DE10034729A1

DE10034729A1 - Regulatorische Sequenzen aus meristematischen Zellen

Info

Publication number: DE10034729A1
Application number: DE2000134729
Authority: DE
Inventors: Nikolaus Theres
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-07-17
Filing date: 2000-07-17
Publication date: 2002-02-28
Also published as: AU2001276327A1; WO2002006487A3; WO2002006487A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die eine spezifische Expression von Transgenen in meristematischen Zellen erlauben.

Description

Zur genetischen Modifikation von monokotylen und dikotylen Pflanzen sind verschiedene Verfahren beschrieben worden (Potrykus, 1991, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol., 42: 205-226). Neben der Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens kann DNA durch Transformation von Protoplasten, Mikroinjektion, Elektroporation oder ballistische Methoden in Pflanzenzellen eingeführt werden. Die Expression der eingeführten Gene in Pflanzenzellen erfordert neben den transkribierten und in Proteine übersetzten Abschnitten weitere Bereiche, die der Regulation der Transkription dienen. Die Gesamtheit aller DNA- Abschnitte, die die Spezifität der Transkription eines Gens regulieren, wird als Promotor des Gens bezeichnet. Innerhalb von Promotoren werden verschiedene regulatorische Elemente voneinander unterschieden: In der Region um die Transkriptionsinitiationsstelle bis ungefähr 100 bp stromaufwärts liegen Elemente, an die die RNA-Polymerase II zusammen mit den basalen Transkriptionsfaktoren binden kann (z. B. TATA-Box, CAAT-Box, GC-Boxen). Diese Elemente werden in vielen Fällen benötigt, um die generelle Funktionsfähigkeit eines Promotors zu gewährleisten. Andere Sequenzelemente, die Enhancer- und Silencer-Elemente, die für die Regulierbarkeit eines Promotors verantwortlich sind, können sich in variablen Entfernungen vor dem Transkriptionsstart, aber auch stromabwärts in Exons, Introns oder 3' des transkribierten Bereiches befinden. An solche Enhancer- und Silencer-Elemente binden spezifische DNA- bindende Proteine, die die Transkriptionsrate durch Interaktion mit dem RNA-Polymerase- Komplex erhöhen oder verringern. Die Synthese bzw. die Aktivität dieser spezifischen Transkriptionsfaktoren ist oft reguliert, so dass auch die Transkription der Gene, die die Enhancer- oder Silencer-Elemente in ihren Promotoren besitzen, durch die Transkriptionsfaktoren entsprechend reguliert werden z. B. gewebespezifisch, entwicklungsspezifisch, etc.

Zur Expression von Fremdgenen in transgenen Pflanzen können prinzipiell zwei Arten von Promotoren benutzt werden: Zum einen können starke, mehr oder weniger konstitutive Promotoren eingesetzt werden, mit dem Resultat, dass sich die exprimierten Proteine in den meisten Geweben und Zellarten der Pflanzen finden. Zu diesem Zweck wird häufig der 35S- Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (cauliflower mosaic virus: CaMV) verwendet. Nachteilig am CaMV 35S-Promotor ist seine reduzierte Aktivität in Pflanzenmeristemen.

Häufig ist eine konstitutive Expression aber unerwünscht, z. B. wenn die exprimierten Proteine dem normalen Stoffwechsel der Zellen schaden. Zusätzlich bedeutet die Expression überflüssiger Proteine unnötige Kosten für den Stoffwechsel der Pflanze. Aus diesen Gründen wird häufig versucht, die Expression von Fremdgenen so zu regulieren, dass sie auf die gewünschten Gewebe und/oder Entwicklungsstadien begrenzt bleibt. So werden z. B. zur Erzeugung männlicher Sterilität letale Proteine in den Antheren exprimiert. Diese Technologie erfordert zwingend einen spezifischen Promotor, der die Expression der entsprechenden Proteine auf die Antheren der Wirtspflanze beschränkt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, regulatorische Sequenzen bereitzustellen, die eine spezifische Expression von Transgenen in meristematischen Zellen erlauben, insbesondere in den Meristemen der Blattachseln und in den Abscissionszonen.

Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert.

Fig. 1 zeigt schematisch die T-DNA-Konstrukte, die zur Komplementation der ls1-Mutante der Tomate verwendet wurden. LB bedeutet linke Grenze, NPT II bedeutet Kanamycin- Resistenzgen, RS1 und RS2 bedeuten regulatorische Sequenzen, Ls-ORF bedeutet offenes Leseraster des ls1-Gens und RB bedeutet rechte Grenze.

Fig. 2 zeigt schematisch die DNA-Konstrukte, die zur Analyse des Expressionsmusters des GUS-Gens unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und RS2 verwendet wurden. LB bedeutet linke Grenze, NPT II bedeutet Kanamycin-Resistenzgen, RS1 und RS2 bedeuten regulatorische Sequenzen, GUS bedeutet β-Glucuronidase, pA bedeutet Polyadenylierungssignal und RB bedeutet rechte Grenze.

Fig. 3 zeigt die T-DNA des RNAi-Konstruktes, das eingesetzt wurde, um die Bildung von Seitentrieben in der Tomate zu inhibieren. LB bedeutet linke Grenze, NPT II bedeutet Kanamycin-Resistenzgen, RS1 und RS2 bedeuten regulatorische Sequenzen, Ls-ORF bedeutet offene Leseraster des ls1-Gens und RB bedeutet rechte Grenze.

Fig. 4 zeigt die genomische DNA-Sequenz des 5'-untranslatierten Bereichs des ls1-Gens aus Lycopersicon esculentum (SEQ ID NO: 1).

Fig. 5 zeigt die genomische DNA-Sequenz des 3'-untranslatierten Bereichs des ls1-Gens aus Lycopersicon esculentum (SEQ ID NO: 2).

Die hier verwendeten Ausdrücke "Homologe" oder "homologe Sequenzen" bezeichnen Nukleinsäuresequenzen mit signifikanter Ähnlichkeit zur Vergleichssequenz oder Teilen davon. Als homologe Sequenzen gelten somit Nukleinsäuresequenzen, die mit den Vergleichssequenzen oder Teilen dieser Sequenzen unter stringenten oder wenig stringenten Bedingungen hybridisieren (zu stringenten und wenig stringenten Bedingungen siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN D-87969-309-6). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 × SSC bei 65°C (alternativ in 50% Formamid und 4 × SSC bei 42°C), gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 × SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 × SSC bei 37°C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 × SSC bei Raumtemperatur. Als homologe Sequenzen sollen des weiteren Nukleinsäuresequenzen oder Teile davon gelten, die unter Zuhilfenahme des Similaritätsalgorithmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) eine signifikante Ähnlichkeit mit Vergleichssequenzen aufweisen. Als signifikant ähnlich werden, wie hier verwendet, Sequenzen bezeichnet, die z. B. unter Verwendung von Standardparametern im BLAST-Service des NCBI ein Signifikanzniveau (E-Value oder Probability) von P < 10^-5 aufweisen, wenn Sie mit den Vergleichssequenzen verglichen werden.

Der hier verwendete Ausdruck "Derivate" bezeichnet Nukleinsäuresequenzen, die gegenüber der Vergleichssequenz Modifikationen in Form von einer oder mehreren Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen. Derivat bedeutet ferner, daß eine Nukleinsäuresequenz zusammengesetzt ist aus einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten einer regulatorischen Sequenz.

Der hier verwendete Ausdruck "Fragmente" bezeichnet Teile von Nukleinsäuresequenzen, solange sie die biologische Funktion der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäuresequenzen aufweisen.

Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verbunden" bedeutet, daß eine regulatorische Sequenz wie ein Promotor, Enhancer oder Silencer die Expression eines Gens steuert.

Der hier verwendete Ausdruck "Promotor" bezeichnet die Gesamtheit aller DNA-Abschnitte, die die Spezifität des Transkriptionsmusters eines Gens bestimmen.

Der hier verwendete Ausdruck "Enhancer" bezeichnet einen DNA-Abschnitt, der als Teil eines Promotors die Transkription des mit dem Promotor verbundenen Transkriptes erhöht, sei es generell oder aber zeitlich, gewebespezifisch oder anderweitig reguliert.

Der hier verwendete Ausdruck "Silencer " bezeichnet einen DNA-Abschnitt, der als Teil eines Promotors die Transkription des mit dem Promotor verbundenen Transkriptes erniedrigt, sei es generell oder aber zeitlich, gewebespezifisch oder anderweitig reguliert.

Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren, z. B. Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Chromosomen, Bakteriophagen, Viren, Retroviren.

Der hier verwendete Ausdruck "transgene Pflanze" betrifft Pflanzen, die mittels rekombinanter Gentechnik und/oder mikrobiologischen Verfahrens und nicht mittels herkömmlicher Züchtungsverfahren hergestellt wurden.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die regulatorischen Nukleinsäuresequenzen (im folgenden auch als Promotor und/oder Enhancer und/oder Silencer bezeichnet), die natürlicherweise in der Tomate die Expression des Lateral suppressor (Ls) Gens steuern. Diese erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen sind in SEQ ID NO: 1 (auch als RS1 bezeichnet) und SEQ ID NO: 2 (auch als RS2 bezeichnet) aufgeführt. Ferner betrifft die Erfindung Fragmente oder Homologe oder Derivate der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, die die biologische Funktion eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers besitzen. Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die mit den Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 hybridisieren und die biologische Form eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers besitzen. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit den Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 hybridisieren und die biologische Form eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers besitzen.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate, können natürlichen Ursprungs sein oder künstlich hergestellt worden sein.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate, eignen sich z. B. zur Identifizierung und Isolierung von zum Ls-Gen homologen Genen in anderen Organismen und/oder von zur SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 verwandten regulatorischen Sequenzen in z. B. Tomate oder anderen Organismen mit Hilfe spezieller Hybridisierungs- oder Screening-Verfahren, z. B. als Sonde für das Screening in DNA-Bibliotheken mit Hilfe der Hybridisierung an einzelsträngige Nukleinsäuren ähnlicher Basenabfolge.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate, eignen sich ferner zur spezifischen Steuerung der Expression von Genen in Organismen oder Zellen, bevorzugt zur spezifischen Steuerung von Genen in meristematischen Zellen, insbesondere in den Meristemen der Blattachseln und in den Abscissionszonen.

Die Erfindung betrifft ferner transgene Pflanzen mit stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe mit der biologischen Funktion eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers, und einer mit diesen Nukleinsäuresequenzen funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsäuresequenz.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit veränderter Genexpression, umfassend das stabile Integrieren einer regulatorischen Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate mit der biologischen Funktion eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers, und einer mit diesen Sequenzen funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsäuresequenz in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben sowie Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe zu Pflanzen.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate, können in Vektoren, Expressionssystemen oder Pflanzen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen oder tierischen Zellen oder Mikroorganismen zur Veränderung der Expressionsmuster verschiedenster Genprodukte verwendet werden. Die Expression der Genprodukte kann dabei gegenüber Ihrer natürlichen Expression sowohl verstärkt als auch verringert sein. Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen funktionell verbundenen Nukleinsäuresequenzen können sowohl in Sense- als auch in Antisense-Orientierung vorliegen.

Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmenten oder Homologen oder Derivaten, funktionell verbundenen Nukleinsäuren können endogene oder exogene genomische DNA-Abschnitte oder cDNAs oder deren Fragmente oder Derivate sein. Endogen bedeutet dabei, daß die Nukleinsäuresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird, z. B. eine Nukleinsäuresequenz aus Tomate wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Tomate integriert. Exogen bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus stammt, z. B. eine Nukleinsäuresequenz aus Tomate wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in z. B. Arabidopsis thaliana integriert. Die Nukleinsäuresequenzen können gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate, können für die Regulation der Expression von verschiedenen Genen oder Genfragmenten in meristematischen Zellen, insbesondere in den Meristemen der Blattachseln und/oder in den Abscissionszonen verwendet werden.

Dabei kann einerseits die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen unterdrückt oder andererseits verstärkt sein.

Bei vielen Nutzpflanzen ist die Bildung von Seitentrieben vom Standpunkt der landwirtschaftlichen Nutzung her aus verschiedenen Gründen unerwünscht. Die jungen Seitentriebe sind zunächst "Sink"-Organe (Verbraucher-Organe) und reduzieren daher den Ertrag am Hauptsproß. Stark verzweigte Sproßsysteme stellen für eine mechanische Bearbeitung (z. B. maschinelle Ernte) oft ein kaum überwindbares Hindernis dar. Die Früchte an Haupt- und Seitentrieben reifen zu unterschiedlichen Zeitpunkten, was eine gemeinsame Ernte verhindert. Bei Nutzhölzern entstehen an Verzweigungsstellen sogenannte Knoten, die bei der Verarbeitung entfernt werden müssen.

So ist z. B. bei der Tomate, dem Tabak, dem Raps, dem Wein, dem Getreide und Nutzhölzern wie z. B. Kiefer und Buche eine Reduktion der Seitentriebbildung von hohem Vorteil, konnte aber bisher nicht in leistungsfähigen Zuchtsorten realisiert werden.

Weiterhin ist auch die Inhibition der Ausbildung von Abscissionszonen in einer Reihe von Pflanzen von Interesse. So führt z. B. der vorzeitige Abwurf von Früchten etwa bei Zitruspflanzen, Kirschen, Pfirsichen oder Johannisbeeren zu Ertragsverlusten, die sich verhindern ließen, wenn keine Abscissionszonen ausgebildet würden. Zum Beispiel ist auch eine Inhibition der Ausbildung von Abscissionszonen in der Tomatenpflanze von Vorteil. Werden die Abscissionszonen nicht ausgebildet, löst sich die Frucht bei der Ernte ohne Reste des Fruchtstiels und der Kelchblätter von der Pflanze. Diese Eigenschaft ist erwünscht, wenn die Tomaten maschinell geerntet und anschließend zu Produkten wie Tomatenmark verarbeitet werden, da die Kelchblätter und Fruchtstiele die Qualität der Tomatenprodukte verschlechtern.

Die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen kann durch die zell- oder gewebepezifische Expression von mit den erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 funktionell verbundenen Genen oder anderer funktionellen Nukleinsäuresequenzen unterdrückt werden, wobei die zell- oder gewebepezifische Expression durch die erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 hervorgerufen wird. Zu diesem Zweck können alle Gene und/oder andere funktionellen Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen hemmen können.

Bevorzugte mit den regulatorischen Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 funktionell verbundenen Nukleinsäuresequenzen können den Zellzyklus regulieren, die Konzentration von Pflanzenhormonen oder die Reaktion auf Pflanzenhormone beeinflussen, zytotoxisch sein, die Meristemanlagen und/oder deren Entwicklung beeinflussen, zur Bildung von Proteinen führen oder den Zusammenhalt von Zellen beeinflussen.

Beispielsweise können solche Sequenzen verwendet werden, die die Zellteilungsaktivität in den Blattachseln und/oder Abscissionszonen spezifisch oder präferentiell unterdrücken. Hierzu kann zum Beispiel eine dominant negative Form der Cdc2a-Kinase unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und RS2 exprimiert werden. Als Folge davon werden meristematische Zellen in die G0-Phase übergehen und ihre Zellteilungsaktivität einstellen. Ebenso kann beispielsweise das Cyclin D-Gen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 exprimiert werden. Dies führt zur Inaktivierung des endogenen Cylin D-Gens wodurch die Teilungsaktivität der Zellen herabgesetzt wird und somit das Auswachsen von Seitentrieben und/oder die Ausbildung von Abscissionszonen vermindert wird oder vollständig unterbleibt. Gleiches bewirkt auch die Expression einer dominant-negativen Form des Cyclin D-Gens.

Weiterhin kann die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen durch gezielte Expression von Genen unterdrückt werden, die die Konzentration von bestimmten Pflanzenhormonen in den betreffenden Geweben verändern. So wird die Dormanz (Ruhephase) von Achselknospen über die Konzentration des Pflanzenhormons Abscissinsäure (ABA) gesteuert. Eine lokale Erhöhung der ABA-Syntheserate kann durch spezifische oder präferentielle Expression des die Syntheserate limitierenden Enzyms 9-cis-Epoxycarotenoid- Dioxygenase unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und RS2 erreicht werden. Dies führt zu einer Unterdrückung der weiteren Entwicklung der Achselknospen.

Außerdem kann die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen durch lokale Expression von zytotoxischen Proteinen in den entsprechen Zellen unterdrückt werden, z. B. durch die Verwendung eines Barnase-Gens unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und RS2. Weiterhin können z. B. Pflanzen-Proteinaseinhibitoren ohne Signalpeptid entsprechend benutzt werden.

Um die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen zu unterdrücken, können ferner Sequenzen von Genen verwendet werden, die zur Etablierung bzw. zur Aufrechterhaltung des meristematischen Zustandes benötigt werden. Dazu kann beispielsweise die kodierende Sequenz des Ls-Gens in Sense- oder Antisense-Orientierung unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 verwendet werden. Zu diesem Zweck können auch Fragmente oder Derivate der Ls-Gensequenz verwendet werden. Dadurch wird die Synthese des endogenen Proteins, das vom Ls-Gen codiert wird, verhindert. Die gezielte Unterdrückung einer Genaktivität in pflanzlichen Zellen durch Einführung von Antisense- oder Sense-Konstrukten ist ein übliches Verfahren, das in vielen Fällen erfolgreich eingesetzt worden ist (Gray et al., 1992, Plant Mol. Biol., 19: 69-87).

Die Unterdrückung von Genaktivitäten durch doppelsträngige RNA-Interferenz wird in Chuang und Meyerowitz, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4985-4990 für verschiedene Gene beschrieben. Hier werden RNA-Moleküle gebildet, die sich aufgrund von inverser Anordnung zweier gleicher Sequenzen zu doppelsträngiger RNA falten und zur Inaktivierung von Genen mit ausreichend homologer Sequenz führen. So kann die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen durch spezifische oder präferentielle Expression eines RNAi-Konstruktes unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und RS2 unterdrückt werden. Hierzu können z. B. Sequenzen des Ls-Gens oder des Cyclin D-Gens verwendet werden.

Ferner kann die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen durch gezielte Expression eines für diesen Zweck konstruierten Ribozyms unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen inhibiert werden.

Ferner kann die Anlage und das Auswachsen von Seitentrieben durch eine spezifische Inhibition der Aktivität von Genen unterbunden werden, deren Funktion für die Bildung von Sprossmeristemen notwendig ist. So kann die Bildung von Seitentrieben zum Beispiel durch eine spezifische oder präferentielle Expression des Shoot Meristemless(STM)-Gens z. B. aus Arabidopsis (Clark et al. 1996, Development, 122: 1567-1575) in Sense- oder Antisense- Orientierung unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und RS2 unterdrückt werden. Alternativ dazu kann die Bildung von Seitentrieben auch durch spezifische Expression eines vom STM-Gen abgeleiteten RNAi-Konstrukts unterdrückt werden.

Während der Abscission von Pflanzenteilen werden Enzyme aktiviert, die Bestandteile der Zellwände spalten. Ferner kann eine spezifische oder präferentielle Inhibition der Synthese dieser Enzyme durch Antisense-, RNAi- oder Cosuppression unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 die Tendenz zur Abszission verringern oder aufheben. Zu diesem Zweck kann z. B. die Synthese der Gene Polygalacturonase oder Cellulase (Endo-beta-1,4- Glucanase) unterdrückt werden. Gleiches wird erreicht durch die Inhibition von allen positiven Regulatoren der Abszission, wie z. B. von Genen, die für die Ethylen- oder Abscissinsäuresynthese oder -signaltransduktion benötigt werden. Ebenso kann hier der mutant dominante NEVERRIPE-Ethylenrezeptor unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 exprimiert werden.

Andererseits können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate, für die Regulation der Expression von verschiedenen Genen oder Genfragmenten in meristematischen Zellen, insbesondere in den Meristemen der Blattachseln und/oder in den Abscissionszonen, verwendet werden, um die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen zu verstärken.

Im Gegensatz zu den oben genannten Nutzpflanzen werden bei Zierpflanzen (z. B. Geranien, Fuchsien, Chrysanthemen, Weihnachtsstern) und anderen Nutzpflanzen, z. B. der Kartoffel oder bodendeckende Pflanzen wie Weidegräser, häufig Phänotypen bevorzugt, die aufgrund einer starken Entwicklung der Seitentriebe einen buschigen Wuchs zeigen. Um diese Wuchsformen zu erzeugen, werden die Pflanzen heute entweder dekapitiert, was das Austreiben der Seitenachsen fördert, oder mit bestimmten Chemikalien behandelt. Diese Praxis ist mit einem beträchtlichen finanziellen Aufwand verbunden. Die Herstellung von transgenen Sorten mit buschigen Wuchsformen würde in diesen Fällen eine kostengünstigere Alternative darstellen.

Eine verstärkte Ausbildung von Abscissionszonen kann z. B. bei Zierpflanzen dazu genutzt werden, dass die Blüten nach Abblühen von selbst abfallen und nicht wie bei vielen Balkon- und Gartenpflanzen manuell entfernt werden müssen. Falls dies unterbleibt, wird oft die Bildung neuer Blüten unterdrückt.

Beispielsweise können ruhende Achselknospen durch eine Förderung der Zellteilungsaktivität zum Auswachsen angeregt werden. Zu diesem Zweck kann z. B. das Cyclin D-Gen unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 spezifisch oder präferentiell in den Achselknospen exprimiert werden. Da die Expressionsrate des Cyclin D-Gens die Wachstumsgeschwindigkeit von Trieben kontrolliert, treiben die so stimulierten Achselmeristeme schneller aus.

Weiterhin kann das Austreiben der Achselknospen durch die Wirkung von verschiedenen Pflanzenhormonen beeinflusst werden. So läßt sich durch die spezifische oder präferentielle Expression z. B. des Isopentenyltransferase-Gens (IPT-Gen) unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 die Konzentration von Cytokinin im Bereich der Blattachseln erhöhen, was zu einem Austreiben der Achselknospen führt. Dieser Effekt ist auf den Ort der Expression beschränkt.

Darüber hinaus läßt sich die Bildung von Blüten bei Zier- und Nutzpflanzen durch eine gezielte Expression von verschiedenen Meristemidentitätsgenen fördern. Eine spezifische oder präferentielle Expression z. B. des LEAFY-Gens aus Arabidopsis thaliana (Weigel et al., 1995, Nature, 377: 495-500) unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 ist geeignet, um Seitentriebe z. B. in einzelne Blüten umzuwandeln. Bei baumartigen Pflanzen, wie zum Beispiel Pappeln oder Obstbäumen, kann auf diesem Weg die normalerweise vorhandene lange vegetative Phase bis zur Bildung der ersten Blüten verkürzt werden. Durch Verwendung der regulatorischen Elemente RS1 und/oder RS2 können die Expression dieser Gene auf die gewünschten Gewebe beschränkt und somit unerwünschte Nebeneffekte verhindert werden.

Um die Abscission von Blüten zu fördern, können Gene, die direkt am Abscissionsprozess beteiligt sind, in Sense-Orientierung unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 spezifisch oder präferentiell in den Abscissionszonen exprimiert werden. Beispiele hierfür sind das EIN3- und das ERF1-Gen aus Arabidopsis (Jenkins et al., 1998, Genes & Dev 12: 3703-3714). Ebenso können Zellwand auflösende Gene, wie Cellulasen oder Poly- Galakturonasen, unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 exprimiert werden.

Ferner können die erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 in Verbindung mit den kodierenden Sequenzen des Ls-Gens benutzt werden, um die Bildung von Seitentrieben und/oder Abscissionszonen zu fördern. Zu diesem Zweck kann die kodierende Sequenz des Ls-Gens oder Homologe oder Derivate davon in Sense-Orientierung unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und/oder RS2 spezifisch oder präferentiell exprimiert werden. Hierbei können die erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen auch mit weiteren regulatorischen Sequenzen, zum Beispiel dem Translations-Enhancer Omega aus dem Tabakmosaikvirus (Sleat et al., 1987, Gene, 60: 217-226), kombiniert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe und eine damit funktionell verbundene Nukleinsäuresequenz.

Zur spezifischen oder präferentiellen Expression in Pflanzen oder Pflanzenzellen können genomische DNA-Abschnitte oder cDNAs oder Fragmente oder Derivate davon in Vektoren mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmenten oder Homologen oder Derivaten, funktionell kombiniert werden. Für die Transformation von Pflanzen oder Pflanzenzellen ist eine Vielzahl von Vektoren beschrieben worden. So wurden zum Beispiel für die Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation die Vektoren pBI (Jefferson et al., 1987, EMBO J., 6: 3901-3908) und pGPTV (Becker et al., 1992, Plant Mol. Biol., 20: 1195-1197) erfolgreich eingesetzt.

Verfahren zur genetischen Modifikation sind sowohl für dikotyle als auch für monokotyle Pflanzen beschrieben worden. Neben der Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens kann DNA z. B. durch Transformation von Protoplasten, Mikroinjektion, Elektroporation oder ballistische Methoden in Pflanzenzellen eingeführt werden. Zur Selektion von transformierten Pflanzenzellen kann die einzuführende DNA mit einem Selektionsmarker gekoppelt werden, der den Zellen eine Resistenz gegenüber Antibiotika (z. B. Kanamycin, Hygromycin, Bleomycin) verleiht. Aus den transformierten Pflanzenzellen können dann in einem geeigneten Selektionsmedium ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen werden mit üblichen molekularbiologischen Methoden auf Anwesenheit und Intaktheit der eingeführten DNA getestet. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und wird an die Nachkommen vererbt.

Folgende Beispiele erläutern die Erfindung. Die Beispiele sind nicht einschränkend aufzufassen. Wenn nicht anders angegeben wurden molekularbiologische Standardmethoden benutzt, wie von Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben. Southern-Hybridisierungen wurden in 6 × SSPE (0,9 M NaCl, 60 mM NaH₂PO₄ × H₂O, 6 mM EDTA) 0,1% BSA, 0,1% Ficoll, 0,1% PVP, 0,5% SDS, 100 µg/ml Kalbsthymus-DNA) mit einer Hybond N⁺ Membran (Amersham) durchgeführt.

Beispiel 1 Isolierung und Charakterisierung von Ls-Genfragmenten

Aus dem Cosmid-Klon Cosmid G (Schumacher et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 290- 295) wurde durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen SnaBI und XhoI ein DNA-Fragment von ca. 5,6 kb, das das offene Leseraster des Ls-Gens enthält, ausgeschnitten und in die EcoRI/XhoI-Schnittstellen des Plasmidvektors Bluescript SK (+) (Stratagene, USA) kloniert (pES6). In gleicher Weise wurde aus Cosmid G mit dem Restriktionsenzym Bst1107I ein DNA- Fragment von ca. 3,8 kb, das ebenfalls das offene Leseraster des Ls-Gens enthält, ausgeschnitten und in die SmaI-Schnittstelle des Plasmidvektors pGEM4Z (Promega, USA) kloniert (GSET-7). Anschließend wurden in beiden Klonen die Segmente vor und hinter dem offenen Leseraster des Ls-Gens sequenziert.

Beispiel 2 Charakterisierung der regulatorischen Sequenzen des Lateral suppressor-Gens der Tomate

Das 5,6 kb SnaBI-XhoI-Fragment des Klons pES6 wurde in die XhoI/SstI-Schnittstellen des Pflanzentransformationsvektors pGPTV-Kan (Becker et al., 1992, Plant Mol. Biol., 20, 1195- 1197) kloniert (GSET-6). Das erhaltene Plasmid wurde durch direkte Transformation in den Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 (Koncz und Shell et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 204: 383-396) eingeführt. Anschließend wurde die T-DNA des Konstruktes in Blattstücke der ls1-Mutante der Tomate nach Fillatti et al., 1987, Biotech., 5, 726-730 transformiert. Die Charakterisierung der hergestellten transgenen Pflanzen zeigte, dass das verwendete DNA- Fragment von GSET-6 in der Lage ist, die ls1-Mutante vollständig zum Wildtyp zu revertieren. Demnach enthält das 5,6 kb-SnaBI-XhoI-Fragment die zur Regulation des Ls-Gens notwendigen Sequenzen. Um den für die Funktion des Ls-Gens notwendigen DNA-Abschnitt einzuengen, wurde ebenso mit dem 3,8 kb Bst1107I-Fragment aus GSET-7 verfahren. Dieses Fragment wurde aus GSET-7 ebenfalls in die XhoI/SstI-Schnittstellen des Vektors pGPTV-Kan kloniert und dieses so erhaltene Plasmid (pTS 1/2) auf die oben beschriebene Weise in die ls1-Mutante der Tomate transformiert. Das hier verwendete DNA-Fragment umfasst das offene Leseraster des Ls-Gens, RS1 sowie 357 Bp der stromaufwärts gelegenen genomischen DNA und die Basenpaare 1-784 von RS2. In Fig. 1 ist die Lage der verwendeten DNA-Fragmente schematisch dargestellt. Unter 44 unabhängigen transgenen Pflanzen wurde in keinem Fall eine Komplementation des mutanten Phänotyps beobachtet (Tabelle 1).

Tabelle 1

Komplementation der ls1-Mutante mit verschiedenen Konstrukten

Um zu prüfen, ob während der Klonierungsschritte oder der Transformation eine Mutation in dem eingeführten DNA-Fragment aufgetreten war, wurde das entsprechende DNA-Fragment aus einer transgenen Tomatenpflanze mit Hilfe des üblichen PCR-Verfahrens mit den Primern pGPTV-FOR (5'-CCGCAACGATTGAAGGAGCC-3') und CD61-13 (5'- TTAGGGTTTTCACTCCACGC-3') amplifiziert und anschließend sequenziert. Die Sequenzanalyse zeigte keine Abweichungen zwischen dem Insert der transgenen Pflanze und der bekannten Sequenz des Cosmids G, so dass eine Mutation als Ursache für die ausbleibende Komplementation ausscheidet. Daraufhin wurde mit dem üblichen PCR-Verfahren mit den Primern 3prime-1.sst (5'-TTAGAGCTCTAGGACCATAATCAATTGCCC-3') und 3-prime- 3.sst (5'-TAGGAGCTCAGATCTAGTTGAGCAAGTAGG-3') ein DNA-Fragment amplifiziert, das die Basenpaare 925 bis 2.723 von RS2 umfasst. Das Amplikon wurde mit SstI geschnitten und in die entsprechende Schnittstelle von pTS 1/2 kloniert. Die Orientierung des Fragmentes wurde durch den Verdau des erhaltenen Plasmids mit geeigneten Restriktionsenzymen und der anschließenden Betrachtung der Restriktionsfragmente im Agarosegel festgestellt. Hierdurch wurde das Fragment in invertierter Orientierung hinter das Ls-Gen eingesetzt (pTS 10). Weiterhin wurde ein mit den Primern 3prime-1.xho (5'- TTACTCGAGTAGGACCATAATCAATTGCCC-3') und 3prime-3.xho (5'- TAGCTGGAGAGATCTAGTTGAGCAAGTAGG-3') amplifiziertes Fragment mit XhoI geschnitten und ebenfalls in die entsprechende Schnittstelle von pTS 1/2 kloniert und somit vor den Promotor des Ls-Gens positioniert (pTS 11). Auch die Orientierung dieses Fragmentes wurde durch den Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen festgestellt. Die relative Anordnung der eingesetzten DNA-Fragmente ist in Fig. 1 schematisch dargestellt. Beide Konstrukte wurden durch die oben beschriebene Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation in die ls1-Mutante eingeführt. Transgene Pflanzen, die das Konstrukt pTS 10 enthielten, zeigten zu 69,0%, pTS 11 enthaltende Pflanzen zu 82,4% eine vollständige Wiederherstellung des Wildtyp-Phänotyps (siehe Tabelle 1). Da die invertierte Orientierung der Basenpaare 925 bis 2.723 aus RS2 in pTS 10 und deren veränderte Position in pTS 11 die korrekte Funktion eines möglichen zusätzlichen Exons in diesem Sequenzsegment nicht zulassen, enthielt die RS2-Sequenz überraschenderweise ein für die Ls-Funktion essentielles regulatorisches Element.

Beispiel 3 Expression des β-Glucuronidasegens unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen RS1 und RS2

Die Funktion der regulatorischen Sequenzen 1 (RS1) und 2 (RS2) wurde durch Reportergen- Konstrukte getestet. Zu diesem Zweck wurde ein 1.990 Bp langes DNA-Fragment, das die vollständige RS1-Sequenz beinhaltet, durch das übliche PCR-Verfahren mit den Primern LsProm-1 (5'-AACCAAAGGATCCTAACATATC-3') und LsProm-2 (5'- GCTCTAGAGGTAAGGCAGCCACATTTTG-3') amplifiziert und als translationale Fusion vor das offene Leseraster des β-Glucuronidasegens (GUS) des Vektors pGPTV-Kan (Becker et al., 1992, Plant Mol. Biol., 20: 1195-1197) kloniert (pTS 7). Dazu wurde das PCR-Produkt mit XbaI und der Vektor mit XbaI und SmaI geschnitten, so dass die Klonierung gerichtet erfolgte. Anschließend wurden die Basenpaare 75 bis 2.723 aus RS2 ebenfalls durch PCR-Reaktion mit den Primern 3prime-3.sst (5'- TAGGAGCTCAGATCTAGTTGAGCAAGTAGG-3') uns 3prime-2.sst (5'-TAGGAGCTCGTGGAGTGAAAACCCTAAATAACC-3') amplifiziert und hinter das GUS-Gen in das Konstrukt pTS 7 eingesetzt (pTS 9). Dies erfolgte durch die Restriktion von PCR-Produkt und Vektor mit SstI und die anschließende übliche Ligation. Die Orientierung des klonierten Fragmentes wurde durch das übliche PCR-Verfahren mit den Primern CD61-27 (5'-CACCAATTCACGCAAGAGAAAC-3') und pGPTV-for (5'- CCGCAACGATTGAAGGAGCC-3') getestet. Die relative Anordnung der verwendeten DNA- Fragmente ist in Fig. 2 schematisch dargestellt. Beide Konstrukte wurden durch die oben beschriebene Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation in die Wildtyptomaten der Varietät Moneymaker eingeführt. Transgene Pflanzen, die eine intakte Kopie des jeweiligen Konstruktes enthielten, wurden durch Anfärbung auf β-Glucuronidase-Aktivität getestet. Dies erfolgte durch Inkubation in 100 mM Na-Phosphat-Puffer (pH7), 10 mM EDTA, 5 mM DTT, 2 mM 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Glukuronid, 10% Methanol bei 37°C für 16 Stunden. Bei diesem Test zeigten transgene Pflanzen, die das pTS 7-Konstrukt trugen, eine heterogene Färbung verschiedener Pflanzenteile, wobei zwischen unterschiedlichen transgenen Pflanzen, die mit demselben Konstrukt transformiert worden waren, deutliche Unterschiede in Färbungsverteilung und Färbungsintensität auftraten. Dagegen war bei den transgenen Pflanzen, die das Konstrukt pTS9 enthielten, eine weitgehend identische Färbung im Bereich der Sprossapikalmeristeme, der Abscissionszonen, der Blütenstiele, der Apikalmeristeme von Haupt- und Seitenwurzeln, im basalen Bereich offener Blüten sowie in den Staubblättern zu beobachten. Bei pTS9-Pflanzen wurde somit eine Färbung nur in solchen Geweben beobachtet, die in der ls¹- Mutante eine Veränderung des Phänotyps zeigen. Ein Vergleich der Färbungsmuster von pTS7- und pTS9-Pflanzen zeigt demnach, dass die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen RS1 und RS2 in der Lage sind, eine spezifische oder präferentielle Expression von Fremdgenen in Zellen der Spross- und Wurzelapikalmeristeme, der Abscissionszonen, im basalen Bereich offener Blüten sowie in den Staubblättern zu vermitteln.

Beispiel 4

Unterdrückung der Seitentriebbildung durch gezielte Expression eines RNAi-Konstruktes Chuang und Meyerowitz, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4985-4990, beschreiben ein Verfahren zur Unterdrückung der Genaktivität durch doppelsträngige RNA-Interferenz (RNAi). In der vorliegenden Erfindung wurde dieses Verfahren in abgewandelter Form eingesetzt, um die Aktivität des Lateral suppressor-Gens der Tomate zu unterdrücken. Zu diesem Zweck wurden ein Promotorfragment von 1.381 Bp (RS1) und das regulatorische 3'-Fragment von 2.884 Bp (RS2) verwendet. Die regulatorischen Sequenzen wurden mit einem vom Ls-Gen abgeleiteten offenen Leseraster kombiniert das eine invertierte Wiederholung der Basenpaare 548 bis 1287 des Ls-ORF enthielt. Das verwendete Konstrukt (pEF28/29) ist in Fig. 3 schematisch dargestellt. Dieses Konstrukt wurde durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation in die Tomatenlinie Moneymaker eingeführt. Transgene Pflanzen wurden auf eine Reduktion der Seitentrieb- und Petalenbildung untersucht. Die untersuchten Pflanzen zeigten eine Suppression der Seitentriebbildung.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe mit der biologischen Funktion eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers, oder eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 hybridisiert und die biologische Funktion eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers aufweist.

2. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, wobei die hybridisierende Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 hybridisiert.

3. Transgene Pflanze mit stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe mit der biologischen Funktion eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers, und einer mit diesen Nukleinsäuresequenzen funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsäuresequenz.

4. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 3, wobei für die für ein Genprodukt codierende oder die andere funktionelle Nukleinsäuresequenz eine endogene oder exogene Nukleinsäuresequenz verwendet wird.

5. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 3 bis 4, wobei die für ein Genprodukt codierende oder eine andere funktionelle Nukleinsäuresequenz in Sense- oder Antisense- Orientierung vorliegt.

6. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze nach einem der Ansprüche 3 bis 5, umfassend das stabile Integrieren von regulatorischen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe mit der biologischen Funktion eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers, und einer mit diesen Nukleinsäuresequenzen funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen.

7. Transformierte Pflanzenzelle oder transformiertes Pflanzengewebe, dadurch gekennzeichnet, daß regulatorischen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe mit der biologischen Funktion eines Promotors und/oder Enhancers und/oder Silencers, und eine mit diesen Nukleinsäuresequenzen funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz stabil in das Genom der Pflanzenzelle oder des Pflanzengewebes integriert ist.

8. Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe nach Anspruch 7, regenerierbar zu einer samenproduzierenden Pflanze.

9. Saatgut, erhalten von Pflanzen nach einem der Ansprüche 3 bis S.

10. Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2.