DE10030376A1

DE10030376A1 - Neues Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe

Info

Publication number: DE10030376A1
Application number: DE10030376A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Betz; Gerald Kleymann; Olaf Weber; Emanuel Lohrmann
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2002-01-24

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren, seine Verwendung zum Auffinden neuer Wirkstoffe, seine Verwendung in Screening-Assays sowie für diagnostische und präparative Zwecke.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren, seine Verwendung zum Auf finden neuer Wirkstoffe, seine Verwendung in Screening-Assays sowie für diagnostische und präparative Zwecke.

Zur Detektion der Aktivität DNA-modifizierender Enzyme stehen eine Reihe von Verfahren zur Verfügung, wie z. B. gelelektrophoretische Verfahren, welche die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit modifizierter und nicht-modifizierter DNA-Spezies zur Grundlage haben (z. B. Detektion der Aktivität von Restrik tionsenzymen mittels Agarosegelelektrophorese (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Auch die katalytische Aktivität der Terminasen der Herpesviren, in vitro eine doppelsträngige superspiralisierte Plasmid-DNA zu nicken, wurde bislang mittels Gel-shift-Assays abgegriffen (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264). Assays zur Messung der Aktivität von HIV-Integrase sind z. B. Gelshiftassays mit und ohne radioaktive Markierung (Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123); eine HTS-Fähigkeit ist hier nicht gegeben. Beschrieben sind auch Eintopfverfahren, welche auf FRET (fluorescence resonance energy transfer) beruhen (Lee, S. P., Censullo, M. L., Kim, H. G., Knutson, J. R., Han, M. K. (1995), Analytical biochemistry 227: 295-301). Weiterhin zu erwähnen ist ein Microtiter-strand-transfer-assay, welcher mit immobilisierten bzw. biotinylierten Oligonukleotiden arbeitet (Hazuda, D. J., Hastings, J. C., Wolfe, A. L., Emini, E. A. (1994), Nucleic Acids Res. 22: 1121-1122).

Die Messung der Aktivität von Ligasen, welche die katalytische Aktivität besitzen, lineare oder genickte DNA-Moleküle zu zirkularisieren, erfolgt klassisch mittels radioaktiver Methoden entweder über die Umwandlung von [³²P] Pyrophosphat in ein Norit-absorbierbares Material (Weiss unit) oder über die Messung der Circu larisierung eines radioaktiv markierten d(A-T)_n polymers (Modrich, P., Lehman, I. R. (1979), J. Biol. Chem. 245: 3626-3631). All diese Verfahren beruhen jedoch auf der Verwendung von Radioaktivität und Filtrations- bzw. Absorptionsschritten oder benötigen entsprechende Waschschritte, welche im Hochdurchsatzverfahren nicht durchführbar sind.

Ausgehend vom derzeitigen Stand der Technik zum Nachweis der Aktivität von DNA-modifizierenden Enzymen, stellten sich die Erfinder die Aufgabe, ein Ver fahren zu entwickeln, welches als Eintopfreaktion leicht durchführbar ist.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren, das die Schritte umfasst:

1. Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität dieser DNA-Spezies zu verändern,
2. die Behandlung mit Exonuklease, und
3. der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA.

Das erfindungsgemäße Verfahren kommt ohne die Hilfe von gelelektrophoretischen oder sonstigen Trennungsvorgängen aus und ist daher Zeit- und kostensparend und im high-throughput-Maßstab einsetzbar. Es eignet sich insbesondere zum Aufbau von Screening Assays, insbesondere High-throughput-Screening (HTS) Assays oder Test-Kits, um Inhibitoren DNA-modifizierender Enzyme zu identifizieren. Sind diese DNA-modifizierenden Enzyme z. B. für Pathogene essentiell, so stellen die hierdurch identifizierten Inhibitoren wertvolle therapeutisch oder prophylaktisch einsetzbare Wirkstoffe dar. Im Rahmen eines Screening Assays werden eine Vielzahl von Ver bindungen auf ihre Fähigkeit hin getestet, die enzymatische Aktivität des DNA- modifizierenden Enzyms zu inhibieren. Dies erfolgt bevorzugt automatisiert im Hochdurchsatzverfahren (HTS). Ein Test-Kit stellt die für die Durchführung des Assays notwendigen Komponenten zur Verfügung.

Die Behandlung der DNA-Spezies mit einem oder mehreren DNA-modifizierenden Enzymen erfolgt in an sich bekannter Weise durch Inkubieren in einem geeigneten wässrigen Puffermedium (wässrige Lösung mit geeigneter Ionenstärke, geeignetem pH-Wert, geeigneter Proteinkonzentration, geeigneten Redoxmitteln bei geeigneter Temperatur). Die genauen Inkubationsbedingungen hängen von der Art des DNA- modifizierenden Enzyms ab. Diesbezüglich wird auf die Beispiele und auf bekannte Literatur (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) verwiesen.

Geeignete, im Verfahren umsetzbare DNA-Spezies schließen zweckmäßig ein:
eine geschlossene, eine genickte oder eine lineare DNA mit gegebenenfalls derart modifizierten Enden, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt werden können. Z. B. können eine doppelsträngige circuläre DNA, eine doppelsträngige lineare DNA, deren Enden gegebenenfalls so modifiziert sind, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt werden können oder eine doppelsträngige circuläre genickte DNA verwendet werden. Die DNA-Spezies können natürlichen, synthetischen oder gen technologischen Ursprungs (z. B. Polymerase-Chain-Reaction (PCR)) sein.

Als DNA-modifizierende Enzyme können z. B. Enzyme folgender Enzymklassen verwendet werden: Terminasen, Ligasen, Topoisomerasen, Restriktionsendo nukleasen, Integralen, Telomerasen, Methylasen, Demethylasen etc. und/oder Kom binationen daraus. Im Falle der Terminasen, Ligasen, Integrasen, Topoisomerasen und Restriktionsendonukleasen erfolgt die Änderung der Exonucleasesensitivität unmittelbar, im Falle der Methylasen oder Demethylasen wird durch deren Aktivität die Suszeptibilität der Substrat-DNA für eine ebenfalls im Reaktionsansatz vor handene restriktive Endonuklease modifiziert, welche dann letzten Endes zur Modi fizierung der Exonuklease-Sensitivität führt. Im Falle der Anwendung des erfin dungsgemäßen Verfahrens beim Auffinden neuer Wirkstoffe wie beispielsweise bei Screening-Assays sind die DNA-modifizierenden Enzyme zweckmäßig solche Enzyme, die für das Pathogen von essentieller Bedeutung sind. Bevorzugt werden Terminasen der Herpes-Viren, Integrasen von HIV 1 oder HIV 2 oder bakterielle Ligasen verwendet. Die Fähigkeit der DNA-modifizierenden Enzyme, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern, schließt im Sinne der Erfindung die Fähigkeit ein, die DNA-Spezies für den Angriff der Exonuklease zu sensibilisieren oder zu desensibilisieren. Dies bedeutet beispielsweise im Falle der Terminase oder Integrase die Spaltung eines oder beider DNA-Stränge einer doppel strängigen circulären Substrat-DNA, wie dies schematisch in Fig. 1 gezeigt ist. Im Falle der Ligase bedeutet dies das kovalente Schließen beider DNA-Stränge einer doppelsträngigen linearen Substrat-DNA, wie schematisch in Fig. 6 gezeigt.

Die Behandlung der DNA-Spezies mit dem DNA-modifizierenden Enzym kann simultan in Gegenwart von Exonuklease erfolgen (z. B. im Falle der Terminase, Bei spiel 1 oder Integrase, Beispiel 2), oder die Behandlung mit der Exonuklease kann nachfolgend erfolgen (z. B. im Falle der Ligase, Beispiel 3). Bevorzugterweise erfolgt die Behandlung, wenn möglich, simultan. Exonukleasen im Sinne der Erfindung schließen solche Enzyme ein, welche DNA-Stränge von den Enden her hydrolytisch abbauen. Beispielsweise können 3'-5'-Exonukleasen, wie Exonuklease III (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr. 779 709) oder 5'-3'-Exonukleasen, wie λ-Exo nuklease (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr. 1666908), verwendet werden. Ebenso besitzen auch einige DNA-Polymerasen (z. B. T4-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr. 1004786)) unter geeigneten Reaktionsbedin gungen eine Exonuklease-Aktivität, diese sind ebenfalls in der vorliegenden Erfin dung enthalten.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt nach oder während der Behandlung mit Exonuklease die Analyse und/oder präparative Umsetzung der aus der Behandlung resultierenden DNA, bevorzugterweise erfolgt die Analyse und/oder präparative Um setzung nachfolgend. Die Analyse schließt hierbei insbesondere die Quantifizierung der resultierenden DNA ein. Die Quantifizierung von DNA ist möglich unter Verwendung interkalierender fluoreszierender Farbstoffe. Derartige Farbstoffe sind kommerziell erhältlich. Beispielsweise kann Hoechst 33258 (2'-[4-Hydroxyphenyl]- 5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1H-benzimidazol) (BioRad Laboratories GmbH, München, Deutschland, Best. Nr.: 170-2480) oder PicoGreen^TM (Molecular Probes, MoBiTec, Göttingen, Deutschland, Best. Nr.: P7581) verwendet werden. Eine Alter native ist die Quantifizierung mittels molecular beacons (Livak, K. J., Flood, S. J. A., Marmaro, J., Mullah, K. B. (1998), US5723591). Falls die DNA für ein Protein kodiert (z. B. Luciferase, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase etc.), so ist eine weitere Alternative die in vitro-Transkription/Translation gefolgt von einer Be stimmung der enzymatischen Aktivität.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung, zum Aufbau von Screening-Assays zur Identifizierung von Inhibitoren essentieller DNA-modifizie render Enzyme pathogener Organismen, ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Schritt (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Gegenwart möglicher Inhibitoren der besagten DNA-modifizierenden Enzyme (Proteine) durchführt, und anschließend die Menge der verbliebenen DNA bestimmt. Mögliche Inhibitoren schließen bei spielsweise Peptide, Antikörper, Proteine, Nukleinsäuren und bevorzugt nieder molekulare chemische Substanzen natürlichen oder synthetischen Ursprungs ein. In Anwesenheit von Inhibitoren der DNA-modifizierenden Enzyme erfolgt keine Veränderung der Exonuklease-Sensitivität der DNA-Substratmoleküle, und dies lässt sich durch die Bestimmung der Menge der verbliebenen DNA nachweisen, wie oben beschrieben.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Auf findung von Inhibitoren DNA-modifizierender Enzyme ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine doppelsträngige, circuläre DNA oder eine doppelsträngige lineare DNA, deren Enden so modifiziert sind, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt werden können, und die jeweils eine oder mehrere Erkennungssequenzen oder Bindungsstellen für das DNA-modifizierende Enzym aufweisen können, ein DNA- Strang-spaltendes Enzym, einen potentiellen Inhibitor dieses Enzyms sowie eine Exonuklease inkubiert und anschließend die verbleibende Menge der doppel strängigen DNA nachweist. Als Exonuclease-insensitive Substrat-DNA ist dabei bei spielsweise circulär geschlossene DNA einsetzbar (z. B. ein bakterielles Plasmid), möglich ist aber auch der Einsatz linearer DNA, wenn die Enden vor Exonucleaseangriff geschützt sind, was insbesondere durch Anwesenheit von Phosphorothioat- Bindungen anstelle von Phosphorodiesterbindungen im DNA-Rückgrat erreicht werden kann. Diese können z. B. mittels terminaler Transferase 3'-anpolymerisiert werden, oder aber, falls die Substrat-DNA durch PCR amplifiziert wurde, durch die Verwendung von phosphorothioathaltigen Primern terminal bereits chemisch synthe tisch eingeführt sein.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Auffindung von Inhibitoren DNA-modifizierender Enzyme ist dadurch gekenn zeichnet, dass man eine doppelsträngige, circuläre genickte DNA oder eine doppel strängige lineare oder linearisierte DNA, ein DNA-Strang-ligierendes Enzym, einen potentiellen Inhibitor dieses Enzyms inkubiert, anschließend eine Exonuklease zu setzt, wiederum inkubiert und anschließend die verbleibende Menge der doppel strängigen DNA nachweist. Als Exonuclease sensitive Substrat-DNA ist beispiels weise Plasmid-DNA einsetzbar, welche zuvor mit Hilfe eines nur an einer be stimmten Stelle schneidenden Restriktionsenzyms in an sich bekannter Weise lineari siert wurde.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft vorliegende Erfindung die Entwicklung eines Assays zur Identifizierung von Wirkstoffen gegen Herpesviren. Zu der Familie der humanpathogenen Herpesviren gehören die Herpes Simplex Viren Typ 1 und 2 (HSV-1, HHV-1 und HSV-2, HHV-2), Varizella Zoster Virus (VZV, HHV-3), das Epstein-Barr Virus (EBV, HHV-4), das humane Cytomegalie Virus (HCMV, HHV-5) sowie die humanen Herpesviren 6, 7, 8 (HHV-6, HHV-7, HHV-8) (Fields, 1996, Virology Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). Herpes viren sind Auslöser für Krankheiten wie: Herpes labialis, Pharyngitis, Gingivosto matitis, Herpes genitalis, Herpes gladiatorum, ocularem Herpes, welcher bis zur Erblindung führen kann, Varicella (Windpocken), Herpes zoster (Gürtelrose), 3- Tage-Fieber, Hepatitis, Pneumonie, Encephalitis, Mononucleose und Kaposi- Sarkom. Herpesviren haben ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom von ca. 100- 270 Kilobasenpaaren. Nach Infektion der permissiven Zielzelle erfolgt die DNA- Replikation vermutlich nach einem rolling circle Mechanismus ab, bei dem Konkate mere der viralen DNA synthetisiert werden. Während der Virusreifung in der Zelle werden die Konkatemere durch eine Nuclease/Terminase geschnitten und in die sich selbst assemblierenden Viruscapside verpackt. Die Terminasereaktion ist dabei für den Replikationszyklus der Herpesviren essentiell. Eine Methode zum Auffinden von Terminaseinhibitoren würde daher antivirale Wirkstoffe identifizieren können. Da die Terminasekomponenten über die verschiedenen Herpesvirenspezies relativ gut konserviert sind besteht die Möglichkeit, mittels dieses Ansatzes ein Breitband antiherpetikum zu identifizieren. Das HCMV Gen UL56 kodiert für ein Protein (p130), welches Teil des Terminasekomplexes ist. P130 alleine besitzt in vitro eine katalytische Nucleaseaktivität. Diese schneidet überwiegend nur einen der beiden DNA-Stränge (nicking) eines supercoil-Plasmides, welches eine spezifische Erkennungssequenz (pac1/pac2) trägt (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264). Hierdurch resultiert in der Agarosegelelektrophorese eine leicht verringerte Wanderungsgeschwindigkeit des genickten Plasmids im Vergleich zur supercoil-Ausgangsform. Die Durchführung der zur Detektion nötigen, Agarose gelelektrophorese ist nicht im high throughput screening (HTS)-Maßstab durch führbar. Durch Anwendung der in diesem Patent beschriebenen Technologie ist die Entwicklung eines HTS-Assays möglich. Diese Ausführungsform wird auch stell vertretend in Beispiel 1 detailliert beschrieben. In diesem Fall wird die DNA- nickende Aktivität von p130 kombiniert mit der Exonucleaseaktivität des Enzyms T4-DNA-Polymerase (Fig. 1). Das Plasmidsubstratmolekül wird in einer Eintopf reaktion zunächst von p130 genickt und dadurch für die Exonuclease (z. B. ExoIII oder T4-DNA-Pol) angreifbar. Während die genickte DNA abgebaut wird, bleibt die nicht-genickte supercoil-DNA erhalten (Fig. 2). Durch die Kombination der beiden Enzymaktivitäten erfolgt somit eine Abnahme der DNA-Konzentration im Reak tionsansatz. Würde die Terminasereaktion (p130-nicking) inhibiert (z. B. durch einen niedermolekularen Inhibitor), so nähme auch die DNA-Menge im Reaktionsgefäß nicht ab. Eine Quantifizierung der DNA nach abgeschlossener Reaktion kann mit Hilfe von Hoechst 33258 (Fig. 3) durchgeführt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft vorliegende Erfindung die Entwicklung eines Assays zur Auffindung von Wirkstoffen gegen das human immunodeficiency virus (HIV). HIV-1 (so wie auch HIV-2) ist als Erreger der er worbenen Immunschwäche AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) bekannt. Infektiöse Virionen enthalten zwei identische Kopien des einzelsträngigen 9,2 kb RNA-Genoms. In frühen Stadien der Infektion wird das RNA-Genom in doppel strängige lineare DNA revers transkribiert, dieser Prozess wird durch die virale Reverse Transkriptase (RT) katalysiert, welche ein Produkt des viralen pol-Gens ist. Für die Replikation essentiell ist aber auch die Integration dieser doppelsträngigen viralen DNA ins Genom der infizierten Wirtszelle (CD4⁺-Zellen also T-Lympho zyten, Makrophagen etc.). Die Integration läuft über zwei Veresterungsschritte ab und wird katalysiert durch das virale 32-kDa-Enzym Integrase (IN), welches eben falls ein Produkt des viralen pol-Gens ist. Da Mutationen in der für IN kodierenden Region von pol zu replikationsdefizientem HIV führen, stellt die Integrase ein interessantes Target für die antivirale Chemotherapie dar. Neben weiteren enzyma tischen Reaktionen katalysiert IN in vitro unter anderem auch die Spaltung (Nicking und Linearisierung) von supercoil-Plasmid-DNA (Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5119-5123). Hierdurch resultiert in der Agarosegel elektrophorese eine leicht vernngerte Wanderungsgeschwindigkeit des genickten Plasmids im Vergleich zur supercoil-Ausgangsform. Die Durchführung der zur Detektion nötigen Agarosegelelektrophorese ist nicht im high throughput screening (HTS)-Maßstab durchführbar. Durch Anwendung der in diesem Patent beschriebenen Technologie ist die Entwicklung eines HTS-Assays möglich. Diese Ausführungs form wird stellvertretend in Beispiel 2 detailliert beschrieben. In diesem Fall wird die DNA-nickende Aktivität der HIV-Integrase kombiniert mit der Exonucleaseaktivität z. B des Enzyms T4-DNA-Polymerase und/oder Exonuclease III (Fig. 4). Das Plasmidsubstratmolekül (pUC18) wird in einer Eintopfreaktion zunächst von der Integrase genickt und dadurch für die Exonucleaseaktivität der T4-DNA-Polymerase oder ExonucleaseIII angreifbar. Während die genickte DNA abgebaut wird, bleibt die nicht-genickte supercoil-DNA erhalten (Fig. 4). Durch die Kombination der beiden oder aller drei Enzymaktivitäten erfolgt somit eine Abnahme der DNA-Konzentration im Reaktionsansatz. Würde die Integraseaktivität (nicking) inhibiert (z. B. durch einen niedermolekularen Inhibitor), so nähme auch die DNA-Menge im Reak tionsgefäß nicht ab. Eine Quantifizierung der DNA nach abgeschlossener Reaktion kann mit Hilfe von Hoechst 33258 (Fig. 5) durchgeführt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft vorliegende Erfindung die Entwicklung eines Assays zur Auffindung von antibakteriellen Wirkstoffen. DNA Ligasen katalysieren die Knüpfung einer Phosphodiesterbindung zwischen einer 5'- Phosphat und einer 3'-Hydroxygruppe in genickter DNA. Ein wichtiger Schritt des katalytischen Mechanismus ist die Bildung eines adenylierten DNA Intermediates. Die Adenylgruppe stammt bei DNA-Ligasen der Eukaryonten und der Archae bakterien von ATP, bei Eubakterien aber vom NAD. Die Ligationsreaktion ist für die DNA-Replikation und für die Reparatur geschädigter DNA essentiell und ligasedefi ziente Stämme sind nicht lebensfähig. Wegen des divergenten katalytischen Mecha nismus und der Essentialität stellen bakterielle DNA-Ligasen ein interessantes Target bei der Identifizierung antibiotisch wirksamer Substanzen dar. Von gram-positiven Bakterien verursachte Krankheiten sind beispielsweise: Pneumonie (z. B. Streptococcus pneumoniae), Abszess (z. B. Staphylococcus aureus), Pharyngitis, Tonsillitis (z. B. Streptococcus pyogenes), Diphtherie (Corynebacterium diphtheriae), Meningitis (z. B. Listeria monocytogenes), Anthrax (Bacillus anthracis), Tetanus (Clostridium tetani). Gram-negative Bakterien lösen z. B. folgende Krankheiten aus: Meningitis (z. B. Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae), Gonorrhea (z. B. Neisseria gonorrhoeae), Urogenitalinfektionen (z. B. Escherichia coli), Pneumonie (z. B. Klebsiella pneumoniae), Typhus (Salmonella typhi), Epiglottitis (z. B. Haemophilus influenzae), Pertussis (Bordetella pertussis), Pest (Yersinia pestis), Cholera (Vibrio cholerae). Wichtige Pathogene schließlich sind noch die Mykobakterien, zu welchen beispielsweise die Erreger der Tuberculose, Mycobakterium tuberculosis und der Lepra (Mycobacterium leprae) gehören. Wird mit kompatiblen sticky ends versehene lineare DNA mit der Ligase unter geeigneten enzymatischen Bedingungen inkubiert, so erfolgt die Bildung von kovalent geschlossener DNA. Hierdurch resultiert in der Agarosegelelektrophorese eine leicht erhöhte Wanderungsgeschwindigkeit im Vergleich zur Ausgangsform. Die Durchführung der zur Detektion nötigen, Agarosegelelektrophorese ist nicht im high throughput screening (HTS)-Maßstab durchführbar. Durch Anwendung der in diesem Patent beschriebenen Technologie ist die Entwicklung eines HTS-Assays möglich. Diese Ausführungsform wird stellvertretend in Beispiel 3 detailliert beschrieben. In diesem Fall wird die DNA-Ligaseaktivität verbunden mit einer nachfolgenden Exonucleasebehandlung (z. B. T4-DNA-Polymerase) (Fig. 6). Im ersten Schritt erfolgt die Circularisierung des linearen DNA-Substratmoleküls durch die Ligase. Danach wird Exonuclease zugesetzt und schließlich die verbleibende DNA-Menge mittels PicoGreen (Molecular Probes, Best. Nr.: P7581) quantifiziert (Fig. 8). Das ursprünglich vorliegende Substratmolekül (mittels Restriktionsverdau linearisiertes pUC18) ist von der Exonuclease angreifbar (Fig. 7). Erfolgt durch die katalytische Aktivität der Ligase eine kovalente Verknüpfung der Enden und damit die Bildung eines circulären DNA-Moleküls, so ist Exonucleaseresistenz gegeben. Würde die Ligaseaktivität inhibiert (z. B. durch einen kleinmolekularen Inhibitor), so nähme auch die Exonucleasebehandlung verbleibende DNA-Menge im Reaktions gefäß nicht zu.

Der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgefundenen Inhibitoren DNA- modifizierender Enzyme können bei entsprechender Eignung als Wirkstoffe zur Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten bei Säugetieren angewendet werden. Dazu können diese Stoffe systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann er auf geeignete Weise appliziert werden, wie z. B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Im plantat.

Für diese Applikationswege kann der Wirkstoff in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden. Gegebenenfalls kann es sinnvoll sein, die erfindungsgemäß gefundenen Verbindungen mit anderen Wirkstoffen zu kombinieren.

Darüberhinaus ist das Verfahren auch zur Detektion von Mutationen (z. B. Punkt mutationen) einsetzbar.

Zur Detektion von Punktmutationen gibt es zahlreiche Methoden (Review: Kwok, Chen (1998), Genet. Eng. (NY) 20: 125-134). Beispielsweise sind hier zu nennen: Restriction Fragment Length Polymerphism (RFLP), Denaturierende Gradientengel elektrophorese, Heteroduplex Analyse, Single-strand Conformation Polymorphism (SSCP) oder DNA-Sequenzierung. Ein Nachteil fast all dieser Methoden ist aber die Tatsache, dass zur Analyse eine aufwendige und nicht im Hochdurchsatzverfahren durchführbare gelelektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten oder die An wendung von Hybridisierungsverfahren notwendig ist, was eine Automatisierung und damit billige Testung sehr erschwert. Ausgehend von diesem Stand der Technik sollte ein Verfahren bereitgestellt werden, welches in einer Eintopfreaktion im Hoch durchsatzverfahren einfach durchzuführen ist.

Im Falle der Diagnostik zur Detektion von Mutationen (z. B. Punktmutationen) um fasst das Verfahren die folgenden Schritte:

a) Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern,
b) die Behandlung mit Exonuklease, und
c) der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA, gegebenenfalls Klonierung, Amplifizierung, Expression oder Sequenzierung der verbliebenen DNA.

Eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Mutationen im Hochdurchsatzverfahren. Hierbei wird DNA, ent haltend eine Wildtyp-Sequenz und/oder eine Mutante besagter Wildtyp-Sequenz, die sich durch die Anwesenheit oder Nicht-Anwesenheit einer Erkennungssequenz einer spezifischen Endonuklease unterscheiden, wobei die genannte DNA gegebenenfalls mit einer PCR amplifiziert wurde, mit einer für die Wildtyp-Sequenz oder die Mutante besagter Wildtyp-Sequenz spezifischen Endonuklease umgesetzt, gleich zeitig oder nachfolgend mit Exonuklease umgesetzt und anschließend die verbliebene Menge der DNA gemessen oder die verbliebene DNA präparativ weiterverwendet. Der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA erfolgt hier z. B. mittels interkalierender fluoreszierender Farbstoffe. Die optional mögliche präpara tive Umsetzung der resultierenden DNA-Spezies erfolgt mittels an sich bekannter gentechnologischer Methoden (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Möglich ist die Unterscheidung zwischen DNAs einer "Wildtyp-Sequenz" und einer "Mutanten-Sequenz", wenn sich beide Sequenzen durch die Anwesenheit oder Nicht- Anwesenheit einer Erkennungssequenz einer spezifischen Endonuklease unter scheiden.

Zweckmäßigerweise wird hierzu zuvor die Substrat-DNA mittels einer PCR aus dem zu analysierenden Genom spezifisch amplifiziert. Initiale Exonucleaseinsensitivität wird mit der Hilfe von exonucleaseresistenten Primern oder durch Anpolymerisieren von Phosphorothioatnucleotiden erreicht. Die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Technologie zu detektierenden Mutationen können beispielsweise sein: Punkt mutationen mit einem oder mehreren Basenaustauschen, Insertionen, Deletionen etc..

Das Verfahren lässt sich in leicht abgewandelter Form auch dazu einsetzen, zu einer bekannten Gensequenz verwandte Gensequenzen effizient zu isolieren.

Im Genom der Vertebraten treten Gene häufig in der Form von Genfamilien auf, welche zahlreiche mehr oder weniger stark verwandte Mitglieder umfassen. Die Identifizierung weiterer Mitglieder der Genfamilie im selben Genom oder aber auch die Suche nach dem phylogenetischen Homolog in Genomen anderer evolutiv ent fernter Spezies stellt sich dabei oft als sehr schwierig und aufwendig dar. Eine Methode, um von einer bekannten Sequenz ausgehend weitere Mitglieder einer Familie zu identifizieren, ist die Hybridisierung einer Genbibliothek mittels einer vom bekannten Gen abgeleiteten markierten Gensonde unter Bedingungen mit geringer Stringenz. Aufgrund zu großer Sequenzunterschiede ist eine Kreuzhybridi sierung bei entfernt verwandten Mitgliedern aber oftmals nicht zu erreichen. Eine weitere Methode zur Klonierung verwandter Gensequenzen beruht auf der Poly merasekettenreaktion (PCR). Aus den bekannten Mitgliedern der zu untersuchenden Genfamilie werden mittels eines Alignments konservierte Bereiche identifiziert und mit deren Hilfe degenerierte Primer entwickelt. Diese Primer sind dann in der Lage, zusätzlich zu den bereits bekannten Vertretern weitere Mitglieder der Genfamilie oder aber homologe Gene in anderen Spezies zu amplifizieren. Ein Nachteil bei dieser Methode, wenn sie zur Klonierung von neuen Genfamilienmitgliedern einge setzt wird, ist aber, dass die bereits bekannten Sequenzen stark bevorzugt amplifiziert werden, so dass eine Identifizierung von noch unbekannten und nur mit geringer Effizienz amplifizierten Familienmitgliedern entweder gar nicht oder nur mit sehr hohem Aufwand möglich ist.

Im Falle der Isolation homologer Gensequenzen umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:

a) Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern,
b) die Behandlung mit Exonuklease, und
c) Klonierung, Amplifizierung, Expression oder Sequenzierung der DNA

Die präparative Umsetzung der resultierenden DNA-Spezies erfolgt mittels an sich bekannter gentechnologischen Methoden (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung betrifft ein zur Isolierung noch unbekannter Gene einsetzbares Verfahren. Hierbei wird DNA, enthaltend eine bekannte Sequenz und eine dazu verwandte Sequenz, die gegebenenfalls mit einer PCR amplifiziert wurden, mit einer für die bekannte Sequenz oder dazu verwandte Sequenz spezifischen Endonuklease umgesetzt, gleichzeitig oder nachfolgend mit Exonuklease umgesetzt und anschließend die verbliebene DNA präparativ weiter verwendet.

Ausgehend von DNA, enthaltend eine bekannte Sequenz und eine dazu verwandte Sequenz (z. B. eine homologe Sequenz), erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die selektive Anreicherung der verwandten Sequenz, wenn diese Varianten sich hin sichtlich der Sensitivität gegenüber einer Restriktionsendonuclease unterscheiden. Eine solche erfindungsgemäß einsetzbare DNA kann beispielsweise mit Hilfe einer Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden. Initiale Exonucleaseinsensi tivität wird mit der Hilfe von exonucleaseresistenten Primern oder durch Anpoly merisieren von Phosphorothioatnucleotiden erreicht. Unter anderem ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Isolierung noch unbekannter Gene möglich, welche zu einem bereits bekannten Gen verwandt (z. B. homolog) sind und diese bei spielsweise während einer PCR zusammen mit der bereits bekannten Zielsequenz mit sehr geringer Effizienz coamplifiziert wurden.

Ebenso möglich ist eine selektive Entfernung der verwandten Sequenzen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die Erfindung soll durch die Fig. 1 bis 10 im folgenden näher erläutert werden.

Fig. 1 zeigt den erfindungsgemäßen Fall, in dem eine Terminase (hier p130 = UL56 von HCMV) (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264) als DNA-modifizierendes Enzym verwendet wird. Dadurch entsteht eine Exo nuklease-Sensitivität, die in Gegenwart von Inhibitoren der Terminase ausbleibt. Somit ergibt sich ein jeweils unterschiedliches Fluoreszenzsignal nach Zugabe von Hoechst33258 (2'-[4-Hydroxyphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1H-benz imidazol) (BioRad, München, Best. Nr. 170-2480).

Fig. 2 die Substrat-DNA pUCaSeq (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264) wurde mit den angegebenen Enzymkombinationen für 3 h bei 37°C inkubiert und anschließend einer Agarosegelelektrophorese unterzogen (siehe Beispiel 1). Die Ethidiumbromid (2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenyl-phenanthridinium bromid)-färbung des Gels zeigt, dass die genickte Plasmidform, welche bei Inkuba tion mit p130 (Protein wurde von Dr. E. Bogner zur Verfügung gestellt) (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264) entsteht, bei gleichzeitiger Anwesenheit einer Exonuclease (ExoIII (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr. 779 709) oder T4-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr. 1004786)) vollständig abgebaut wird.

Fig. 3 die Substrat-DNA pUCaSeq wurde mit den angegebenen Enzymkombina tionen für 3 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die verbleibende DNA- Konzentration mittels Hoechst33258 bestimmt. Die gemessenen Fluoreszenzwerte (Excitation 355 nm, Emission 460 nm) sind jeweils angegeben (Terminale = p130).

Fig. 4 zeigt den erfindungsgemäßen Fall in dem eine Integrase (hier HIV-Integrase) (Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123) als DNA-modifizierendes Enzym verwendet wird. Damit entsteht eine Exonuclease- Sensitivität, die in Gegenwart von Inhibitoren der HIV-Integrase ausbleibt.

Die Substrat-DNA pUC18 (Amersham Pharmacia Best. Nr. 27494901) wurde mit den angegebenen Enzymkombinationen für 3 h bei 37°C inkubiert und anschließend einer Gelelektrophorese unterzogen (siehe Beispiel 2). Die Ethidiumbromid (2,7- Diamino-10-ethyl-9-phenyl-phenanthridinium bromid)-färbung des Gels zeigt, dass die genickte Plasmidform, welche bei Inkubation mit HIV-Integrase (Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123) entsteht, bei gleich zeitiger Anwesenheit einer oder mehrerer Exonucleasen (ExoIII (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr. 779 709) oder T4-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr. 1004786)) partiell oder vollständig abgebaut wird, das ohne Integrase vorliegende supercoil-Plasmid wird jedoch nicht angegriffen.

Fig. 5 die Substrat-DNA pUC18 wurde mit den angegebenen Enzymkombinationen für 3 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die verbleibende DNA-Konzentration mittels Hoechst 33258 bestimmt. Die gemessenen Fluoreszenzwerte (Excitation 355 nm, Emission 460 nm) sind jeweils angegeben (Terminase = p130).

Fig. 6 zeigt den erfindungsgemäßen Fall, in dem eine Ligase als DNA-modifizie rendes Enzym und eine zuvor mit einem Restriktionsenzym linearisierte Plasmid- DNA als Substrat verwendet wird. Durch die Aktivität der Ligase wird die DNA- Spezies für die Exonuklease desensibilisiert. In Gegenwart von Inhibitoren der Ligase bleibt diese Desensibilisierung aus. Die Detektion der resultierenden kovalent geschlossenen DNA erfolgt mit Hilfe von Pico Green^TM (Molecular Probes, MoBiTec, Göttingen, Best. Nr. P7581).

Fig. 7 die linearisierte Substrat-DNA wurde mit den angegebenen Enzymkombina tionen inkubiert (siehe Beispiel 3). Der Reaktionsansatz wurde einer Agarosegel elektrophorese unterzogen und das Gel mit PicoGreen gefärbt. Es ist deutlich zu sehen, dass ein Abbau der Substrat-DNA durch die Exonuclease T4-DNA-Poly merase durch die Aktivität der E. coli Ligase (Roche Molecular Biochemicals) ver hindert werden kann.

Fig. 8 linearisierte Substrat-DNA wurde mit den angegebenen Enzymkombina tionen inkubiert (siehe Beispiel 3) und danach die resultierende DNA mit Hilfe von PicoGreen quantifiziert. Die gemessenen Fluoreszenzwerte (Excitation 485 nm, Emission 538 nm) sind jeweils angegeben. Die Aktivität der Ligase wird durch das erfindungsgemäße Verfahren übersetzt in ein Fluoreszenzsignal.

Fig. 9 zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Diagnostik von Mutationen unter Verwendung der PCR. Die Anwesenheit einer Restriktionsendonukleaseerkennungssequenz wird durch das erfindungsgemäße Verfahren über setzt in ein vorhandenes oder abwesendes Fluoreszenzsignal. PCR-Primer sind als Rechtecke, der Bereich der Mutation als Dreieck dargestellt. Die 3' oder 5'-Enden der amplifizierten DNA sind, falls wie im Text beschrieben exonucleaseresistent gemacht, als dunkle Kreise markiert.

Fig. 10 zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Klonierung verwandter Gensequenzen unter Verwendung der PCR. Entsteht bei einer PCR durch ineffiziente Coamplifikation eines noch unbekannten verwandten Gens ein hetero genes DNA-Gemisch, so kann durch das erfindungsgemäße Verfahren das neue Genfragment angereichert werden.

Das Gen, welches für das Design der PCR-Primer zugrunde gelegt wurde, ist als Balken, das verwandte, in der PCR ineffizient coamplifizierte Gen als Balken mit Kreis dargestellt.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken:

Beispiel 1 Design eines Screening-assays zur Identifizierung von Wirkstoffen gegen Herpesviren

Folgender Reaktionsansatz wurde zusammenpipettiert:
41 µl H₂O dest.
5 µl Puffer M (Roche, Best. Nr. 1417983)
1 µl pUCASeq-Plasmid (2 µg/µl) (zur Verfügung gestellt von Dr. E. Bogner; (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264)
1 µl p130 (0,5 µg/µ1) (zur Verfügung gestellt von Dr. E. Bogner; (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264)
2 µl T4-DNA-Polymerase (1µ/gl) (Roche, Best. Nr. 1004786)
(zu Kontrollzwecken können einzelne Komponenten weggelassen werden)

Wird die Reaktion als Assay gefahren, wird zusätzlich die Testsubstanz zugegeben.

Der Ansatz wurde gemischt und in einer 96er Mikrotiterplatte für 3 h bei 37°C inkubiert,

Nach Ablauf der Reaktion wurde der Reaktionsansatz wie unter a) oder unter b) beschrieben weiterverarbeitet:

a) mittels einer Agarosegelelektrophorese in an sich bekannter Weise analysiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 2^nd Ed.). In Fig. 2 sind darüber hinaus Kontrollreaktionen gezeigt, welche umfassen: unbehandeltes Plasmid, Verdau des Plasmids mit einem Restriktionsenzym, Inkubation des Plasmids mit T4- DNA-Polymerase, Inkubation des Plasmids mit ExoIII, Inkubation des Plasmids mit p130 und T4-DNA-Polymerase, wie oben beschrieben, sowie Inkubation des Plasmids mit p30 und ExoIII.
b) Es wurden 50 µl 4 µg/ml Hoechst 33258 in 2 × TEN Assay Puffer (BioRAD, Best. Nr.: 170-2480) zupipettiert. Die Messung der Fluoreszenz (360 nm/455 nm) erfolgte mittels eines Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer (Labsystems). In einem typischen Experiment ergaben sich die in Fig. 3 dargestellten Meß werte.

Eine Unterscheidung zwischen Inhibitoren der Terminase (nicking-Aktivität) und Inhibitoren der T4-DNA-Polymerase (Exonucleaseaktivität), welche im Primärassay beide als Hit auffallen würden, ist durch Ersetzen der Terminase p130 durch ein Restriktionsenzym möglich:

Hierzu wird folgender Reaktionsansatz zusammenpipettiert:
41 µl H₂O dest.
5 µl Puffer M
1 µl pUCaSeq-Plasmid (2 µg/µl)
1 µl BamHI (10 U/gl) (Roche, Best. Nr. 220612)
2 µl T4-DNA-Polymerase (1 U/µl)
Testsubstanz

Der Ansatz wird gemischt und in verschlossenen Gefäßen für 3 h bei 37°C inkubiert.

Nach Ablauf der Inkubation werden wie oben 50 µl 4 µg/ml Hoechst 33258 in 2 × TEN Assay Puffer (BioRAD, Best. Nr.: 170-2480) zupipettiert und wiederum die Fluoreszenz wie oben beschrieben gemessen.

Handelt es sich bei der zu testenden Substanz um einen echten Terminaseinhibitor, so wird in diesem Kontrollassay ein Abbau der eingesetzten DNA erfolgen. Handelt es sich bei der zu testenden Substanz um einen T4-DNA-Polymeraseinhibitor, so wird auch in diesem Kontrollassay der Abbau der eingesetzten DNA inhibiert sein.

Dies wird schematisch in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2 Design eines Screening-assays zur Identifizierung von Wirkstoffen gegen HIV

Folgender Reaktionsansatz wurde zusammenpipettiert:
32 µl H₂O dest.
5 µl Puffer M (Roche, Best. Nr. 1417983)
1 µl pUC₁₈-Plasmid (1 µg/µl) (Amersham-Pharmacia Best. Nr. 27494901)
10 µl HIV-Integrase (rekombinant, exprimiert in E.coli wie beschrieben in:
Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123)
1 µl T4-DNA-Polymerase (1 U/µ1) (Roche, Best. Nr. 1004786)
1 µl Exonucleaselll (100 U/µ1) (Roche, Best. Nr. 779709)
(zu Kontrollzwecken können einzelne Komponenten weggelassen werden)

Der Ansatz wurde gemischt und in einer 96er Mikrotiterplatte für 3 h bei 37°C inkubiert.

a) mittels einer Agarosegelelektrophorese in an sich bekannter Weise analysiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 2^nd Ed.). In Fig. 4 sind darüber hinaus Kontrollreaktionen gezeigt: unbehandeltes Plasmid, Inkubation des Plasmids mit ExoIII, Inkubation des Plasmids mit T4-DNA-Polymerase, Inkubation des Plasmids mit Integrase, Inkubation des Plasmids mit Integrase und T4-DNA- Polymerase, Inkubation des Plasmids mit Integrase und ExoIII, Inkubation des Plasmids mit Integrase und T4-DNA-Polymerase und ExoIII.
b) Es wurden 50 µl 4 µg/ml Hoechst 33258 in 2 × TEN Assay Puffer (BioRAD, Best. Nr.: 170-2480) zupipettiert. Die Messung der Fluoreszenz (360 nm/455 nm) erfolgte mittels eines Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer (Labsystems). In einem typischen Experiment ergaben sich die in Fig. 5 dargestellten Meß werte.

Das Prinzip ist analog zu Fig. 1.

Beispiel 3 Design eines Screening-assays zur Identifizierung antibakteriell wirksamer Substanzen

Im Reaktionsansatz werden folgende Komponenten eingesetzt:

Ligasepuffer

(30 mM Tris HCl, 10 mM (NH₄

)₂

SO₄

, 10 mM MgCl₂

, 1,2 mM EDTA, 1,0 mM DTE, 50 µg/ml BSA, 5% PEG8000)
NAD-Lösung (3,4 mg/ml in Ligasepuffer)

Substrat-DNA

pUC18-DNA linearisiert mit BamHI (100 ng/µl)
(5 µg pUCIS DNA wurden mit SOU BamHI in Puffer B (Roche Best Nr. 1417967) 3 h bei 37°C inkubiert.
Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kits (QIAGEN Best. Nr. 28104) aufgereinigt und die DNA- Konzentration auf 100 ng/µl eingestellt.)

Folgende Komponenten wurden zusammenpipettiert:
5 µl Substrat-DNA (500 ng)
2,5 µl NAD-Lösung
1-4 µl E.coli Ligase (0,25 U/µl)(Roche)
38,5-41,5 µl Ligasepuffer

Der Ansatz wurde 30 min bei 12°C inkubiert. Danach wurde zu einigen Ansätzen 1 U T4-DNA-Polymerase (Roche) zugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert.

a) mittels einer Agarosegelelektrophorese in an sich bekannter Weise analysiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 2^nd Ed.). In Fig. 7 sind folgende Reaktionen gezeigt: unbehandeltes Plasmid, Inkubation des Plasmids mit Ligase, Inkubation des Plasmids mit Ligase + T4-DNA-Polymerase, Inkubation des Plasmids mit T4-DNA-Polymerase.
b) Es wurden 50 µl einer 1 : 200 verdünnten PicoGreen-Lösung (PicoGreen Ex.. 485 nm, Em. 538 nm; (Molecular Probes, Best. Nr.: P7581)) zupipettiert. Die Messung der Fluoreszenz (Ex 485 nm/Em 538 nm) erfolgte mittels eines Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer (Labsystems). In einem typischen Experiment ergaben sich die in Fig. 8 dargestellten Meßwerte.

Dies wird schematisch in Fig. 6 dargestellt.

Beispiel 4 Methode zur Detektion von Mutationen aus Gewebeproben

Wir stellen hier ein Verfahren vor, mit welchem unter Anwendung der in diesem Patent beschriebenen Technologie eine Detektion von Punktmutationen im HTS- Durchsatz durchführbar ist.

Der DNA-Bereich, welcher auf Vorhandensein der Punktmutation gescreent werden soll, wird mittels spezifischer Primer in einer PCR amplifiziert. Die eingesetzten Primer sind gegen den Angriff einer Exonuclease geschützt (z. B. Phosphothioate- Modifikation) (Fall A). Alternativ wird mit exonuclease sensitiven Primern gear beitet und nach Abschluss der PCR werden Phosphorthioatnucleotide mittels termi naler Transferase an das PCR-Produkt 3'-anpolymerisiert (Fall B). Danach wird dem Reaktionsansatz eine Restriktionsendonuklease zugesetzt, welche nur in der mu tanten, nicht aber in der Wildtypsequenz schneidet (oder vice versa). Außerdem zugesetzt wird in Fall A eine 5'-3'-Exonuclease (z. B. Bacteriophagen λ Exonuclease) oder in Fall B eine 3'-5'-Exonuclease (z. B. T4-DNA-Polymerase). Da die ampli fizierte DNA erst nach dem Schnitt der Endonuclease von der Exonuclease ange griffen werden kann, erfolgt ein allelspezifischer Abbau. Die vorhandene Restmenge DNA kann nun beispielsweise mittels Fluoreszenz eines Interkalators gemessen werden. Ist nur das mutante Allel gegenüber der Endonuclease und somit auch gegenüber der Exonuclease sensitiv, ergibt sich bei homozygot WT Individuen ein intensives Signal, bei Anwesenheit der Mutation in heterozygoten Individuen ein reduziertes Signal und bei homozygot mutanten Individuen kein Signal. Ist lediglich das amplifizierte Wildtypallel für den Angriff der Restriktionsendonuclease und damit auch der Exonuclease empfindlich, so würde man bei homozygot wildtyp-Individuen kein Signal erhalten, bei Individuen mit einem mutanten und einem Wild typallel ein reduziertes Signal sowie bei homozygot mutanten Individuen schließlich ein intensives Signal.

Dies wird schematisch in Fig. 9 dargestellt.

Beispiel 5 Methode zur Klonierung verwandter Gensequenzen

Im Folgenden wird ein Verfahren vorgestellt, mit welchem unter Anwendung der in diesem Patent beschriebenen Technologie zu einer bekannten Sequenz eine neue, noch unbekannte verwandte Sequenz aus einem DNA-Pool (z. B. genomische DNA) isoliert werden kann.

Zu Beginn wird eine PCR durchgeführt mit exonucleaseresistenten Primern (z. B. Phosphorothioatmodifikation) (Fall A), welche in der Lage sind, die bekannte Ziel sequenz zu amplifizieren. Alternativ wird mit exonuclease sensitiven Primern ge arbeitet und nach Abschluss der PCR werden Phosphorthioatnucleotide mittels terminaler Transferase an das PCR-Produkt 3'-anpolymerisiert (Fall B). Sind bereits weitere verwandte Sequenzen bekannt (z. B. Homologe, Mitglieder der gleichen Genfamilie etc.), so kann gegebenenfalls auf degenerierte Primer zurückgegriffen werden. Die Reaktionsbedingungen der PCR können hinsichtlich Stringenz der Amplifikation in an sich bekannter Weise frei variiert werden. Nach Beendigung der PCR werden eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen zugesetzt, welche die bereits bekannten Zielsequenzen im amplifizierten Bereich schneiden. Da bei Ab weichung bereits einer Base die Restriktionsendonuklease nicht mehr schneiden kann, besteht die Wahrscheinlichkeit, dass zu isolierende, noch unbekannte ver wandte Gensequenzen diese interne Restriktionsschnittstelle nicht aufweisen. Somit erfolgt nach Zugabe einer 5'-3'-Exonuklease (Fall A) oder einer 3'-5'-Exonuclease (Fall B) ein Abbau der DNA-Moleküle mit der bereits bekannten Zielsequenz, wohingegen jedoch die noch unbekannten DNA-Sequenzen gegebenenfalls unangegriffen bleiben. Somit resultiert im amplifizierten DNA-Pool eine Enfernung der bereits bekannten Sequenzen und damit eine Anreicherung der bis dato noch unbe kannten, aber bei der PCR coamplifizierten DNA-Sequenzen. Die verbleibende DNA kann dann in entsprechende Klonierungsvektoren in an sich bekannter Weise ein gebracht, weiter vermehrt und einer genaueren Charakterisierung (weitere Ampli fikation, Expression, Klonierung, Sequenzeirung etc.) zugeführt werden. Unter Ver wendung dieser Sequenz als Gensonde kann nun nachfolgend beispielsweise in einer Genbibliothek bei Hybridisierung unter hoher Stringenz der entsprechende genomische oder c-DNA Klon isoliert werden.

Dies wird schematisch in Fig. 10 dargestellt.

Claims

1. Verfahren, das die Schritte umfasst:

1. Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern,
2. die Behandlung mit Exonuklease, und
3. der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA mit Fluoreszenzfarbstoff erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA mit molecular beacons erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA mittels mittels in vitro Transkription/Translation und Quantifizierung des kodierten Proteins erfolgt.

5. Verfahren, das die Schritte umfasst:

a) Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern,
b) die Behandlung mit Exonuklease, und
c) Klonierung, Amplifizierung, Expression oder Sequenzierung der DNA.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 zur Auffindung von Inhibitoren DNA-modifizierender Enzyme, dadurch gekennzeichnet, dass man Schritt (1) in Gegenwart möglicher Inhibitoren der DNA-modifizierenden Enzyme durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine doppelsträngige, circuläre DNA oder eine doppelsträngige lineare DNA, deren Enden so modifiziert sind, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt werden können, und die jeweils eine oder mehrere Erkennungs sequenzen oder Bindungsstellen für das DNA-modifizierende Enzym auf weisen können, ein DNA-Strang-spaltendes Enzym, einen potentiellen Inhi bitor dieses Enzyms sowie eine Exonuklease inkubiert und anschließend die verbleibende Menge der doppelsträngigen DNA nachweist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine doppel strängige, circuläre genickte DNA oder eine doppelsträngige lineare oder linearisierte DNA, ein DNA-Strang-ligierendes Enzym, einen potentiellen Inhibitor dieses Enzyms inkubiert, anschließend eine Exonuklease zusetzt, wiederum inkubiert und anschließend die verbleibende Menge der doppel strängigen DNA nachweist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, worin DNA, enthaltend eine Wildtyp- Sequenz und/oder eine Mutante besagter Wildtyp-Sequenz, die sich durch die Anwesenheit oder Nicht-Anwesenheit einer Erkennungssequenz einer spezi fischen Endonuklease unterscheiden, wobei die genannte DNA gegebenen falls mit einer PCR amplifiziert wurde, mit einer für die Wildtyp-Sequenz oder die Mutante besagter Wildtyp-Sequenz spezifischen Endonuklease um gesetzt wird, gleichzeitig oder nachfolgend mit Exonuklease umgesetzt wird und anschließend die verbliebene Menge der DNA gemessen wird oder die verbliebene DNA präparativ weiterverwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9 zur Identifizierung und/oder Isolierung ver wandter oder mutanter Gene.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 zur Verwendung in der Diagnostik.

12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man eine hybridi sierte Mischung eines modifizierten c-DNA oder RNA-Pools als DNA- Spezies verwendet, um ein differentiell exprimiertes Gen zu isolieren.

13. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 6 als Basis für den Aufbau eines Screeening-Assays oder eines Test-Kits.

14. Verwendung der Inhibitoren, die durch das Verfahren nach Anspruch 6 gefunden wurden, zur Herstellung eines Arzneimittels.

15. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe viraler oder bakterieller Infektionen.

16. Inhibitor, identifiziert nach dem Verfahren nach Anspruch 6.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Inhibitor nach Anspruch 16 in Mischung mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten umfasst.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-modifizierende Enzym eine Terminase der Herpes-Viren ist

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-modifizierende Enzym die Integrase von HIV-1 oder HIV-2 ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-modifizierende Enzym eine bakterielle Ligase ist.