples and figures are intended to illustrate the invention without the subject matter of the invention would be limited to this.
Fig. 1) zeigt das graphisch aufbereitete Ergebnis eines Screening-Assays nach Beispiel 4 und entspricht der Tabelle 3. Dabei entsprechen x- und y-Achse der alphanumerischen Einteilung einer 96-well-Mikrotiterplatte und die z-Achse den gemessenen "corrected counts per minute" (ccpm), den um Nullwert und Quenchfaktor korrigierten, im Counter gezählten radioaktiven Zerfällen pro Minute. Fig. 1) shows the graphically processed result of a screening assay according to Example 4 and corresponds to the table 3. In this case, the x- and y-axis of the alphanumeric division of a 96-well microtiter plate and the z-axis corresponding to the measured "corrected counts per minute "(ccpm), the radioactive decay counted per minute corrected for zero value and quench factor.
In einem HTS-NOS-Assay wird radioaktives Arginin als Substrat benutzt. Das Assayvolumen kann je nach Art der Mikrotiterplatte (MTP) im Bereich zwischen 25 µl und 250 µl gewählt werden. In Abhängigkeit von der benutzten Enzymquelle werden Cofaktoren und Coenzyme zugefügt. Die Inkubation der Ansätze in dieser Mikrotiterplatte (Assay-MTP) gemäß Schritt (a) wird bei Raumtemperatur vorgenommen und beträgt je nach verwendeter Enzymaktivität (units) zwischen 5 und 60 Minuten. Zum Ende der Inkubation (Schritt (a)) wird die Platte in einen Zellharvester plaziert, der mit einer MTP bestückt ist, die eine Kationenaustauschermembran als Filterboden besitzt (Filter-MTP). Alle Ansätze der Assay-MTP werden in diese Filter-MTP überführt und über eine Kationenaustauscher-Filter-Platte, einen mit Phosphatgruppen beladenen Papierfilter, abgesaugt. Die Filter-MTP wird anschließend mit Puffer oder Wasser gewaschen. Mit Hilfe dieser Vorgehensweise wird das verbliebene Substrat Arginin auf dem Kationenaustauscher gebunden, während das enzymatisch gebildete radioaktive Citrullin quantitativ ausgewaschen wird. Nach Trocknen der Filter-MTP und Zugabe von Szintillationsflüssigkeit kann das gebundene Arginin am Szintillationszähler ausgezählt werden. Eine nicht gehemmte NOS-Reaktion spiegelt sich in einer geringen Radioaktivität wieder. Eine gehemmte Enzymreaktion bedeutet, daß das radioaktive Arginin nicht umgesetzt worden ist. Das heißt, auf dem Filter befindet sich eine hohe Radioaktivität.Radioactive arginine is used as a substrate in an HTS-NOS assay. The Depending on the type of microtiter plate (MTP), the assay volume can range between 25 µl and 250 µl can be selected. Depending on the enzyme source used Added cofactors and coenzymes. The incubation of the approaches in this Microtiter plate (assay MTP) according to step (a) is at room temperature and is between 5 depending on the enzyme activity (units) used and 60 minutes. At the end of the incubation (step (a)) the plate is placed in a Zellharvester placed, which is equipped with an MTP, the one Has cation exchange membrane as filter bottom (filter MTP). All approaches of Assay MTP are transferred to this filter MTP and via a Cation exchanger filter plate, one loaded with phosphate groups Paper filter, vacuumed. The filter MTP is then washed with buffer or water washed. With the help of this procedure, the remaining substrate becomes arginine bound on the cation exchanger while the enzymatically formed radioactive citrulline is washed out quantitatively. After drying the filter MTP and addition of scintillation fluid can bind the bound arginine Scintillation counters can be counted. An uninhibited NOS reaction reflects yourself in low radioactivity. An inhibited enzyme reaction means that the radioactive arginine has not been reacted. That is, on The filter has a high level of radioactivity.
Der Assay kann mit sehr geringen Substratkonzentrationen gefahren werden (z. B. 50 nM). Auch unter diesen Bedingungen liegt das "signal to noise ratio" noch bei über 6. Bei Verwendung höherer Substratkonzentrationen kann ein Verhältnis von mehr als 10 erzielt werden. Bedingt durch dieses extrem einfache Verfahren (der Inhalt einer Assay-MTP wird nur über eine Kationenaustauscher enthaltende Filterplatte abgesaugt (in der Filter-MTP), deren Radioaktivität dann gemessen wird), können je nach vorhandener HTS-Anlage mehrere 100-tausend Verbindungen einer Library in nur wenigen Tagen gescreent werden.The assay can be run with very low substrate concentrations (e.g. 50 nM). Even under these conditions, the "signal to noise ratio" is still included above 6. When using higher substrate concentrations, a ratio of more than 10 can be achieved. Due to this extremely simple procedure (the The content of an assay MTP is only via a cation exchanger Aspirated filter plate (in the filter MTP), the radioactivity then measured depending on the existing HTS system, several 100,000 connections can be made a library can be screened in just a few days.
- - Arginin, L-[2, 3, 4-3H]-monohydrochlorid; Best.-Nr. NET-1123, NEN- arginine, L- [2, 3, 4- 3 H] monohydrochloride; Order no. NET-1123, NEN
- - CaCl2 wasserfrei; Best.-Nr. 2388.1000; Merck- CaCl 2 anhydrous; Order no. 2388.1000; Merck
- - 1.4-Dithiothreitol (DTT), Best.-Nr. 708984; ROCHE- 1.4-Dithiothreitol (DTT), order no. 708984; ROCHE
- - Na2EDTA-Dihydrat; Best.-Nr. 03680; FLUKA- Na 2 EDTA dihydrate; Order no. 03680; FLUKA
- - HEPES, Best.-Nr. H-3375; SIGMA- HEPES, order no. H-3375; SIGMA
- - NADPH, tetrasodium salt; Best.-Nr. 1585363; ROCHE- NADPH, tetrasodium salt; Order no. 1585363; ROCHE
- - TRIS; BEST.-Nr. 93349; FLUKA- TRIS; ORDER NO. 93349; FLUKA
Enzym-Präparationspuffer: 50 mM Tris-HCl mit 1 mM EDTA: Der pH des
Puffers wird bei 4°C auf 7,4 eingestellt.
Inkubationspuffer (-medium): 50 mM HEPES mit 1 mM EDTA; 1,25 mM CaCl2 Enzyme preparation buffer: 50 mM Tris-HCl with 1 mM EDTA: The pH of the buffer is adjusted to 7.4 at 4 ° C.
Incubation buffer (medium): 50 mM HEPES with 1 mM EDTA; 1.25 mM CaCl 2
und 1 mM Dithiothreitol.
Der pH des Puffers wird bei 25°C auf 7,4
eingestellt.
Waschmedium: H2 and 1 mM dithiothreitol.
The pH of the buffer is adjusted to 7.4 at 25 ° C.
Washing medium: H 2
OO
Als Ausgangsgewebe werden Ratten-Cerebelli benutzt. Pro Rattenkleinhirn wird
1 ml Enzympräparationspuffer (4°C) hinzugegeben. Die Tiere werden betäubt und
getötet, das Gehirngewebe, das Cerebellum, wird herauspräpariert und mit einem
Polytron-Homogenisierer für 1 min bei 6000 U/min aufgeschlossen.
↓
Zentrifugation bei 4°C für 15 min bei 20 000 g
↓
Überstand abdekantieren und bei -80°C portioniert einfrieren (Niederschlag
verwerfen).Rat cerebelli are used as the starting tissue. 1 ml enzyme preparation buffer (4 ° C) is added per rat cerebellum. The animals are anesthetized and killed, the brain tissue, the cerebellum, is dissected out and digested with a Polytron homogenizer for 1 min at 6000 rpm.
↓
Centrifugation at 4 ° C for 15 min at 20,000 g
↓
Decant the supernatant and freeze it in portions at -80 ° C (discard precipitate).
Der nNOS-haltige Gewebeüberstand ist unter diesen Lagerungsbedingungen lange stabil, sollte aber nur einmal aufgetaut und nicht wieder eingefroren werden.The nNOS-containing tissue supernatant is long under these storage conditions stable, but should only be thawed once and not frozen again.
Verwendet werden 96-well MTP mit einer "Well"-Kapazität von ≦ 250 µl Pipettierreihenfolge, siehe Tabelle 1: 96-well MTP with a "well" capacity of ≦ 250 µl are used Pipetting order, see table 1:
Nach beendetem Pipettiervorgang wird ein Deckel auf diese MTP (Assay-MTP) gelegt. Inkubation bei 25°C, was der Raumtemperatur (RT) entspricht, für 5-60 min. je nach Menge und Aktivität des eingesetzten Enzyms.After the pipetting process has been completed, a lid is placed on this MTP (assay MTP) placed. Incubate at 25 ° C, which corresponds to room temperature (RT), for 5-60 min. depending on the amount and activity of the enzyme used.
Anschließend wird der Inhalt der Assay-MTP z. B. mit Hilfe eines 96-well Cell- Harvesters in eine 96-well Kationenaustauscher MTP (Filter-MTP) transferiert und abgesaugt. Es schließt sich eine einmalige Wäsche mit 200 ml H2O (aus einer Wanne) an.Then the content of the assay MTP z. B. with the help of a 96-well cell harvester in a 96-well cation exchanger MTP (filter MTP) and suctioned off. This is followed by a single wash with 200 ml H 2 O (from a tub).
Dann wird die Platte für 1 h bei 60°C im Trockenschrank getrocknet. Nun wird die Bodenseite der Filter-MTP von unten her exakt mit einem "back seal" versiegelt. Danach werden pro weIl 35 µl Szintillator hinzupipettiert. Ferner wird nunmehr die Plattenoberseite mit einem "top seal" versiegelt. Nach 1 h Wartezeit kann die Platte am β-counter ausgemessen werden (Messung kann auch sehr viel später erfolgen, da das Meßsignal stabil bleibt).The plate is then dried in a drying cabinet at 60 ° C. for 1 h. Now the Bottom side of the filter MTP sealed exactly with a "back seal" from below. Then 35 µl of scintillator are pipetted into each. Furthermore, the Top of the plate sealed with a "top seal". After a waiting time of 1 h the plate can be measured at the β-counter (measurement can also take place much later, since the measurement signal remains stable).
Im HTS-Betrieb empfiehlt es sich, das Inkubationsmedium, NADPH- und Enzymlösung vor Beginn des Pipettierschrittes zu vereinen, um nicht drei separate Pipettierungen vornehmen zu müssen, die zeitaufwendiger sind. Das Assay- Volumen kann bei gleichen Konzentrationen auch verkleinert werden.In HTS operation it is recommended to use the incubation medium, NADPH and Combine enzyme solution before the start of the pipetting step, so as not to separate three Having to do pipetting that is more time consuming. The assay Volume can also be reduced at the same concentrations.
Verwendet wurden:Were used:
Testsubstanzen: 1 × 10-5 M im Ansatz
Interner Standard: 7-Nitroindazol, 1 × 10-5 M im Ansatz
NADPH:. 0,5 mM im Ansatz
[3H] Substrat: 50 nM im Ansatz
Inkubationszeit: 30 min bei RaumtemperaturTest substances: 1 × 10 -5 M in the batch
Internal standard: 7-nitroindazole, 1 × 10 -5 M in the batch
NADPH :. 0.5 mM in the approach
[ 3 H] Substrate: 50 nM at the start
Incubation time: 30 min at room temperature
Alle anderen Parameter und Verfahrensschritte wie zuvor aufgeführt (siehe Beispiel 4).All other parameters and process steps as previously listed (see example 4).
Die Tabelle 3 zeigt eine Versuchsserie, in der 80 Substanzen getestet worden sind (Positionen A2-A11; B2-B11; C2-C11; D2-D11; E2-E11; F2-F11; G2-G11 und H2- H11). Dabei entspricht die alphanumerische Einteilung der einer 96-well- Mikrotiterplatte und es werden die gemessenen "corrected counts per minute" ccpm, die um Nullwert und Quenchfaktor korrigierten, im Counter gezählten radioaktiven Zerfälle pro Minute, angegeben.Table 3 shows a test series in which 80 substances have been tested (Positions A2-A11; B2-B11; C2-C11; D2-D11; E2-E11; F2-F11; G2-G11 and H2- H11). The alphanumeric division corresponds to that of a 96-well Microtiter plate and the measured "corrected counts per minute" ccpm, the radioactive counted in the counter corrected for zero value and quench factor Decays per minute.
Komplette Ansätze, jedoch ohne Enzym, geben den 100% [3H]Arginin- Ausgangsgehalt an ("Max" = Positionen A1; B1; C1; A12; B12; C12). Complete batches, but without enzyme, give the 100% [3H] arginine Starting salary at ("Max" = positions A1; B1; C1; A12; B12; C12).
Komplette Ansätze (mit Enzym) zeigen den Umsatz zu [3H]Citrullin und NO dadurch an, daß der Gehalt an [3H]Arginin abgenommen hat ("Min" = minimaler [3H]Arginin- Gehalt = ungehemmte Enzymreaktion; Positionen D1, E1; F1; D12; E12 und F12). Dies kann jedoch bei NOS-Aktivatoren übertroffen werden, da dort noch mehr Arginin umgesetzt wird als bei unmoduliertem Enzym, so daß noch weniger Radioaktivität auf dem Filter verbleibt.Complete batches (with enzyme) indicate the conversion to [ 3 H] citrulline and NO by the fact that the content of [3H] arginine has decreased ("Min" = minimal [ 3 H] arginine content = uninhibited enzyme reaction; positions D1, E1; F1; D12; E12 and F12). However, this can be exceeded with NOS activators, since even more arginine is converted there than with unmodulated enzyme, so that even less radioactivity remains on the filter.
Als interner Standard (Referenz) wurde der NOS-Inhibitor 7-Nitroindazol in einer
Konzentration von 1 × 10-5 M verwendet ("Ref" = G1; H1; G12 und H12).
As an internal standard (reference), the NOS inhibitor 7-nitroindazole was used in a concentration of 1 × 10 -5 M ("Ref" = G1; H1; G12 and H12).
Von den getesteten 80 Verbindungen zeigen 3 eine NOS-Inhibition (Positionen A2; C2 und B7; N = 1)3 of the 80 compounds tested show NOS inhibition (Positions A2; C2 and B7; N = 1)
Der Mittelwert für die Referenzsubstanz 7-Nitroindazol (= interner
Standard, 1 × 10-5 M im Ansatz) lautet:
The mean value for the reference substance 7-nitroindazole (= internal standard, 1 × 10 -5 M in the batch) is:
x = 12 697 ± 1050 ccpm (x ± SD; N = 4)x = 12 697 ± 1050 ccpm (x ± SD; N = 4)
Diese 7-Nitroindazol Konzentration ist bewußt so gewählt worden, daß sie sich im Bereich von ca. 50% Hemmung befindet.This 7-nitroindazole concentration was deliberately chosen to be is in the range of approximately 50% inhibition.
Der Mittelwert der "Max"-Daten (ohne Enzym, Bezugswert. für 100%
[3H]Arginin) stellt sich wie folgt dar:
The mean of the "Max" data (without enzyme, reference value for 100% [ 3 H] arginine) is as follows:
x = 19 746 ± 607 cepm (x ± SD; N = 6)x = 19 746 ± 607 cepm (x ± SD; N = 6)
Der Mittelwert der "Min"-Daten (ungehemmte Enzymreaktion) ergibt.
folgende Radioaktivität:
The mean of the "Min" data (uninhibited enzyme reaction) gives. following radioactivity:
x = 3158 ± 334 ccpm (x ± SD; N = 6)x = 3158 ± 334 ccpm (x ± SD; N = 6)
Als Gesamt-Meßstrecke stehen somit in diesem Beispiel 16 588 ccpm (19 746 - 3158 ccpm) zur Verfügung.In this example, 16 588 ccpm (19th 746 - 3158 ccpm).
Claims (44)
- a) Inkubation der NO-Synthase mit markiertem Arginin als Substrat in einem Reaktionsgefäß,
- b) Trennung des markierten Arginins von dem gegebenenfalls als Produkt der enzymatischen Reaktion entstandenen, markierten Citrullin, zu einem Zeitpunkt, zu dem die Konzentration an Citrullin ansteigt,
- c) Messung der Menge an jeweils abgetrenntem Arginin, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung über eine Filterplatten- Membran erfolgt.
- a) incubation of the NO synthase with labeled arginine as substrate in a reaction vessel,
- b) separation of the labeled arginine from the labeled citrulline possibly formed as a product of the enzymatic reaction at a point in time at which the concentration of citrulline increases,
- c) Measurement of the amount of arginine separated in each case, characterized in that the separation takes place via a filter plate membrane.
- a) Inkubation einer zu testenden Substanz mit NO-Synthase und markiertem Arginin als Substrat in einem Reaktionsgefäß,
- b) Trennung des markierten Arginins von dem gegebenenfalls als Produkt der enzymatischen Reaktion entstandenen, markierten Citrullin, zu einem Zeitpunkt, zu dem die Konzentration an Citrullin ansteigt,
- c) Messung der Menge an jeweils abgetrenntem Arginin, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung über eine Filterplatten-Membran erfolgt.
- a) incubation of a substance to be tested with NO synthase and labeled arginine as substrate in a reaction vessel,
- b) separation of the labeled arginine from the labeled citrulline possibly formed as a product of the enzymatic reaction at a point in time at which the concentration of citrulline increases,
- c) Measurement of the amount of arginine separated in each case, characterized in that the separation takes place via a filter plate membrane.
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