DE10032808A1 - Vorrichtung zur multilayerartigen Zusammenführung unterschiedlicher Zelltypen in bestimmten Formen und Mustern zu Geweben oder Organen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrift eine Vorrichtung zur multilayerartigen Zusammenführung von unterschiedlichen Zellen in bestimmten Formen und Mustern in einzelnen Kammern eines in sich abgeschlossenen Bioreaktors, wobei eine getrennte Medium-Perfusion der einzelnen Kammern und/oder des gesamten Bioreaktors stattfindet. Eine Zelllinie wird in jeweils einer Kammer angesiedelt und durch eine Zellträgermembran oder eine andere verdaubare Membran und/oder durch eine zusätzliche Begasungsebene oder andere Zu- und Ableitungen mit Nährstoffen versorgt. Durch eine von außen herbeigeführte Positionsänderung der Kammern entsteht ein neues Zellkompartiment, wobei die Zelllinien miteinander proliferieren und sich zu einem völlig neuem Gewebe zusammensetzen. Die Formgebung des entstehenden Gewebes wird dabei durch vorgegebene Formen und Muster des Hohlraumes der einzelnen Kammer bestimmt. Das entstehende Gewebe oder Organ kann im Bioreaktor weiterhin mit Nährstoffen und Gasen bis zur völligen Reifung versorgt werden. Dabei wird das Organ oder Gewebe durch spezielle Zu- und Ableitungen mit entsprechenden Nähr- und Wachstumsstoffen versorgt.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Zusammenführung unterschiedlicher Zelllinien in bestimmten Formen und Mustern zu Geweben und Organen, wie sie zum Beispiel bei der Haut auftreten.

Bekannt sind verschiedene Reaktormodelle, in denen einzelne Zelltypen kultiviert werden können. Meist werden dafür Zellkulturflaschen, Flach­ membranreaktoren oder Reaktorbeutel mit einer Membran, benutzt. Diese Arten der Zellkultivierungen haben den großen Nachteil, dass sich die Zellen anscheinend nur willkürlich zusammensetzen. Selbst bei neueren Flachmembran- und Beutelreaktoren besteht noch immer das Problem, dass sich die Zellen nur bedingt zusammensetzen und dabei keine homogene Fläche bilden. Bei einer Durchmischung von Zellen in einem Bioreaktor besteht vor allem das große Problem, dass sich unterschiedliche Zellen willkürlich zusammensetzen und es Schwierigkeiten beim Wachstum der unterschiedlichen Zellen gibt, da die meisten Zellarten für ihre Entwicklung unterschiedliche Nähr- und Zusatzstoffe benötigen. Diese Nähr- und Zusatzstoffe können meist nur für eine Zelllinie verwandt werden. Bei der Kultivierung der Hautzellen beispielsweise ist es derzeit nicht möglich, Haut in all ihren drei Schichten (Keratinozyten, dermale Fibroplasten und Lipozyten) als transplantierbares 3D-Gewebe zu kultivieren. Zum Kultivieren einzelner Hautschichten gibt es verschiedene und teilweise etablierte Verfahren, die aber noch nicht für eine kommerzielle Produktion von Hautgewebe geeignet sind. So werden bei Verbrennungspatienten heute immer noch nur kleine Stücken einzelner Schichten kultivierter Hautzellen transplantiert. Diese kultivierten Hautzellen bestehen aus nur einer Zelllinie. Ebenso ist es derzeit nicht möglich, Hautschichten in Form der eigentlichen Verbrennungsverletzung zu kultivieren.

Hier setzt die vorliegende Erfindung an, deren Anwendung im Beispiel der Kultivierung von Hautzellen eine kommerzielle Produktion eines Zell­ kompartimentes mit unterschiedlichen Zelllinien (allen drei Hautschichten) als transplantierbarem Gewebe, als Endprodukt, ermöglicht. Das dabei entstehende Gewebe hat die Form der Verbrennungsverletzung des Patienten. Ebenso ist es technisch möglich, jede Größe eines Gewebes kommerziell und verbrennungsspezifisch zu produzieren. Im Bereich des Tissue-Engineering öffnen sich völlig neue Anwendungen. Durch die hier vorliegende Erfindung ist es erstmals möglich, alle Arten von Organen oder Geweben kommerziell zu produzieren. So kann zum Beispiel Knorpel durch den Aufbau des in den Kammern definierten Hohlraumes in einem Bioreaktor multilayerartig produziert und zusammengesetzt werden. Es können somit komplexe, dreidimensionale Knorpelformen als Implantate produziert werden. Durch einen modularen Aufbau der Kammern ist es auch möglich, komplexe, vollständige Organe, wie zum Beispiel eine Leber, zu erzeugen. Man hätte somit eine durch Tissue-Engineering produzierte, transplantierbare Leber. Damit würden in Zukunft Dialyse und andere extrakorporale Unterstützungssysteme wegfallen. Den Patienten, die auf ein Spenderorgan waden, werden noch intakte Zellen entnommen, und diese können in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor wirtschaftlich kultiviert und zu einem Gewebe oder Organ zusammengesetzt werden. Der Patient hätte somit eine größere Chance, geheilt zu werden, da keine Abstoßungsgefahr für das Gewebe oder Organ besteht. Ebenso entfällt die Wartezeit auf Spenderorgane.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus mehreren Kammern, deren Anzahl und Position im Bioreaktor je nach Anwendung unterschiedlich ist. Die Kammern besitzen einen Hohlraum, der durch eine oder mehrere Zellträgermembranen oder ein anderes verdaubares Material nach außen geschützt ist. Der Hohlraum hat je nach Anwendung eine spezifische Form. Durch das spätere Zusammensetzen der Kammern können durch die spezifischen Innenformen der Hohlräume 3D-Formen für Gewebe und Organe hergestellt werden. Bei einem kompletten Hautgewebe (alle drei Hautschichten) hätten die Kammern einen Hohlraum mit der Größe und der Form der zu versorgenden Verbrennungsverletzung oder des Hauttransplantates. Es würden nur drei Kammern benötigt. Bei einem Knorpelersatz würden je nach Größe des Ersatzes unterschiedlich viele Kammern benötigt. Durch das spätere Zusammensetzen der unterschiedlichen Kammern und der Formgebung des Hohlraumes der Kammern können verschiedene dreidimensionale Formen für einen Knorpelersatz erzeugt werden. Durch das multilayerartige Zusammensetzen von gleichen und/oder unterschiedlichen Zelllinien können auch andere Organe künstlich erzeugt werden.

Im Hohlraum einer Kammer befindet sich mindestens eine Zu- und Ableitung für Zellen und Nährstoffe, sowie eine oder mehrere normale oder resorbierbare/verdaubare Hohlfasermembranen zur Begasung der zu kultivierenden Zellen. Durch eine Zu- und Ableitung der Begasungsebene können Gase, wie zum Beispiel Sauerstoff, durch die Hohlfasermembranen, die durch eine oder mehrere Konnektierungen nach außen geführt werden, in den Hohlraum der Kammer geleitet und abgeführt werden. Diese Konnektierungen schließen hermetisch mit den Reaktordeckeln ab. Zur notwendigen Perfusion der einzelnen Kammern und des späteren durch Zusammensetzung der Kammern entstehenden Zellkompartimentes besitzt der Bioreaktor einen Zu- und Ablauf, durch den sich der gesamte Bioreaktorinnenraum mit Flüssigkeiten und/oder Gasen befüllen lässt. Die Konnektierungen der obig genannten Zu- und Abläufe schließen ebenfalls hermetisch mit dem Bioreaktorgehäuse ab.

Die Kammern sitzen auf einer oder je nach Größe der Kammern oder des zu erstellenden Zellkompartimentes auf mehreren Kammerwellen, welche durch ihre Formgebung die Kammern in einer bestimmten Position hält. Die Kammerwellen werden durch Gleitlagerführungen, die im Reaktordeckel eingepresst sind und keine Gase oder Flüssigkeiten durch die äußere Reaktorhülle lassen, nach außen geführt. Damit das Reaktorinnere steril und druckstabil bleibt, sind die Gleitführungen und die Kammerwellen miteinander verbunden, wobei die Verbindungsstelle hermetisch versiegelt ist. Am äußeren Gehäuse des Reaktors befindet sich eine mechanisch - pneumatische oder elektromechanische Vorrichtung zum axialen Drehen der Kammerwellen. Zwischen den beiden äußeren Kammern, die an den Reaktordeckeln liegen, befindet sich pro Kammerwelle zwischen den Kammern und den Reaktordeckeln jeweils mindestens eine Druckfeder. Durch axiales Drehen der Kammerwelle in einem bestimmten Winkel verlieren die Kammern durch die Formgebung der Kammerwelle ihren festen Sitz und werden durch Federn oder einen anderen Mechanismus zusammengedrückt. Eine feste und definierte Position der Kammer bleibt durch die Formgebung der Kammerwelle auch nach einer Positionsänderung der Kammern erhalten. Die Deckel des Bioreaktors sind abnehmbar und werden durch eine oder mehrere Dichtungen zur äußeren Umgebung hermetisch verriegelt.

Die hier vorliegende Erfindung in ihrer ersten Anwendung beim Beispiel von Hautgewebe, hat zur Aufgabe, ein transplantierbares Hautgewebe aus drei unterschiedlichen Zelllinien in einer bestimmten Form als komplettes transplantierbares Gewebe zu produzieren. Dabei werden Kammern mit einer für den anwendungsspezifischen Bereich entwickelten Trägermembran bestückt. Im Bioreaktor werden im Anschluss in einer bestimmten Reihenfolge Kammern auf die Kammerwellen gesetzt. Dabei haben die Kammern einen durch die Kammerwelle definierten Abstand zueinander.

Der gesamte Bioreaktor wird durch Pumpsysteme mit einem Basalmedium durchspült. Bei der Produktion von Hautgewebe beispielsweise werden in den drei einzelnen Kammern jeweils Keratinozyten, dermale Fibroplasten und Lipozyten kultiviert. Die Zelleinfüllung erfolgt über die dafür vorgesehenen Zell- und Nährstoffzu- und -ableitungen. Die Begasungsebenen sorgen für bessere Bedingungen der Zellproliferation. Durch spezielle Nährstoffe, die durch die Zell- und Nährstoffzu- und -ableitungen nach Bedarf hinzugefügt werden, können in einer Kammer individuelle Bedingungen für die jeweilige Zelllinie geschaffen werden. Ein Basalmedium, das durch den Zu- und Ablauf, der für den gesamten Bioreaktor zuständig ist, eingeleitet wird, dient zur Grundversorgung der Zellen und für den Abtransport von Reststoffen. Nachdem die Zellen auf der Zellträgermembran der einzelnen Kammer kultiviert wurden, enthält jede Kammer eine flächige Zellstruktur eines Zelltyps. Durch das Zusammensetzen der Kammern fangen die unterschiedlichen Zelllinien an, nachdem die Zellträgermembran verdaut wurde, zu einem dreidimensionalen Gewebe zu proliferieren. Durch den Zu- und Ablauf, der für den gesamten Bioreaktor zuständig ist, werden jetzt Medien benutzt, die für das weitere Kultivieren des entstandenen Zellkompartimentes nötig sind.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorzüge der hier vorliegenden Erfindung, ergeben sich am Beispiel der Produktion eines dreischichtigen Hautgewebes anhand der Abbildungsbeschreibungen.

Abbildungsbeschreibung

Fig. 1 zeigt eine dimetrische Projektion der Vorrichtung in ihrer ersten Anwendung bei der kommerziellen Produktion von Hautzellen. Pos. 1 und 6 zeigen einen Zu- und Ablauf, der für eine Durchspülung des gesamten Reaktors benutzt wird. Der Ablauf (Pos. 6) befindet sich im unterem Deckel (Pos. 7). Die Zu- und Abläufe der einzelnen Kammern (Gas und Flüssigkeiten) werden durch Anschlüsse (Pos. 3), die sich im Reaktordeckel (Pos. 2) befinden, realisiert. In diesem Deckel befindet sich ebenfalls die oben genannte Zuleitung (Pos. 1). Die Kammern (Pos. 4) werden durch die Kammerwellen (Pos. 5) auf einer definierten Position gehalten. Durch Drehen der Positionsräder (Pos. 8) werden die Kammerwellen um einen bestimmten Winkel axial gedreht, wobei durch die Formgebung der Kammerwelle eine Positionsänderung in einer definierten Richtung stattfindet.

Fig. 2 zeigt eine dimetrische Projektion einer einzelnen Kammer in ihrer ersten Anwendung bei der kommerziellen Produktion von Haut. Zwischen das Kammergehäuse (Pos. 9) und den Kammerdeckel (Pos. 4) werden zwei Membranen (Pos. 3 und 6) geklemmt. Durch Schrauben (Pos. 2) wird diese Klemmung abgedichtet. Dabei entsteht ein Hohlraum, in dem sich später die Zellen kultivieren lassen. Dieser Hohlraum muß nicht, wie im gezeichneten Beispiel, eine runde Form haben, sondern kann je nach Anwendung eine spezifische Form haben. Da jede Kammer eine andere Innenform haben kann, lassen sich somit durch multilayerartiges Zusammensetzen der Kammern dreidimensionale Formen oder Gewebe erzeugen. Eine Hohlfasermembran (Pos. 5), die durch den Anschluss (Pos. 8), nach außen geführt wird, sorgt für die Gasversorgung des Hohlraumes. Flüssigkeiten werden durch den äußeren Anschluss (Pos. 7) mit einem Schlauch (Pos. 1) in den Hohlraum der Kammer geleitet.

Fig. 3 zeigt eine dimetrische Projektion von drei Kammern im Schnitt mit einer kultivierten Zelllinie (Pos. 2). Weiterhin werden die Zellen mit Gas durch die eingezeichneten Hohlfasermembranen versorgt. Die restliche Versorgung des Hohlraumes erfolgt durch die oben genannten Versorgungszu- und -ableitungen. Die kultivierte Zelllinie wird durch zwei resorbierbare Membranen (Pos. 1) im Inneren der Kammer gehalten.

Fig. 4 zeigt eine dimetrische Projektion der drei Kammern nach ihrer definierten Positionsänderung durch die Kammerwellen. Die Zelllinien liegen nun direkt übereinander und werden lediglich durch eine resorbierbare Membran (Pos. 2) getrennt. Nach dem sich diese Membranen aufgelöst haben, fangen die unterschiedlichen Zelllinien an zu proliferieren. Es entsteht ein multilayerartig zusammengesetzten Gewebe oder Organ (Pos. 1).

Claims (11)

1. Vorrichtung zur multilayerartigen Zusammenführung unterschiedlicher Zellentypen in bestimmten Formen und Mustern zu Geweben oder Or­ ganen.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 2, in welcher die Form des Hohlraumes einer jeden Kammer unterschiedlich sein kann.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 3, in welcher die Ober- und/oder Unterseite jeder Kammer mit einer resorbierbaren/verdaubaren Membran und/oder einem anderen Gewebe bestückt ist.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher eine jede Kammer in ihrem Hohlraum eine Begasungsebene, die durch eine oder mehrere Hohlfasermembran realisiert ist, besitzt.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 5, in welcher Zu- und Ableitungen für Zellen und/oder Nährstoffe vom Äußeren einer jeden Kammer in das Innere des Hohlraumes einer Kammer führen.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 6, in welcher Zu- und Ableitungen für Gase vom Äußeren einer jeden Kammer durch die Begasungs­ ebene in den Hohlraum einer Kammer und wieder nach außen geführt werden können.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 7, in welcher alle Zu- und Ableitungen einer jeden Kammer durch elastische Verbindungen zum Äußeren des Bioreaktors führen.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 8, in welcher der Bioreaktor mindesten einen eigenen Zu- und Ablauf für Basalmedien, Gase und/oder Nährstoffe für das zu produzierte Gewebe/Organ besitzt.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 9, in welcher eine Perfusion und Diffusion des sich im gesamten Bioreaktor befindlichen Mediums durch eine Membran oder ein Gewebe mit Nähr- und Zellwachstumsstoffen aus dem Hohlraum einer Kammer ermöglicht wird.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 10, in welcher eine Zusammenführung der Kammern durch eine Kammerwelle auf eine durch die Kammerwelle bestimmte Position gewährleistet wird.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 11, in welcher eine Perfusion und Diffusion aller Kammern nach ihrer Positionsänderung durch Anspruch 10 beschrieben, durch im Anspruch 8 beschriebenen Zu- und Abläufe erfolgt.